CN112679584B - 一种猪瘟抗原表位肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种猪瘟抗原表位肽及其用途，所述猪瘟抗原表位肽选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端第100‑550个氨基酸，所述猪瘟抗原表位肽的长度为20‑210个氨基酸，且单独的所述猪瘟抗原表位肽或包括所述猪瘟抗原表位肽的重组抗原可诱发哺乳动物针对非洲猪瘟病毒蛋白P72的免疫反应；发明人根据已解析天然非洲猪瘟病毒全病毒结构，揭示了其主要抗原蛋白P72的抗原表位信息，本发明的猪瘟抗原表位肽相比生物信息学等手段预测的抗原表位信息更真实、可靠、有效。

Description

一种猪瘟抗原表位肽及其用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种猪瘟抗原表位肽及其用途。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒科的唯一成员非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、发热、传染性很高的疾病。家猪和欧洲野猪普遍易感，呈现复杂的临床症状，引起消化系统和呼吸系统充血、出血以及功能紊乱，在家猪中是一种高度接触性传播疾病，发病过程短，潜伏期5-15天，有很高的发病率和死亡率，死亡率甚至可高达100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

ASFV是一个复杂的二十面体病毒，其特征与虹彩病毒科和痘病毒科的成员相似。ASFV为双股线性DNA基因组，根据病毒株的不同其大小为170～190kb(Blasco等，1989；Tabares等，1980)，基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，在不同的实验室所得到的结果有一定差异。ASFV病毒可以编码34种以上的结构蛋白，虽然病毒的结构蛋白很多，但是证实具有抗原性的蛋白仅有几种，Tabares(1980)等发现6种，分别为VP72，VP162，VP146，VP54，VP34和VP23.5，其中p72、p54、p30和p12具有良好的抗原性。P72是一个主要的核衣壳蛋白，占整个病毒粒子总蛋白的32％，国外研究表明，不同区域的ASFV病毒诱导产生的P72抗体的相应抗原表位都相当保守，而且抗原性很稳定，常被用来作为血清学检测和免疫制剂。

2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2018年，我国已经发现了ASF疫情，带来了巨大的直接和间接经济损失。疫苗是预防和治疗ASF的重要手段。目前的ASFV疫苗主要有灭活疫苗和减毒活疫苗。然而，传统的灭活疫苗不能对非洲猪瘟病毒感染产生有效的免疫保护，而利用传代减毒的毒株进行免疫预防，部分免疫的猪发病甚至死亡，另外，由于免疫接种导致出现大量的带毒猪，对后期该病的扑灭非常不利，而且接种传代减毒的非洲猪瘟弱毒疫苗存在病毒毒力返强的风险。为克服上述缺陷，研究人员提出了利用基因工程制备含有ASFV病毒的抗原性蛋白载体蛋白结合的融合蛋白用于ASFV疫苗。如中国专利文献CN103172749B公开的一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备中，公开的一种非洲猪瘟多表位融合蛋白，根据已分离的非洲猪瘟病毒保守结构蛋白P72，膜结构蛋白P54与红细胞凝集素HA的多个T细胞表位联合后与纯化标签串联，在大肠杆菌中实现表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的蛋白工程疫苗。然而上述文献中的融合蛋白为包涵体，单体形式存在，抗原表位丰度低，免疫效果较低,且通过变复性方法获得，蛋白质构象折叠准确性低，同时纯化方法复杂。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于现有的非洲猪瘟多表位融合蛋白抗原表位丰度低，免疫效果低，蛋白构象折叠准确率低，纯化方法复杂，进而提供一种猪瘟抗原表位肽及其用途，所述猪瘟抗原表位肽可引发有效的免疫反应，且根据所述猪瘟抗原表位肽设计的重组抗原，均为病毒样颗粒形式或多聚体蛋白形式存在，不为单体形式存在，使得抗原表位丰度高，免疫效果优良，且所述重组抗原为可溶性表达，蛋白构象折叠准确率高，纯化方法简单。

为此，本发明提供了如下的技术方案：

一种猪瘟抗原表位肽，所述猪瘟抗原表位肽选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端第100-550个氨基酸，所述猪瘟抗原表位肽的长度为20-210个氨基酸，且单独的所述猪瘟抗原表位肽或包括所述猪瘟抗原表位肽的重组抗原可诱发哺乳动物针对非洲猪瘟病毒蛋白P72的免疫反应。

