CN101638661B

CN101638661B - 新城疫病毒hn基因和f基因重组乳酸菌的构建

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Publication number: CN101638661B
Application number: CN200810051042A
Authority: CN
Inventors: 王春凤; 宁军; 肖冲; 任谓明
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2008-08-01
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2028-08-01
Also published as: CN101638661A

Abstract

一种新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建，属于生物技术领域，其特征是：1新城疫病毒F48E9株HN基因和F基因的克隆与序列分析，2新城疫病毒重组表达载体pW425et-HN和pW425et-F的构建及在大肠杆菌中的表达，3重组质粒pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌中的表达。有益效果是：外源基因F和HN在乳酸菌中获得了表达，并且具用反应原性，而且重组基因工程乳酸菌可以增强机体对新城疫病毒的粘膜免疫。利用这一平台也可将其它引起禽类高度接触性传染病的病原微生物的保护性抗原基因转入益生的乳酸菌中，使其表达。

Description

新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建

技术领域：

本发明属于生物技术领域。

背景技术

1新城疫病毒的综述

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种极易传染家禽的毁灭性疾病，广泛流行于世界许多国家，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，因此国际兽疫局(OIE)将其与高致病性禽流感一起列为A类疫病^[1]。NDV在1926年于爪哇首次发现，同年在英国新城(Newcastle)发现；1927年，Doyle研究证明该病是一种由病毒引起的疫病，即用发现该病的地名命名为新城疫^[2]。我国于1948年分离到NDV，但据载1935年曾有过“鸡瘟”的流行，可能是由NDV引起的。由于ND给世界养禽业造成的损失巨大，故对其病原NDV的研究一直是禽病研究的重点。早期的研究集中于对NDV的生物学特性鉴定、致病性比较及疫苗的研制和应用上。80年代以来，随着分子生物学技术的发展与完善，对NDV基因组的组成及特征、结构蛋白与功能、致病的分子基础和新型疫苗等方面的研究不断深入^[3]。

1.1NDV的一般生化性质

1.1.1理化性质

NDV病毒粒子含有约20％-25％(w/w)的来自宿主细胞的脂质和约6％的碳水化合物。病毒颗粒在蔗糖中的浮密度为1.18-1.20g/ml^[4]。NDV对理化因素的抵抗力较强，能在自然界顽固生存。影响其在宿主体外生存的主要因素包括病毒的数量、毒株的种类、温度、阳光照射、贮存条件及是否存在有机物等。一般NDV在4℃经过几周，在-20℃经过几个月，在-70℃经过几年仍能保持感染力。大多数去污剂能迅速将其灭活，Na₂CO₃和NaOH的消毒效果不稳定。NDV对酸、碱的耐受力强，在pH2和pH10条件下可存活数小时。感染宿主时病毒的毒力主要由以下几种因素引起，包括宿主类型、年龄、健康状况、环境条件以及是否存在其他病原感染。

1.1.2生物学活性

血凝性：NDV可凝集所有两栖类、爬行类、禽类及小鼠、豚鼠的红细胞，但凝集牛、绵羊、猪、马及人O型血红细胞的能力则随毒株或血清型的不同而异^[5]。NDV凝集红细胞是由于其囊膜表面的HN糖蛋白与红细胞表面的受体结合所引起的。因此可通过鸡的红细胞做血凝(HA)试验，同时结合血凝抑制(HI)试验来进行ND的抗体监测及诊断^[6]。

神经氨酸酶活性(NA)：神经氨酸酶是HN蛋白的一部分，该酶的明显作用是将病毒逐渐从红细胞上洗脱下来，此酶还可以作用于细胞受体位点，使F蛋白充分接近细胞而发生病毒与细胞膜的融合。

细胞的融合和溶血：和其它副粘病毒类似，NDV可引起红细胞溶解或细胞融合。在病毒复制时，其囊膜附着于相应细胞膜的受体位点，继之囊膜与细胞膜融合，进而导致两个或多个细胞的融合。僵硬的红细胞膜常因与病毒间的膜融合而导致溶解，产生溶血。同血凝活性一样，细胞融合与溶血性也可被特异性抗血清所抑制。

NDV有诱导干扰素生成的作用，近期研究发现，NDV还具有抗肿瘤免疫，引起细胞凋亡的特性^[7，8]，研究显示，NDV能选择性地杀伤肿瘤细胞，而对人的成纤维细胞没有杀伤作用^[9]。许多人类的肿瘤细胞都能高效地被NDV感染，并独立于肿瘤细胞增殖而自我复制，这种增殖与复制无传染性^[10]。Schinmmacher等发现NDV有促进巨噬细胞抗肿瘤活动的能力，诱导出现抗肿瘤白细胞聚集和抗肿瘤细胞毒作用以及诱导TNF的表达，还可抑制肿瘤细胞的转移和生长^[11]。这使NDV在肿瘤治疗及有关衰老机理的研究等方面备受重视^[12，13]。

1.2NDV的分子生物学特性

1.2.1基因组的结构

NDV的整个基因组为单一开放阅读框，全场15 156个核苷酸，分子量5.2-5.7×10⁶Da。由6种结构蛋白(NP、P、L、F、HN、M)构成^[14，15]，基因组的排列次序为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’^[16，17]。编码6种结构蛋白，按它们在病毒粒子中的分布可分为内部蛋白和外部蛋白。前者包括：核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)，磷酸化蛋白(Phosphate Protein，P)，高分子量的RNRA聚合酶(Large Protein，L)；后者包括：agglutinin Neuraminidase protein，HN)、融合蛋白(Fusionportein，F)及基质蛋白(Matrix，M)。其中NP，P，L在功能上相互促进，共同参与病毒RNA的转录复制，形成有活性的mRNA^[18，19]，HN，F为两种糖基化形式蛋白，是NDV重要的免疫原成分。

1.2.2NDV的结构蛋白的特点

1.2.2.1HN蛋白NDV的HN基因长约2000bp，约占基因组的13.5％，含有一个长的开放阅读框。HN具有血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)两种活性活性，这两种活性对于NDV侵染细胞都有重要作用。血凝素成分负责病毒吸附到易感细胞含唾液酸的受体，这是病毒感染细胞的第一步；神经氨酸酶则有分解膜结合或糖结合的唾液酸的能力，在病毒生命周期中起增加病毒粒子迁移性的作用，包括破坏细胞受体和从感染细胞表面释放病毒粒子^[20]。

