WO2012141540A2 - 바이러스 감염 억제 활성을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 균주 - Google Patents

바이러스 감염 억제 활성을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 균주 Download PDF

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우서형
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus

Definitions

  • the present invention relates to a novel isolated Lactobacillus fermentum strain having viral infection inhibitory activity.
  • influenza A In the case of influenza A, it is a problem when it spreads to a new host through genetic mutation, so minimizing the influenza epidemic in animals other than humans is attracting attention as an important means of preventing influenza pandemic in humans.
  • influenza countermeasures that can be used in animals are the only vaccination vaccines, but they are not able to prevent 100% of the virus infection and catch the mutation of the virus.
  • influenza drugs have been developed, they are all expensive drugs developed for humans, and even these have limited effective serotypes and routes of administration, and side effects such as the appearance of resistant viruses, vomiting and dizziness (Ward P et. al., J. antimicrob. Chemother. , 55 (supp1), ppi5-i21, 2005).
  • IB Infectious bronchitis
  • IBV IB virus
  • cortisol IB virus
  • IBV does not have a high mortality rate during infection, but has a high morbidity (expressed as a percentage of the population per patient over a given period of time) and causes lower egg laying rates with cough, runny nose, lower body weight, lower external and internal egg quality, as well as respiratory sequelae. It is accompanied by a huge variety of productivity degradation, such as the continued mortality caused by Escherichia coli, causing huge economic damage to the poultry industry worldwide (David cavanagh and Syed A. Naqi, 2003, infectious bronchitis, Disease of poultry 11 th edition 101-119).
  • PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome
  • PRRSV Porcine Genital Respiratory Syndrome Virus
  • probiotics refers to a living microbial agent or component of a microorganism that acts on the normal bacterial flora in the intestinal tract and improves its balance to benefit the host.
  • lactic acid bacteria is a generic term for bacteria that are characterized by producing a lot of lactic acid in the growth process, it is commonly used as a probiotic as a strain that exists in the gut of healthy animals.
  • probiotics efficacy of lactic acid bacteria helps to suppress the growth of harmful microorganisms in the intestinal tract and balance the useful bacteria flora through sterilization of pathogenic bacteria, inducing changes in bacterial metabolism, and stimulating host immune function. will be.
  • the present inventors have conducted research to develop a next-generation antiviral agent that is safe and effective for inhibiting viral diseases in animals.
  • the present invention was completed by confirming that the morphological, biochemical and genetic characteristics of Lactobacillus spp. Isolated from nature are novel and possess the effect of inhibiting infection and proliferation of one or more viruses.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating virus infection in an animal, comprising the Lactobacillus strain as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a livestock feed additive or drinking water additive comprising the Lactobacillus strain as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating infectious diseases caused by viruses of animals using a composition comprising the Lactobacillus strain as an active ingredient.
  • the novel isolated Lactobacillus bacteria of the present invention is excellent in the prevention and treatment of one or more different types of viral infections, and thus may be widely used for the prevention and treatment of viral diseases in animals.
  • 1 is an electron micrograph of the Lactobacillus latement CJL-112 of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the phylogenetic relationship with other bacteria based on the nucleotide sequence of the Lactobacillus Permanent CJL-112 of the present invention.
  • Figure 3 is an electrophoresis picture showing the SDS-PAGE results of Lactobacillus Permanent CJL-112 and Lactobacillus Permanent standard strain ATCC9338 according to an embodiment of the present invention. Protein patterns of both strains were observed with major proteins of about 145kDa, 80kDa, 70kDa, 51kDa and 48kDa.
  • Figure 4 is an electrophoresis picture showing the results of RAPD analysis after PCR using a primer after extracting and purifying the DNA of Lactobacillus Permanent CJL-112 and Lactobacillus Permanent standard ATCC9338 according to an embodiment of the present invention.
  • (a) is a primer P2
  • (b) is an electrophoresis picture using the primer P3.
  • 5A to 5G are inoculated with influenza virus (A / NWS / 33 [H1N1]) after administration of Lactobacillus permanent CJL-112 to BALB / c mice 6 times in total for 10 days. This is the result of measuring the changes in cytokine and IgA concentration in the mouse lung.
  • Figure 5a shows the concentration measurement results of IL-1 ⁇
  • 5b is IL-2
  • 5c is IFN- ⁇
  • 5d is IFN- ⁇
  • 5e is IgA
  • 5f IL-10
  • 5g TNF- ⁇ .
  • the present invention relates to a novel isolated Lactobacillus fermentum CJL-112 (Accession No. KCCM11184P) having a virus infection inhibitory activity.
  • samples from healthy infants and fermented plants were taken, cultured in MRS solid medium and grouped according to colony observation to isolate strains of Lactobacillus sp .
  • Lactobacillus strains showing the best anti-influenza effect was finally selected through mouse in vivo proliferation inhibition test against influenza virus, a representative respiratory virus in animals.
  • Lactobacillus strains In order to identify the selected Lactobacillus strains, physiological, biochemical properties, sugar availability, and 16S rRNA gene sequencing were performed. As a result of physiological and biochemical characterization, the lactic acid bacteria were Gram-positive bacteria, did not form spores, were able to grow under both aerobic and anaerobic conditions, and did not have motility, and the shape of cells was bacilli.
  • the 16S rRNA gene sequence of the Lactobacillus strain is the same as SEQ ID NO: 1 and shows the highest homology (99.9%) with the Lactobacillus fermentum standard strain ( Lactobacillus fermentum IFO3956, GeneBank accession number NC_010610) in molecular taxonomic analysis. It was.
  • Lactobacillus Permantum CJL-112 of the present invention is to freeze-dried by storage in -70 °C or suspended in sterilized 10% skim milk in a storage solution made by mixing a certain amount of glycerol components in water in order to preserve long-term stable desirable.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of infectious diseases caused by viruses of animals other than humans, comprising the Lactobacillus pertumtum CJL-112 as an active ingredient.
  • Veterinary compositions comprising the Lactobacillus fermentum CJL-112 of the present invention may further comprise suitable excipients and diluents according to conventional methods.
  • the veterinary composition comprising Lactobacillus permanent CJL-112 according to the present invention may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a spice, an emulsifier, a preservative, and the like. It can be formulated using methods well known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to the formulations, the formulations being powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, solutions, Syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, suppositories, sterile injectable solutions, sterile external preparations, and the like.
  • Veterinary composition according to the invention may vary depending on the age, sex, body weight of the animal, but the 10 4 to 10 has the amount of 10 cfu / kg can be administered once a day to several times.
  • the dose of Lactobacillus permanent CJL-112 may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 of the present invention has a viral infection inhibitory activity
  • the virus is not particularly limited to this, may be an RNA virus or a DNA virus.
  • RNA virus is a generic term of a virus having RNA as a gene, and has a (+) chain RNA which becomes an mRNA, a (-) chain RNA of a complementary chain, and a double stranded RNA as genes in a virus particle, and only one molecule of RNA And the like (coronavirus, paramyxovirus), a virus having two homologous RNA molecules (retrovirus), and a virus using eight different RNA molecules as genes (influenza virus).
  • RNA synthetase DNA synthetase in case of retrovirus
  • retrovirus DNA synthetase in case of retrovirus
  • DNA viruses are classified as either circular DNA viruses or linear DNA viruses, depending on the shape of the gene.
  • linear DNA viruses include parvoviruses with single stranded linear DNA in virus particles and adenoviruses, herpesviruses, and poxviruses with double stranded linear DNA. Most of them have a special repetitive sequence at the ends of the genome and show unique infection and proliferation patterns due to differences in genome structure and size. DNA viruses having circular DNA molecules as genomes are largely classified into two viral families.
  • the genome of a papain virus (polyomavirus, SV40, papilloma virus, etc.) having a double-stranded closed-loop DNA molecule as a genome and a double-stranded cyclic DNA molecule including the outer strand portion (Hepadnavi) -ridae) virus (hepatitis B virus, Woodchuck hepatitis virus, etc.).
  • the virus that Lactobacillus permanent CJL-112 may have an infection inhibitory activity is not particularly limited, and may include all of the above RNA-type or DNA-type viruses, preferably orthomyxoviruses. (orthomyxovirus), paramyxovirus (paramyxovirus), coronavirus (coronavirus), aterivirus (arterivirus), herpesvirus (herpesvirus) or adenovirus (adenovirus).
  • orthomyxovirus orthomyxovirus
  • paramyxovirus paramyxovirus
  • coronavirus coronavirus
  • aterivirus arterivirus
  • herpesvirus herpesvirus
  • adenovirus adenovirus
  • Lactobacillus permanent CJL-112 of the present invention is influenza A virus (H1N1 strain), low pathogenic avian influenza virus (H9N2 strain), infectious bronchitis virus (KM91 strain), porcine respiratory genital syndrome virus (PRRS) By confirming that it has an infection inhibitory activity against viruses, LMY strains, etc., it was confirmed that it had antiviral complex efficacy against various viruses.
