KR101046001B1 - 돼지유행성 설사 또는 돼지전염성 위장염에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 자돈 사료용 첨가물 조성물 - Google Patents

돼지유행성 설사 또는 돼지전염성 위장염에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 자돈 사료용 첨가물 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium)에 대한 IgY, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)에 대한 IgY, TGEV(Transmissible gastroenteritis virus)에 대한 IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea)에 대한 IgY 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY 중 선택되는 어느 하나 이상의 IgY를 함유하는 난황; 프락토올리고당; 비타민 B6; 이노시톨; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 또는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 이상의 미생물; 및 정제수;를 혼합한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 자돈 사료용 첨가물 조성물에 관한 것으로, 50%이상의 폐사율을 야기하는 돼지유행성 설사(PED) 또는 100%의 폐사율을 야기하는 돼지전염성 위장염(TGE)으로 인한 양돈 산 업에 막대한 경제적 손실을 예방할 수 있다
난황, 대장균(Escherichia coli), 사료, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), 살모넬라 티피뮤리엄, 자돈, 항체, IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea), TGEV(Transmissible gastroenteritis virus),

Description

돼지유행성 설사 또는 돼지전염성 위장염에 대한 항체를 지닌 난황을 함유하는 자돈 사료용 첨가물 조성물{Composition of food additives of Piglets containing IgY from egg yolk for preventing of porcine epidemic diarrhea or transmissible gastroenteritis}
본 발명은 자돈 사료용 첨가물 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돼지유행성 설사(PEDV) 또는 돼지전염성 위장염 바이러스(TGEV)에 대한 특이적인 항체를 함유하는 난황을 포함하는 것을 특징으로 하는 자돈 사료용 첨가물 조성물에 관한 것이다.
돼지전염성 위장염 바이러스(transmissible gastroenteritis virus; TGEV)와 돼지유행성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; PEDV)는 코로나바이러스과에 속하는 바이러스로 모든 일령의 돼지에서 감수성이 있으나 특히 어린 연령일수록 발병률과 치사율이 높다
돼지유행성 설사(PED)는 포유자돈에서 50%이상의 폐사율을 야기하고 급성의 심한 수양성 설사, 구토, 식욕부진, 원기저하 등의 임상증상을 보인다.
돼지전염성 위장염(TGE)는 흡수불량성 설사와 구토를 일으켜 탈수를 유발하여 2주령 이하의 포유자돈에서 폐사율이 거의 100%에 달하여 양돈산업에 막대한 경제적 손실을 주고 있는데 자돈에서의 빠른 전파와 높은 폐사율을 제외하고는 PED와 매우 유사하다.
한편, TGEV는 1954년 경기도의 수입종돈으로부터 국내에 전파된 것으로 추정하고 있고, 이후 겨울철에 꾸준한 발생을 보였으며, PEDV는 1993년 국내에서 처음 발생보고되었다. 근래에는 PED가 TGE 보다 월등히 많은 발생을 보이고 있어 양돈농가에 경제적인 피해를 유발하고 있으며, 2003년 12월까지 한 해 동안 국립수의과학검역원에서 발표한 자료에 의하면 TGE는 1건에 300두에서 발생한 반면, PED의 경우 90건에 40,297두가 발생하였고 2004년도에도 45건에 9,195두에서 발생되었다.
한편, PED가 빈번하게 발생되고 있는 아시아의 양돈국가에서는 PED를 예방하기 위하여 임신돈에 생백신을 접종하여 고역가의 모체이행항체를 포유자돈에 부여하는 방법, 감염자돈의 장유제액으로 모돈에 인공감염시켜 유즙면역을 자극시키는 방법등의 여러 가지 방법을 모색하여 왔다.
TGE의 경우에는 강독백신, 약독화 백신, 불활화 백신, 서브유닛(subunit) 백신을 경구, 비강, 근육, 피하 또는 유방에 접종하여 국소면역항체 및 혈중항체를 높여 주는 방법을 많이 이용하고 있다
그러나 상기의 같은 방법은 국내의 열악한 사양환경이나 양돈 농가의 인식부족으로 인하여 현장에서 손쉽게 사용할 수 없어 PED와 TGE를 예방하는데 어려움이 있다.
