CN105420161A - 一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法及其疫苗 - Google Patents

一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法及其疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法及其疫苗，属生物技术领域。体外以铁离子限制的培养基培养猪胸膜肺炎放线杆菌shope菌株，经离心、0.22μm过滤处理后获取无细胞培养上清，继而超速离心制备出细菌释放的外膜囊泡，经过透射电镜观察可见大部分外膜囊泡直径50nm~100nm之间，以外膜囊泡作为亚单位疫苗二次鼻内免疫小鼠，外膜囊泡免疫小鼠长期增重及肺脏眼观形态与PBS免疫组无显著差异。同时实验表明外膜囊泡是一种高效免疫刺激物，不仅能够刺激小鼠血清产生高水平的IgG，而且在小鼠肺脏中产生高水平的IgA，有效的刺激了小鼠肺脏的黏膜免疫，显现出外膜囊泡作为亚单位疫苗较好的应用前景。

Description

一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法及其疫苗
技术领域
本发明涉及一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法及其疫苗，具体是猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株于铁离子限制条件下进行体外培养，制备细菌释放的外膜囊泡，以此为亚单位疫苗，评估该疫苗对小鼠的免疫刺激效果，属生物技术领域。
背景技术
猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus(A.)pleuropneumoniae)是一种革兰氏阴性菌，能够引起猪发生肺炎，急性感染猪临床表现严重的呼吸困难、肺部出血和纤维性胸膜炎，病死率高，慢性耐过猪生长迟缓，往往成为隐性病原携带者，该病被公认为危害现代养猪业的重要传染病之一。A.pleuropneumoniae主要侵袭呼吸道，而正常呼吸道重要的防御免疫球蛋白为分泌型IgA，多聚体IgA可以中和粘液中细菌，阻止细菌与黏膜表面粘附，起到免疫清除，因此增强机体黏膜免疫反应的免疫策略可提高免疫保护效果。目前国内外可获得针对A.pleuropneumoniae的疫苗包括全菌灭活疫苗和Apx毒素、蛋白质组合的亚单位疫苗，而大多数灭活全菌疫苗采用肌肉注射，不能够诱发黏膜免疫，此外全菌灭活疫苗仅提供血清型特异性的免疫保护，对于不同血清型A.pleuropneumoniae菌株无交叉保护效果，使得灭活疫苗的应用存在一定的限制。自然感染或实验感染一种血清型A.pleuropneumoniae的猪能够产生针对异源菌株攻击的保护力，提示在感染发生时存在具备交叉保护力的抗原物质，而这种物质可能较少或不存在于灭活疫苗中。敲除A.pleuropneumoniae的部分毒力相关基因，可人为获得毒力致弱菌株，以此作为减毒活疫苗免疫动物可产生较好的交叉免疫保护效果，但是考虑安全性问题，该类疫苗尚未进行大范围的推广应用。相比较灭活疫苗和减毒活疫苗，亚单位疫苗具有更好的安全性，但由于亚单位疫苗仅含有一种或某几种抗原物，单独免疫动物时往往不能在体内诱发较高水平的免疫反应，因此需要通过配合佐剂、偶联多糖或抗原控释等方式来改善亚单位疫苗的免疫原性。通过抗原控释技术处理，获得整合有抗原物的极微小颗粒物，可以较好地刺激机体免疫系统，显现出诱人的应用前景，但该技术需要对抗原进行纯化及包埋，大大增加了产品成本，阻碍了该技术在畜禽疫苗制剂上的应用。
革兰氏阴性菌体外培养时能够将一种膜结合小囊泡释放到培养液中，被称为外膜囊泡(Outmembranevesicles，OMVs)，OMVs大小20nm到250nm不等，其组成成份包含毒素、酶、黏附素、DNA、部分外膜蛋白和胞质成份，尽管目前对于OMVs生物合成的途径还不清楚，但是OMVs能够刺激免疫系统，并且具有类似于控释技术处理的抗原效果，许多病原菌研究中均将其列为疫苗候选物进行评估，其中以脑膜炎奈瑟球菌OMVs进行疫苗研制最为成功。另外，病原菌进入机体后，将会受到新环境的信号刺激，产生一系列的毒力因子，这些信号中包括宿主体内低水平的铁离子浓度，许多病原菌中毒力因子的表达受离子的调节，包括毒素、黏附素、侵袭因子、外膜蛋白。OMVs的形成同样会受到环境因素的影响，研究发现EDTA螯合培养基中细菌生长所需的离子物质后，刺激了恶臭假单胞菌的OMVs的释放。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种猪胸膜肺炎纳米亚单位疫苗的制备，具体是猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株于铁离子限制条件下进行体外培养，制备细菌释放的外膜囊泡，以此为亚单位疫苗，评估该疫苗对小鼠的免疫刺激效果。