  • H1N1 strain high pathogenic avian influenza virus
  • H9N2 strain low pathogenic avian influenza virus
  • KM91 strain infectious bronchitis virus
  • PRRS porcine respiratory genital syndrome virus
  • infectious disease caused by a virus refers to a disease that is caused by a virus and is contagious.
  • the disease is not particularly limited thereto, but is mainly a disease of an animal caused by an RNA virus or a DNA virus. It may mean.
  • the infectious diseases are poultry diseases such as avian influenza, Newcastle disease, chicken infectious bronchitis, avian pneumovirus infection, infectious laryngeal bronchitis; Swine influenza, swine respiratory syndrome, swine pandemic diarrhea, bullous stomatitis and the like; Diseases of dogs such as individual influenza, adenovirus infection, canpabovirus infection, canopies virus infection, canine measles, rabies; Diseases of cats such as feline calcivirus infection, feline herpesvirus infection, etc .; Equine influenza, equine encephalitis, equine arteritis virus infection, etc .; It may be a disease of the cow, such as Ozeski disease, bovine viral diarrhea, bovine infectious rhinitis.
  • the present invention relates to a feed additive or drinking water additives for livestock useful for the prevention and improvement of infectious diseases caused by a virus comprising the Lactobacillus Pertumtum CJL-112 as an active ingredient.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 included in the additive is not particularly limited but may be in the form of a concentrate, powder or granules.
  • the additive of the present invention is organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate and polyphosphate (polymeric phosphate), polyphenols and catechins (catechin) ), Alpha-tocopherol, rosemary extract (rosemary extract), vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, phytic acid and the like may further include any one or more than one.
  • organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid and malic acid
  • phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate and polyphosphate (polymeric phosphate), polyphenols and catechins (catechin)
  • Alpha-tocopherol rosemary extract (rosemary extract), vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid,
  • the additives are amino acids, inorganic salts, vitamins, antibiotics, antimicrobials, antioxidants, antifungal enzymes, live microbial preparations, grains (milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice), vegetable proteins as auxiliary ingredients.
  • Feed flat, soy and sunflower
  • animal protein feed blood, meat, bone meal and fish meal
  • sugar and dairy products milk powder and whey powder
  • dry additives lipids (animal fats and vegetable fats), nutritional supplements, digestive and It may be included in feeds with substances such as absorption enhancers, growth promoters, disease prevention agents, and the like.
  • the present invention comprises the step of administering the composition for the prevention or treatment of Lactobacillus permanent CJL-112 or an infectious disease caused by the virus to an individual in need thereof, except human A method for treating an infectious disease caused by a virus in an animal.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 a composition comprising the same, and an infectious disease are the same as described above.
  • the method of administering the composition for the prevention or treatment of Lactobacillus permanent CJL-112 or the infectious disease caused by the virus is not particularly limited thereto, but is administered by oral or parenteral routes to an individual in need thereof. Can be selected, and can be preferably administered via a parenteral route.
  • the strain or composition when administered orally, it is preferable to administer the strain or composition to the feed mixed or administered in a separate oral dosage form other than the feed.
  • parenteral route when administered via a parenteral route, it is possible to prevent loss due to metabolism, partial or total degradation of the drug, binding to food, degradation in the digestive tract or other causes, preferably subcutaneous, muscle, It can be administered by injection or infusion through intravenous, transdermal, dermal, nasal, arterial, abdominal, ocular, mucosal, skin or the like, more preferably in the manner of injection into the nasal or ocular.
  • parenteral route it is preferable to administer in a dosage form suitable for the route of administration.
  • the nasal cavity when administered through the nasal cavity, it is formulated in the form of a spray or inhalant, and when administered through the eye, it is formulated in the form of a spray or eye drop, and when administered through the mucous membrane or skin, It may be administered in the form of a patch or ointment.
  • the method for treating an infectious disease caused by the virus of the present invention can be applied to a plurality of animals including mammals, poultry and fish. More specifically, the method can be used in commercially important mammals such as pigs, cattle, sheep, goats, laboratory rodents (rats, mice, hamsters and gerbils), furry animals (eg mink and fox), And zoo animals (eg monkeys and tailless monkeys), as well as pets (eg cats and dogs).
  • mammals including mammals, poultry and fish. More specifically, the method can be used in commercially important mammals such as pigs, cattle, sheep, goats, laboratory rodents (rats, mice, hamsters and gerbils), furry animals (eg mink and fox), And zoo animals (eg monkeys and tailless monkeys), as well as pets (eg cats and dogs).
  • Reference Example 1-1 Influenza A Virus
  • the A / NWS / 33 (H1N1) strain which was a published virus, was purchased from the American Type Culture Collection, USA (ATCC), and used for storage for 48 hours in 10 days old SPF (Specific Pathogen Free) eggs for storage and storage at -80 ° C. .
  • the KM91 strain a published virus, was distributed by the National Veterinary Research and Quarantine Service, and used for 48 hours in 10-day-old SPF eggs and stored at -80 ° C.
  • Samples obtained from fecal and fermented plants of Korean infants were diluted in stages and incubated in MRS solid medium (Difco, USA) for 24 hours under anaerobic conditions at 37 ° C.
  • Strains isolated from each sample were grouped according to colony observation to isolate strains. Selected colonies were purely separated by culturing in a new medium over 3 times, and the pure cultured cells were stored in a medium to which 20% glycerol was added and stored at below 70 ° C.
  • Example 1-2 Selection of strains excellent in anti-influenza efficacy
  • mice Six-week-old SPF BALB / c mice (Orient, Korea) were divided into 10 groups per group, and were divided into a test group to which lactic acid bacteria were administered, a positive control group to which no lactic acid bacteria were administered, and a negative control group to which virus was not challenged.
  • lactic acid bacteria administered using oral sonde at 300 ⁇ l daily, starting from 21 days before challenge and 14 days after challenge.
  • a 90 ⁇ l dose of lactic acid bacteria suspension was administered to the nasal cavity after ketamine anesthesia (100 mg / kg) for 6 times at intervals of 3 to 4 days for 21 days prior to challenge with influenza virus.
  • influenza A / NWS / 33 (N1H1) virus fluid with a titer of 10 4.0 TCID 50 / ml was administered to the nasal cavity at 90 ⁇ l dose per animal after ketamine anesthesia (100 mg / kg). .
  • Test Lactobacillus is administered orally every day from 21 days before challenge to 14 days after challenge with influenza virus (A / NWS / 33 [H1N1]) at a dose of 300 ⁇ l per animal.
  • Pathogenicity index 14 (PI 14 ); Pathogenicity index, average score per mouse observed daily over a period of 14 days, normal: 0, sick (fever, eyelids, hairy abnormalities): 1, death: 2
  • CJL-A seven candidate strains (CJL-A, CJL-B, CJL-C, and CJL-) showed delayed mean mortality or decreased pathogenicity indices compared to the challenge group through oral administration of lactic acid bacteria.
  • D CJL-E, CJL-H, CJL-I) were selected first.
  • test lactic acid bacteria were administered at a dose of 90 ⁇ l per bird in total 6 times at intervals of 3-4 days for 21 days prior to challenge with influenza virus (A / NWS / 33 [H1N1]).
  • Pathogenicity index 14 (PI 14 ); Pathogenicity index, average score per mouse observed daily over a period of 14 days, normal: 0, sick (fever, eyelids, hairy abnormalities): 1, death: 2
  • CJL-A three candidate strains (CJL-A, CJL-D, and CJL-E) that significantly reduced mortality were identified through nasal administration of lactic acid bacteria among the seven selected lactic acid bacteria.
  • Lactobacillus spp. CJL-E which was shown to completely inhibit mortality due to influenza infection, was selected.
  • the strain is a Gram-positive bacterium, without forming a spore, and capable of growing under both aerobic and anaerobic conditions, and lacking motility, and have a cell morphology (FIG. 1).
  • FIG. 1). 1 is an electron micrograph of the CJL-E of the present invention.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 is L-arabinose, ribose, D-xylose, glucose, fructose, maltose, melbiose, sucrose, d-rapinose, gluconate and 5- It was confirmed that the keto-gluconate can be metabolized.
  • Lactobacillus permanum CJL-112 strain was performed by Angelis et al. (Angelis et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2011-2020).
  • Lactobacillus standard strain ATCC9338 was also used in the analysis. Lactobacillus species incubated for 24 hours using MRS liquid medium were washed twice with 0.05M Tris-HCl (pH 7.5) solution containing 0.1M CaCl2. The cells were suspended in the same solution to prepare 1 ml of OD 10.0 (A 600 ) solution, followed by centrifugation at 8000 xg for 5 minutes.