이에 본 발명은 농가에서 사용하기 편하면서 천연성분으로 구성되어 사람들에게 거부감이 없고, 항생제 내성 및 부작용이 발생하지 않는 자돈 사료용 첨가물 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium)에 대한 IgY, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)에 대한 IgY, TGEV(Transmissible gastroenteritis virus)에 대한 IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea)에 대한 IgY 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY 중 선택되는 어느 하나 이상의 IgY를 함유하는 난황; 프락토올리고당; 비타민 B6; 이노시톨; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레 움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 또는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 이상의 미생물; 및 정제수;를 혼합한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 자돈 사료용 첨가물 조성물을 제공한다.
이하 본 발명의 과제 해결 수단에 대해 상세히 설명하고자 한다.
돼지유행성 설사(Porcine epidemic diarrhea; PED)는 구토와 수양성 설사를 주증상으로 하는 소화기 질병으로, 소장벽이 얇아지고 황색 수양성 액체가 충만하다. 포유자돈에서 50%이상의 폐사율을 야기하고 구토, 식욕부진, 원기저하 등의 임상증상을 보인다.
돼지전염성 위장염(Transmissible gastroenteritis; TGE)은 고전염성, 급성 전염병으로, 겨울과 봄 사이에 다발하며, 소변으로는 바이러스가 배설되지 않고 변으로 배설된다. 흡수불량성 설사와 구토로 인한 탈수를 유발하여 1주일령 미만의 포유자돈에서 폐사율이 거의 100%에 달하고, 자돈에서 빠른 전파와 높은 폐사율의 특징이 있다.
본 발명은 상기에서 설명한 어린 연령일수록 발병률과 치사율이 높은 돼지 전염성 위장염 또는 유행성 설사의 발병을 예방하기 위해 반드시 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium)에 대한 IgY, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)에 대한 IgY, TGEV(Transmissible gastroenteritis virus)에 대한 IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea)에 대한 IgY 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY 중 선택되는 어느 이상의 IgY를 함유하는 난황을 포함한다.
난황항체는 조류의 면역체계를 이용한 수동면역의 한 형태로, 조류 이하의 난생동물의 경우는 어미 닭이 능동면역으로 획득한 면역항체는 난황 중으로 이행되어 자손에게 면역능이 전해진다. 난황 중의 항체 중 가장 많은 비율을 차지하는 것은 혈중의 IgG와 유사한 IgY이다. 이는 분자량이 약 200∼220kDa으로 포유류의 IgG보다 크며 포유류의 항체보다 장점을 가지고 있기 때문에 이용범위가 넓다.
한편, 돼지유행성 설사 또는 전염성 위장염을 유발하는 바이러스에 대한 항체 IgY를 함유하는 난황을 생산하기 위해 본 발명은 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), TGEV(Transmissible gastroenteritis virus), PEDV(Porcine epidemic diarrhea) 및 대장균(Escherichia coli)을 배양하여 백신을 제조한 후, 백신을 일정기간 간격으로 산란계에 3차 접종까지 실시하였다. 접종 후, 항체역가를 측정한 결과, 3차 접종 후인 4주부터 가장 높은 역가를 나타내었고, 항체역가가 감소하기 시작한 10주에 추가 접종을 실시한 후, 5~14주까지의 항체역가가 높은 계란의 난황만을 수거하여 수득하였다.
한편, 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물은 프락토올리고당을 포함하는데, 프락토올리고당은 비피더스균이나 유산균의 증식효과가 있고, 살모넬라(Salmonella)균과 크로스트리디엄 퍼프리진(Clostridium perfringens)를 억제한다. 특히, 본 발명에서는 감미료로 사용되어 자돈이 사료 섭취시 나타나는 거부감 을 완화시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물은 비타민 B6을 포함하는데, 비타민 B6은 자돈의 생장을 촉진하면서 피부염을 예방할 수 있다.
한편, 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물은 이노시톨을 포함하는데, 이노시톨은 당과 같이 결정성이 좋고 감미를 가지기 때문에 자돈이 사료 섭취시 나타나는 거부감을 완화시킬 수 있을 뿐만 아니라, 자돈의 발육을 촉진하며 동맥경화 예방한다.
한편, 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 또는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 이상의 미생물을 포함하는데, 상기의 미생물은 자돈의 섭취시 자돈에 대해 항생, 항바이러스, 면역 증강 효과가 있다.
