CN111454979B - 一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用,属于生物技术领域。该方法,包括培养敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株的步骤。本发明还提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。采用本发明方法,大肠杆菌外膜囊泡的产量达到701mg/L,较原始菌株在LB培养基中培养产量,提高了约100倍,可适用于制药工业大量生产外膜囊泡,显著降低了生产成本。采用本发明方法制备的细菌外膜囊泡,具有良好的免疫增强功能,可以添加到一般疫苗中,能够显著增强免疫效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用。
背景技术
外膜囊泡(Outer membrane vesicles,OMVs)是革兰氏阴性菌表面出芽分泌的产物,是细菌外膜在一定的机制下出芽并在细菌表面形成一种囊泡状的结构,其大小约20nm-300nm不等。这种结构包括了脂多糖(LPS)、外膜蛋白、磷脂、细菌毒素、黏附素、DNA以及在形成过程中被外膜包裹的周质成分。由于外膜囊泡不能复制且含有大量的细菌抗原,具备良好的免疫原性和免疫增强作用,可以激活宿主细胞免疫系统。因此,外膜囊泡可以作为一种极具潜力的新型细菌疫苗或免疫增强剂使用。
但是,外膜囊泡是细菌对外界释放物质、交换信号分子、转移遗传物质的载体,在正常情况下其分泌量较小。如果收集外膜囊泡用于生物制品,其成本极高,从而限制了该物质的使用推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高细菌外膜囊泡产量的方法,能够显著提高细菌外膜囊泡产量。
本发明的再一目的是提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。
本发明的目的采用如下技术方案实现:
一种制备细菌外膜囊泡的方法,包括培养敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株的步骤。本发明技术方案可以适用于可以分泌外膜囊泡的任何革兰氏阴性菌,本发明优选的革兰氏阴性菌不仅包括大肠杆菌属,还包括以下任何属中的物种:大肠杆菌属、志贺氏菌属、奈瑟氏球菌属、莫拉氏菌属、博德特菌属、伯疏氏螺旋体属、布鲁氏菌属、衣原体属、嗜血菌属、军团菌属、假单胞菌属、耶尔森菌属、螺杆菌属、沙门菌属、弧菌属等。
在本发明中,所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌。
在本发明中,所述细菌突变株是通过Red重组技术,缺失染色体yjeE基因的。
在本发明中,将两端带有yjeE基因上下游同源臂、中间为氯霉素抗性基因cat的同源重组片段,导入大肠杆菌J5株,进行同源重组,将大肠杆菌J5株染色体上yjeE基因置换为氯霉素抗性基因,然后消除氯霉素抗性基因,得到敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株。
在本发明中,利用温度敏感型质粒pCP20的FLP位点专一性重组酶,将大肠杆菌J5株染色体上氯霉素抗性基因cat消除。
优选的技术方案中,所述敲除了yjeE基因的细菌突变株在通气状态下培养8-12h,然后收集外膜囊泡。
优选的技术方案中,所述敲除了yjeE基因的细菌突变株采用HPO培养基进行培养,所述HPO培养基含有:大豆蛋白胨5-10g/L,胰蛋白胨15-20g/L,酵母粉5-10g/L,葡萄糖2-7g/L,磷酸氢二钠0.2-0.8g/L,250mM氯化钾溶液8-12mL/L,2M氯化镁溶液4-6mL/L,胎牛血清,8-12mL/L,pH为7.0-7.8。
本发明还提供所述方法制备的细菌外膜囊泡在制备疫苗和免疫增强剂中的应用。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)采用本发明方法,大肠杆菌外膜囊泡的产量达到701mg/L,较原始菌株在LB培养基中培养产量(6.9mg/L),提高了约100倍,可适用于制药工业大量生产外膜囊泡,显著降低了生产成本。
(2)本发明中敲除的特定基因yjeE,不仅存在于大肠杆菌中,而且在沙门菌等其他革兰氏阴性菌中均有其对应基因变体,因此,对这类细菌的yjeE基因进行改造,均可以提高原始菌株释放外膜囊泡的能力。
(3)采用本发明方法制备的细菌外膜囊泡,具有良好的免疫增强功能,可以添加到一般疫苗中,能够显著增强免疫效果。
附图说明