  • the soaked cells were suspended in 1 ml of extract solution (0.01M EDTA, 0.01M NaCl, 2% SDS), and allowed to stand at room temperature for 60 minutes and reacted at 100 ° C for 5 minutes. After the reaction, the supernatant was recovered by centrifugation for 10 minutes at 11600 xg and 4 ° C. 15 ⁇ l of the recovered supernatant and 3 ⁇ l of 5X SDS sample solution were mixed and then boiled for 5 minutes. This was followed by the development of cell wall proteins of Lactobacillus permentum species on 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) gels.
  • FIG. 3 is an electrophoresis picture showing the SDS-PAGE results of CJL-112 and Lactobacillus Permanent standard stock ATCC9338 according to an embodiment of the present invention.
  • the protein pattern of CJL-112 was observed as the main protein of about 145 kDa, 80kDa, 70kDa, 51kDa and 48kDa. This is the same as the protein pattern of the standard strain, it was confirmed that CJL-112 is a kind of Lactobacillus percentage.
  • Randomly amplified polymerhic DNA (RAPD) analysis of Lactobacillus permanent CJL-112 used the method of Angelis et al. (Angelis, MD et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2011-2020).
  • the primers used for the test were P2 (5'-ATGTAACGCC-3 ', SEQ ID NO: 2) and P3 (5'-CTGCGGCAT-3', SEQ ID NO: 3), and PCR conditions were 94 ° C 1 after 4 min treatment at 94 ° C. The reaction for 45 minutes at 35 ° C. for 1 minute and 72 ° C. for 2 minutes was repeated 45 times, and the reaction was completed after 5 minutes at 72 ° C.
  • FIG. 4 shows the results of RAPD analysis after PCR using primer P2 after extracting and purifying the DNA of Lactobacillus permanent CJL-112 and Lactobacillus permanent standard ATCC9338 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 (b) shows the extraction and purification of the DNA of the Lactobacillus Permanum CJL-112 and Lactobacillus Permanent standard strain ATCC9338 according to an embodiment of the present invention and then PCR using primer P3 RAPD An electrophoretic photograph showing the results of the analysis.
  • the RAPD patterns of the Lactobacillus permanent CJL-112 using primers P2 and P3 were all different from those of the Lactobacillus permanent standard strain ATCC9338. This confirmed that CJL-112 is a novel Lactobacillus permanent strain that is distinguished from the standard strain ATCC9338.
  • One hundred-day-old SPF chicks were divided into three groups (oral administration, eye drop administration, and non-administration challenge control group), 30 in each group, and isolated.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 was used as a test target bacterium.
  • MRS liquid medium was prepared, incubated at 37 ° C. for 24 hours, the culture solution was centrifuged, washed with sterile distilled water, and suspended in an appropriate amount of sterile distilled water for use in the test.
  • test subject bacterium Lactobacillus permanent CJL-112 was prevented daily according to the group administration route.
  • 2x10 for oral group 9.0 Test bacteria at a concentration of cfu / ml were administered orally at a dose of 500 ⁇ l per animal.
  • 3x10 for eye drops 10.0 Test bacteria of cfu / ml concentration Topical administration was conducted at a 30 ⁇ l dose per horse.
  • Table 4 Preventing Chicken Infectious Bronchitis in Lactobacillus Permanent CJL-112 Administration in SPF Chickens CJL-112 Administration Path A CJL-112 Administration Period B Virus positive sorghum / Avail sorghum C Agency kidney Control Administration group Control Administration group oral- 1 week 10/10 8/10 5/10 6/10 2 weeks 10/10 10/10 9/10 4/10 * 3 weeks 10/10 10/10 8/10 5/10 Eye drops 1 week 10/10 7/10 5/10 4/10 2 weeks 10/10 10/10 9/10 4/10 * 3 weeks 10/10 10/10 8/10 4/10
  • the re-separation rate of infectious bronchitis virus in the respiratory tract and kidneys was reduced by oral and instillation of CJL-112, compared to the challenge control group, especially when the CJL-112 was administered for 2 weeks. Regardless, the virus re-separation rate P was less than 0.05, indicating a significant decrease.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 exhibited excellent antiviral efficacy against not only influenza virus but also chicken infectious bronchitis virus.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 was used as a test target bacterium.
  • MRS liquid medium was prepared, incubated at 37 ° C. for 24 hours, the culture solution was centrifuged, washed with sterile distilled water, and suspended in an appropriate amount of sterile distilled water for use in the test.
  • Lactobacillus fermentum CJL-112 was administered daily nasal from 1 week before challenge to 14 days after challenge.
  • 3 ⁇ 10 9 cfu / ml lactobacillus permanent CJL-112 was administered by nasal route at a dose of 500 ⁇ l per animal, and 100 ⁇ l of chicken at a concentration of 10 7.0 EID 50 / ml per animal for influenza virus challenge. Inoculated into the nasal cavity.
  • Cage 1 10 challenge chickens, 10 direct contact chickens, 2 cages 10 indirect contact chickens), and between two cages.
  • the distance was set to maintain a distance of about 40 cm to allow direct or air propagation of the inoculated virus.
  • the symptoms of clinical symptoms were observed daily for 14 days after influenza virus challenge, and oral and total excretory swabs were performed in the contact and airborne groups at 3, 5, 7 and 9 days of challenge and real-time influenza virus genes were exchanged. Detected using time RT-PCR. In addition, the presence of influenza specific antibodies was evaluated by collecting blood 14 days after challenge and performing hemagglutination inhibition.
  • HI Hemagglutination-inhibition assay
  • the clinical symptom observed in the airborne group was 80% seroconversion rate and 30% morbidity rate in the CJL-112 non-administered control group (number of patients in a given period, as percentage of population). ).
  • the CJL-112 despite the 50% seroconversion rate, no clinical symptom expression system was observed.
  • a challenge virus re-isolation / total test count (mean virus titer logEID 50 / ml ⁇ standard error)
  • virus titers in the oral swabs of the challenge group and the contact group treated with CJL-112 at 7 and 9 days after challenge were significantly decreased compared to the control group (respectively, respectively).
  • p ⁇ 0.05 and p ⁇ 0.001 Moreover, 7 days after challenge, total excretory virus re-separation rate of airborne infectious system in control group reached 80% (4.3 ⁇ 0.9log EID 50 / ml), while challenge virus in CJL-112 treated group It was not detected at all (p ⁇ 0.001).
  • Lactobacillus permanent CJL-112 of the present invention showed excellent antiviral efficacy against H9N2 type low pathogenic avian influenza virus as well as human influenza virus.
  • Example 6 Inhibition and propagation inhibition effect of Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) by administration of Lactobacillus pertumtum CJL-112
  • PRRS Virus (LMY week) 2 ml of Lactobacillus permanent CJL-112 (1 ⁇ 10 10 CFU / ml) was daily sprayed through the nasal cavity in the piglets administered daily from 7 days before challenge to 21 days after challenge.
  • the administration method was a method of spray administration using a spray gun, a total of 2 ml of the strain solution 1 ml in one nasal cavity at a distance of about 1 cm from the nasal cavity of the piglets.
  • the same amount of physiological saline was administered to piglets of the non-administered challenge control group and the negative control group.
  • piglets For virus challenge, four randomly selected piglets were anesthetized and stabilized in the administration group and the non-administration group, and then challenged and inoculated by dropping the virus solution in the nasal cavity. A total of 2 ml of 1 ml in one nasal cavity is inoculated, and the total amount of virus inoculated in each piglet has a viral titer of 5 ⁇ 10 5 TCID 50 . Four piglets remaining in the administration group and the non-administration group were isolated from the inoculated piglets for 24 hours, and then recombined for contact infection.
  • the clinical symptoms were observed for 21 days after challenge, and specimens (blood, pulmonary lavage fluid, nasal and oral swabs, lung tissue, etc.) were collected according to the planned schedule. Lung lavage fluid was collected at weekly intervals during the test period. ELISA and real-time RT-PCR were used to detect the concentration of IgA and RNA of challenge virus, and calculate the titer.
  • the detection time of virus in the blood of the contact infected piglets administered Lactobacillus permanent CJL-112 tended to be delayed by 4 days compared to the non-administered challenge control group.
  • the PRRSV-specific IgA antibody titer in the pulmonary lavage fluid of the challenge group administered Lactobacillus pertumtum CJL-112 was higher than that of the non-administered control group.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 had an effect on the formation of pig PRRS virus-specific antibody and delayed virus proliferation, and inhibited weight loss due to viral infection.
  • a total of 6 ketamine anesthesia (100 mg / kg) was administered intranasally, followed by a 90 ⁇ l dose of CJL-112 suspension intranasally and 10 ⁇ l of PBS in the control group for 10 days prior to challenge with influenza virus. It was administered nasal.