1.2.2.2F蛋白F蛋白即融合蛋白，具有融合功能，介导病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，使病毒侵入宿主细胞并在宿主细胞间扩散。F蛋白由553个氨基酸组成，是NDV另一种较大的糖蛋白，F基因从其转录起始信号到PolyA尾巴约有1790个核苷酸，有一个开放阅读框^[43]，病毒的F基因转录、翻译成F蛋白。此蛋白由553个氨基酸组成，含有3个高疏水区域：(1)N端的信号肽；(2)F₁蛋白的N端，提供胞内蛋白酶的切割位点^[21-24](3)C端的跨膜区域，F蛋白以此区域插入膜内。

1.2.2.3M蛋白M蛋白即基质蛋白(Matrix)，是NDV囊膜除F、HN蛋白的第三种蛋白，是一种非糖蛋白。M基因长度为1241bp，有一个开放阅读框。转录起始信号是ACGGGTAGAA，翻译起始信号ATG位于35-37碱基处，终止信号TAA位于1127-1129核苷酸处，编码一个由346个氨基酸组成的多肽，分子量约为40KD。NDV的M蛋白序列中含有8对碱性氨基酸残基，其中5对在羧基端的半个分子中，这些成对的碱性氨基酸对M蛋白与病毒核衣壳相结合是十分重要的^[25，26]。

1.2.2.4NP，P和L蛋白衣壳结构蛋白NP是核衣壳蛋白(N)的主要成分，其结构单位有两个主要区域。一是氨基端区域，约占整个结构单位的三分之二，它与RNA直接结合；另一个是羧基端区域，裸露于装配后的核衣壳表面。核衣壳结构单位与负链RNA病毒基因组模板活性有密切关系。但核衣壳蛋白中的NP和N蛋白必须与操纵RNA合成的辅助蛋白相互作用，才能完成RNA的合成。

1.4NDV基因工程疫苗的研究进展

免疫接种是目前控制ND的主要手段。新城疫的疫苗目前主要是灭活疫苗和弱毒活疫苗两种，而且常常结合使用，使用较繁琐，免疫保护期往往不长，虽然总的来看是很有效的，但存在着免疫不全或毒力返强等问题。为了弥补常规疫苗的不足，国内外许多研究者从80年代末开始重组DNA研制ND基因工程疫苗，在DNA疫苗、亚单位和活载体疫苗方面都进行探索。

1.4.1DNA疫苗

DNA疫苗是将外源基因克隆到表达载体上，直接注入到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生抗原从而激活免疫力。在NDA疫苗研究方面，日本学者Sakaguchi等将NDV F基因插人质粒载体后，肌肉注射一周龄试验鸡，免疫9个星期后，体内有抗体的试验鸡都能抵抗致死剂量NDV强毒的攻击^[27]。

1.4.2亚单位疫苗

亚单位疫苗是将NDV保护性抗原基因在原核或真核系统中表达所获得的产品制成的疫苗。杆状病毒载体系统是验制ND亚单位苗的主要工具，它是以昆虫杆状病毒为外源基因载体，以昆虫和昆虫细胞为受体的表达系统。迄今为止，已有NDV BI Hitchner株、Miyadera株、D26株的HN和F基因在杆状病毒系统中表达。

1.4.3ND的活载体疫苗

此类疫苗包括疱疹病毒活载体疫苗、痘病毒活载体疫苗、减毒沙门氏菌载体活疫苗。早在1991年MorgnaR.W等将NDV的HN，F基因分别克隆人火鸡疱疹病毒(HVT)的复制非必需区US2，利用Rous肉瘤病毒LTR的强启动子构建了重组HVT^[28]。

1.5ND的免疫

NDV侵入鸡体后即能引起抗体反应，产生中和抗体和HI抗体，中和抗体能够有效地破坏病毒的致死性感染力，而HI抗体水平是鸡群检测的重要指标。在感染病毒后6-10天可在鸡血清内测出体液抗体(IgG)和分泌型抗体(IgA)的存在^[29]。

1.5.1体液免疫

在新城疫免疫反应中，体液免疫起着十分重要的作用。鸡在初次感染NDV后，通常于6-10天能够检测出血清抗体，高峰一般在第3-4周出现。HI抗体可保持一年。不同疫苗毒株刺激抗体产生的水平不一，Majiyagbe等的试验证明，NDV B1株，Ulster株免疫鸡产生的抗体水平最低，LaSota株产生抗体最高^[30]。由于鸡的免疫器官发育成熟一般需要数周时间，一些毒力较强的疫苗株常会给雏鸡造成严重的接种反应，因此雏鸡初次免疫应该选用缓发型弱毒株疫苗，一段时间后再进行第二次免疫，可选用毒力相对较强的疫苗，能出现强烈的免疫应答，抗体水平显著提高。

1.5.2细胞免疫

细胞免疫是指宿主体内致敏的T细胞与特异性抗原接触后，由活化T细胞启动的免疫反应。刘胜旺等认为仅细胞免疫不能完全抵抗鸡新城疫病毒的入侵，但是细胞免疫在鸡新城疫的免疫和感染中，可能起到重要作用，其作用方式可能是与体液免疫协同发挥作用的^[31]。Meszaros应用NDV-6/10传代变异株免疫130万只鸡，均显示出显著的细胞介导免疫和低的血清HI抗体效价，免疫鸡群可抵抗速发型NDV强毒株的攻击^[32]。

1.5.3局部黏膜免疫

雏鸡早期抵抗新城疫感染的机制主要依靠的是呼吸道和消化道的局部免疫作用^[33]。此外由于新城疫病毒是副黏病毒，对黏膜有特殊的亲嗜性，极易经呼吸道和消化道感染，弱毒疫苗经滴鼻、点眼、饮水和气雾途径免疫，均可产生S-IgA而建立相应的黏膜免疫。产生的S-IgA对机体呼吸道、消化道等局部免疫具有相当重要的作用，是机体免疫的一道“屏障”，在新城疫的预防接种中，局部免疫作用利于封锁入侵门户，是防制的最好措施。王彩虹等通过手术切除鸡结膜相关淋巴组织造成黏膜诱导位点缺失，研究诱导位点缺失对效应位点(哈氏腺)点眼免疫应答的影响。结果表明鸡结膜相关淋巴组织缺失可能导致泪腺中特异性抗体及哈氏腺中抗体生成细胞数量的显著降低。通过细胞迁移试验发现被抗原激活的结膜相关淋巴组织细胞可迁移到哈氏腺中去^[34]。