图1大肠杆菌J5株重组鉴定琼脂糖凝胶电泳结果,其中“M”、“WT”、“yieE一重”和“yieE一重”分别为:DL2000,J5株,J5△yjeE::cat,J5△yjeE。
图2大肠杆菌J5株其他部分重组基因鉴定琼脂糖凝胶电泳结果,其中M、WT-mltA、mltA一重、mltA二重、WT-murQ、murQ一重、murQ二重、WT-yjbH、yjbH一重和yjbH二重分别为:DL2000 Marker,J5株,J5△mltA::cat,J5△mltA,J5株,J5△murQ::cat,J5△murQ,J5株,J5△yjbH::cat,J5△yjbH。
图3是J5株、J5△yjeE和其他突变株在HPO培养基培养下外膜囊泡(OMV)产量的对比。
图4安全性试验中小鼠体重变化趋势,其中“OMV”是OMV注射组小鼠的缩写,PBS是对照组的缩写。
图5HE染色小鼠注射部位组织切片,其中“OMV”是OMV注射组小鼠的缩写,PBS是对照组的缩写。
图6免疫后2周小鼠血清平均血凝抑制价,其中H9+白油是组1,H9+白油OMV是组2,H9+CV13是组3,H9+CV13+OMV是组4,PBS是组5。
图7免疫后2周雏鸡血清平均血凝抑制价,其中H9+白油是组1,H9+白油+OMV是组2,H9+CV13是组3,H9+CV13+OMV是组4,PBS是组5。
图8是J5△yjeE所产外膜囊泡的Tecnai 12透射电镜照片。
具体实施方式
实施例1大肠杆菌J5株yjeE基因的缺失
(1)材料
大肠杆菌J5株购自美国ATCC,菌株代号ATCC43745。
LB培养基制备方法:称取胰蛋白胨10g、酵母粉5g和氯化纳10g,用蒸馏水溶解后定容至1000mL,调节pH为7.4,121℃高压灭菌15min。如需配制固体平板,高压灭菌前另加入琼脂16g。
氨苄青霉素、氯霉素和L-阿拉伯糖均购自上海生工。
rTaq PCR MIX购自南京诺唯赞生物有限公司。
pKD3质粒、pKD46、pCP20质粒由扬州大学朱国强教授馈赠,但是均可以由商业途径购买得到。
(2)引物设计
根据GenBank公开的大肠杆菌K-12MG1655株(登录号:NC_000913)yjeE基因ORF序列(基因组位置4395585-4396046)的上下游外翼,设计鉴定引物F1和R1,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。在F1、R1内侧设计一对同源重组引物F2和R2,其5’端序列与yjeE两翼序列同源,3’端序列与pKD质粒的cat基因序列同源。
各引物的序列如下:
F1(SEQ ID No.1):5’-TTGTTAACCCGGAAGTGACTGATAA-3’;
R1(SEQ ID No.2):5’-CCAACCAATTTCTGATGCGATACA-3’。
F2(SEQ ID No.3):
5’-CTTTTCCACGCTACAGCGTATTGTTAACCCGGAAGTGACTGATAAAAACCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’;
R2(SEQ ID No.4):
5’-GCTACCAACCAATTTCTGATGCGATACATCATCCCGCCACCTTTCAAAGGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’。
(3)重组片段的制备
以pKD3质粒为模板,以F2和R2为引物,扩增两端为yjeE基因上下游同源臂、中间为氯霉素抗性基因cat的重组DNA片段,片段长度为1115bp。取25uL rTaq PCR MIX,引物F2和R2各2uL,pKD3质粒(Datsenko KA,Wanner BL:One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U SA2000,97:6640–6645.)2uL,加超纯水至总体积为50uL。PCR反应程序:95℃预变性5min;94℃15s,51℃退火15s,72℃60s,10个循环;94℃15s,61℃退火15s,72℃60s,25个循环;72℃再延伸5min。将扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳分离片段,并切胶回收1115bp的目的基因片段。
(4)yjeE基因的重组缺失
制备大肠杆菌J5株感受态细胞,具体方法如下:挑取大肠杆菌J5株单个菌落接种于4mL LB液体培养基中,于37℃摇床中培养过夜,取50μL培养物加入到5mL LB液体培养基中,于37℃振摇培养1.5-2h,使培养物OD600达到0.5-0.6,将菌液在4℃冰浴30min,5000r/min离心5min,弃上清,将沉淀用0.1M的CaCl2溶液轻轻吹打,充分悬浮,冰浴10min后离心取沉淀,将沉淀用400μL预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻吹打,充分悬浮,冰浴30min,得到大肠杆菌J5株感受态细胞。
