CN112410239A

CN112410239A - 细菌膜囊泡及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN112410239A
Application number: CN201910777479.2A
Authority: CN
Inventors: 王震玲; 魏于全
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: CN112410239B

Abstract

本发明属于微生物学领域，涉及一种细菌膜囊泡及其制备方法与应用。本发明提供了一种从灭活细菌中分离的膜囊泡。所述灭活细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,以及基因工程菌。本发明还提供了分离和制备方法，以及作为疫苗的应用。本发明首次采用电离射线X射线辐照细菌，分离并纯化其分泌的MVs，制得的MVs可作为疫苗、疫苗佐剂、和药物载体。

Description

细菌膜囊泡及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种细菌膜囊泡的制备分离纯化以及该膜囊泡的应用。

背景技术

膜囊泡(MVs，membrane vesicles)是细菌细胞(包括革兰氏阳性菌和阴性菌)外膜分泌的囊泡状结构产物。多数为球形，直径大约20–250nm(Structures of gram-negativecell walls and their derived membrane vesicles/革兰氏阴性菌细胞壁结构及其分泌的膜囊泡)。细菌膜囊泡含有多种生物活性大分子如核酸、脂多糖、外膜蛋白等成分，以及金属离子、酶、信号分子等(Biological functions and biogenesis of secretedbacterial outer membrane vesicles/分泌的细胞外膜囊泡的生物学功能和生物学起源)。它在细菌的多种生命活动中扮演着重要角色，如分泌毒力因子、压力应激反应、营养摄取，及作为细菌间、细菌与宿主细胞间进行信息交流的载体等。

膜囊泡的分泌发生在细菌的任何生长阶段，不同于细胞裂解及凋亡，研究发现在压力刺激、缺氧、抗生素压迫等情况能够促进细菌产生膜囊泡。然而，自然生成的细菌膜囊泡产量低，往往需要培养大量的菌体才能收获一定量的膜囊泡，并且后续还需要额外的纯化工艺才能得到一定质量的膜囊泡。

现代工艺技术在生产制备及纯化细菌膜囊泡时存在以下问题：1)利用抗生素、去污剂、氧化剂等手段虽然能促进膜囊泡分泌，但也伴随着有毒残留问题，给其应用带来了不确定性。2)上述干预因素刺激细菌产生膜囊泡的效率也相对较低，且该制备工艺不能实现标准化生产。3)上述方法会使菌体本身的外膜抗原性、构象等可能发生变化，进而影响囊泡，限制其后续应用。

综上，本发明提供了一种分离细菌MVs的方法，和一种制备细菌MVs的方法。本发明采用国际领先的工艺技术，不添加化学刺激物质，因此无残留物引起不良作用，同时工艺流程简单、囊泡产量高，高效、放大效果好，可以用于囊泡的大量制备。制备的囊泡与正常囊泡相比内毒素含量较低且具有较好的免疫原性，后续进一步的开发应用前景广阔。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细菌膜囊泡。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