2关于乳酸菌的概述

乳酸菌是一类能够代谢糖类、产生50％以上乳酸的细菌总称。从形态上可分为杆状和球状两大类，并且多数为革兰氏阳性菌，无菌条件下生长良好的兼性厌氧性细菌^[35]。乳酸菌为人及动物体内正常菌群的重要成员，以其作为表达外源保护性抗原基因的受体菌株，可以将乳酸菌的生物学功能和外源功能抗原基因的特异性免疫相结合，同时乳酸菌作为正常生理性细菌，又符合新型疫苗的口服安全、方便、廉价等特点。这类疫苗的研制成功将为新型疫苗的发展探索一条新路^[36]。

2.1乳酸菌的益生功能

2.1.1促进机体生长

乳酸菌能在体内正常发挥代谢活性，促进营养成分的分解，吸收，就能直接为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素，还可提高矿物元素的生物学活性，进而达到为宿主提供必需营养物质，增强动物的营养代谢，直接促其生长的作用^[37]。毕德成等用保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌发酵玉米和小麦粉，发现赖氨酸含量分别增加72％和85％，蛋氨酸分别增加40％和46％，硫胺素(VB1)和核黄素(VB2)均有所增加，游离氮增加1.6倍和1.4倍，游离铁分别增加1.3倍和0.9倍，游离钙增加1.5和1.2倍，总体营养价值有明显提高。

2.1.2调节免疫系统功能

乳酸菌制剂能够增强免疫力，表现两方面：一是影响非特异性免疫应答，增强单核细胞，多形白细胞的活力，刺激活性氧、溶酶体酶和单核因子的分泌；二是刺激特异性免疫应答，如提高粘膜表面和血清中的IgA、IgM和IgG水平从而增强体液免疫，促进T、B淋巴细胞的增殖从而加强细胞免疫^[13]。另外，乳酸菌菌体抗原及代谢物还可通过刺激肠粘膜淋巴结，激发免疫活性细胞，产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，调节机体的粘膜免疫，防止病原菌侵入和繁殖。

2.1.3改善动物消化道微生态平衡

在正常微生物群与机体内环境之间构成的微生态系统内，微生物种群中的优势种群对整个种群起决定作用，一旦失去了优势种群则微生态平衡失调。如果给动物消化道补充乳酸菌等，这些优势菌群与畜禽肠道内有益菌一起形成强有力的优势菌群，维持正常微生态区系平衡。在乳酸菌生长代谢过程中，会产生一些具有抗微生物活性的物质，如有机酸、丁二酮、脂肪酸等，均在体外表现出抑菌活性。双歧杆菌能防止致病菌对氨基酸脱羧作用，减少肠道内容物的氨浓度，从而减少毒性胺的合成，改善肠道环境。

2.1.4抗肿瘤作用

乳酸菌抗肿瘤作用是由于肠道菌群的改善，抑制了致癌物质的产生，一般认为，乳酸菌及其代谢产物活化了免疫功能，抑制了癌细胞的增殖。乳酸菌的抗癌特性可归纳为四类^[38，39]。

(1)对肿瘤细胞的抑制。如保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌和婴儿双歧杆菌对S-180肿瘤细胞的抑制，干酪乳杆菌对L1210肿瘤细胞的抑制^[38]。

(2)抑制肠道中条件致病菌产生的有致癌作用的酶，如β-葡萄糖苷酶、β-葡糖糖苷酸酶、硝基还原酶、偶氮还原酶和7a-脱轻基酶等，这些酶能催化致癌前体物质转化为致癌物质^[40]。

(3)破坏化学致癌物。抑制硝胺产生或抑制涉及硝胺合成的硝基还原酶，如干酪乳杆菌能抑制乳酪中硝酸盐转化为硝酸胺，嗜酸乳杆菌可显著降低高肉食大鼠粪便中的硝酸基和氮基还原酶的活性^[41]。

(4)抗突变活性。致癌作用是通过致癌物诱导动物细胞开始的，一些乳酸菌能抑制动物细胞的突变。如Hosono报道保加利亚乳杆菌、乳酸乳杆菌和嗜热链球菌的发酵乳对各种变异原性物质诱导的细胞突变有抑制作用^[42]。

2.2乳酸菌与黏膜免疫

许多报道证实，存在于肠道粘膜表面的益生菌作为一种活的有机体对肠道粘膜具有双重的保护作用，一方面它可以在肠道内定植，维护肠道微生物菌群的平衡；另一方面益生菌可直接作用于宿主的免疫系统，诱发肠道免疫；并刺激胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官的发育，促进巨噬细胞活力或发挥佐剂作用；通过增强T、B细胞对抗原刺激的反应性，发挥特异性免疫作用；活化肠粘膜内的相关淋巴组织，使S-IgA生物合成增加，提高消化道粘膜免疫功能；诱导淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子，发挥免疫调节作用，从而增强机体免疫功能^[43]。

2.3乳酸菌食品级表达系统

2.3.1乳酸菌食品级表达系统必须具备的基本条件

(1)食品级选择性标记载体，载体必须是食品级的，不得含有非食品级功能性DNA片段。传统的乳酸菌载体都带有一个或多个编码特定抗生素(如红霉素、氯霉素等)抗性的基因。虽然这为遗传操作时保持一定的压力，对载体的选择作用是有效的。但将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于抗性因子的转移，将带来生物安全性的严重后果。为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害，最有效的办法是用对人体安全的食品级标记代替抗生素抗性标记以建立食品级选择性标记的载体。

(2)稳定的宿主，表达宿主必须是安全的、特性清楚而稳定的食品级微生物，如乳酸球菌、乳酸杆菌以及其它已在食品工业中得到长期而广泛应用的菌株。必须用先进的分类方法去鉴定宿主菌，用适当的分子生物学技术，如DNA序列分析、PCR扩增、DNA杂交等手段去确定表达宿主的遗传组成。此外，食品级系统的宿主菌在生产状况下，在食品中和进入人的肠胃及消化道后必须是足够稳定的。

(3)诱导物必须是食品级的，如乳糖、蔗糖、嘌呤、嘧啶、乳链菌肽等可被人食用的物质。

2.3.2共生乳酸杆菌食品级表达系统的潜在应用前景

2.3.2.1表达抗原基因，研制各种口服疫苗乳酸杆菌为人及动物体内正常菌群的重要成员，以乳酸杆菌作为表达保护性抗原基因的受体，就可以将乳酸杆菌的非特异性抗感染能力和疫苗抗原的特异性免疫相结合，同时乳酸杆菌作为正常生理性细菌，又符合新型疫苗的口服安全、方便、廉价、不依赖冷链等特点。这类疫苗的研制成功将为新型疫苗的发展探索一条新路。