将质粒pKD46导入大肠杆菌J5株,具体方法如下:取编码Red重组系统的质粒pKD46与200μL大肠杆菌J5株感受态细胞混合,冰浴30min,42℃热休克90s后立即冰浴1-2min,加入800μL无抗生素的LB液体培养基,在30℃、150r/min振摇培养45min,取200μL涂布氨苄青霉素(100μg/mL)抗性的LB平板,30℃培养过夜。
将上述转化的重组菌挑取单个菌落,接种于5mL新鲜的含氨苄青霉素抗性的LB培养基中,30℃振荡培养过夜,次日按1:100接种于50mL LB培养基,在30℃培养至OD600达到0.2-0.3时,加入L-阿拉伯糖至终浓度为30mmol/L,诱导1h,以使pKD46上的Exo、Bet和Gam三个蛋白充分表达。将培养物冰上预冷30min,然后在5000r/min离心5min,弃培养基,用预冷的10%甘油水溶液离心洗涤3次,浓缩100倍制成500μL携带质粒pKD46的重组菌的感受态细胞,每管分装40μL。
取100ng左右纯化好的本实施例标题(3)中扩增片段,与40μL携带质粒pKD46的重组菌的感受态细胞混合,将混合物加入到0.1cm规格的Bio-Rad电极杯中,在电压1.8KV,脉冲25μF,电阻200欧姆的参数下进行电击,电击后迅速加入1ml预冷的SOC培养基,在150r/min、30℃条件下培养1h,全部涂布含有氯霉素(34ng/ml)和氨苄青霉素(100ng/mL)的LB平板上,以筛选yjeE基因缺失突变株。其中,SOC培养基含有2%(W/V)胰蛋白胨,0.5%(W/V)酵母粉,0.05%(W/V)氯化钠,2.5mM氯化钾,10mM氯化镁,20mM葡萄糖。
采用PCR法鉴定上一步平板单菌落。将上一步平板单菌落于4mL含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中,置于30℃恒温箱中振摇培养过夜(8-12h),取1mL菌液利用煮沸法制备鉴定菌株模板。建立反应体系:取10uL rTaq PCR MIX,F1和R1引物各1uL,鉴定菌株模板2uL,加超纯水至总体积25uL。PCR反应条件为:94℃预变性4min;94℃1min,53℃30s,72℃60s,25个循环;72℃延伸10min。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果。从图1可见,yjeE基因缺失突变株的扩增产物中出现了约1500bp大小的条带,阴性对照(J5株)中出现700bp大小的条带,说明成功敲除了J5株基因组DNA中yjeE基因ORF,并将其替换成了氯霉素抗性基因。
将PCR鉴定成功敲除了yjeE基因的重组菌接种于含有氯霉素的LB培养基中,在42℃培养传代接种3代,每代培养不少于6小时,从而消除菌株中的温度敏感型质粒pKD46,最后于含有氯霉素的LB平板上划线分离,然后在37℃倒置培养,随机挑选单菌落分别于氨苄青霉素和氯霉素平板划线进行抗性检测,筛选对氨苄青霉素敏感而具有氯霉素抗性的单菌落,从而获得已成功消除了质粒pKD46且敲除了yjeE基因ORF的重组菌,命名为J5△yjeE::cat。
(5)cat基因的消除
采用本实施例标题(4)中方法制备J5△yjeE::cat的感受态细胞,并将pCP20质粒(Datsenko KA,Wanner BL:One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A2000,97:6640–6645.)电转化导入该感受态细胞中。全部涂布含有氯霉素(34ng/ml)和氨苄青霉素(100ng/mL)的LB平板上,置于30℃恒温箱中培养过夜(8-12h)。由于pCP20质粒在30℃条件下可以表达FLP位点专一性重组酶,识别cat基因两端的FRT序列并将其中间的序列切除,因此达到消除一次重组菌中cat基因片段的目的。
挑取上述平板单菌落于LB培养液中置于42℃培养并传3代,每代培养不少于6小时,最后于无抗生素的LB平板划线分离。挑取二次重组敲除株(敲除了yjeE和cat基因)单菌落于4mL LB培养基中,置于37℃恒温箱振摇培养过夜(8-12h),取1mL菌液利用煮沸法制备鉴定菌株模板。建立反应体系,取10uL rTaq PCR MIX,引物F1和R1各1uL,鉴定菌株模板2uL,加超纯水至总体积25uL。PCR反应条件为:94℃预变性4min;94℃1min,53℃30s,72℃60s,25个循环;72℃延伸10min。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳观察结果。从图1可见,二次重组敲除株(敲除了yjeE和cat基因)PCR产生了200bp大小的条带,阴性对照(J5株)扩增条带为700bp,说明cat基因成功消除,将二次重组敲除株命名为J5△yjeE。