  • mice After 0, 6, 24, and 48 hours of inoculation, 4 mice were euthanized in each group, and the lungs were aseptically collected and then emulsified. However, four mice in the dosing group and five mice in the non-administration group were randomly selected and used to measure the cytokine and IgA concentrations in each lung emulsion prior to the challenge.
  • the concentrations of IL-1 ⁇ (a), IL-2 (b), IFN- ⁇ (c), IFN- ⁇ (d), and Ig A (e) in the CJL-112 treated group were significantly higher than those in the non-administered group.
  • the concentrations of IL-10 (f) and TNF- ⁇ (g) decreased significantly.
  • Lactobacillus permanent CJL-112 induces increased IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ and Ig A secretion in the lungs of the mouse, activating the early immune response in the body, and especially significantly secreting IL-2 secretion after influenza virus infection. Increasingly, it was found that they induce Th1 type cellular immune response. In addition, it was confirmed that the secretion of IFN- ⁇ , which plays an important role in killing the virus, contributes to the elimination of influenza virus and mouse survival by inducing rapid and high levels.

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Abstract

본 발명은 바이러스 감염 억제 활성을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 균주에 관한 것으로, 본 발명의 신규 분리한 균주는 1종 이상의 서로 다른 종류의 바이러스 감염증에 대한 예방 및 치료 효능이 우수하므로, 동물의 바이러스성 질병의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

바이러스 감염 억제 활성을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 균주
본 발명은 바이러스 감염 억제 활성을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 균주에 관한 것이다.
가축의 바이러스성 질병에 의한 피해가 최근 급증하고 있어 차단 방역 및 예방 백신 접종 등 동물의 바이러스 감염 억제 노력이 활발하나, 바이러스의 유전적 변이, 백신의 불완전한 효능 외에 동물용으로 사용 가능한 항바이러스제의 부재 등으로 어려움을 겪고 있다. 특히, 가스교환이 일어나는 동물의 호흡기계는 외부 병원체에 쉽게 노출되므로 선천성 면역이 가장 활발하게 일어나는 곳이다. 호흡기 질환을 일으키는 바이러스는 그 종류가 매우 다양하고, 감염 부위, 숙주 범위 및 임상 증상이 바이러스에 따라 큰 차이를 나타낸다. 또한, 대부분의 바이러스성 호흡기 질환은 전파속도가 매우 빠른 것이 특징이므로 예방과 치료에 어려움이 많다.
대표적인 호흡기 질환 원인체인 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus)는 오르소믹소 계통 (Family Orthomyxoviridae)에 속하는 RNA 바이러스로서 혈청형은 A형, B형, C형 등 3가지로 구분되며, 그 중 B형과 C형은 사람에서만 감염이 확인되고 있고, A형은 사람, 말, 돼지, 기타 포유류 그리고 다양한 종류의 가금과 야생조류에서 감염이 확인되고 있다 (Webster RG et al., 1992. Microbiol Rev., 56(1): 152-179).
A형 인플루엔자의 경우, 유전자 변이를 통한 새로운 숙주로의 전파가 일어날 경우 문제시되므로, 사람 이외의 동물에서 인플루엔자 유행을 최소화하는 것이 사람의 인플루엔자 대유행을 예방하는 중요한 수단으로 주목받고 있다.
현재 동물에서 사용 가능한 인플루엔자 대응책은 예방백신 접종이 유일하나, 바이러스의 감염을 100% 예방하지 못하고 바이러스의 변이를 따라 잡지 못하고 있는 실정이다. 비록 인플루엔자 치료제가 개발되어 있기는 하지만 모두 인체용으로 개발된 고가의 약물이며 이마저도 유효한 혈청형과 투여 경로에 제한이 있거나 내성바이러스 출현, 구토와 현기증 등의 부작용이 단점으로 지적되고 있다 (Ward P et al., J. antimicrob. Chemother., 55(supp1), ppi5-i21, 2005).
전세계 양계 산업에서 대표적인 호흡기 질환으로는 전염성기관지염(Infectious bronchitis: IB)이 있다. 이는 코로나 계통(Family Coronaviridae) 의 IB 바이러스 (IBV)에 의해서 발생되는 전파력이 매우 빠른 닭의 대표적인 급성 호흡기 전염병이다. IBV는 감염시 폐사율은 높지 않으나 이환율(일정한 기간 내에 발생한 환자의 수를 인구당의 비율로 나타낸 것)이 높고 기침, 콧물, 증체율 저하, 외부 및 내부 난질 저하를 동반하는 산란율 저하를 유발할 뿐만 아니라 호흡기 후유증으로 대장균증이 수반되어 만성 폐사가 지속되는 등 매우 다양한 생산성 저하를 유발하여 전세계적으로 양계산업에 막대한 경제적 피해를 입히고 있다 (David cavanagh and Syed A. Naqi, 2003, infectious bronchitis, Disease of poultry 11 th edition:101-119).
IBV는 RNA 바이러스로서 바이러스 입자를 구성하는 유전자가 인플루엔자 바이러스와 유사하게 쉽게 변이 되는 특성이 있다. 따라서 현재 전세계적으로 매우 다양한 혈청형의 IBV들이 분리 보고되고 있으며, 이들 각 혈청형에서 변이된 변이형 바이러스까지 포함하면 그 종류는 수십 종에 이를 것으로 추정되고 있다. 또한 이들 혈청형들 간에는 상호 교차반응이나 교차 면역이 잘되지 않아 백신 사용에 어려움이 있다 (Jane K.A.Cook et al., Avian pathol. 28: 477-485, 1999, J. Ignjatovic and S. Sapats, Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz., 19(2): 493-508, 2000).
전세계 양돈 산업에서 대표적인 바이러스성 호흡기 질환으로는 아테리바이러스과(arteriviridae)의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV)에 의해서 유발되는 돼지 생식기 호흡기기 증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome: PRRS)이 대표적이다. 1980년대 이후부터 북미, 유럽 및 아시아의 대다수 돼지 생산 국가에서 돼지의 생식능력 감소 및 호흡기 질환을 유발하고 있다(K. D. Rossow, 1998, Vet Pathol., 35(1): 1-20).
현재 PRRS의 예방을 위해 생독 백신과 사독 백신이 전세계적으로 사용되고 있다. 그러나, 생독백신은 질병 발생과 임상증상 발현 정도, 바이러스 배출기간 등의 감소에 효과적이지만 동종 혈청형에 대해서만 효과가 나타나고 면역능이 오랫동안 지속되지 못한다는 단점이 있다. 사독백신은 세포성면역 유도가 지연될 뿐만 아니라, 바이러스 제거에 필요한 중화항체 생산이 불가능하여 효능이 매우 제한적이어서 (T.G. Kimman et al., 2009, Vaccine, 27:3704-3718; W. Charerntantanakul, 2009, Vet. Immunol. Immunopathol. 129: 1-13) 대책마련이 시급히 요구되고 있다. 또한 준임상형감염을 통한 돈군 내 지속적 바이러스의 순환, 감수성 번식돈군의 계속적 유입, 변이주의 출현 등이 이 바이러스에 의한 피해예방을 어렵게 하고 있다(Michael PM et al., 2002, Viral Immunol., 15(4):533-47, 2002; Murtaugh MP et al. Virus Res., 154(1-2):18-30, 2010).
한편, 프로바이오틱스(probiotics)란 생체 장관내 정상세균총에 작용하여 그 균형을 개선함으로써 숙주에 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물 제제 또는 미생물의 성분을 말한다. 특히 유산균은 생육과정에서 유산을 많이 생산하는 것이 특징인 균을 총칭하며, 건강한 동물의 장에서 많이 존재하는 균주로써 프로바이오틱스로 흔하게 이용된다. 일반적으로 알려진 유산균의 프로바이오틱스 효능은 병원성 세균에 대한 살균, 세균 대사의 변화 유도, 숙주 면역기능의 자극 등을 통해 숙주의 장관내 유해 미생물의 생육을 억제하고 유용균 균총의 균형을 유지하는 데 도움을 주는 것이다.
최근에는 유산균의 숙주 면역 기능 부활작용에 의한 병원성 미생물에 대한 감염 방어 효과와 관련한 약리 효능이 주목받고 있다. 기존에 알려진 설사유발 위장관계 감염성 질환 외에도 호흡기 및 전신성 바이러스 감염증의 예방, 치료제로의 적용도 새롭게 보고되고 있다(미국 등록특허 7807185, 미국 공개특허 20040057965 및 미국 등록특허 7862808). 그러나 대다수의 기술이 사람의 감염증으로 대상을 제한하고, 동물의 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하지 않는다.