2.3.2.2表达抗原基因，治疗各种感染如果将产生特异性抗体的基因表达在消化道的乳酸杆菌中，当特定的病原微生物进入消化道时，可以很快被杀灭，使“病不能从口入”。另外，生殖道是体内多种细菌生活的场所，很容易引起感染。如果将特定的抗体基因表达在生殖道的乳酸杆菌中，也许可以用来防治诸如炎症、性病和艾滋病等。乳酸菌定植在粘膜表面，刺激免疫系统，对调整菌群平衡起着重要的作用。

2.3.2.3表达某种酶和营养素的基因可以将诸如维生素、氨基酸和消化酶等的基因和帮助营养物质吸收利用的某些酶的基因克隆到乳酸杆菌表达系统。例如，将植酸酶基因克隆到消化道乳酸杆菌中，则可能提高日粮中磷和钙的利用率，大大减少日粮中钙磷的添加量，降低养殖成本。

2.3.2.4表达保健和治病药物基因可以将一些对机体有保健和治疗效果的外源性或内源性基因在乳酸菌中进行表达。例如通过食物链，农副产品和环境中残留的农药均有可能进入人和动物的体内，对人和动物的健康造成影响。这些影响可能是急性的中毒、死亡，也可能是慢性的致畸、致癌等。如果将昆虫的农药抗药性基因整合到肠道有益共生乳酸杆菌中，有可能降低以至消除残留化学农药的危害，使机体具有自我解毒，自我保护功能。将SOD基因(所谓的长寿基因)表达在消化道共生菌，则可能有利于维持消化道的厌氧环境，消除自由基等对机体的危害，保障机体的健康。

2.3.2.5表达促生长发育激素基因通过转基因的方法可以将生长激素等基因转到动物遗传物质中，获得所谓的超常生长速度或其它超级性状的“超级动物”，但这种方法费时、复杂，且获得的性状不一定稳定。但如果通过将基因转入肠道共生菌来达到同样目的的方法则就简单多了。相当于在消化道为动物增加了一个内分泌器官。

2.3.2.6应用于食品和饲料工业方面乳酸杆菌的“食品级”表达系统在食品和饲料工业方面亦有广泛用途。如将胆固醇氧化酶基因转化到该系统中用于发酵酸奶，可以降低奶中的胆固醇含量；将纤维素酶基因和淀粉酶基因转入后可以制作青贮饲料。

发明内容

本发明的目的是：

提供一种新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建，将NDV的保护性抗原基因HN和F基因克隆入可在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的载体pW425et中，将阳性重组质粒转化到益生的嗜酸乳杆菌中，并进行表达。为乳酸菌介导黏膜免疫传导途径和可能作用机制的研究奠定重要基础，为制备口服的新城疫病毒基因工程乳酸菌的研究奠定实验基础。

本发明的技术方案是：

新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌的构建

1新城疫病毒F48E9株HN基因和F基因的克隆与序列分析

根据Genebank中NDV F48E9株的HN基因序列和F基因序列，分别设计出带有SacI和KpnI酶切位点的一对引物，应用RT-PCR方法扩增出HN基因和F基因，并将其克隆至pMD-18T载体中，进行核苷酸序列分析。结果表明：新城疫HN基因片段长度为1716bp，编码571个氨基酸，该基因与Genebank上纪录的HN基因序列同源性达到99.4％。F基因片段长度为1662bp，该基因与Genebank上纪录的F基因序列同源性达到99.8％。

2新城疫病毒重组表达载体pW425et-HN和pW425et-F的构建及在大肠杆菌中的表达

SacI和KpnI双酶切重组质粒pMD18-T-HN和pMD18-T-F，将纯化的HN基因和F基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中，构建出可以在大肠杆菌与乳酸菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-HN和pW425et-F。将pW425et-HN和pW425et-F分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态X13中，经过生长功能弥补筛选阳性克隆，经SDS-PAGE分析，可见约66kD的融合蛋白和59kD的融合蛋白。这与根据核苷酸大小计算的蛋白及融合蛋白之和的大小相符，说明外源片段插入正确表达成功。Western-blot分析表明，融合蛋白能与NDV阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有较好的抗原性，从而为pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌受体菌株中的表达提供实验基础。

3重组质粒pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌中的表达

应用电转化技术将已构建的新城疫病毒重组质粒pW425et-HN和pW425et-F分别转化至嗜酸乳杆菌感受态中。对筛选到的阳性克隆，采用SDS-PAGE进行鉴定，可见约66kD的融合蛋白和59kD的融合蛋白。经Western blotting分析表明该蛋白具有与新城疫多克隆抗体的反应原性，从而为乳酸菌介导黏膜免疫传导途径和可能作用机制的研究奠定重要基础，为制备口服的新城疫病毒基因工程乳酸菌的研究奠定实验基础。

本发明的有益效果是：

本发明是在乳酸杆菌和大肠杆菌中穿梭表达的载体pW425et基础上，构建了新城疫病毒F基因和HN基因乳酸菌表达载体，并使其在乳酸菌中进行表达，经过SDS-PAGE和Western blotting分析，表明外源基因F和HN在乳酸菌中获得了表达，并且具用反应原性，而且重组基因工程乳酸菌可以增强机体对新城疫病毒的粘膜免疫。

因此，利用这一平台也可将其它引起禽类高度接触性传染病的病原微生物的保护性抗原基因转入益生的乳酸菌中，使其表达。通过口服带有保护性抗原的基因工程乳酸菌即可使动物机体获得免疫力，这相当于将一个“微型工厂”建立在了禽肠道内，从而起到“相伴终生、互利终生”的功效。由此可见，通过分子生物学技术和基因工程原理，开发研制可以表达外源保护性抗原基因的基因工程乳酸菌，可以将乳酸菌的生物学功能和外源保护性抗原的免疫保护性相结合，对于防治禽病具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.新城疫病毒的RNA提取。

图2.F基因的RT-PCR扩增M：DL2000 marker；1：阴性对照，2：扩增的F基因。

图3.HN基因RT-PCR扩增产物M：DNA marker DL 2000；1、2：RT-PCR产物。

图4.RT-PCR纯化回收产物M：DNA marker DL 2000；1、2：RT-PCR纯化产物。

图5.目的片段的回收纯化M：DL2000 Marker；1：F基因的回收纯化产物。

图6.重组质粒酶切结果1-2：重组质粒酶切产物；M：DNA Marker DL 2000；M’：λ-HindIIImarker。

图7.重组质粒的酶切鉴定M1：DL2000 marker；M2：λ-HindIII marker；1：3号菌质粒酶切。

图8重组质粒PCR结果M：DNA Marker DL 2000；1-3：重组质粒PCR产物。

图9.重组质粒PMD-18-T-F PCR鉴定结果1：PCR阴性对照；2：3号菌株PCR产物；M：DL2000 marker。

图10.重组质粒pMD18-T-F和pW425et酶切回收产物M1：DL2000 marker；M2：λDNA/HindIII Marker；1：pMD18-T-F酶切回收产物；2：pW425et酶切回收产物。