细菌分泌的生物颗粒，其特征在于，所述生物颗粒是从灭活细菌中分离的膜囊泡。

进一步，所述灭活细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和基因工程菌。

进一步，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、结核杆菌、破伤风杆菌、芽孢杆菌或棒状杆菌。

进一步，所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、变形杆菌、志贺菌。

进一步，所述灭活菌为厌氧菌。

进一步，所述厌氧菌包括幽门螺杆菌、反硝化细菌或核梭杆菌。

含有上述生物颗粒的灭活细菌。

进一步，所述灭活细菌与所述作用疫苗和/或疫苗佐剂和/或药物载体的生物颗粒组合。

本发明的目的还在于提供一种膜囊泡的分离方法。

一种从细菌中分离膜囊泡的方法，所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，具体包括以下步骤：

1)将细菌的菌液离心并收集上清液1，

2)将所述上清液1用高速离心机离心，并去沉淀收集上清液2；

3)将所述上清液2用超高速离心机离心，沉淀为膜囊泡。

进一步，所述步骤1)中，将所述上清液1用0.3-0.5μM滤器过滤去杂质。

优选的，将所述上清液1用045μM滤器过滤去杂质。

进一步，所述步骤1)中离心速率为100-10000g；离心时间为10-60min。

优选的，步骤1)的离心的速率为400-8000g；离心时间为10-30min。

进一步，所述步骤2)中的高速离心速率为5000-25000g；离心时间为10-100min。

优选的，步骤2)中的高速离心速率为10000-20000g；离心时间为30-60min。

进一步，所述步骤3)中的所述超高速离心速率为10000-20000g；离心时间为30-60min。

优选的，步骤3)中的超高速离心速率为15000-150000g；离心时间为60-180min。

进一步，所述细菌为灭活细菌。

采用上述方法所得的膜囊泡。

本发明的目的还在于提供一种制备方法。

一种制备生物颗粒的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)膜囊泡增量

培养细菌至对数生长期，发酵，使菌体进一步富集；收集菌体，将所述菌体重悬后用电离射线辐照处理，得辐照细菌；

2)分离纯化

用上述分离膜囊泡的方法进行分离，得膜囊泡。

进一步，所述电离射线辐照处理的方式为X-ray射线，辐照剂量为100-2000Gy。所述辐照剂量具体包括：100-200Gy，200-300Gy，300-400Gy，400-500Gy，500-600Gy，600-700Gy，700-800Gy，800-900Gy，900-1000Gy，1000-1100Gy，1100-1200Gy，1200-1300Gy，1300-1400Gy，1400-1500Gy，1500-1600Gy，1600-1700Gy，1700-1800Gy，1800-1900Gy，1900-2000Gy。

优选的，所述辐照剂量为500-1000Gy。所述辐照剂量具体包括：500-600Gy，600-700Gy，700-800Gy，800-900Gy，900-1000Gy。