한편, 본 발명의 실험예에서는 본 발명에 포함되는 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium)에 대한 IgY, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)에 대한 IgY, TGEV(Transmissible gastroenteritis virus)에 대한 IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY를 함유하는 난황의 돼지유행성 설사(PED)와 돼지전염성 위장염(TGE) 대한 예방효과를 측정하였는데, 그 결과, 대조군에 비해 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus), PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus) 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 항체가 높게 유지되었고, 자돈의 분에서 분리된 대장균 수가 적었으며, 소장과 분에서 검출된 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus), PEDV(Porcine epidemic diarrhea)가 감소하였다.
상기와 같은 특이항체 난황을 포함하는 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물을 제조하여 직접 자돈에 섭취시킨 결과, 대조군에 비해 사고두수가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었고, 대조군의 사고율이 28%인 것에 비해 실험군은 4.7%를 나타내 본 발명의 우수한 효과를 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물은 바람직하게 난황 0.05~9.5 중량%; 프락토올리고당 47.6~71.6 중량%; 비타민 B6 0.01~0.11 중량%; 이노시톨 0.02~0.22 중량%; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 또는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 이상의 미생물 0.05~1.9 중량% ; 및 정제수 24.2~44.2 중량%로 조성되는 것이 좋다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물은 50%이상의 폐사율을 야기하는 돼지유행성 설사(PED) 또는 100%의 폐사율을 야기하는 돼지전염성 위장염(TGE)으로 인한 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 예방할 수 있다.
또한, 천연재료로 구성된 자돈 사료용 첨가물을 사용함으로써 소비자들의 거부감을 감소시킬 수 있다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 살모넬라 티피뮤리엄( Salmonella Tiphimurium )에 대한 IgY , 살모 넬라 콜레라수이스( Salmonella Choleraesuis )에 대한 IgY , TGEV( Transmissible gastroenteritis virus )에 대한 IgY , PEDV ( Porcine epidemic diarrhea )에 대한 IgY 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 IgY 을 함유하는 난황 제조
실시예 1은 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium)에 대한 IgY, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)에 대한 IgY, TGEV(Transmissible gastroenteritis virus)에 대한 IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea)에 대한 IgY 및 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY을 함유하는 난황을 제조하였다.
단계 1: 항원생산
살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis), TGEV(Transmissible gastroenteritis virus), PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus) 및 대장균(Escherichia coli)을 블러드아가(blood agar)를 이용하여 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 1~2일 혐기배양하였다. 콜로니(colony)를 확인한 후, 준비된 BHI broth에 접종하고 37℃ 쉐이킹인큐베이터(shaking incubator)에서 1~2일 동안 배양하였다. 수득된 배양액을 0.3% 포르말린(formalin)으로 불활화시킨 후, 10000Xg에서 원심분리한 다음 0.1% 포르말린(formalin)으로 다시 불활화를 시켰다. 그리고 스펙트로포토메 터(Spectrophotometer)를 이용하여 1012 cell/ml로 농도를 맞췄다.
단계 2: 백신 제조
상기 단계 1에서 배양된 균주와 미네랄오일(ISA 70)을 3:7 비율로 혼합한 후, 균질기(Hmogenizer)를 이용하여 유화시킨 후, 무균검사와 불활화 확인시험을 거쳤다.
단계 3: 살모넬라 티피뮤리엄( Salmonella Tiphimurium )에 대한 IgY , 살모넬 라 콜레라수이스( Salmonella Choleraesuis )에 대한 IgY , TGEV( Transmissible gastroenteritis virus )에 대한 IgY , PEDV ( Porcine epidemic diarrhea )에 대한 IgY 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 특이항체 난황의 생산
상기 단계 2에서 제조된 백신을 22주령된 Hy-Line Brown 산란계에 1ml씩 2주 간격으로 가슴에 접종하였으며, 항체 역가의 감소시기인 3차 접종 후, 6주 후에 'Boosting'을 실시하였다.
난황 중의 특이항체 난황의 역가는 'Indirect ELISA Method'를 이용하였으며, 측정 샘플은 1차 접종 후부터 추가접종 후 2주까지의 난황을 모아 주별로 측정하였다. 난황항체의 활성은 Mine(1997)가 사용한 ELISA 방법을 응용하여 측정하였다.