在所述的猪瘟抗原表位肽中，包括如下至少一种：

(1)SEQ ID NO.1-4任一所示的氨基酸序列；

(2)具有与SEQ ID NO.1-4任一所示的氨基酸序列≥80％同源性的多肽，且单独的所述猪瘟抗原表位肽或包括所述猪瘟抗原表位肽的重组抗原可诱发哺乳动物针对非洲猪瘟病毒蛋白P72的免疫反应。

一种重组抗原，含有所述的一种猪瘟抗原表位肽与载体蛋白。

所述的重组抗原，所述载体蛋白包括猪圆环病毒结构蛋白Cap、乙肝病毒核心抗原蛋白、人铁蛋白、三聚体蛋白1na0c3_3、三聚体蛋白5L6HC3_1或三聚体蛋白2L6HC3_12。

一种抗所述的一种猪瘟抗原表位肽的抗体。

一种编码所述的一种猪瘟抗原表位肽、所述的重组抗原或所述的抗体的核苷酸序列。

一种表达载体，包括所述的核苷酸序列。

在所述的表达载体中，所述表达载体为质粒载体或病毒载体。

一种宿主，包括所述的表达载体。

在所述的宿主中，所述宿主为原核细胞或真核细胞。

在所述的宿主中，所述原核细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

一种药物，包括所述的一种猪瘟抗原表位肽、所述的重组抗原、所述的抗体、所述的核苷酸序列、所述的表达载体或所述的宿主；优选的，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

一种疫苗，包括所述的一种猪瘟抗原表位肽、所述的重组抗原、所述的抗体、所述的核苷酸序列、所述的表达载体或所述的宿主；优选的，还包括免疫学上可接受的载体和/或辅料。

所述的一种猪瘟抗原表位肽、所述的重组抗原、所述的抗体、所述的核苷酸序列、所述的表达载体或所述的宿主的用途，包括：

a1.用于制备诊断、检测、预防或治疗与所述抗原表位肽相关的疾病的药物；

a2.用于制备诊断、检测、预防或治疗与所述抗原表位肽相关的疾病的疫苗；

a3.用于制备针对所述非洲猪瘟病毒蛋白P72的抗体；

a4.用于所述非洲猪瘟病毒蛋白P72的分离纯化或检测；或

a5.制备检测所述非洲猪瘟病毒蛋白P72的产品；

优选的，所述疾病为非洲猪瘟病毒感染。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种猪瘟抗原表位肽，所述猪瘟抗原表位肽选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端第100-550个氨基酸，所述猪瘟抗原表位肽的长度为20-210个氨基酸，且单独的所述猪瘟抗原表位肽或包括所述猪瘟抗原表位肽的重组抗原可诱发哺乳动物针对非洲猪瘟病毒蛋白P72的免疫反应；发明人根据已解析非洲猪瘟病毒主要抗原蛋白P72的原子结构信息，发现P72结构中朝向病毒外侧的关键区域——非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端第100-550个氨基酸参与受体结合、中和性抗体的结合，是关键的抗原表位，可引发有效的免疫反应，相比生物信息学等手段预测的抗原表位信息更真实、可靠、有效。

2.本发明提供的一种猪瘟抗原表位肽，包括如下至少一种：(1)SEQ ID NO.1-4任一所示的氨基酸序列；(2)具有与SEQ ID NO.1-4任一所示的氨基酸序列≥80％同源性的多肽，且单独的所述猪瘟抗原表位肽或包括所述猪瘟抗原表位肽的重组抗原可诱发哺乳动物针对非洲猪瘟病毒蛋白P72的免疫反应；其中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端D(Asp)119-R(Arg)174，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端P(Pro)240-D(Asp)305，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端G(Gly)373-P(Pro)399，SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列为非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端A(Ala)496-T(Thr)529，上述的抗原表位肽均为发明人根据天然非洲猪瘟病毒中P72抗原的结构直接设计的多肽，相比生物信息学等手段预测的表位信息更真实、可靠。