进一步，所述步骤1)中所述对数生长期的细菌的OD₆₀₀值为0.3-0.8。

优选的，所述步骤1)中所述对数生长期的细菌的OD₆₀₀值为0.5-0.7。

进一步，所述步骤1)中用磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水重悬所述菌体。

优选的，所述步骤1)中用磷酸盐缓冲液重悬所述菌体。

进一步，所述步骤1)中将所述菌体重悬至OD₆₀₀值为20-80。

优选的，所述步骤1)中将所述菌体重悬至OD₆₀₀值为40-60。

采用上述方法所得的膜囊泡。

上述方法制得的膜囊泡，同未经电离射线辐照的细菌相比，所述膜囊泡中核酸的含量和蛋白质的含量提升了10-20倍。

本发明的目的还在于提供膜囊泡及灭活菌的应用。

上述膜囊泡作为免疫原中的应用，所述膜囊泡包含权利要求18、27或28所述的膜囊泡，以下简称本发明制得的膜囊泡。

发明制得的膜囊泡的膜囊泡作为治疗细菌感染疾病的疫苗中的应用。

进一步，所述细菌感染疾病包括肺炎、泌尿道感染、脑膜炎、败血症，或皮肤、软组织感染。

发明制得的膜囊泡作为疫苗佐剂中的应用。

进一步，所述疫苗佐剂为非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答。

发明制得的膜囊泡作为抗原递呈细胞功能促进剂中的应用。

进一步，抗原递呈细胞树突状细胞，巨噬细胞，及B细胞。

经过辐射再分离纯化得到的膜囊泡作为DC细胞成熟的促进剂中的应用。

进一步，所述的膜囊泡作为促进骨髓来源树突状细胞细表面分子CD80、CD86及MHCII分子显著上调的促进剂中的应用。

本发明制得的膜囊泡作为DC细胞抗原递呈能力促进剂中的应用。

本发明制得的膜囊泡联合DC细胞在制备CD+T细胞的增殖剂中的应用。

提升CD+T细胞增殖的方法，将辐照处理制备的膜囊泡刺激并吞噬OVA抗原的DCs与CFSE标记的CD4+T淋巴细胞在体外共培养。

发明制得的膜囊泡在制备兽药中的应用。

本发明所述的灭活细菌作为细菌疫苗的应用。

有益效果：

本发明首次采用电离射线X射线辐照细菌分离并纯化其分泌的MVs，工艺技术国际领先。不添加抗生素及其他化学刺激物质，因此避免了刺激物残留及刺激物本身对膜囊泡导致的不良作用。同时工艺流程简单、适合工业放大化、标准化生产；囊泡产量高，高效、放大效果及纯化效果好，可以用于囊泡的大量制备。制备的囊泡与正常囊泡相比，产量提高数十倍具有较好的免疫原性。优化生产后得到的细菌膜囊泡后续进一步的开发应用前景广阔。此外，本发明制备的细菌膜囊泡可直接作为疫苗使用。

附图说明

图1铜绿假单胞菌膜囊泡透射电镜图(A：对照组膜囊泡；B：辐照组膜囊泡；比例尺：200nm)。

图2铜绿假单胞菌膜囊泡内容物含量测定图。

图3铜绿假单胞菌膜囊泡粒径分布图。

图4金黄色葡萄球菌膜囊泡内容物含量测定图。

图5辐照处理的膜囊泡促进骨髓来源树突状细胞细表面分子CD80、CD86及MHCII分子显著上调。

图6辐照处理的膜囊泡刺激后的DC细胞对抗原吞噬能力的柱状图。

图7CD4+ T细胞在与不同处理方式后的DC发生作用后的增殖百分比。

图8CD4+ T细胞在与不同处理方式后的DC发生作用后的增殖流式图。

图9辐照处理的膜囊泡增强DC细胞与T细胞相互作用(GC：growth control，树突状细胞生长对照组(未刺激组)；Cell+MVs(全菌体+囊泡处理组)；MVs(囊泡处理组))。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明提供了一种分离制备细菌膜囊泡的方法，所述方法包括如下步骤：

1)培养细菌至对数生长期，对数生长期的细菌的OD₆₀₀值为0.3-0.8；最好是选择OD₆₀₀值为0.5-0.8；发酵，使菌体进一步富集；收集菌体，将所述菌体用适量的磷酸盐缓冲液重悬，所加磷酸盐缓冲液的量与菌体总量的比例为每1ml溶液含有的菌量为OD₆₀₀值20-80；最好是选择OD₆₀₀值为40-60；重悬后用电离射线辐照处理，得辐照细菌；最好用X-ray射线辐照处理，辐照剂量为100-2000Gy，具体包括：100-200Gy，200-300Gy，300-400Gy，400-500Gy，500-600Gy，600-700Gy，700-800Gy，800-900Gy，900-1000Gy，1000-1100Gy，1100-1200Gy，1200-1300Gy，1300-1400Gy，1400-1500Gy，1500-1600Gy，1600-1700Gy，1700-1800Gy，1800-1900Gy，1900-2000Gy。

2)收集菌液，菌液离心并收集上清液，上清液用03-0.5μM滤器过滤除菌；400-8000g；离心时间为10-30min；

3)将过滤后的上清液用高速离心机离心，收集上清液，去除鞭毛；高速离心速率为10000-20000gg；离心时间为30-60min；

4)将去除鞭毛后的上清液用超高速离心机离心，沉淀膜囊泡；超高速离心速率为15000-150000g；离心时间为60-180min；

5)收集膜囊泡，得纯化后的膜囊泡。

实施例2

电离射线辐照铜绿假单胞杆菌PAO1制备、分离纯化膜囊泡

1)从-80℃复苏铜绿假单胞菌PAO1划线至LB平板，37℃培养箱培养16～18h；

2)从LB平板上挑取单克隆菌落接种于20mL LB液体培养基中，37℃，250rpm恒温培养16～18h；

3)取过夜菌液接种至1L LB培养基中，至起始浓度为0.05OD₆₀₀/mL，37℃，250rpm培养至对数生长期，测OD₆₀₀值；

4)将上述3)的菌液转移至离心桶中，5,000g离心20min，收集菌体用生理盐水重悬，调整菌体浓度为50OD左右；

5)取上述菌液置于辐照仪中，辐照剂量为1000Gy；

6)将辐照后的菌液8,000×g，20min，离心两次，收集上清液；上清液用0.45μM滤器过滤除菌再次收集得到的上清，同时取少量上清液涂在LB平板上，37℃培养24-72h，以确认无活菌存在；