일부 동물을 대상으로 하는 사례도 보고되어 있으나(Izumo, T. et al., 2010. Int. Immunopharmacol. 10: 1101-1106; Harata, G. et al., 2010. Lett. Appl. Microbiol. 50: 597-602; 대한민국 공개특허 2005-0023475), 이들 기술의 경우 단일 바이러스성 질병에 대한 제한적인 효능만을 포함할 뿐, 1종 이상의 바이러스에 대한 항바이러스 복합 효능을 나타내지 못한다.
그 밖에 유산균을 이용한 항바이러스 용도와 관련하여 등록된 특허기술은 유산균 세포가 제외된 배양액, 혹은 균체 추출물의 효능을 강조하거나 복합 균주를 이용하여 효능을 나타내는 경우가 많다(대한민국 등록특허 1104397, 대한민국 등록특허 0813637, 미국 공개특허 20100034877, 대한민국 등록특허 0808910, 대한민국 공개특허 2008-0081146).
본 발명자들은 동물의 바이러스성 질병 억제용으로 안전하고 효과가 우수한 차세대 항바이러스제를 개발하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과, 자연계에서 분리한 락토바실러스 종의 형태적, 생화학적 및 유전학적 특성이 신규하고 1종 이상의 바이러스의 감염 및 체내 증식을 억제하는 효능을 보유함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 바이러스 감염으로 인한 동물 질병의 발생 억제 또는 증상 치료 효능을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 균주를 유효성분으로 포함하는, 동물의 바이러스 감염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 균주를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 균주를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 동물의 바이러스로 인한 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 신규 분리한 락토바실러스 균은 1종 이상의 서로 다른 종류의 바이러스 감염증에 대한 예방 및 치료 효능이 우수하므로, 동물의 바이러스성 질병의 예방 및 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112와 락토바실러스 퍼멘텀 표준주 ATCC9338의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 두 균주의 단백질 패턴은 모두 약 145kDa, 80kDa, 70kDa, 51kDa 및 48kDa의 주단백질로 관찰되었다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112와 락토바실러스 퍼멘텀 표준주 ATCC9338의 DNA를 추출하고 정제한 후 프라이머를 사용해 PCR 후 RAPD 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. (a)는 프라이머 P2, (b)는 프라이머 P3를 이용한 전기영동 사진이다.
도 5a 내지 5g는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 BALB/c 마우스에게 10일간 총 6회 비강으로 투여한 뒤 인플루엔자바이러스 (A/NWS/33[H1N1]) 공격접종에 따른 마우스 폐 내 싸이토카인 및 IgA 농도 변화를 측정한 결과이다. 도 5a는 IL-1β, 5b는 IL-2, 5c는 IFN-γ, 5d는 IFN-α, 5e는 IgA, 5f는 IL-10, 5g는 TNF-α의 농도측정 결과를 나타낸다. (* ; p< 0.05, ** ; p < 0.01, hpc ; hour of post challenge)
상기 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 바이러스 감염 억제 활성을 갖는 신규 분리한 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112(Lactobacillus fermentum CJL-112)(수탁번호 KCCM11184P)에 관한 것이다.
구체적으로, 건강한 유아 및 발효 식물 유래의 시료를 채취하여 MRS 고체배지에서 배양한 후 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 락토바실러스 종 (Lactobacillus sp.)의 균주들을 분리하였다.
1차 분리 균주들 중 동물의 대표적 호흡기 바이러스인 인플루엔자 바이러스에 대한 마우스 생체 내 증식 억제 시험을 통해 가장 우수한 항인플루엔자 효과를 나타내는 락토바실러스 균주 1종을 최종 선발하였다.
상기 선발된 락토바실러스 균주를 동정하기 위하여 생리, 생화학적 특성과 당이용성 및 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다. 생리, 생화학적 특성 분석 결과, 상기 유산균은 그람양성의 세균으로 포자를 형성하지 않고, 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 모두 성장이 가능하며, 운동성이 없으며, 세포의 형태는 간균임을 확인하였다. 상기 락토바실러스 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같으며 분자계통 분류학적 분석에서 락토바실러스 퍼멘텀 표준 균주(Lactobacillus fermentum IFO3956, GeneBank accession number NC_010610)와 가장 높은 상동성(99.9%)을 나타내었다. 따라서, 상기 미생물을 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)으로 동정하고, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2011년 4월 7일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM11184P).
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112은 장기간 안정적으로 보존하기 위해서는 물에 글리세롤 성분을 일정량 혼합하여 만든 보관용액에 균체를 풀어 -70℃에서 보관하거나 멸균된 10% 탈지유에 현탁하여 동결건조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 유효성분으로 포함하는, 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 포함하는 수의학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 세탄올, 스테아릴알콜, 유동파라핀, 솔비탄모노스테아레이트, 폴리소르베이트60, 메칠파라벤, 프로필파라벤 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 104 내지 1010cfu/kg의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112는 바이러스 감염 억제 활성을 가지며, 상기 바이러스는 특별히 이에 제한되지 않으나, RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스일 수 있다.
RNA 바이러스는 RNA를 유전자로 갖고 있는 바이러스의 총칭으로서 mRNA가 되는 (+)사슬 RNA, 상보사슬의 (-)사슬 RNA, 2중가닥 RNA를 바이러스 입자내 유전자로서 갖는 것이 있고, 1분자의 RNA만을 갖는 것 (코로나바이러스, 파라믹소바이러스), 동종의 RNA분자를 2개 갖는 바이러스(레트로바이러스)나, 8개의 다른 RNA분자를 유전자로 삼는 바이러스(인플루엔자바이러스) 등이 있다. 보통 RNA를 주형으로 하는 RNA합성효소(레트로바이러스의 경우에는 DNA 합성효소)가 존재한다.
DNA 바이러스는 유전자의 형상에 따라 환형 DNA 바이러스 또는 선형 DNA 바이러스로 분류한다. 선형 DNA 바이러스에 속하는 것으로는 바이러스 입자에 외가닥 선형 DNA가 있는 파보바이러스와 2중 가닥 사슬선형 DNA가 있는 아데노바이러스, 허피스바이러스, 폭스바이러스 등이 있다. 그 대부분은 유전체 말단에 특수한 반복배열이 있고, 유전체 구조나 크기의 차이에 의해 각각 고유한 감염, 증식양식을 나타낸다. 환형 DNA 분자를 유전체로 갖고 있는 DNA 바이러스는 크게 2개 바이러스과로 분류된다. 즉, 2중 나선 닫힌고리형 DNA 분자를 유전체로 갖는 파포바이러스과 바이러스(폴리오마바이러스, SV40, 파필로마 바이러스 등)와 외가닥부분을 포함한 2중나선 고리형 DNA 분자를 유전체로 하는 헤파드나바이러스과(Hepadnavi-ridae)의 바이러스(B형 간염바이러스, 우드척(Woodchuck) 간염 바이러스 등)이다.
본 발명에서 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112가 감염 억제 활성을 가질 수 있는 바이러스는 특별히 제한되지는 않으며, 상기와 같은 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스를 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 오르쏘믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 아테리바이러스(arterivirus), 허피스바이러스(herpesvirus) 또는 아데노바이러스(adenovirus)일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112가 인플루엔자 A 바이러스(H1N1주), 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(H9N2주), 전염성 기관지염 바이러스(KM91주), 돼지 호흡기생식기증후군 바이러스(PRRS 바이러스, LMY주) 등에 대한 감염 억제 활성을 가짐을 확인함으로써, 다양한 바이러스에 대하여 항바이러스 복합 효능을 가짐을 확인하였다.
본 발명의 "바이러스로 인한 감염성 질환"이란 바이러스에 의해 발병되어 전염성을 나타내는 질환을 총칭하는 의미로, 상기 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 주로 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스에 의하여 발병되는 동물의 질환을 의미할 수 있다. 바람직하게는 상기 감염성 질환은 조류인플루엔자, 뉴캐슬병, 닭전염성기관지염, 조류뉴모바이러스감염증, 전염성후두기관지염 등 가금의 질환; 돼지인플루엔자, 돼지생식기호흡기증후군, 돼지유행성설사, 수포성구내염 등 돼지의 질환; 개인플루엔자, 아데노바이러스 감염증, 개파보바이러스 감염증, 개허피스바이러스 감염증, 개홍역, 광견병 등 개의 질환; 고양이 칼리시바이러스 감염증, 고양이 허피스바이러스 감염증 등 고양이의 질환; 말인플루엔자, 말뇌염, 말동맥염바이러스 감염증 등 말의 질환; 오제스키병, 소바이러스성 설사병, 소 전염성 비기관염 등 소의 질환일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 유효성분으로 포함하는 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 및 개선에 유용한 가축용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제에 관한 것이다.
상기 첨가제에 포함되는 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 형태는 특별히 이에 제한되지 않으나 농축액, 분말 또는 과립의 형태일 수 있다.