图11目的片段HN和载体pW425et的回收纯化M：DL2000 Marker；M’：λ-HindIII Marker；1、2：目的片段HN回收纯化产物；3、4：pW425et载体回收纯化产物。

图12.重组质粒的提取M：λ-HindIII marker；1-6：提取的质粒。

图13.重组质粒的提取M：λ-HindIII Marker；1-2：提取的质粒。

图14.重组质粒的酶切鉴定M1：λ-HindIII marker；M2：DL2000 marker；1-2：2、3号菌质粒酶切；

图15重组表达质粒双酶切鉴定1-2：重组质粒酶切产物；M：DNA Marker DL 2000；M’：DNAλ-HindIII Marker。

图16.PCR鉴定含F基因的重组质粒M：DL2000 marker 1：PCR阴性对照2：菌株3的质粒为模板进行PCR扩增产物。

图17重组表达质粒的PCR鉴定M：DL2000 marker；1：重组表达质粒PCR产物。

图18.SDS-PAGE电泳检测F基因表达产物M：低分子量的蛋白质marker；C：空载体pW425et在E.coli X13中5h的表达产物；1-8：pW425et-F在E.coli X13中1、2、3、4、5、6、7、0h的表达产物。

图19重组蛋白SDS-PAGE分析M：低分子量蛋白Marker；C：空载体pW425et诱导4h表达产物；1-7：重组蛋白分别诱导0-6h表达产物。

图20.重组质粒pW425et-F表达产物的Western blot分析1：重组质粒pW425et-F在大肠杆菌E.coli X13中的表达产物；M：低分子量蛋白质Marker。

图21.重组蛋白Western-blot分析M：低分子量蛋白Marker；1：pW425et-HN诱导产物；2：空载体pW425et诱导产物。

图22.酶切鉴定结果M1：λ-HindIII marker；M2：DL2000 marker；1-2：2、5号菌质粒酶切；

图23重组表达质粒双酶切鉴定1：重组质粒酶切产物；M：DNAλ-HindIII Marker；M’：DNAMarker DL 2000。

图24PCR鉴定含F基因的重组质粒1：PCR阴性对照；2菌株5的质粒为模板进行PCR扩增产物：；M：DL2000 marker。

图25重组表达质粒的PCR鉴定M：DL2000 marker；1-4：重组表达质粒PCR产物

图26.SDS-PAGE电泳检测F基因在乳酸菌中的表达产物M：低分子量的蛋白质marker；C：空载体pW425et在嗜酸乳杆菌中5h的表达产物；1-3：pW425et-F在嗜酸乳杆菌中2h、4h、8h的表达产物。

图27重组蛋白SDS-PAGE分析M：低分子量蛋白Marker；C：空载体pW425et诱导4h表达产物；1-5：重组蛋白分别诱导5、4、3、2、1h表达产物。

图28Western blotting分析1：pW425et-F在嗜酸乳杆菌中4h的表达产物转印到PVDF膜的显色结果；C：空载体表达产物转印到PVDF膜的显色结果即阴性对照；M：低分子量蛋白标准转印后的染色结果。

图29重组蛋白Western-blot分析M：低分子量蛋白Marker；1：pW425et-HN诱导产物；2：空载体pW425et诱导产物。

具体实施方式

实施例1

(一)新城疫病毒F48E9株HN基因的克隆与序列分析

1主要试验材料及分子生物学试剂

(1)病毒与鸡胚

NDV F48E9标准强毒株由中国农业大学刘尚高教授惠赠；9-11日龄SPF鸡胚由哈尔滨兽医研究所实验动物室购进。

(2)菌株与载体

大肠杆菌JM109由本实验室保存，pMD-18T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

(3)主要材料与试剂

RNA提取用Trizol试剂盒为GIBCOBRL公司产品；RT-PCR试剂盒，限制性内切酶SacI、KpnI等为自宝生物工程(大连)有限公司产品；T4DNA ligase为Promega公司产品；琼脂糖为Spanish公司产品；溴化乙锭、氨苄青霉素为Sigma公司生产；溶菌酶为Benbco公司产品；酵母浸出粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品；DNA快速回收试剂盒和质粒微量快速提取试剂盒为维特洁生化技术有限公司产品。其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

(4)自制试剂

6×上样缓冲液、50×TAE、0.1mol/L CaCl2溶液、100μg/μl氨苄青霉素、0.1％的DEPC水溶液

(5)培养基

乳酸菌专用MRS培养基，LB大肠杆菌培养基，含氨苄青霉素的LB培养基。

2病毒的增殖与纯化

将NDV接种30枚10日龄的SPF鸡胚，0.2ml/枚，置37℃孵育。弃去24h死亡鸡胚，以后每天照蛋两次。收取24-72h鸡胚的尿囊液30mL，3000r/min离心15min去除杂质，上清尿囊液经18000r/min离心1h，沉淀用2mL STE(10mmol/L Tris·Cl，PH7.4；100mmmol/L NaCl；5mmol/L EDTA)悬浮，以10％蔗糖垫底，18000rpm离心1h去除杂蛋白；病毒沉淀再用30mL STE悬浮后，以18000rpm沉淀1h去除蔗糖；重新悬浮病毒沉淀于2mL STE中，-70℃保存。

3新城疫病毒总RNA的提取

用Trizol法提取新城疫病毒的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。

4引物设计与合成

参照Genebank中NDVHN序列和F序列设计合成了引物，引物序列如下：

PHN1：5′TAT GAGCTC ATG GAC CGT GT 3′

SacI

PHN2：5′GCC GGTACC TTA AAT CCC ATC 3′

KpnI

PF1：5’TACGAGCTCATGGGCCCCAAATCTTCTACC 3’

SacI

PF2：5’TGTGGTACCTCAGATTCTTGTAGTGGCCCT 3’