7)将步骤6)上清液高速离心机离心，除去上清液中的鞭毛；

8)将步骤7)上清液超高速离心机离心，沉淀膜囊泡；

9)弃去上清，沉淀用MV buffer重悬，-80℃保存；

10)将提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡进行透射电镜观察。同时测定提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡的内容物含量，包括测定其DNA含量、RNA含量和蛋白质含量。最后再测量提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡粒径大小。

实验结果：

由电镜结果可知，电离射线能够刺激绿脓杆菌PAO1分泌膜囊泡，实验组膜囊泡数量更多；囊泡形态大小与正常对照组无明显差异。见图1。

内容物含量测定结果：实验组制备的膜囊泡的核酸含量和蛋白质含量与正常对照组相比提高10～20倍。见图2。具体测量数据见表1。

表1膜囊泡内容物含量测定

粒径分布图数据显示，正常对照组和实验组制备的膜囊泡大小上无明显差别，平均在150nm左右。见图3；具体测量数据见表2。

表2粒径

辐照剂量Gy	平均粒径(nm)	Peak(nm)
			-	152.2	192.6
980	146.5	222.9

实施例3

电离射线辐照金黄色葡萄球菌ATCC 25923制备膜囊泡

1)从-80℃复苏金黄色葡萄球菌ATCC 25923划线至LB平板，37℃培养箱培养16～18h；

2)从LB平板上挑取单克隆菌落接种于100mL LB液体培养基中，37℃，250rpm恒温培养16～18h；

3)取过夜菌液接种至2L LB培养基中，至起始浓度为0.05OD₆₀₀/mL，37℃，250rpm培养至对数生长期，测OD₆₀₀值；

4)将上述3)菌液转移至2L离心桶中，5,000g离心20min，收集菌体用生理盐水重悬，调整菌体浓度为50OD左右，取100μL稀释10⁷涂板计算活菌数；

5)取上述菌液置于辐照仪中，辐照剂量为1000Gy；

7)将步骤6)上清液超高速离心机离心，39,000×g，90min，沉淀MVs；

8)弃去上清，沉淀用2mL MV buffer重悬，-80℃保存；

9)测定提取的正常组膜囊泡和本发明实验组膜囊泡的内容物含量，包括测定其DNA含量、RNA含量和蛋白质含量。

实验结果：

经测定结果表明，对于金黄色葡萄球菌ATCC27853，实验组制备的膜囊泡的核酸含量和蛋白质含量明显提高，表明，电离射线辐照革兰氏阳性菌也能刺激膜囊泡的产生。见图4。

实施例4

辐照处理的细菌膜囊泡的免疫调节作用-促进树突状细胞成熟

树突状细胞(Dentitic Cells,DCs)是机体的主要的抗原递呈细胞，其主要功能是吞噬、处理加工抗原分子，并递呈给T细胞。是已知体内功能最强、唯一能活化静息T细胞的专职抗原提呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。树突状细胞的成熟状况决定机体产生免疫应答或免疫耐受。DCs表面的共刺激分子B7(B7-1＝CD80和B7-2＝CD86)可以和T细胞表面的CD28或CD152分子结合，加强或者减弱DCs与T细胞之间MHC-TCR的信号传导。在成熟的DCs上主要表现为表明共刺激分子CD80、CD86表达变化，吞噬抗原能力减弱而处理递呈抗原能力增强(MHCII分子表达增高)，以及与T淋巴细胞的相互作用等。