申请人按照上述相同方法,还分别敲除了表1中各基因,构建相应的单缺失基因株。其中部分基因mltA、yjbH、murQ基因缺失株的电泳图见图2。
表1各菌株及其缺失基因
菌株编号 | 敲除基因 | 菌株编号 | 敲除基因 |
J5△slt | slt | J5△murQ | murQ |
J5△mltA | mltA | J5△nagZ | nagZ |
J5△ynhG | ynhG | J5△LPa | LPa |
J5△ycbB | ycbB | J5△lolC | lolC |
J5△yjbH | yjbH | J5△lolA | lolA |
J5△yjbF | yjbF | J5△yhjD | yhjD |
实施例2重组菌J5△yjeE的培养和外膜囊泡的制备方法
(1)培养基及缓冲液
LB培养基:取胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化纳10g,用蒸馏水溶解后定容至1000mL,调节pH至7.4,121℃高压灭菌15min。如需配制固体平板,高压灭菌前另加入琼脂16g。
HPO培养基:取大豆蛋白胨5g,胰蛋白胨15g,酵母粉5g,葡萄糖3g,磷酸氢二钠0.4g,另加入250mM氯化钾溶液10mL,2M氯化镁溶液5mL,用蒸馏水溶解后定容至1000mL,调节pH至7.4。121℃高压灭菌15min。使用前,另加入过滤除菌的胎牛血清10mL。
PBS缓冲液:是含有8mM十二水合磷酸氢二钠、1.5mM磷酸二氢钾、2.7mM氯化钾和136.7mM氯化钠的水溶液,pH 7.4,121℃高压灭菌15min。
(2)采用J5△yjeE制备细菌外膜囊泡
将实例1中构建的大肠杆菌J5△yjeE划线接种于LB固体培养基,37℃培养16h。挑取单菌落接种于10mL的HPO培养基中,在37℃、180rpm条件下振荡培养8h,作为种子液。将种子液以体积比为1:100转接至装有1000mL的HPO液体培养基的锥形瓶(瓶底带有桨叶)中,在37℃、180rpm振荡培养,培养时间为12h,此时细菌生长处于平台期,OD600 nm约为4.0,停止培养。
将1000mL的细菌培养物在4℃、10000g离心15min,弃去沉淀,将上清通过0.22μm滤膜过滤除菌,获得无细胞上清物约1000mL。将获得的无细胞上清物通过100KDa超滤膜浓缩100倍,收获终体积为10mL的无细胞上清。在4℃、120000g超速离心3h,弃去上清,沉淀以适量PBS缓冲液重悬;再次在4℃、120000g超速离心3h,弃去上清,沉淀重悬于5mL PBS缓冲液。最后,通过0.22μm滤膜过滤,即得到细菌外膜囊泡。
取细菌外膜囊泡50μL滴加至铜网上,10min后用滤纸轻轻的吸去液体,然后用1%的磷钨酸(pH 7.4)负染2min,迅速用滤纸吸去磷钨酸,把铜网放在65℃的灯下烘干。烘干的样品放于Tecnai 12透射电镜下进行观察。结果如图8所示,可见多数外膜囊泡处于50-100nm的大小。另取制备的外膜囊泡20μL,按照等倍梯度稀释后加入96孔板,通过BCA法测定外膜囊泡蛋白总量,换算到1000mL培养基后,外膜囊泡产量为701mg/L,换算成蛋白总量(微克)与细菌OD值之比为233.7。
另外采用上述相同方法以表1中其他菌株制备细菌外膜囊泡。发现lolC,lolA,ycbB,nagZ,yhjD,LPa,slt,mltA,yjbF,ynhG,yjbH,murQ等12个单基因敲除株的外膜囊泡产量较原始菌株J5没有显著改变,均小于50mg/L;从图3可见,J5△yjeE所产外膜囊泡产量显著高于原始菌J5株和其他敲除突变株。
除了采用锥形瓶培养,还可以在发酵罐中进行培养,通入0.5V/V·min的无菌空气。
实施例3外膜囊泡的安全性评价
20g清洁级BALB/c雌鼠20只,随机分为2组,每组10只。其中一组小鼠(OMV注射组)使用实施例2中以J5△yjeE制备的外膜囊泡,按照100ug/只的剂量进行腿部肌肉注射;另外一组小鼠(对照组)接种与外膜囊泡相同体积的PBS缓冲液。
接种后,每天观察小鼠情况并记录体重变化。42天后处死小鼠,解剖小鼠观察内脏(心、肝、脾、肺和肾)有无病理变化,取腿部肌肉组织做HE染色切片观察。
OMV注射组小鼠的体重变化与对照组无显著差异(如图4),说明制备的外膜囊泡对小鼠生长无影响。42天后解剖小鼠,两组的内脏均正常,无病理变化。注射部位的组织切片(图5)也显示无差异。