KpnI

PHN1和PF1含有SacI酶切位点，PHN2和PF2含有KpnI酶切位点。引物由Takara公司合成。

5F基因和HN基因的扩增、回收与克隆

(1)RT-PCR扩增目的基因：

反应体系如下：

10倍反转录缓冲液 2.5μl

上游引物Primer(5pm) 1.0μl

下游引物Primer(5pm) 1.0μl

RNase Inhibitor(40U/μl) 1.0μl

dNTP Mixture(25mmol) 4.0μl

AWV(禽源) 0.5μl

Ex Taq polymerase 0.5μl

模板RNA 5.0μl

RNase-Free-Water 9.5μl

Total V 25.0μl

PCR运行程序为：

反转录：45℃，30min

预变性：94℃，3min

变性：94℃，30s

退火：61℃，30s

延伸：72℃，90s

循环数：30个

延伸：72℃，5min

反应结束后取5μl PCR产物与10×Loading Buffer混合，进行琼脂糖凝胶电泳。结果扩增出与预期大小相符的条带，如图2，图3。

(2)F基因和HN基因的回收

将含有目的基因片断的PCR产物在1×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察，切取目的条带，称重，用维特洁公司的DNA回收试剂盒回收目的基因片断。方法按说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图4，图5。

(3)F基因与PMD-18-T的连接

将回收的目的片断与PMD-18-T载体进行连接反应，16℃连接2h；再4℃连接过夜。反应体系如下：

PMD18-T 0.5μl

RT-PCR产物 3.5μl

T4DNALigase 1.0μl

2×T4DNA Ligase Buffer 5.0μl

Total V 10.0μl

(4)连接产物转化大肠杆菌JM109感受态

①取1管感受态细胞(Competent Cell)在冰上融化(感受态细胞必须贮存在-60～80℃，现用现取)，轻摇离心管使细胞混匀；将5μl连接液加入200μl细胞中，轻弹混均，冰上放置30min；

②将离心管从冰上取出，于42℃水浴中放置90s(不摇动)；

③冰上放置5min；

④向离心管中加800μl LB(不含氨苄青霉素)，在37℃摇床上，250r/min培养4h；

⑤取200μl菌液涂布于准备好的AMP+LB琼脂平板上，37℃温箱培养过夜。

6重组载体的鉴定

在含有氨苄青霉素(终浓度200μg/ml)的LB琼脂平板上筛选阳性克隆进行鉴定。

(1)酶切鉴定

挑取其中8个白色菌落，接种于含有AMP的LB液体培养基中，37℃200rpm过夜培养后，进行质粒的小抽提。选择相对滞后的质粒分别用SacI和KpnI进行酶切，反应体系如下：

SacI 1.0μl

KpnI 1.0μl

10×BufferL 1.0μl

质粒 4.5μl

D.D.W 2.5μl

TotalV 10.0μl

37℃水浴3h

反应结束后取5μl反应产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察。结果分别在约2700bp和1700bp处各有一清晰条带如图6，在约2700bp和1662bp处各有一清晰条带如图7。

(2)PCR鉴定

以重组质粒为模板，用普通Taqplus DNA polymerase进行PCR扩增，反应体系如下：

10×PCR缓冲液 2.0μl

dNTP(2.5mmol/L) 2.0μl

上游引物Primer(50pm) 0.5μl

下游引物Primer(50pm) 0.5μl

MgCl₂ 4.0μl

Taq plus polymerase 0.25μl

模板质粒 1.0μl

D.D.W 14.75μl

液体石蜡 25.0μl

Total V 50.0μl

PCR运行程序为：

预变性：94℃，3min

变性：94℃，30s

退火：61℃，30s

延伸：72℃，90s

循环数：30个

延伸：72℃，5min

反应结束后取5μl PCR产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察。结果扩增出与预期大小相符的条带如图8，图9。

(3)测序鉴定与序列分析

将上述通过质粒小量提取、酶切鉴定和PCR鉴定的阳性质粒送往TaKaRa公司测序，并将测序结果与Genbank上已知的F序列进行同源性比较分析。结果显示：本实验所得F基因序列与已知序列同源性达到99.8％，HN序列同源性达到99.4％。

(二)新城疫乳酸菌表达载体pW425et-F和pW425et-HN的构建

1主要试验材料及分子生物学试剂

(1)菌种与质粒

ThyA缺陷型大肠杆菌X13由本实验室筛选保存，质粒PMD18-T-F和PMD18-T-HN由实验一构建，质粒载体pW425et由本实验室构建保存。

(2)新城疫病毒高免血清

新城疫病毒高免血清由吉林大学畜牧兽医学院丛彦龙博士惠赠。

(3)酶和试剂

T4DNA连接酶购自Promega(北京)生物技术有限公司；核酸分子量标准、限制性内切酶SacI和KpnI为TaKaRa公司产品；琼脂糖为Spanish公司产品；溶菌酶、DNA凝胶回收与纯化试剂盒为杭州维特洁生化技术有限公司产品；酵母浸出粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品；红霉素、DL-苏氨酸、DTT、RNaseA为Sigma公司产品；辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG，购置于鼎国技术公司；PVDF转移膜Gleman公司产品；其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

(4)培养基

LB培养基(含红霉素)LB液体培养基(无红霉素)

(5)自制试剂

SDS-PAGE试剂、0.5mol/L EDTA(pH 8.0)、50×TAE、0.1M CaCl2溶液、20μg/μL红霉素、5×贮存液、1.5mol/L Tris·Cl(pH 8.8)、1mol/L Tris·Cl(pH 6.8)、染色液、脱色液2HN基因、F基因和基础载体pW425et的回收、连接及鉴定

(1)外源片段F、HN和双标记表达载体pW425et的获得

将大抽提的双标记表达载体pW425et和pMD18-T-F质粒用SacI和KpnI限制性内切酶进行酶切，反应体系如下：

SacI 4.0μl

KpnI 4.0μl

10×Buffer L 4.0μl

pW425et/pMD18-T-F 20.0μl

D.D.W 8.0μl

TotalV 40.0μl

37℃，水浴作用4h

同样将大抽提的双标记表达载体pW425et和pMD18-T-HN质粒用SacI和KpnI限制性内切酶进行酶切，反应体系同上。

酶切完毕后，各取酶切产物1μl与10×LoadingBuffer混合，进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。如果酶切完全，用维特洁回收纯化试剂盒回收纯化F和pW425et的片断，以用于下一步连接。结果如图10，图11。

(2)载体与外源片断的连接

连接反应体系如下：

载体pW425et 1.0μl

HN基因(F基因) 4.0μl

10×T₄DNA连接酶Buffer 1.0μl

T₄DNA连接酶 1.0μl

D.D.W 3.0μl

Total V 10.0μl

16℃连接2h，4℃过夜保存

(3)连接产物的转化

①取1管X13感受态细胞(Competent Cell)在冰上融化，轻摇离心管使细胞混匀；将5μl连接液加入到感受态细胞中，轻弹混均，冰上放置30min；

②将离心管从冰上取出，于42℃水浴中放置90s(不摇动)；

③立即放于冰上5min；

④向离心管中加800μl LB，在37℃摇床上培养8h(190-220r/min)；

⑤4℃5000r/min离心5min；

⑥弃掉上清，加100μl LB，用移液器吸打混匀，使沉淀悬浮。用曲玻棒将其均匀涂布于含有红霉素(终浓度200μg/mL)LB琼脂平板上，置于37℃温箱中过夜培养。