3.本发明提供的一种重组抗原，均为病毒样颗粒形式或多聚体蛋白形式存在，不为单体形式存在，使得抗原表位丰度高，免疫效果优良，且所述重组抗原为可溶性表达，蛋白构象折叠准确率高，纯化方法简单，同时相比非洲猪瘟减毒活疫苗，不具有病毒核酸，没有感染性，安全性极高，且所有重组抗原均采用大肠杆菌表达系统，具有周期短，成本低廉等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例2中重组抗原HBCAG-ER4的SDS-PAGE结果；

图2是本发明实施例2中重组抗原HBCAG-ER4的负染电镜图片；

图3是本发明实施例3中重组抗原HBCAG-ER2的SDS-PAGE结果；

图4是本发明实施例3中重组抗原HBCAG-ER2的负染电镜图片；

图5是本发明实施例6-8中重组抗原PCV-构建1、PCV-构建3、PCV-构建4的SDS-PAGE结果；

图6是本发明效果例中重组抗原HBCAG-ER2、HBCAG-ER4的ELISA结果；

图7是本发明效果例中重组抗原PCV-构建1、PCV-构建3、PCV-构建4的ELISA结果。

具体实施方式

下述实施例中涉及到的试剂、细胞、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌Rosetta(DE3)、pET-28a载体、pET-24a载体、LB培养基、PBST溶液、0.2％BSA、Balb/c小鼠等均为市售产品，使用不同厂家型号的产品在技术效果上并不会带来显著的差别。

实施例1猪瘟抗原表位肽

本实施例根据ASFV P72抗原的的N端第100-550个氨基酸，设计了4个关键的抗原表位肽ER1、ER2、ER3和ER4。

ER1为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端D119-R174。

ER2为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端P240-D305。

ER3为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端G373-P399。

ER4为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，选自非洲猪瘟病毒蛋白P72的N端A496-T529。

ER1、ER2、ER3和ER4可以以任一个或以排列组合形式嵌入猪圆环病毒PCV2的Cap蛋白、乙肝核心抗原单体的免疫优势区域、人铁蛋白以及三聚体蛋白进行重组抗原的表达，让其发生自组装形成重组病毒样颗粒或三聚体重组抗原。

实施例2重组抗原HBCAG-ER4的制备

重组抗原HBCAG-ER4的制备，包括如下步骤：

(1)基因合成和分子构建：将ER4抗原表位肽的基因序列嵌入HBCAG蛋白骨架(HBCAG蛋白骨架如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列)的基因序列的79-80aa之间，并将获得的重组基因序列插入pET-28a载体NcoI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。

(2)质粒转化：向大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自博迈德公司)中加入2μl步骤(1)中所述重组质粒(80ng/μl)，冰浴30分钟，之后42℃热激90秒，再次置于冰上2分钟，加入800μl的LB培养基后，置于恒温振荡培养箱中，37℃，200rpm培养1小时。取100μl菌液，均匀涂布于含有卡那抗性的LB固体培养皿，将所述固体培养皿置于37℃的培养箱中倒置过夜培养。

(3)表达和纯化：从步骤(2)中所述的LB固体培养皿中挑取单一菌落，接种于5ml的LB液体培养基(含卡那霉素50μg/ml)中于37℃、200rpm的摇床中过夜培养。第二天将菌液接种入1L的LB培养基(含卡那霉素50ug/ml)中扩大培养，待OD值约为0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，终浓度为1mM，于16℃继续培养16h-18h。将培养后的菌液3800rpm、4℃离心30min，倒掉上清，用PBS缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，超声破碎细菌。破碎后，16000rpm，离心30min，取上清，进行饱和硫酸铵沉淀，于4℃环境中持续搅拌，向上清中逐滴加入饱和硫酸铵直至上清开始变浑浊，继续搅拌0.5h。搅拌结束后于16000rpm、4℃离心30min，离心后将沉淀用1-2ml的PBS缓冲液重悬均匀。然后进行蔗糖密度梯度离心，蔗糖梯度由15％-45％，上样后于29000rpm、4℃离心5h，离心后分层取样，得到病毒样颗粒，于4℃冰箱保存。