实施例4外膜囊泡的免疫增强作用鉴定
(1)小鼠免疫
3周龄清洁级雌性BALB/c小鼠50只,随机分为5组(组1-组5),每组10只。分别使用白油佐剂(购自于河南通商进出口有限公司)和复乳型佐剂1(公开于中国发明专利ZL 201610963355.X)配制禽流感病毒H9亚型HN03株灭活疫苗,考察实施例2采用J5△yjeE制备的外膜囊泡(缩写为OMV)是否对其有免疫增强作用。
小鼠分组的具体情况如下:
组1:免疫疫苗A。根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》,将灭活的禽流感病毒H9亚型HN03株病毒液(病毒含量是108.38EID50/0.1ml)与白油佐剂按1:3体积比混合,制备疫苗A。
组2:免疫疫苗B。根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》,将灭活的禽流感病毒H9亚型HN03株病毒液(病毒含量是108.38EID50/0.1ml)与白油佐剂按1:3体积比混合,另外添加终浓度为50ug/mL的OMV,制备疫苗B。
组3:免疫疫苗C。根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》,将灭活的禽流感病毒H9亚型HN03株病毒液(病毒含量是0.5*108.38EID50/0.1ml)与CV13佐剂按1:1体积比混合,制备疫苗C。
组4:免疫疫苗D。根据《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》,将灭活的禽流感病毒H9亚型HN03株病毒液(病毒含量是0.5*108.38EID50/0.1ml)与CV13佐剂按1:1体积比混合,另外添加终浓度为50ug/mL的OMV,制备疫苗D。
组5:注射PBS缓冲液,作为对照组。
对不同分组的小鼠,每只颈背部皮下注射对应的疫苗200μL。对照组小鼠,每只注射PBS缓冲液200μL。2周后分别采血,制备血清待测。
根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》中红细胞凝集抑制试验的方法,检测各组小鼠血清的平均血凝抑制价。结果如图6所示,组1的平均血凝抑制价为9.2log2,组2的平均血凝抑制价为11log2,组3的平均血凝抑制价为7.7log2,组4的平均血凝抑制价为9.75log2,对照组的平均血凝抑制价为0.75log2。说明组2抗体效价是组1的抗体效价的3倍以上,组4抗体效价是组3抗体效价的4倍以上,因此采用J5△yjeE制备的外膜囊泡具有显著的增强免疫效果。
(2)雏鸡免疫
3周龄雏鸡50只,随机分为5组,每组10只(组1-组5),分别免疫本实施例标题(1)中疫苗A、B、C、D,具体分组见表2。
表2雏鸡的免疫分组
对各组雏鸡颈部皮下注射对应的疫苗,每只200μL。对照组注射PBS缓冲液,每只200μL。接种2周后采血,制备血清待测。
根据《中华人民共和国兽用生物制品规程》中红细胞凝集抑制试验的方法,检测各组鸡只血清的平均血凝抑制价。结果如图7所示。组1鸡只的平均血凝抑制价为8.09log2,组2鸡只的平均血凝抑制价为10.1log2,组3鸡只的平均血凝抑制价为8.36log2,组4鸡只的平均血凝抑制价为10.17log2,阴性对照组的平均血凝抑制价为0.57log2。从上述结果可以看到,组2抗体效价是组1抗体效价的4倍以上,组4抗体效价是组3抗体效价的3倍以上,因此采用J5△yjeE制备的外膜囊泡具有显著的增强免疫效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (2)
1.一种制备细菌外膜囊泡的方法,其特征在于包括培养敲除了yjeE基因的大肠杆菌J5株突变株的步骤;将两端带有yjeE基因上下游同源臂、中间为氯霉素抗性基因cat的同源重组片段,导入大肠杆菌J5株,进行同源重组,将大肠杆菌J5株染色体上yjeE基因置换为氯霉素抗性基因,然后消除氯霉素抗性基因,得到敲除了yjeE基因的革兰氏阴性细菌突变株;利用温度敏感型质粒pCP20的FLP位点专一性重组酶,将大肠杆菌J5株染色体上氯霉素抗性基因cat消除;所述敲除了yjeE基因的细菌突变株在通气状态下培养8-12h,然后收集外膜囊泡。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于所述细菌突变株是通过Red重组技术,缺失染色体yjeE基因的。
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