(4)重组表达质粒的鉴定

挑取在红霉素平板上生长良好的菌落，接种于5mL含红霉素的LB培养基中，37℃200r/min过夜培养。进行小提质粒鉴定，进行1％琼脂糖凝胶电泳观察。结果如图12，图13。

①酶切鉴定

选择可能含有目的片段的质粒分别用SacI和KpnI进行酶切，反应体系如下：

SacI 1.0μl

KpnI 1.0μl

10×Buffer L 1.0μl

质粒 4.5μl

D.D.W 2.5μl

TotalV 10.0μl

37℃水浴3h

反应结束后取5μl反应产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。结果如图14，图15。得到与预期大小相符的条带。

②PCR鉴定

以重组质粒为模板，用普通Taq plus DNA polymerase进行PCR扩增，反应体系如下：

上游引物 1.0μl

下游引物 1.0μl

dNTP 2.0μl

10×Taq Polymerase Buffer 5.0μl

MgCl₂ 3.5μl

Taq plusDNA poly merase 0.5μl

模板 2.0μl

D.D.W 10.0μl

液体石蜡 25.0μl

TotalV 50.0μl

PCR运行程序为：

预变性：94℃，5min

变性：94℃，40s

退火：58℃，50s

延伸：72℃，90s

循环数：30个

延伸：72℃，10min

保存：4℃，10min

反应结束后取5μl PCR产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察结果。结果如图16，图17。得到与预期大小相符的条带。

3SDS-PAGE分析

(1)经双酶切、PCR鉴定为阳性的重组表达质粒接种于5mL含红霉素的LB液体培养基中，37℃200r/min培养过夜；

(2)取1ml接种于50mL含红霉素的LB液体培养基中，在培养基中添加60μl IPTG，37℃250r/min培养至OD600为0.6-0.8。每隔1h取一次菌液，取至7h。以同样的方法诱导含空载体pW425et的E.coli X13作对照；

(3)将各个时间诱导收获的菌液OD600均调至0.6-0.8，取菌液1.8mL，12000r/min离心5min，弃上清；

(4)沉淀中加入50μl蒸馏水，1×SDS上样缓冲液40μl，DTT 10μl，沸水煮10min，20℃，12000r/min离心10min，按《分子克隆实验指南》方法进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳。结果如图18，图19。表达的分子量与预期的相同。

4Western blotting分析

SDS-PAGE凝胶电泳后，取出凝胶，将6张转印滤纸、硝酸纤维素膜剪成与凝胶同样大小，在转印缓冲液中浸泡30min。依次放置滤纸(3层)、硝酸纤维素膜、凝胶、滤纸(3层)，放置每一层均用玻璃棒擀走气泡(整个操作在转印液中进行)，装入转印夹中，转印凝胶侧接负极，硝酸纤维素膜侧接正极，转印电泳槽置冰浴中，200mA恒流转印1h。转印结束后，按加样孔的位置剪下分子量标准Marker的膜条用氨基黑染色，观察转印效果。其余部分置于封闭液BSA中，室温摇动封闭1h。取出膜置于用PBS 1∶20稀释的NDV阳性血清中，37℃振摇2h，用PBS洗涤3次，每次5min，加用封闭液1∶500稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG中，37℃振摇2h，用PBS洗涤3次，加底物(30mg联苯胺溶于pH7.6Tris-Cl 500mL，加入40μl 3％过氧化氢)显色。结果如图20，图21。在66kD和59KD处有一条蛋白印迹，说明该表达产物可与鸡新城疫病毒多克隆抗体反应，具有反应原性。

(三)重组质粒pW425et-HN在乳酸菌中的表达

1主要试验材料及分子生物学试剂

(1)菌种与质粒

重组质粒pW425et-HN和pW425et-F由本人构建；嗜酸乳杆菌，分离自鸡肠道内。

(2)酶和试剂

dNTP、EX-Taq DNA聚合酶；SacI、KpnI购自大连宝生物工程公司；酵母浸出粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品；红霉素为Sigma公司产品，所用所有试剂均为分析纯。

仪器：BIO-RAD电穿孔仪，购置于美国BIO-RAD公司。

(3)培养基

MRS培养基

(4)自制试剂

PEB电击缓冲液、1％甘氨酸

2pW425et-HN和pW425et-F重组质粒在乳酸菌中的表达

(1)重组质粒pW425et-HN的纯化

①将3mL粗制重组质粒移至30mL洁净的离心管中，在冰浴中冷却至0℃；

②加入3mL冰预冷的5mol/L Licl，混匀，于4℃，12000r/min离心10min；

③上清转移至另一洁净的离心管中，加等体积异丙醇，混匀，室温12000r/min离心10min回收核酸；

④小心倒去上清，倒置管口，使液体流干，室温下用70％乙醇洗沉淀和管壁，小心将乙醇除去，但保持沉淀湿润；

⑤用500μl含RNaseA TE(pH 8.0)溶解核酸沉淀，将溶液移至Eppendorf管中，室温放置30min；

⑥用酚：氯仿抽提一次，再用氯仿抽提一次，然后用乙醇沉淀法回收DNA；

⑦1ml灭菌水溶解质粒DNA沉淀，加0.5mL PEG-MgCl₂溶液，室温放置10min，室温最大速离心20min，回收DNA；

⑧沉淀用0.5mL 70％乙醇重悬去除聚乙二醇(PEG)，最大速离心5min，回收核酸；

⑨吸去乙醇，重复上一步，第二次洗涤后，在离心管架上放置10-20min，使乙醇完全挥发；

⑩湿润的质粒沉淀用500μl TE(pH8.0)溶解，分装于-20℃保存备用。

(2)嗜酸乳酸杆菌受体菌株的筛选

将40日龄左右的健康鸡，以断颈方式宰杀，体表消毒。在无菌条件下取腺胃、十二指肠、盲肠等。取内容物0.1g，以灭菌的生理盐水将样品稀释成10^-1、10^-3、10^-6、10^-9等浓度。选择不同的稀释度，用灭菌的200μltip头取100μl稀释液接种于各自的选择培养基MRS中，用曲玻棒推匀，以利于单个菌落的分离筛选。在厌氧罐中37℃培养24-72h。根据嗜酸乳酸杆菌在MRS选择培养基上菌落的形态、大小、革兰氏染色特点、菌体排列和生化特性等特点，可以筛选出嗜酸乳酸杆菌。