1)小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)细胞诱导培养

取6-8周C57雌性小鼠，无菌分离小鼠股骨，将股骨上的肌肉剔干净后剪开股骨两端，PBS冲洗骨管腔直至发白，将PBS悬液过滤后1200rpm离5min，去上清，加入5ml红细胞裂解液重悬细胞。静置15min后1200rpm离心5min，去上清，加入50ml 1640完全培养基(20ng/ml GM-CSF、10％FBS、50mM 2-巯基乙醇)重悬细胞。混匀后分至5个培养皿中置培养箱中培养，，每2天换液，第7天收集细胞。

2)BMDC刺激

取诱导7天的BMDC细胞，6孔板中反复吹打使贴壁细胞脱落，收集细胞悬液，1100rpm离心5min，去上清，加入1ml培养基重悬细胞、活细胞计数，调整细胞浓度至1×10⁶/ml，接种2ml至新的6孔板。加入各刺激物并混匀，分别为：全菌，全菌+囊泡及囊泡，使得终浓度为15μg/mL(以蛋白质为标准)，继续培养24小时，生长对照组加入等体积的PBS。

3)流式检测成熟marker

24h后取出6孔板，反复吹打细胞使其脱落，收集细胞悬液至流式管，1500rpm离心3min，去上清，加入1ml PBS继续1500rpm离心3min后去上清，反复清洗3遍。加入CD11c/CD80/CD86/MHCII抗体室温避光孵育30min，同时阴性对照组应设立一个同型对照组加入CD11c/CD80/CD86/MHCII的同行对照。孵育完成后加入PBS清洗2遍后加入200μl PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测。

4)结果处理

流式细胞仪软件分析CD11c细胞中CD80/CD86/MHCII比例。

实验结果：

与全菌体相比，X射线处理的实验组(MVs)囊泡能使刺激后DCs表面共刺激分子CD80、CD86和MHCII等显著上调，而这些表面分子是树突状细胞成熟的标志。综上证明囊泡能显著促进DCs的分化和成熟。见图5。

实施例5

通过检测FITC标记的葡聚糖荧光强度来检测DC细胞的吞噬能力

DC细胞具有极强的抗原内吞和加工处理能力。在未接触到抗原物质时处于非成熟状态，其吞噬能力强，在接触到抗原激活后变为成熟，其吞噬能力变弱，抗原提呈能力增强，本实验通过检测FITC标记的葡聚糖荧光强度来确定DC的吞噬葡聚糖的多少从而检测DC的吞噬能力是否增强。

1)BMDC细胞诱导培养

2)刺激

第7天收集细胞，将细胞全部吹下后离心重悬计数，然后接种到6孔板，每孔接种1×10⁶个细胞，再分别加入刺激物，GC组加入等体积的PBS，Control组及Treatment组加入相同浓度的膜囊泡(按蛋白质水平)后37℃培养24h。

3)吞噬与检测

加入葡聚糖(5μg/ml)，继续培养1h后，吸出细胞到流式管，PBS洗涤3次后加入CD11c抗体室温避光孵育30min，PBS清洗3次后流式检测FITC荧光。

4)结果处理

流式细胞仪软件分析CD11c细胞中FITC比例。

实验数据：

为了检测DCs的吞噬功能，我们采用FITC-葡聚糖作为模式抗原供DCs吞噬，检测CD11c+DCs的FITC平均荧光强度值。实验结果，GC组树突状细胞(生长对照组)基本没有FITC-葡聚糖摄入，但是无论是DCs接受刺激后，FITC平均荧光强度值相比于GC组明显降低。这个实验结果再次证明囊泡能够促进DCs成熟，从而降低对抗原的摄取能力。见图6。

实施例6

X射线处理组细菌膜囊泡刺激后的成熟DC与T细胞相互作用：

A、成熟DC与CD4+T细胞相互作用

DCs对胞外蛋白有效的交叉抗原递呈在诱导特异性细胞免疫反应中具有重要作用。因此检测囊泡刺激后DCs对OVA抗原的交叉递呈作用。在DCs-T细胞共培养后的72h，我们通过CFSE流式细胞术来检测OT-II CD4+T淋巴细胞的增殖情况。荧光染料CFSE(CFDA-SE)，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂。它进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的一半。因此我们可以利用流式细胞术对CFSE荧光较弱的细胞百分比进行统计，从而得到增殖细胞的比例。