항원을 200ng/ml의 농도로 100㎕씩 96 웰 폴리스틸렌 프레이트(well poly styrene plate)에 코팅하여 4℃에서 하룻밤 방치하였다. PBS-T(phosphate buffer saline, 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 세척 후, 2% BSA가 함유된 PBS 버퍼로 1h/37℃ 블라킹(Blocking)하며 상기와 같은 방법으로 세척하였다. 음성대조군, 양성대조군 및 샘플을 2X씩 희석하여 웰(well)당 100㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 적절히 희석된 이차 항체를 샘플처리와 같은 방법으로 반응시키고, 10분간 발색시킨 후, 492mm에서 ELISA Reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
단계 4: 난황분말 제조
IgY의 항체 역가가 음성대조군의 160X 이상이 되는 5주부터 14주까지의 계란을 집중적으로 집란하여 할란 후 난황만을 수거하였으며 이를 동결건조하여 난황분말(이하, '특이항체 난황분말'이라고 칭함)을 생산하였다.
하기 실험예에서는 특이항체 난황(IgY)을 경구 투여한 실험군과 투여하지 않은 대조군간의 통계처리는 ＳＡＳ　ｐａｃｋａｇｅ（Ver 6.12, USA)를 이용하여 Duncan's new multiple ttest 에 의하여(P<0.05) 수준에서 유의성 검정을 진행하였다.
실험예 1: 특이항체 난황으로부터 수득된 IgY 를 자돈에 투여
산차를 고려하여 분만중인 모돈의 초유를 섭취하지 않은 포유자돈 20두를 대상으로 실시하였다. 실험군(Group I)은 10두의 포유자돈을 초유전부터 3일간 2㎖씩 특이항체 난황분말(IgY)을 경구투여하였으며, 대조군(Group Ⅱ)은 10두로써 동일한 조건하에서 특히항체 난황분말을 투여하지 않고 생리식염수를 3일간 2㎖씩 투여하였다. 실험군과 대조군의 포유자돈은 각각의 실험돈방에 넣어 24시간 동안 적응시 킨 후 4일령에 공격접종을 실시 시기별로 채혈하고 체중을 측정하였다(도 1).
실험기간 동안에는 대용유(돈돈밀크, (주)제일제당사료)를 제조사의 권장사항에 따라 급여하였고 음수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 돈방주위는 정기적으로 소독하였다.
실험예 2: TGEV ( Transmissible gastroenteritis virus ), PEDV ( Porcine epidemic diarrhea ) 및 대장균( Escherichia coli )에 대한 항체 역가 검사
상기 실험예 1에서 특이항체 난황분말을 경구투여한 자돈의 수동면역상태를 확인하기 위한 항체역가검사를 위하여 경정맥에서 혈액을 채취하여 응고시킨 후 3,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액을 이펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 다음 56℃에서 30분간 비동화시킨 뒤 사용하였다. ELISA로 항체 역가 검사를 실시하였다.
ELISA를 이용한 항체 역가 검사 결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었고, 이를 정리하여 하기 표 1에 나타냈다.
처리 PED ELISA 역가
0 7 10
Group Ⅰ(실험군) 0.66±0.17a 0.65±0.10a 0.72±0.08a
Group Ⅱ(대조군) 0.68±0.15a 0.59±0.07a 0.59±0.08b
처리 TGE ELISA 역가
0 7 10
Group Ⅰ(실험군) 0.75±0.34a 0.84±0.05a 0.85±0.07b
Group Ⅱ(대조군) 0.86±0.13a 0.72±0.33a 0.72±0.11a
처리 대장균 ELISA 역가
0 7 10
Group Ⅰ(실험군) 0.66±0.07a 0.79±0.07a 0.79±0.08a
Group Ⅱ(대조군) 0.68±0.15a 0.74±0.11a 0.72±0.06b
항체 역가를 검사한 결과(표 1), PEDV의 경우, 공격접종 전, 공격접종 후 7일 및 10일 실험군과 대조군의 평균 혈청항체가는 각각, 공격접종 전에는 0.66±0.17, 0.68±0.15, 공격접종 후 7일에는 0.65±0.10, 0.59±0.07, 공격접종 후 10일에는 0.72±0.08, 0.59±0.08이었다. TGEV의 경우, 공격접종 전, 공격접종 후 7일 및 10일 실험군과 대조군의 평균 혈청항체가는 각각, 공격접종 전에는 0.75±0.34, 0.86±0.13, 공격접종 후 7일에는 0.84±0.05, 0.72±0.33, 공격접종 후 10일에는 0.85±0.07, 0.72±0.11이었다. 대장균의 경우에는 공격접종 전, 공격접종 후 7일 및 10일 실험군과 대조군의 평균 혈청항체가는 각각, 공격접종 전에는 0.66±0.07, 0.68±0.15, 공격접종 후 7일에는 0.79±0.07, 0.74±0.11, 공격접종 후 10일에는 0.79±0.08, 0.72±0.06이었다.