본 발명의 첨가제는 상기 유효성분 이외에 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 상기 첨가제는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제, 곡물(분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀), 식물성 단백질 사료(평지, 콩 및 해바라기), 동물성 단백질 사료(혈분, 육분, 골분 및 생선분), 당분 및 유제품(분유 및 유장 분말), 건조 첨가제, 지질(동물성 지방 및 식물성 지방), 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사료에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 또는 상기 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 감염성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112, 이를 포함하는 조성물 및 감염성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 또는 상기 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 투여하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 치료를 필요로 하는 개체에게 경구적 또는 비경구적 경로를 통하여 투여하는 방법을 선택할 수 있고, 바람직하게는 비경구적 경로를 통하여 투여할 수 있다.
먼저, 경구적으로 투여할 때는, 상기 균주 또는 조성물을 사료에 혼합하여 투여하거나 또는 사료가 아닌 별도의 경구형 제형으로 투여함이 바람직하다.
또한, 비경구적 경로를 통하여 투여할 때는, 대사작용, 약물의 부분 또는 전체 분해, 음식과의 결합, 소화기관에서의 분해 또는 기타 원인으로 인한 손실을 방지할 수 있는데, 바람직하게는 피하, 근육, 정맥, 경피, 진피, 비강, 동맥, 복강, 안구, 점막, 피부 등을 통해 주사 또는 주입되는 방식으로, 보다 바람직하게는 비강 또는 안구로 주입되는 방식으로 투여할 수 있다. 상기 비경구적 경로를 통하여 투여할 때는 투여경로에 적합한 제형으로 투여함이 바람직하다. 예를 들어, 비강을 통해 투여할 때는 분무제 또는 흡입제의 형태로 제형화하여 투여하고, 안구를 통해 투여할 때는 분무제 또는 점안제의 형태로 제형화하여 투여하며, 점막 또는 피부를 통하여 투여할 때는 분무제, 패치제 또는 연고제 등의 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.
상기 본 발명의 바이러스로 인한 감염성 질환을 치료하는 방법은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물에 적용할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물 (랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물 (예, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물 (예, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 애완동물 (예, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 바이러스의 준비
참고예 1-1: 인플루엔자 A 바이러스 (Influenza A virus)
공시 바이러스인 A/NWS/33 (H1N1)주는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였으며, 실험을 위하여 10일령 SPF(Specific Pathogen Free) 종란에서 48시간 증식하여 -80℃에 보관하면서 사용하였다.
참고예 1-2: 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 (low pathogenic avian Influenza virus)
공시 바이러스인 A/Korean native chicken/Korea/K040110/2010 (H9N2)주는 국내 토종닭에서 분리된 야외주로써 본 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80℃에 보관하면서 사용하였다.
참고예 1-3: 전염성 기관지염 바이러스 (Infectious bronchitis virus)
공시 바이러스인 KM91주는 국립수의과학검역원에서 분양 받았으며, 실험을 위하여 10일령 SPF 종란에서 48시간 증식하여 -80℃에 보관하면서 사용하였다.
실시예 1: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 균주의 분리
실시예 1-1: 시료 확보 및 후보균주 분리
한국인 유아의 분변과 발효 식물로부터 확보된 시료를 단계 희석하여 MRS 고체배지(Difco, 미국)에 도말 후 37℃ 혐기 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 각 시료에서 분리된 균주들은 콜로니 관찰에 따라 그룹화하여 균주들을 분리하였다. 선별된 콜로니는 3차에 걸쳐 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리하였으며, 순수 배양된 균을 20% 글리세롤이 첨가된 배지에 담아 영하 70℃ 이하에서 보존하였다.
실시예 1-2: 항인플루엔자 효능 우수 균주 선발
6주령의 SPF BALB/c 마우스 (오리엔트, 한국)를 그룹당 10수씩으로 하여 유산균을 투여하는 시험군, 유산균을 투여하지 않는 공격접종 양성대조군, 바이러스 공격접종을 실시하지 않는 음성대조군으로 나누었다.
순수 분리된 9종의 시험 대상균을 각각 MRS 액체배지(Difco, USA)에서 37℃ 조건으로 24시간 동안 배양한 후 배양액을 원심분리하여 멸균된 증류수로 세척하였고 다시 >1010cfu/ml 의 농도로 멸균증류수에 부유시켜 시험에 사용하였다.
준비된 유산균의 투여는 크게 경구 투여와 비강 투여로 구분하여 실시하였다. 경구투여의 경우, 인플루엔자 바이러스의 공격접종 전 21일부터 시작하여 공격접종 후 14일까지 매일 300 ㎕ 용량으로 경구 존데(sonde)를 이용하여 유산균 부유액을 투여하였다. 비강투여의 경우, 인플루엔자 바이러스의 공격접종 전 21일 동안 3~4일 간격으로 총 6회에 걸쳐 케타민 마취(100㎎/kg) 후 90 ㎕ 용량의 유산균 부유액을 비강으로 투여하였다.
인플루엔자 바이러스 공격접종을 위하여 케타민 마취(100㎎/kg) 후 마우스 전수 치사량에 해당하는 역가 104.0TCID50/㎖의 인플루엔자 A/NWS/33(N1H1) 바이러스액을 비강으로 마리 당 90μl 용량으로 투여 하였다.
시험기간 동안 마우스 체중, 사료 및 음수섭취량, 폐사율 등을 관찰하여 유산균 비강투여에 대한 인플루엔자 바이러스 공격접종 후 임상증상 및 폐사율 발현억제 효과를 측정하였다. 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종을 실시하지 않은 음성 대조군에 사용한 마우스가 80% 이상 살아남지 못할 경우 재시험을 실시하였다.
구강투여 시험과 비강투여 시험 결과를 각각 표 1 및 표 2에 나타내었다.
표 1 마우스에서 유산균 구강 투여 후 인플루엔자 공격접종에 따른 임상 증상 변화
그룹 투여균주A 평균체중(±SD)(kg) 임상증상B(MTO) 폐사율(%)(MDT) PI14
접종전 접종후
시험군 CJL-A 20.3±0.7 14.8±4.4 10/10(3) 7/10(8.9) 1.7
CJL-B 20.1±1.5 15.1±1.3 10/10(3) 8/10(8.4) 1.8
CJL-C 20.9±1.0 15.4±0.4 10/10(3) 9/10(8.1) 1.9
CJL-D 21.1±0.6 16.4±1.1 10/10(3) 7/10(9.4) 1.7
CJL-E 20.9±1.0 15.4±0.4 10/10(3) 8/10(8.0) 1.8
CJL-F 20.9±0.7 0.0±0.0 10/10(3) 10/10(7.5) 2.0
CJL-G 20.9±1.0 18.2±0.0 10/10(3) 9/10(7.8) 1.9
CJL-H 20.1±1.4 0.0±0.0 10/10(3) 10/10(8.0) 2.0
CJL-I 20.2±0.8 0.0±0.0 10/10(3) 10/10(8.6) 2.0
공격접종대조군 - 20.4±0.8 0.0±0.0 10/10(3) 10/10(7.8) 2.0
음성대조군 - 20.0±1.0 20.8±0.7 0/10 0/10 0
A) 시험 유산균을 마리당 300 ㎕의 용량으로 인플루엔자 바이러스 (A/NWS/33[H1N1]) 공격접종 전 21일부터 공격접종 후 14일까지 매일 구강 투여함
B) 임상증상 발현두수/접종두수
ND; not determined
MTO(Mean time of onset clinical signs); 평균 임상증상발현시간
MDT(Mean deathh time); 평균 치사시간
PI14 (Pathogenicity index 14); 병원성 지수, 14일의 기간에 걸쳐 매일 관찰시 마우스당 평균 점수, 정상: 0, 앓음(열, 눈꺼풀, 털 이상): 1, 사망: 2
표 1과 같이, 유산균의 구강투여 시험을 통해 공격접종 대조군에 비하여 평균 치사 시간을 지연시키거나 병원성 지수의 감소를 나타내는 7종의 후보 균주(CJL-A, CJL-B, CJL-C, CJL-D, CJL-E, CJL-H, CJL-I)를 1차 선발하였다.