1、BMDC细胞诱导培养

与成熟实验相同。

2、抗原吞噬

将培养7天的DCs在含10μg/ml OVA培养基中培养24h作为GC(growth control，生长对照组)，MVs组别另外加入囊泡，接下来离心收集吞噬过抗原的DCs并重悬在正常培养基中，以2×10⁴细胞/孔的密度铺板于96孔板中，每孔100μl，每组3个复孔。

3、T细胞提取

在第二天，OT-II小鼠脾脏OVA特异性的CD4+T淋巴细胞使用Stem CellTechnologies公司的阴性磁珠筛选试剂盒分离富集。

4、DC与T细胞共培养

对分选出的CD4+T细胞按照试剂盒说明书使用1μM CFSE进行标记。标记后用PBS洗涤3次，以10⁵细胞/孔的密度加入到96孔板中，使其培养终体积为200μl(CD4:DC＝5:1)。

5、在共培养后的第3天，利用流式细胞术通过CFSE递减来检测CD4+T细胞群的增殖情况。

将囊泡刺激并吞噬OVA抗原的DCs与CFSE标记的OT-II小鼠CD4+T淋巴细胞在体外共培养。流式分析CFSE荧光强度结果表明，增殖CD4+T细胞的比例增加。如图所示，囊泡(14.05％)能显著增加吞噬OVA抗原的DCs(6.80％)对于特异性CD4+T细胞的促进增殖作用。详见图7、图8。

B、囊泡处理后的DC促进T细胞增殖

DCs对胞外蛋白有效的交叉抗原递呈在诱导特异性细胞免疫反应中具有重要作用。因此检测囊泡刺激后DCs对OVA抗原的交叉递呈作用。在DCs-T细胞共培养后的72h，我们通过CFSE流式细胞术来检测T淋巴细胞的增殖情况。荧光染料CFSE(CFDA-SE)，即羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂，是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂。它进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，其荧光强度是亲代细胞的一半。因此我们可以利用流式细胞术对CFSE荧光较弱的细胞百分比进行统计，从而得到增殖细胞的比例。

1、BMDC细胞诱导培养

与成熟实验相同。

2、抗原吞噬

将培养7天的DCs在培养基中培养24h作为GC(growth control，生长对照组)，MVs组别另外加入囊泡，接下来离心收集吞噬过抗原的DCs并重悬在正常培养基中，以4×10⁴细胞/孔的密度铺板于96孔板中，每孔100μl，每组3个复孔。

3、T细胞提取

在第二天，使用MVs免疫一次后一周的小鼠脾脏Stem Cell Technologies公司的阴性磁珠筛选试剂盒分离富集小鼠的T细胞。

4、DC与T细胞共培养

对分选出的T细胞按照试剂盒说明书使用1μM CFSE进行标记。标记后用PBS洗涤3次，以4×10⁵细胞/孔的密度加入到96孔板中，使其培养终体积为200μl(CD3:DC＝10:1)。

5、在共培养后的第3天，利用流式细胞术通过CFSE递减来检测CD3+，CD8+，CD4+T细胞群的增殖情况。

实验结果：

将囊泡刺激并吞噬OVA抗原的DCs与CFSE标记的OT-II小鼠CD4+T淋巴细胞在体外共培养。流式分析CFSE荧光强度结果表明，增殖CD4+T细胞的比例增加。如图所示，菌体加囊泡刺激组荧光强度为63.5％，囊泡刺激组为71％。说明，囊泡处理后DCs，能显著刺激CD4+T细胞的增殖。见图9。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.细菌分泌的生物颗粒，其特征在于，所述生物颗粒是从灭活细菌中分离的膜囊泡。