PEDV는 공격접종한 대조군은 공격접종 후 7일에서 항체가가 다소 감소하였으며 공격접종 후 10일에서는 공격접종 후 7일과 비슷한 상태를 유지하였다. 특이항체 난황 투여 후 PEDV를 공격접종한 실험군은 공격접종 후 7일까지는 별다른 변화를 보이지 않았으며 공격접종 후 10일에서는 다소 증가하였다.
TGEV를 공격접종한 대조군은 공격접종 후 7일에서 공격접종 당일에 비해 현저하게 감소하였으며 공격접종 후 10일에서는 공격접종 후 7일과 별다른 변화를 보이지 않았다. 특이항체 난황을 투여 후 TGEV를 공격접종 한 실험군은 공격접종 후 7일에서 현저하게 증가하였으며 공격접종 후 10일에서는 공격접종 후 7일에 비해 약간의 증가만 보였다.
대장균을 공격접종한 대조군은 공격접종 후 7일과 10일에 약간 증가하였으나, 특이항체난황을 투여한 후, 대장균을 공격접종한 실험군은 공격접종 후 7일과 10일에 대조군보다 증가율이 높았다.
실험예 2: 자돈의 분에서 분리된 대장균 수 측정
본 실험예 2에서는 상기 실험예 1에서 특이항체 난황분말을 경구투여한 자돈의 분에서 분리된 대장균 수를 측정하였다.
측정결과(도 5), 대장균을 공격접종한 대조군보다 특이항체 난황분말을 투여한 후, 대장균을 공격접종한 실험군에서 분리된 대장균 수가 적은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: 특이항체 난황을 투여한 자돈의 소장과 분에서 RT - PCR 에 의한 PEDV, TGEV 검출
상기 실험예 1에서 PEDV, TGEV를 공격접종한 자돈의 분변을 통한 PEDV, TGEV의 배출 여부를 조사하기 위해 매일 소독된 면봉으로 실험자돈의 직장에서 분변을 채취하였다. 실험도중에 폐사한 실험자돈의 소장에서 PEDV를 확인하기 위하여 소장조직을 페스틀(pestle)로 분쇄하여 멸균된 500㎕ PBS(pH 7.2)에 넣어 충분히 혼합시킨 다음 14,000 rpm에서 20분간 원심하여 상층액을 취하여 -70℃에 보존하여 RT-PCR을 실시하였다.
PEDV를 특이적으로 검출하기 위해 'forward primer'는 5'GGGCGCCTGTATAGAGTTTA3', 'reverse primer'는 5'AGACCACCAAGAATGTGTCC3'로 412bp 크기의 프라그먼트(fragment)가 증폭되도록 설계하였다.
TGEV를 특이적으로 검출할 수 있는 것으로 'forward primer'는 5'GATGGCGACCAGATAGAAGT3', 'reverse primer'는 5'GCAATAGGGTTGCTTGTACC3'로 612bp 크기의 프라그먼트(fragment)가 증폭되도록 설계하였다.
RNA 추출
분변과 소장조직에서 RNA 추출은 RNeasy Mini kit(QIAGEN, Germany)를 사용하여 실시하였다.
역전사 반응( Reverse transcription ; RT )
역전사 반응은 RNA 템프레이트(template) 5㎕, 0.2μM의 1쌍의 'reverse primer', 디에틸피로카르보네이트(diethylpyrocarbonate; DEPC) 처리된 증류수 31㎕, 10×RT buffer(MBI, Lithuania), 0.2mM dNTPs (MBI), 40 unit RNasin(Promega, USA), 2.5 mM MgCl2(Promega)를 첨가하여 65℃에서 10분간 반응시킨 뒤 200unit MBI(Molony murine leukemia virus reverse transcriptase)를 첨가하여 50㎕의 반응액으로 42℃에서 1시간, 94℃에서 5분으로 1 사이클(cycle)을 시행하여 cDNA를 합성하였다.