技术方案
一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其主要特征在于依次包括如下步骤：
a.体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌至细菌对数期早期，在培养基中添加铁离子螯合剂后继续培养细菌，通过离心、过滤获取无细胞培养上清；
b.对无细胞培养上清进行超速离心处理，制得猪胸膜肺炎放线杆菌释放的外膜囊泡。
所述体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌方法为，将shope菌株的冻干菌种划线接种于含NAD的THB固体培养基，5％～10％CO2条件下，37℃培养16h～18h，接种固体培养基上5～8个单菌落至6mL含NAD的THB液体培养基，37℃振荡培养6h～8h；含NAD的THB固体培养基为：每1000mLTHB加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌15分钟，待培养基温度至50℃时，添加NAD至0.01％(v/w)，适量倾入平皿中凝固；含NAD的THB液体培养基为：称取30gTHB，溶解于1000mL去离子水，121℃高压灭菌15分钟，待培养基恢复至室温，添加NAD至0.01％(v/w)；
随后将培养物以体积比1％比例接种400mL含NAD的THB液体培养基，继续37℃振荡培养，待细菌培养至对数生长早期OD600nm为0.1～0.2时，在培养基中添加终浓度150μM二乙烯三胺五乙酸钙三钠盐水合物，形成铁离子限制环境，继续37℃振荡培养14h～16h。
所述细菌外膜囊泡的制备方法为：
收集体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌培养物，4℃10000g离心15min，弃去沉淀，0.22μm过滤上清，获得无细胞上清物；
4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀以适量PBS缓冲液重悬；PBS缓冲液为：8mMNa2HPO4·12H2O、1.5mMKH2PO4、2.7mMKCl、136.7mMNaCl，pH7.4，121℃高压灭菌15分钟；
同上再次4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀重悬于3mLPBS缓冲液，即为制备的细菌外膜囊泡。
所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡可以在制备猪胸膜肺炎纳米亚单位疫苗中得到应用。所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡也可用作免疫刺激物。
有益效果
细菌外膜囊泡大小20nm到250nm，其中包含多种抗原物质，可以刺激机体的免疫系统，同时具备类似于控释技术处理抗原效果，本发明制备了猪胸膜肺炎放线杆菌释放的外膜囊泡，电镜显示多数囊泡颗粒物直径介于50nm至100nm之间，同时外膜囊泡内含有多种抗原物质，可视为一种纳米亚单位疫苗，实验评估了该疫苗对小鼠的免疫刺激效果。
猪胸膜肺炎放线杆菌减毒活疫苗具有较好的免疫保护效果，提示在感染发生时存在具备交叉保护力的抗原物质。由此本发明以铁离子限制的培养条件，模拟出细菌进入宿主后面临的低铁环境，对猪胸膜肺炎放线杆菌进行体外培养，制备该条件下猪胸膜肺炎放线杆菌释放的外膜囊泡，更加贴近活菌感染宿主时外膜囊泡的表达情况。
本发明试验结果显示，初次免疫后21d、42d，OMV免疫小鼠血清中IgG抗体反应OD均值分别为0.489±0.094、1.442±0.205，显著高于同时期PBS免疫组0.056±0.003、0.065±0.003；初次免疫后42d，OMV免疫小鼠血清中IgA抗体反应OD均值分别为0.348±0.056，显著高于同时期PBS免疫组0.107±0.02(图3)；初次免疫后42d，OMV免疫小鼠肺泡盥洗液中IgG及IgA抗体反应OD均值分别为1.079±0.323、1.575±0.135，显著高于同时期PBS免疫组0.049±0.006、0.069±0.003(图4)，确定了OMV是一种高效免疫刺激物，不仅能够刺激小鼠血清产生高水平的IgG，而且在小鼠肺脏中产生高水平的IgA，有效的刺激了肺脏的黏膜免疫系统，显现出外膜囊泡作为亚单位疫苗较好的应用前景。
附图说明
图1外膜囊泡的透射电镜观察
图2免疫小鼠体重变化
*表示两组间体重具有显著性差异
图3小鼠血清OMV抗体检测
***、**表示两组间抗体具有极显著性差异
图4小鼠肺泡盥洗液OMV抗体检测
*表示两组间抗体具有显著性差异；***表示两组间抗体具有极显著性差异
具体实施方式
本发明提供一种猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型菌株铁离子限制培养条件下，外膜囊泡制备的方法，并以此外膜囊泡作为亚单位疫苗，分析该疫苗对小鼠免疫系统的刺激效果。