2.根据权利要求1所述的生物颗粒，其特征在于，所述灭活细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的生物颗粒，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、结核杆菌、破伤风杆菌、芽孢杆菌或棒状杆菌。

4.根据权利要求2所述的生物颗粒，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、变形杆菌、志贺菌。

5.根据权利要求1所述的生物颗粒，其特征在于，所述灭活细菌为厌氧菌。

6.含有权利要求1所述的生物颗粒的灭活细菌。

7.根据权利要求6所述的灭活细菌，其特征在于，所述灭活细菌与所述作为疫苗和/或疫苗佐剂和/或药物载体的生物颗粒组合。

8.从细菌中分离膜囊泡的方法，所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)将细菌的菌液离心并收集上清液1，

2)将所述上清液1用高速离心机离心，并去沉淀收集上清液2；

3)将所述上清液2用超高速离心机离心，沉淀为膜囊泡。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，将所述上清液1用0.3-0.5μM滤器过滤去杂质。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中离心速率为100-10000g；离心时间为10-60min。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的所述高速离心速率为5000-25000g；离心时间为10-100min。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中高速离心速率为10000-20000g；离心时间为30-60min。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的所述超高速离心速率为5000-150000g；离心时间为60-600min。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中所述的超高速离心速率为15000-150000g；离心时间为60-180min。

15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、结核杆菌、破伤风杆菌、芽孢杆菌或棒状杆菌。

16.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、变形杆菌、志贺菌。

17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细菌为灭活细菌。

18.权利要求8-17任一方法所得的膜囊泡。

19.制备权利要求1所述的生物颗粒的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)膜囊泡增量

2)分离纯化

用权利要求8-17所述的方法进行分离，得膜囊泡。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述电离射线辐照处理的方式为X-ray射线，辐照剂量为100-2000Gy。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述辐照剂量为500-1000Gy。

22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述对数生长期的细菌的OD₆₀₀值为0.3-0.8。

23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中所述对数生长期的细菌的OD₆₀₀值为0.5-0.7。

24.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中用磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水重悬所述菌体。

25.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中将所述菌体重悬至OD₆₀₀值为20-80。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中将所述菌体重悬至OD₆₀₀值为40-60。

27.权利要求19-26任一所述的方法所得的膜囊泡。

28.根据权利要求27所述的膜囊泡，其特征在于，同未经电离射线辐照的细菌相比，所述膜囊泡中核酸的含量和蛋白质的含量提升了10-20倍。

29.权利要求18、27或28所述的膜囊泡作为免疫原中的应用。

30.权利要求18、27或28所述的膜囊泡作为治疗细菌感染疾病的疫苗中的应用。

31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，所述细菌感染疾病包括肺炎、泌尿道感染、脑膜炎、败血症，或皮肤、软组织感染。

32.权利要求18、27或28所述的膜囊泡作为疫苗佐剂中的应用。

33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，所述疫苗佐剂为非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答。

34.权利要求18、27或28所述的膜囊泡作为抗原递呈细胞功能促进剂中的应用。

35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，抗原递呈细胞包括树突状细胞，巨噬细胞，及B细胞。

36.权利要求27所述的膜囊泡作为DC细胞成熟的促进剂中的应用。

37.根据权利要求36所述的应用，其特征在于，所述的膜囊泡作为促进骨髓来源树突状细胞细表面分子CD80、CD86及MHCII分子显著上调的促进剂中的应用。

38.权利要求18、27或28所述的膜囊泡作为DC细胞抗原递呈能力促进剂中的应用。

39.权利要求18、27或28所述的膜囊泡联合DC细胞在制备CD+T细胞的增殖剂中的应用。

40.提升CD+T细胞增殖的方法，其特征在于，将权利要求27所述的膜囊泡刺激并吞噬OVA抗原的DCs与CFSE标记的CD4+T淋巴细胞在体外共培养。

41.权利要求18、27或28所述的膜囊泡在制备兽药中的应用。

42.权利要求6或7所述的灭活细菌作为细菌疫苗的应用。