중합효소 연쇄반응( PCR )
역전사 반응에서 합성된 5㎕ cDNA에 0.2 μM의 프라이머(primer), 10× PCR 버퍼(buffer), 2.5 unit Taq DNA 폴리머라제(polymerase), 0.2mM dNTPs, 2.5mM MgCl2, 멸균된 증류수 32㎕를 첨가한 50㎕의 반응액을 94℃ 5분, 51.5℃ 45초, 72℃ 1분의 반응조건에서 1회 시행한 다음 계속하여 95℃ 45초, 51.5℃ 45초, 72℃ 1분의 반응조건에서 30회 반복하였고 51.5℃ 45초, 72℃5분간 반응조건에서 1회 시행하였다.
증폭된 PCR산물의 확인은 TAE 버퍼(40 mM Trisacetate, 1mM EDTA, pH 8.0)를 전해질로 사용한 1％ 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 실시한 후, 40 mM 에티디엄 브로마이드(etidium bromide)용액에서 겔(gel)을 염색하여 'UV transilluminator(Vilberlourmat, France)'로 생성된 밴드(band)를 확인하였으며 DNA 마커(marker)로는 100 bp DNA ladder(Promega, USA)를 사용하였다.
그룹 자돈
번호		 분변(Feces) 소장 누적
검출
(%)
공격접종 후 일(Days) 누적
검출(%)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Group Ⅰ
(실험군)		 1 - - - T - T - - - - - - TGEV
26/100
(26)


PEDV
3/100
(3)		 - 0/10
(0)
2 - - T T T T T - - - - - -
3 - - P - PT T PT - - - - - -
4 - - - - T T - - - - - - -
5 - - - - - - - - - - - - -
6 - - T T - - - - - - - - -
7 - - - - T - - - - - - - -
8 - - - T T T T - - - - - -
9 - - - T T T T T T T - - -
10 - - - - - - - - - - - - -
Group Ⅱ
(대조군)		 1 - - - P T PT T T T - - -
TGEV
39/91
(42.8)


PEDV
20/91
(21.9)
 -

2/10
(20.0)
2 - - T - T T - T T - - - -
3 - - - P P P T T T - - - -
4 - - T TP PT PT T - T - - - -
5 - - - P T T T T T - - - -
6 - - T P T P T - T - - - -
7 - - - P P P P - P P - - -
8 - - T T T T T T - - - - -
9 - - - P P P D +
10 - - - T T T T T - D +
a) : - ; negative, + ; positive.
b) : D =died.
특이항체 난황분말을 투여한 자돈의 소장과 분에서 RT-PCR에 의한 PEDV, TGEV 검출을 한 결과(표 2), 실험군의 10두에서는 공격접종 후 5일째까지 분변에서 PEDV가 검출되었으며 공격접종 후 8일째까지 분변에서 TGEV가 검출되었다. 공격접종 후 1일째부터 10일째까지 총 100예의 분변재료 중 3예에서 PEDV, 26예에서 TGEV 검출되어 각각 3％, 26％의 검출률을 보였으나 소장에서는 검출되지 않았다.
한편, 대조군은 공격접종 후 1일째부터 10일째까지 총 91예의 분변재료 중 20예에서 PEDV, 39예에서 TGEV 검출되어 각각 21.9％ 42.8％의 검출률을 보였고 폐사한 2두의 소장에서 PEDV와 TGEV가 검출되었다. TGEV와 PEDV의 검출율은 실험군이 대조군에 비해 낮게 검출되었다.
실시예 2: 자돈 사료용 첨가물 제조
실시예 2에서는 상기 실시예 1에서 수득된 특이항체 난황분말을 이용하여 자돈 사료용 첨가물을 제조하였다.
특이항체 난황분말 20g; 프락토올리고당 240g; 비타민 B6 0.4g; 이노시톨 0.4g; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides)를 포함하는 미생물 3.24g; 및 정제수 136ml를 첨가하여 자돈 사료용 첨가물을 제조하였다.
실험예 4: 자돈 사료용 첨가물의 효과 측정
10일령부터 50일령까지만 상기 실시예 2에서 제조된 사료용 첨가물을 섭취시키고 70일령이 되었을 때 체중 및 총 사고두수를 측정하였다. 실시예 2의 사료용 첨가물의 첨가율은 자돈이 10일령~21일령에는 0.6 중량%, 21일령~35일령에는 0.4 중량%, 35일령~50일령에는 0.2 중량% 첨가하였다. 대조군은 상기 실시예 2에서 제제된 사료용 첨가물을 첨가하지 않은 사료를 섭취시킨 자돈이다.