材料：
猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型shope菌株(彭小华，猪胸膜肺炎放线杆菌快速检测技术的研究，硕士学位论文2005，p27)，该菌购自中国兽医药品监察所。
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购自南京生兴生物技术有限公司。
二乙烯三胺五乙酸钙三钠盐水合物购自Sigma公司。
BactoTMToddHewittBroth(THB)培养基购自BD公司。
THB(含NAD)液体培养基：称取30gTHB，溶解于1000mL去离子水，121℃高压灭菌15分钟，待培养基恢复至室温，添加NAD至0.01％(v/w)。
THB(含NAD)固体培养基：每1000mLTHB加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌15分钟，待培养基温度至50℃时，添加NAD至0.01％(v/w)，适量倾入平皿中凝固。
PBS缓冲液：8mMNa2HPO4·12H2O、1.5mMKH2PO4、2.7mMKCl、136.7mMNaCl，pH7.4，121℃高压灭菌15分钟。
PBST缓冲液：PBS缓冲液添加0.05％(v/v)Tween20。
包被液：碳酸盐缓冲液(100mMNaHCO3,46mMNa2CO3[pH9.6])。
封闭液：1％(w/v)明胶溶液，溶剂为PBST缓冲液。
HRP标记羊抗鼠IgG二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(H+L)二抗，购于南京诺维赞生物科技有限公司。
HRP标记羊抗鼠IgA二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgA二抗，购自Abcam公司。
TMB显色液：单组份TMB显色液，购自湖州英创生物科技有限公司。
RCDCproteinassay：蛋白定量试剂盒，购自Bio-Rad公司。
1.生产抗原用菌株的培养将shope菌株的冻干菌种划线接种于THB(含NAD)固体培养基，5％～10％CO2条件下，37℃培养16h～18h，接种固体培养基上5～8个单菌落至6mLTHB(含NAD)液体培养基，37℃振荡培养6h～8h，随后将培养物以1％比例接种400mLTHB(含NAD)液体培养基，继续37℃振荡培养，待细菌培养至对数生长早期(OD600nm为0.1～0.2)时，在培养基中添加终浓度150μM二乙烯三胺五乙酸钙三钠盐水合物，形成铁离子限制环境，继续37℃振荡培养约14h～16h。
2.细菌外膜囊泡的制备收集培养物，4℃10000g离心15min，弃去沉淀，0.22μm过滤上清，获得无细胞上清物，4℃150000g超速离心3h(Ti45型转头，Beckman离心机)，弃去上清，沉淀以适量PBS缓冲液重悬，同上再次4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀重悬于3mLPBS缓冲液，即为制备的细菌外膜囊泡。
3.细菌外膜囊泡蛋白浓度测定及形态观察参照RCDCproteinassay试剂盒说明书，测定外膜囊泡中蛋白浓度为0.035mg/mL，适量外膜囊泡以乙酸双氧铀负染后，透射电镜(JEOL-1010，日本电子株式会社)观察外膜囊泡形态，可见多数囊泡颗粒物直径介于50nm至100nm之间(图1)。
本发明制备抗原诱发小鼠免疫效果评估：
1.外膜囊泡小鼠免疫实验购买5周龄清洁级雌性BALB/c小鼠20只，随机分为2组，每组10只，其中1组鼻内接种20μLPBS缓冲液，另1组鼻内接种20μL制备的外膜囊泡，首次免疫后21d，同法再进行一次加强免疫。首次免疫后21d、42d，随机采集各组5只小鼠的血液；另外于首次免疫后42d，每组随机各选3只小鼠，无菌分离小鼠肺脏，通过气管将1mLPBS缓冲液注入肺脏中，令肺脏充盈，制备肺泡盥洗液。
2.安全评价小鼠免疫后42d内，每周监测小鼠的体重，将两个免疫组间进行非匹配双尾t检验，结果显示初次免疫后7d及二次免疫后7d，外膜囊泡免疫组小鼠的平均体重分别为17.67±1.026g、19.42±0.869g，显著低于同时期PBS免疫组18.63±0.410g、20.48±0.939g，其它时间点两个免疫组之间体重无显著差异(图2)，说明外膜囊泡仅于免疫后较短时间内影响小鼠的增长，后期小鼠的体重能够恢复正常水平。另外首次免疫后42d，每组随机各选5只小鼠，解剖观察肺脏，眼观两组肺脏间无显著差异。
3.外膜囊泡诱发小鼠抗体产生水平评价采集的小鼠血液37℃静置1h后，4℃静置过夜，4℃2000g离心10min，收集上清制备小鼠血清；制备的肺泡盥洗液于4℃2000g离心10min，弃去细胞碎片，收集上清。外膜囊泡作为抗原包被酶标板，测定小鼠血清及肺泡盥洗液中针对外膜囊泡的IgG抗体及IgA抗体水平，步骤如下：
a包被液100倍被稀释外膜囊泡后，100μL/孔加入酶标板中，4℃作用16h～18h；