(4)病毒样颗粒的鉴定：对得到的病毒样颗粒通过SDS-PAGE电泳进行初步鉴定，随后通过电镜观察病毒样颗粒形态，确定形成了预期的病毒样颗粒。其中，图1示出了HBCAG-ER4重组抗原的SDS-PAGE结果，图2示出了HBCAG-ER4重组抗原的负染电镜图片，可见HBCAG-ER4重组抗原按照预期成功组装成了病毒样颗粒，且从负染电镜图片中可以看出所述病毒样颗粒大小为30nm-40nm，提高抗原表位丰度，引起免疫效果更优。

实施例3重组抗原HBCAG-ER2的制备

本实施例的制备方法与实施例2的基本相同，区别仅在于，在步骤(1)基因合成和分子构建中，为将ER2抗原表位肽的基因序列嵌入HBCAG蛋白骨架(HBCAG蛋白骨架如SEQ IDNO.5所示的氨基酸序列)的基因序列79-80aa之间，并将获得的重组基因序列插入pET-28a载体NcoI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。其中，图3示出了HBCAG-ER2重组抗原的SDS-PAGE结果，图4示出了HBCAG-ER2重组抗原的负染电镜图片，可见HBCAG-ER2重组抗原按照预期成功组装成了病毒样颗粒，且从负染电镜图片中可以看出所述病毒样颗粒大小为30nm-40nm，提高抗原表位丰度，引起免疫效果更优。

实施例4重组抗原HBCAG-ER1-ER3-ER4的制备

本实施例的制备方法与实施例2的基本相同，区别仅在于，在步骤(1)基因合成和分子构建中，为将组合的抗原表位肽ER1-(GGGGS)-ER3-(GGGGS)2-ER4(其中GGGGS为连接肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的基因序列嵌入HBCAG蛋白骨架(HBCAG蛋白骨架如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列)的基因序列79-80aa之间，并将获得的重组基因序列插入pET-28a载体NcoI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。

实施例5重组抗原HBCAG-ER1-ER3-ER4-ER2的制备

本实施例的制备方法与实施例2的基本相同，区别仅在于，在步骤(1)基因合成和分子构建中，为将组合的抗原表位肽ER1-(GGGGS)-ER3-(GGGGS)2-ER4-(GGGGS)-ER2(其中GGGGS为连接肽Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)的基因序列嵌入HBCAG蛋白骨架(HBCAG蛋白骨架如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列)的基因序列79-80aa之间，并将获得的重组基因序列插入pET-28a载体NcoI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。

实施例6重组抗原PCV-构建1的制备

(1)基因合成和分子构建：将抗原表位肽ER1、ER2、ER3的基因序列嵌入PCV2 Cap蛋白骨架(其中所述PCV2 Cap蛋白骨架如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列)的基因序列中，插入信息如下：PCV Cap S(Ser)169-T(Thr)170插入ER3、PCV Cap D(Asp)127-N(Asn)128插入ER1、PCV Cap T(Thr)189-A(Ala)190插入ER2，并将获得的重组基因序列插入pET-24a载体NdeI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。

(2)质粒转化：向大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞(购自博迈德公司)中加入2μl步骤(1)中所述重组质粒(80ng/μl)，冰浴30分钟，之后42℃热激90秒，再次置于冰上2分钟，加入800μl的LB培养基后，置于恒温振荡培养箱中，37℃，200rpm培养1小时。取100μl菌液，均匀涂布于含有卡那抗性的LB固体培养皿，将所述固体培养皿置于37℃的培养箱中倒置过夜培养。

(3)表达和纯化：从步骤(2)中所述的固体培养皿中挑取单一菌落，接种于5ml的LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中于37℃、200rpm的摇床中过夜培养。第二天将菌液接种入1L的LB培养基(含卡那霉素50ug/ml)中扩大培养，待OD值约为0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达，终浓度为1mM，于16℃继续培养16h-18h。将培养后的菌液3800rpm、4℃离心30min，倒掉上清，用Caps缓冲液(含20mM Caps和500mM NaCl的水溶液，pH10.5)重悬菌体，超声破碎细菌。破碎后，16000rpm，离心30min，取上清，进行饱和硫酸铵沉淀，于4℃环境中持续搅拌，向上清中逐滴加入饱和硫酸铵直至上清开始变浑浊，继续搅拌0.5h。搅拌结束后于16000rpm、4℃离心30min，离心后将沉淀用PBS重悬均匀，图5示出了按照上述方法纯化获得的重组抗原PCV-构建1的SDS-PAGE结果。