(3)嗜酸乳杆菌感受态菌的制备

将乳酸菌单个菌落培养至OD₆₀₀值为0.3-0.4时，以2％的接种量转移到含有1％甘氨酸的MRS培养液中，摸索乳酸菌不同生长时期对电转化效率的影响。将生长到最佳时期的乳酸菌，8000r/min离心5min收集菌体。用冰冷无菌的电击转化缓冲液(PEB-2)悬浮洗2-3次后，悬浮于电击缓冲液，冰浴5min，即可作为重组质粒pW425et-HN的感受态。

(4)电转化

取5-10μl(含3μg质粒)的重组质粒pW425et-HN与上述方法制备的200μl冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液混合[90，91]，移入预冷的电击杯中(间距0.2cm)，置于冰上静止

5min，摸索电压及脉冲时间。根据最适的条件，释放脉冲[92-94]。电击完毕后，将电击杯置于冰上静止5min。将电击杯中的液体吸入到Eppendorf管中，同时加入800μl、37℃预热的MRS(补加0.5mol/L)蔗糖培养液，37℃厌氧培养3-4h。取100μl转化后产物，涂在含红霉素(200μg/mL)的固体MRS平板上，37℃静置厌养培养48h，观察菌落形态并记录结果。

3重组质粒的鉴定

(1)酶切鉴定

对筛选的菌落进行质粒小量提取，选取可能含有目的片段的重组质粒，用SacI和KpnI双酶切1％琼脂糖凝胶电泳条带滞后的乳酸菌重组质粒pW425et-HN和pW425et-F，双酶切体系如下：

SacI 1.0μl

KpnI 1.0μl

10×Buffer L 1.0μl

质粒 4.5μl

D.D.W 2.5μl

Total V 10.0μl

37℃水浴3h

双酶切反应后取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图22，图23。得到与预期大小相符的条带。

(2)PCR鉴定

选择质粒提取和双酶切鉴定疑似阳性的质粒DNA进行PCR鉴定，PCR反应体系如下：

上游引物 0.5μl

下游引物 0.5μl

dNTP 3.0μl

10×Taq Polymerase Buffer 5.0μl

MgCl₂ 4.0μl

Taq plusDNA poly merase 1.0μl

模板 1.0μl

D.D.W 10.0μl

液体石蜡 25.0μl

TotalV 50.0μl

PCR运行程序为：

预变性：94℃，5min

变性：94℃，40s

退火：58℃，50s

延伸：72℃，90s

循环数：30个

延伸：72℃，10min

保存：4℃，10min

反应结束后取5μl PCR产物于1％琼脂糖凝胶上进行电泳，观察。结果如图24，图25。得到与预期大小相符的条带。

4SDS-PAGE分析

将各个时间诱导收获的菌液均调至OD₆₀₀为0.7，取菌液1.4ml，4℃8000r/min离心10min，收集菌体。向菌体沉淀中加入40μl去离子水裂解细菌，再加入10μl DTT和50μl1×SDS凝胶上样缓冲液，混匀后，于沸水中煮5min，12000r/min离心10min，取上清15μl按《分子克隆》方法进行12％凝胶SDS-PAGE分析。结果如图26，图27。在乳酸菌中表达的分子量与预期的相同。

5Western-blotting分析

表达产物经SDS-PAGE后，按《分子克隆》中方法以BIO-RAD系统电转移至PVDF转移膜上，经牛血清白蛋白封闭后，依次加入新城疫阳性血清、HRP标记的兔抗鸡IgG，最后在联苯胺(DAB)溶液中显色并观察结果。结果如图28，图29。在66kD和59KD处有一条蛋白印迹，说明该表达产物可与鸡新城疫病毒多克隆抗体反应，具有反应原性。

Claims

1.一种新城疫病毒HN基因和F基因重组乳酸菌，它是由下述方法制成的：

a、新城疫病毒F48E9株HN基因和F基因的克隆与序列分析

根据Genebank中NDV F48E9株的HN基因序列和F基因序列，分别设计出带有SacI和KpnI酶切位点的一对引物，以NDV F48E9株的总RNA为模板，应用RT-PCR方法扩增出HN基因和F基因，并将其克隆至pMD-18T载体中，进行核苷酸序列分析；

所述的引物：

PHN1：5′TAT GAGCTC ATG GAC CGT GT 3′

PHN2：5′GCC GGTACC TTAAAT CCC ATC 3′；

PF1：5’TACGAGCTCATGGGCCCCAAATCTTCTACC 3’

PF2：5’TGTGGTACCTCAGATTCTTGTAGTGGCCCT 3’；

b、新城疫病毒重组表达载体pW425et-HN和pW425et-F的构建及在大肠杆菌中的表达SacI和KpnI双酶切重组质粒pMD18-T-HN和pMD18-T-F，将纯化的HN基因和F基因亚克隆至双标记表达载体pW425et中，构建出在大肠杆菌与乳酸菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-HN和pW425et-F；

c、重质粒pW425et-HN和pW425et-F在乳酸菌中的表达

应用电转化技术将已构建的新城疫病毒重组质粒pW425et-HN和pW425et-F分别转化至嗜酸乳杆菌感受态中;对筛选到的阳性克隆，采用SDS-PAGE进行鉴定，可见66kD的融合蛋白和59kD的融合蛋白；

所述的嗜酸乳杆菌感受态是将40日龄的健康鸡，以断颈方式宰杀，体表消毒；在无菌条件下取腺胃内容物0.1g，以灭菌的生理盐水将样品稀释成10^-1、10^-3、10^-6、10^-9浓度；选择不同的稀释度，用灭菌的200μl tip头取100μl稀释液接种于各自的选择培养基MRS中，用曲玻棒推匀，以利于单个菌落的分离筛选；在厌氧罐中37℃培养24-72h；根据嗜酸乳酸杆菌在MRS选择培养基上菌落的形态、大小、革兰氏染色特点、菌体排列和生化特性的特点，可以筛选出嗜酸乳酸杆菌；将乳酸菌单个菌落培养至OD₆₀₀值为0.3-0.4时，以2％的接种量转移到含有1％甘氨酸的MRS培养液中，摸索乳酸菌不同生长时期对电转化效率的影响；将生长到最佳时期的乳酸菌，8000r/min离心5min收集菌体；用冰冷无菌的电击转化缓冲液PEB-2悬浮洗2-3次后，悬浮于电击缓冲液，冰浴5min。