b倾去包被液，酶标板中加入200μLPBST洗液，室温作用5min，倾去洗液，同法再次洗涤，共计3次，于酶标板中加入封闭液(1％的明胶)，200μL/孔，37℃作用1h；
c倾去封闭液，同上以PBST洗涤，酶标板中加入一抗，即1％脱脂奶粉100倍稀释的小鼠血清或4倍稀释的小鼠肺泡盥洗液，100μL/孔，37℃作用1h；
d倾去一抗，同上以PBST洗涤，酶标板中加入PBST2000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG或400倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgA二抗，100μL/孔，37℃作用1h；
e倾去二抗，同上以PBST洗涤，酶标板中加入TMB底物显色液，100μL/孔，室温显色15min，于酶标板中加入2MH2SO4，50μL/孔，终止显色。
f酶标仪读取酶标板各孔OD450nm值。
结果显示，初次免疫后21d、42d，OMV免疫小鼠血清中IgG抗体反应OD均值分别为0.489±0.094、1.442±0.205，显著高于同时期PBS免疫组0.056±0.003、0.065±0.003；初次免疫后42d，OMV免疫小鼠血清中IgA抗体反应OD均值分别为0.348±0.056，显著高于同时期PBS免疫组0.107±0.02(图3)；初次免疫后42d，OMV免疫小鼠肺泡盥洗液中IgG及IgA抗体反应OD均值分别为1.079±0.323、1.575±0.135，显著高于同时期PBS免疫组0.049±0.006、0.069±0.003(图4)，确定了OMV是一种高效免疫刺激物，不仅能够刺激小鼠血清产生高水平的IgG，而且在小鼠肺脏中产生高水平的IgA，有效的刺激了肺脏的黏膜免疫系统，显现出外膜囊泡作为亚单位疫苗较好的应用前景。
上述实施方式仅为本发明优选的一种方式，不能以此来限定本发明的保护范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于,包括如下步骤：
a.体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌至细菌对数期早期，在培养基中添加铁离子螯合剂后继续培养细菌，通过离心、过滤获取无细胞培养上清；
b.对无细胞培养上清进行超速离心处理，制得猪胸膜肺炎放线杆菌释放的外膜囊泡。
2.根据权利要求1所述一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌方法为：
将shope菌株的冻干菌种划线接种于含NAD的THB固体培养基，5％～10％CO2条件下，37℃培养16h～18h，接种固体培养基上5～8个单菌落至6mL含NAD的THB液体培养基，37℃振荡培养6h～8h；含NAD的THB固体培养基为：每1000mLTHB加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌15分钟，待培养基温度至50℃时，添加NAD至0.01％(v/w)，适量倾入平皿中凝固；含NAD的THB液体培养基为：称取30gTHB，溶解于1000mL去离子水，121℃高压灭菌15分钟，待培养基恢复至室温，添加NAD至0.01％(v/w)；
随后将细菌培养物以体积比1％比例接种400mL含NAD的THB液体培养基，继续37℃振荡培养，待细菌培养至对数生长早期OD600nm为0.1～0.2时，在培养基中添加终浓度150μM二乙烯三胺五乙酸钙三钠盐水合物，形成铁离子限制环境，继续37℃振荡培养14h～16h。
3.根据权利要求1或2所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，所述细菌外膜囊泡的制备方法为：
收集体外培养猪胸膜肺炎放线杆菌培养物，4℃10000g离心15min，弃去沉淀，0.22μm过滤上清，获得无细胞上清物；4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀以适量PBS缓冲液重悬；PBS缓冲液为：8mMNa2HPO4·12H2O、1.5mMKH2PO4、2.7mMKCl、136.7mMNaCl，pH7.4，121℃高压灭菌15分钟；
同上再次4℃150000g超速离心3h，弃去上清，沉淀重悬于3mLPBS缓冲液，即为制备的细菌外膜囊泡。
4.权利要求1-3任一所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡在制备猪胸膜肺炎纳米亚单位疫苗中的应用。
5.用权利要求1-3任一所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡制备的猪胸膜肺炎纳米亚单位疫苗。
6.权利要求1-3任一所述的一种猪胸膜肺炎放线杆菌外膜囊泡用作免疫刺激物。
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