实施例7重组抗原PCV-构建3的制备

本实施例的制备方法与实施例6基本相同，区别仅在于，在步骤(1)基因合成和分子构建中，将抗原表位肽ER3、ER4的基因序列嵌入PCV2 Cap蛋白骨架(其中所述PCV2 Cap蛋白骨架如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列)的基因序列中，插入信息如下：PCV Cap S(Ser)169-T(Thr)170插入ER4、PCV Cap T(Thr)189-A(Ala)190插入ER3，并将获得的重组基因序列插入pET-24a载体NdeI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。

图5示出了按照上述方法纯化获得的重组抗原PCV-构建3的SDS-PAGE结果。

实施例8重组抗原PCV-构建4的制备

本实施例的制备方法与实施例6基本相同，区别仅在于，在步骤(1)基因合成和分子构建中，将抗原表位肽ER1、ER3、ER4的基因序列嵌入PCV2 Cap蛋白骨架(其中所述PCV2Cap蛋白骨架如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列)的基因序列中，插入信息如下：PCV Cap S(Ser)169-T(Thr)170插入ER4、PCV Cap T(Thr)189-A(Ala)190插入ER3、PCV Cap D(Asp)127-N(Asn)128插入ER1，并将获得的重组基因序列插入pET-24a载体NdeI和xhoI之间，获得重组质粒。以上均由南京金斯瑞公司进行上述基因的合成和质粒构建。

图5示出了按照上述方法纯化获得的重组抗原PCV-构建4的SDS-PAGE结果。

效果例免疫效果分析

使用灭活非洲猪瘟病毒免疫血清对抗原进行ELISA检测：

使用灭活非洲猪瘟病毒(含有p72蛋白)免疫小鼠(购自维通利华公司)，分离血清(分别编号1^#、2^#、3^#、4^#)用于对抗原的ELISA检测，Balb/c小鼠(六周龄)为未免疫小鼠血清对照，具体步骤如下：

将待检测抗原(HBCAG-ER2、HBCAG-ER4、PCV-构建1、PCV-构建3、PCV-构建4)分别稀释至2μg/ml,每孔加入100μl所述待检测抗原，于37℃包被过夜；第二天用PBST溶液洗板三次后，加入0.2％BSA按照200μl/孔室温(25℃)封闭1h；封闭结束用PBST溶液洗板三次；加入按照血清：PBS缓冲液＝1:1000(体积比)稀释的小鼠血清，100ul/孔室温反应1h；加入PBST溶液洗板3次；加入按照HRP-山羊抗小鼠二抗：PBS缓冲液＝1:10000(体积比)稀释的HRP-山羊抗小鼠二抗100μl/孔，室温反应1h；加入PBST溶液洗板5次；加入TMB显色液100μl/孔显色，显色后加入2M硫酸100μl/孔终止反应；读取450nm吸收值。

结果如图6、图7所示，HBCAG-ER2、HBCAG-ER4重组抗原以及PCV-构建1、PCV-构建3、PCV-构建4重组抗原均可与血清发生免疫反应，且免疫效果显著，说明本发明所述猪瘟抗原表位肽抗原表位丰度高，免疫效果优良。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院生物物理研究所