표 2 마우스에서 유산균 비강 투여 후 인플루엔자 공격접종에 따른 임상 증상 변화
그룹 투여균주A 평균체중(±SD)(kg) 임상증상B(MTO) 폐사율(%)(MDT) PI14
접종전 접종후
시험군 CJL-A 19.9±1.8 18.2±2.4 10/10(3) 40(9.5) 1.4
CJL-B 19.9±1.8 15.9±2.1 10/10(3) 50(10.2) 1.5
CJL-C 20.7±1.5 16.8±3.7 10/10(3) 80(9.0) 1.8
CJL-D 19.6±1.3 16.3±1.9 10/10(3) 40(9.8) 1.4
CJL-E 19.9±1.0 15.6±2.3 10/10(3) 0(ND) 0
CJL-H 20.4±0.8 16.8±2.3 10/10(3) 100(8.3) 1.3
CJL-I 20.4±0.8 18.9±1.9 10/10(3) 50(10.2) 1.5
공격접종대조군 - 20.2±0.7 0.0±0.0 10/10(3) 10/10(8.0) 2.0
음성대조군 - 20.3±0.7 21.1±0.9 0/10(ND) 0/10(ND) 0
A) 시험 유산균을 마리당 90 ㎕의 용량으로 인플루엔자 바이러스 (A/NWS/33[H1N1]) 공격접종 전 21일동안 3~4일 간격으로 총 6회 비강 투여함
B) 임상증상 발현두수/접종두수
ND; not determined
MTO(Mean time of onset clinical signs); 평균 임상증상발현시간
MDT(Mean deathh time); 평균 치사시간
PI14 (Pathogenicity index 14); 병원성 지수, 14일의 기간에 걸쳐 매일 관찰시 마우스당 평균 점수, 정상: 0, 앓음(열, 눈꺼풀, 털 이상): 1, 사망: 2
표 2와 같이, 1차 선발된 7종의 유산균 중 유산균의 비강투여 시험을 통하여 대조군에 비하여 폐사율을 유의성 있게 감소시키는 3종의 후보 균주 (CJL-A, CJL-D, CJL-E)를 확인하였고, 이 중 비강투여시 인플루엔자 감염으로 인한 폐사를 완벽하게 억제하는 것으로 나타난 락토바실러스 종 CJL-E를 최종선발 하였다.
실시예 1-3: 선발균주 동정 및 생리, 생화학적 특성조사
순수 분리된 최종 선발균주 CJL-E를 MRS 액체배지(Difco, USA)에서 37℃ 조건으로 18-24시간 동안 배양하였다.
배양 후, 최종 선발 균주 CJL-E의 생리학적 특성과 당이용성 및 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.
상기 균주는 그람양성의 세균으로 포자를 형성하지 않고, 호기적인 조건과 혐기적인 조건에서 모두 성장이 가능하며, 운동성이 없으며, 세포의 형태는 간균이다(도 1). 도 1은 본 발명의 CJL-E의 전자현미경 사진이다.
또한, 유산균 동정 및 분류를 위하여 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 분석을 통해 확인된 선발 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열은 서열목록에 기재하였다(서열번호 1)(도 2). 도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 CJL-E의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 모식도이다.
도 2에서 보듯이, 최종 선발 균주의 16S rRNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 퍼멘텀 표준 균주(Lactobacillus fermentum IFO3956, GeneBank accession number NC_010610)와 가장 높은 상동성(99.9%)을 나타내어 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)으로 동정하고, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2011년 4월 7일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM11184P).
락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 구체적인 생화학적 특성 및 당이용성은 API 50 CHL(바이오메리우스사 제품)을 사용하여 확인하였으며 분석한 결과는 하기 표 3과 같은 것으로 나타났다.
표 3 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 당이용성
특성 결과 특성 결과 특성 결과
Glycerol - Mannitol - d-raffinose +
Erythritol - Sorbitol - Starch -
D-arabinose - α-methyl-D-mannoside - Glycogen -
L-arabinose + α-methyl-D-glucoside - Xylitol -
Ribose + N-acetyl-glucosamine - b-Gentibiose -
D-xylose + Amygdalin - d-turanose -
L-xylose - Arbutin - d-lyxose -
Adonitol - Esculin - d-tagatose -
β-methyl-D-xylose - Salicin - d-fucose -
Galactose - Cellobiose - l-fucose -
Glucose + Maltose + d-arabitol -
Fructose + Lactose - l-arabitol -
Mannose - Melbiose + Gluconate +
Sorbose - Sucrose + 2-Keto-gluconate -
Rhamnose - Trehalose - 5-Keto-gluconate +
Dulcitol - Inulin -
Inositol - Melezitose -
+: 양성 반응, -: 음성 반응
상기 표 3에서 보듯이, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112은 L-아라비노스, 리보스, D-자일로스, 글루코스, 프럭토스, 말토스, 멜비오스, 수크로스, d-라피노스, 글루코네이트 및 5-케토-글루코네이트를 대사할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 균주의 세포벽 단백질 패턴 분석
락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 균주의 세포벽 단백질 패턴 분석은 Angelis 등(Angelis et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2011-2020)의 방법을 사용하였다. 비교를 위하여 락토바실러스 표준주 ATCC9338 역시 분석에 사용하였다. MRS 액체배지를 이용해 24시간 배양한 락토바실러스 종을 0.1M CaCl2를 포함하는 0.05M Tris-HCl(pH 7.5) 용액을 이용하여 2회 세척하였다. 균체를 동일한 용액에 부유시켜 1ml의 OD 10.0(A600) 용액으로 제조한 뒤, 8000 x g에서 5분간 원심 분리하였다. 균체로부터 단백질을 추출하기 위하여 가라앉은 균체를 1 ml의 추출용액 (0.01M EDTA, 0.01M NaCl, 2% SDS)에 부유시킨 뒤 60분간 상온에 정치시키고 100℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 다시 11600 x g, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액 15 ㎕와 5X SDS 시료 용액 3 ㎕를 섞은 후 5분간 끓였다. 이를 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen 사) 젤에서 락토바실러스 퍼멘텀 종의 세포벽 단백질을 전개하였다. 쿠마시블루(coomassie blue) 염색 용액을 이용하여 젤을 1 시간 동안 상온에서 염색하였다(도 3). 도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 CJL-112와 락토바실러스 퍼멘텀 표준주 ATCC9338의 SDS-PAGE 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 3에서 보듯이, CJL-112의 단백질 패턴은 약 145 kDa, 80kDa, 70kDa, 51kDa 그리고 48kDa 의 주 단백질로 관찰되었다. 이는 표준주의 단백질 패턴과 동일한 것으로, CJL-112가 락토바실러스 퍼멘텀의 일종임을 확인하였다.
실시예 3: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 균주의 RAPD 분석
락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 RAPD (Randomly amplified polymerhic DNA) 분석은 Angelis 등 (Angelis, M.D. et al., 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2011-2020)의 방법을 사용하였다. 시험에 사용한 프라이머는 P2(5'-ATGTAACGCC-3', 서열번호 2)와 P3(5'-CTGCGGCAT-3', 서열번호 3)이며, PCR 조건은 94℃에서 4분 처리 후, 94℃ 1분, 35℃ 1분, 72℃ 2분의 반응을 45번 반복하고 72℃에서 5분 반응 후 종료하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔에 전기영동한 뒤 EtBr로 염색하고 UV를 조사하여 확인하였다(도 4). 도 4의 (a)는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112와 락토바실러스 퍼멘텀 표준주 ATCC9338의 DNA를 추출하고 정제한 후 프라이머 P2를 사용해 PCR 후 RAPD 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이고, 도 4의 (b)는 본 발명의 일실시예에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112와 락토바실러스 퍼멘텀 표준주 ATCC9338의 DNA를 추출하고 정제한 후 프라이머 P3를 사용해 PCR 후 RAPD 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
상기 도 4에서 보듯이, 프라이머 P2와 P3를 이용한 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112의 RAPD 패턴은 모두 락토바실러스 퍼멘텀 표준주 ATCC9338과 모두 상이하게 나타났다. 이로써 CJL-112가 표준주 ATCC9338과 구별되는 신규 락토바실러스 퍼멘텀 균주임을 확인하였다.
실시예 4: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여에 의한 닭 전염성 기관지염 바이러스 감염 및 증식 억제 효능
1일령 SPF 병아리 150수를 그룹별 30수씩 총 3개의 그룹(경구투여군, 점안투여군, 비투여 공격접종 대조군)으로 나누어 그룹별로 격리 사육하였다.
시험 대상균으로써 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 사용하였다. 시험 대상균의 준비를 위하여 MRS 액체 배지를 제조하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 멸균된 증류수로 세척하였고 적정량의 멸균 증류수에 부유시켜 시험에 사용하였다.
사육 2일째부터 그룹별 투여경로에 따라 시험 대상균 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 매일 예방 투여하였다. 경구투여군의 경우 2x109.0 cfu/ml 농도의 시험균을 마리당 500 ㎕ 용량으로 경구 투여하였다. 점안투여군의 경우 3x1010.0 cfu/ml농도의 시험균을 마리당 30 ㎕ 용량으로 점안 투여하였다.