먼저, 일반적으로 월간 이유두수 1500두에 대한 발병율, 발병일령, 발병 양상, 폐사율, 폐사일령, 부검소견을 하기 표 3에 나타냈다.
월간이유두수 1500 두
발병율 30~40%
발병일령 35일령
발병양상 거친피모, 사료섭취량저하, 복식호흡, 잔기침, 설사
폐사율 발병돈 중 80% 폐사
폐사일령 40일령이후(40~50일령 집중)
부검소견 심낭염, 폐 및 복강 내 섬유소성 삼출물, 위궤양, 임파절종대 및 출혈, 폐렴
본 실험예 4에서 실시한 자돈 사료용 첨가물을 자돈에 섭취시켰을 때 나타나는 효과를 대조군과 비교하여 하기 표 4에 나타냈다.
대조군 실험군
이유평균체중(kg) 6.29 6.33
개시두수 322 363
종료두수 256 346
종료평균체중(kg) 25.5 27.3
총 사고두수 96 17
위축 24 4
폐사 56 9
도태 16 4
사고율(%) 28.0 4.7
표 4에 나타난 대조군과 실험군의 종료평균 체중과 사고율을 비교하기 위해 도 6을 작성하였다.
측정결과, 실험군은 위축 및 폐사가 대조군에 비해 현저히 낮게 나타났고, 세균성 및 식이성 하리가 발생되지 않았다.
그리고 이를 4개의 농장에서 0~8주의 자돈에 적용한 결과(도 7), 실험군은 대조군에 비해 위축증과 폐사율이 현저히 낮아진 것을 확인할 수 있었다.
도 1은 실험군과 대조군의 자돈을 각각의 실험 돈방에 넣어 24시간 동안 적응시킨 후 4일령에 공격접종을 실시하고 시기별로 채혈하여 체중을 측정한 실험도이다.
도 2는 PEDV를 4일령에 공격접종하기 전과 접종 후 7일 10일에 실험군과 대조군 각각 10두씩 시기별로 채혈하여 항체역가를 측정한 도이다.
도 3은 TGEV를 4일령에 공격접종하기 전과 접종 후 7일 10일에 실험군과 대조군 각각 10두씩 시기별로 채혈하여 항체역가를 측정한 도이다.
도 4는 대장균을 4일령에 공격접종하기 전과 접종 후 7일 10일에 실험군과 대조군 각각 10두씩 시기별로 채혈하여 항체역가를 측정한 도이다.
도 5는 대장균을 공격접종 후 실험군과 대조군의 분에서 분리된 대장균의 수를 일별로 나타낸 도이다
도 6은 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물을 자돈에 섭취시킨 후 체중 및 사고율을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 자돈 사료용 첨가물 조성물을 4개의 농장에서 0~8주의 자돈에 적용한 후, 실험군은 대조군의 위축증과 폐사율을 나타낸 도이다.

Claims (2)

  1. 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella Tiphimurium)에 대한 IgY, 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella Choleraesuis)에 대한 IgY, TGEV(Transmissible gastroenteritis virus)에 대한 IgY, PEDV(Porcine epidemic diarrhea)에 대한 IgY 또는 대장균(Escherichia coli)에 대한 IgY 중 선택되는 어느 하나 이상의 IgY를 함유하는 난황; 프락토올리고당; 비타민 B6; 이노시톨; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 또는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 이상의 미생물; 및 정제수;를 혼합한 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 자돈 사료용 첨가물 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    자돈 사료용 첨가물 조성물은,
    난황 0.05~9.5 중량%; 프락토올리고당 47.6~71.6 중량%; 비타민 B6 0.01~0.11 중량%; 이노시톨 0.02~0.22 중량%; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 류터리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis), 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 김치아이( Leuconostoc kimchii), 류코노스톡 시트레움(Leuconostoc citreum), 류코노스톡 가시코미타툼(Leuconostoc gasicomitatum), 류코노스톡 락티스(Leuconostoc lactis) 또는 스트렙토코커스 써머필러스(Streptococcus thermophilus) 중 선택되는 어느 하나 이상의 미생물 0.05~1.9 중량% ; 및 정제수 24.2~44.2 중량%로 조성되는 것을 특징으로 하는 자돈 사료용 첨가물 조성물.
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