<120> 一种猪瘟抗原表位肽及其用途

<130> HA201903905-L

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 56

<212> PRT

<213> 人工合成（ER1）

<400> 1

Asp Ala Pro Ile Gln Gly Thr Ser Gln Met Gly Ala His Gly Gln Leu

1 5 10 15

Gln Thr Phe Pro Arg Asn Gly Tyr Asp Trp Asp Asn Gln Thr Pro Leu

20 25 30

Glu Gly Ala Val Tyr Thr Leu Val Asp Pro Phe Gly Arg Pro Ile Val

35 40 45

Pro Gly Thr Lys Asn Ala Tyr Arg

50 55

<210> 2

<211> 66

<212> PRT

<213> 人工合成（ER2）

<400> 2

Pro Leu Leu Cys Asn Ile His Asp Leu His Lys Pro His Gln Ser Lys

1 5 10 15

Pro Ile Leu Thr Asp Glu Asn Asp Thr Gln Arg Thr Cys Ser His Thr

20 25 30

Asn Pro Lys Phe Leu Ser Gln His Phe Pro Glu Asn Ser His Asn Ile

35 40 45

Gln Thr Ala Gly Lys Gln Asp Ile Thr Pro Ile Thr Asp Ala Thr Tyr

50 55 60

Leu Asp

65

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工合成（ER3）

<400> 3

Gly Leu Phe Val Arg Gln Ser Arg Phe Ile Ala Gly Arg Pro Ser Arg

1 5 10 15

Arg Asn Ile Arg Phe Lys Pro Trp Phe Ile Pro

20 25

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工合成（ER4）

<400> 4

Ala Ile Met Gln Pro Thr His His Ala Glu Ile Ser Phe Gln Asp Arg

1 5 10 15

Asp Thr Ala Leu Pro Asp Ala Cys Ser Ser Ile Ser Asp Ile Ser Pro

20 25 30

Val Thr

<210> 5

<211> 147

<212> PRT

<213> 人工合成（HBCAG）

<400> 5

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Arg

65 70 75 80

Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg

85 90 95

Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr

100 105 110

Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro

115 120 125

Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr

130 135 140

Thr Val Val

145

<210> 6

<211> 194

<212> PRT

<213> 人工合成（PCV2 cap）

<400> 6

Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Thr Ile Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr Pro Ser Trp Ala Val Asp Met

20 25 30

Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn

35 40 45

Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val

50 55 60

Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala

85 90 95

Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr

100 105 110

Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu

115 120 125

Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu

130 135 140

Trp Leu Arg Leu Gln Thr Ala Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly

145 150 155 160

Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val

165 170 175

Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu

180 185 190

Asn Pro

Claims (14)

1.一种猪瘟抗原表位肽，其特征在于，为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

2.一种重组抗原，其特征在于，含有权利要求1所述的一种猪瘟抗原表位肽与载体蛋白。

3.根据权利要求2所述的重组抗原，其特征在于，所述载体蛋白包括猪圆环病毒结构蛋白Cap、乙肝病毒核心抗原蛋白、人铁蛋白、三聚体蛋白1na0c3_3、三聚体蛋白5L6HC3_1或三聚体蛋白2L6HC3_12。

4.编码权利要求1所述的一种猪瘟抗原表位肽或权利要求2-3任一项所述的重组抗原的核苷酸序列。

5.一种表达载体，包括权利要求4所述的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒载体或病毒载体。

7.一种宿主，包括权利要求5-6任一项所述的表达载体。

8.根据权利要求7所述的宿主，其特征在于，所述宿主为原核细胞或真核细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌或枯草芽孢杆菌；所述真核细胞为哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞或昆虫细胞。

10.一种药物，其特征在于，包括权利要求1所述的一种猪瘟抗原表位肽、权利要求2-3任一项所述的重组抗原、权利要求4所述的核苷酸序列、权利要求5-6任一项所述的表达载体或权利要求7-9任一项所述的宿主。

11.根据权利要求10所述的药物，其特征在于，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

12.一种疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述的一种猪瘟抗原表位肽、权利要求2-3任一项所述的重组抗原、权利要求4所述的核苷酸序列、权利要求5-6任一项所述的表达载体或权利要求7-9任一项所述的宿主。

13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，还包括免疫学上可接受的载体和/或辅料。

14.权利要求1所述的一种猪瘟抗原表位肽、权利要求2-3任一项所述的重组抗原、权利要求4所述的核苷酸序列、权利要求5-6任一项所述的表达载体或权利要求7-9任一项所述的宿主的用途，其特征在于，包括：

a1.用于制备诊断、检测、预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的药物；

a2.用于制备诊断、检测、预防或治疗非洲猪瘟病毒感染的疫苗；

a3.用于制备针对所述非洲猪瘟病毒蛋白P72的抗体；

a4.制备用于非洲猪瘟病毒蛋白P72分离纯化的产品；或

a5.制备检测所述非洲猪瘟病毒蛋白P72的产品。

Images