예방 투여 후 7일, 14일, 21일째 되는 날 그룹별로 각 10수씩의 동물을 무작위로 선발하여 전염성기관지염바이러스 KM91주를 마리당 105.0 EID50로 공격접종한 뒤, 격리 사육하였다. 매 공격접종 5일 뒤, 시험동물을 안락사하여 기관과 신장을 채취한 후 종란에 접종하였다. 3일간 배양한 종란으로부터 요막강액을 채취하고 이를 Dot-Immunoblotting assay하여 공격접종한 바이러스의 닭 장기 내 증식 여부를 확인하였다 (Song, CS et al., 1998, Avian Dis. 42 (1): 92-100)(표 4).
표 4 SPF 닭에서 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여 시 닭 전염성기관지염 예방효과
CJL-112투여경로A CJL-112투여기간B 바이러스양성 수수/공격접종 수수C
기관 신장
대조군 투여군 대조군 투여군
경구 1주 10/10 8/10 5/10 6/10
2주 10/10 10/10 9/10 4/10*
3주 10/10 10/10 8/10 5/10
점안 1주 10/10 7/10 5/10 4/10
2주 10/10 10/10 9/10 4/10*
3주 10/10 10/10 8/10 4/10
A 2일령 SPF 병아리에게 매일 CJL-112 를 109.0cfu/bird의 용량으로 경구 혹은 점안으로 투여함
B CJL-112 투여 개시 후 7, 14, 및 21일째 되는 날 그룹별로 10수의 닭에게 마리당 105.0 EID50 의 닭전염성 기관지염 바이러스를 공격접종함.
C 공격접종 5일 후, 닭의 기관과 신장 내 공격접종 바이러스 재분리율로 방어효능을 산정함.
* p<0.05, by Fisher exact t-test, 비투여 공격접종 대조군과 비교한 결과
상기 표 4에서 보듯이, CJL-112의 경구 및 점안 투여로 인해 공격접종 대조군에 비하여 기도 및 신장 내 전염성 기관지염 바이러스의 재분리율이 대부분 감소하였으며, 특히 CJL-112를 2주간 투여할 경우, 투여 경로와 상관없이 신장 내 바이러스 재분리율 P 값이 0.05 미만으로 나타나 유의성 있게 감소한 것으로 나타났다.
이로써 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112가 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 닭 전염성 기관지염 바이러스에 대해서도 우수한 항바이러스 효능을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여에 의한 H9N2형 저병원성 조류인플루엔자 감염 및 전파 억제 효능
3주령 SPF 병아리 60수를 그룹별 30수씩 총 2개의 그룹(투여군, 비투여 공격접종 대조군)으로 나누어 그룹별로 격리 사육하였다.
시험 대상균으로써 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 사용하였다. 시험 대상균의 준비를 위하여 MRS 액체 배지를 제조하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 멸균된 증류수로 세척하였고 적정량의 멸균 증류수에 부유시켜 시험에 사용하였다.
저병원성 조류인플루엔자 (A/Korean native chicken/Korea/K040110/2010 [H9N2]) 공격접종 1주일 전부터 공격접종 14일 후까지 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 비강으로 매일 투여하였다. 시험을 위하여 3x109cfu/ml 농도의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 마리당 500 ㎕ 용량으로 비강 경로로 투여하였고, 인플루엔자 바이러스 공격접종을 위하여 마리당 107.0EID50/ml 농도의 바이러스를 100 ㎕씩 닭 비강에 접종하였다.
시험 기간 동안 그룹별 30수의 닭을 0.4㎡ 의 철제 격자 케이지 2개로 나누어 사육하였으며 (케이지 1 = 공격접종 닭 10수, 직접 접촉 닭 10수, 케이지 2 = 간접 접촉 닭 10수), 두 케이지간 거리는 약 40 ㎝간격을 유지하도록 설치하여 공격접종한 바이러스의 직접 또는 공기 전파가 이루어지도록 하였다.
인플루엔자 바이러스 공격접종 후 14일간 임상증상 발현양상을 매일 관찰하였고, 공격접종 3, 5, 7, 9일째에 접촉감염군 및 공기전파감염군에서 구강 및 총배설강 스왑을 실시하여 인플루엔자 바이러스 유전자를 real-time RT-PCR을 이용하여 검출하였다. 또한, 공격접종 후 14일째 채혈하여 혈구응집 억제반응을 실시함으로써 인플루엔자 특이 항체 생성 유무를 평가하였다.
그 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.
표 5 SPF 닭에서 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여의 H9N2 조류인플루엔자 감염에 의한 임상증상 발현 억제 효과
구분 그룹 수수 혈청전환A 이환율B
CJL-112투여군 공격접종군 10 10/10 7/10
접촉감염군 10 10/10 6/10
공기전파감염군 10 5/10 0/10
CJL-112비투여 대조군 공격접종군 10 10/10 7/10
접촉감염군 10 10/10 7/10
공기전파감염군 10 8/10 3/10
A 공격접종 후 14일째 채취한 혈청에 대하여 A/Korean native chicken/Korea/K040110/2010 (H9N2)주를 항원으로 하는 혈구응집 억제시험(hemagglutination-inhibition assay, HI)을 실시함. 결과는 HI 시험 양성수수/총 시험수수를 의미함
B 임상증상 발현 수수/총 시험 수수
표 5에 나타난 바와 같이, 임상증상 관찰 결과 공기전파감염군의 경우, CJL-112 비투여 대조군에서는 80%의 혈청전환율과 30%의 이환율(일정한 기간 내에 발생한 환자의 수를 인구당의 비율로 나타낸 것)을 나타내었다. 반면, CJL-112를 투여할 경우에는 50%의 혈청전환율을 나타냈음에도 불구하고 임상증상 발현계는 관찰되지 않았다.
표 6 SPF 닭에서 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여의 H9N2 조류인플루엔자 수평 감염 시 바이러스 체외 배출 억제 효과
구분 그룹 바이러스 재분리 결과A
3 dpc 5 dpc 7 dpc 9 dpc
구강 총배설강 구강 총배설강 구강 총배설강 구강 총배설강
CJL-112투여군 공격접종군 10/10(4.2±0.2) 4/10(2.3±0.9) 9/10(4.0±0.5) 7/10(4.0±1.0) 7/10(2.2±0.5*) 8/10(2.7±1.0) 8/10(2.1±0.5) 6/10(1.6±0.7)
접촉감염군 9/10(4.9±0.7) 2/10(1.2±0.8) 10/10(5.9±0.2) 6/10(2.4±0.8) 10/10(5.8±0.2) 9/10(4.9±0.8) 10/10(4.0±0.3***) 9/10(5.1±0.7)
공기전파감염군 0/10(0) 0/10(0) 5/10(1.6±0.6) 0/10(0) 3/10(0.9±0.5) 0/10＋＋＋ (0) 3/10(1.1±0.6) 0/10(0)
CJL-112비투여 대조군 공격접종군 8/10(3.4±0.6) 7/10(2.3±0.6) 6/10(2.3±0.7) 7/10(2.5±0.7) 10/10(3.5±0.2) 10/10(4.3±0.5) 8/10(2.9±0.5) 9/10(3.4±0.6)
접촉감염군 9/10(4.0±0.6) 3/10(0.9±0.4) 10/10(5.9±0.2) 4/10(1.7±0.8) 9/10(5.7±0.6) 5/10(2.5±0.9) 10/10(5.6±0.3) 9/10(6.2±0.8)
공기전파감염군 0/10(0) 0/10(0) 3/10(1.1±0.6) 2/10(0.6±0.4) 5/10(1.5±0.5) 8/10(4.3±0.9) 5/10(2.6±0.9) 0/10(0)
dpc, day post-challenge
A공격접종 바이러스 재분리 수수/총 시험 수수 (평균 바이러스 역가 logEID50/ml ±표준 오차)
* p < 0.05 by two-tailed Student's t-test, 비투여 공격접종 대조군과 비교한 결과
*** p < 0.001 by two-tailed Student's t-test, 비투여 접촉감염 대조군과 비교한 결과
＋＋＋ p < 0.001 by Fisher's exact test, 비투여 공기전파감염 대조군과 비교한 결과
표 6에 나타난 바와 같이, 바이러스 재분리 결과, 공격접종 후 7일과 9일에 각각 CJL-112를 투여한 공격접종군과 접촉감염군의 구강 스왑내 바이러스 역가가 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다 (각각 p<0.05 와 p<0.001). 더욱이, 공격접종 후 7일째 대조군 내 공기전파감염계의 총배설강 바이러스 재분리율이 80% (4.3±0.9log EID50/ml)에 달한 반면, CJL-112 투여군의 공기전파감염계에서는 공격접종 바이러스가 전혀 검출되지 않았다 (p<0.001).
이러한 결과를 통하여, 본 발명의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112이 사람 인플루엔자 바이러스뿐 아니라 H9N2형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 대해서도 우수한 항바이러스 효능을 나타냄을 확인하였다.
실시예 6: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여에 의한 돼지 호흡기생식기증후군 (Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS) 감염 및 전파 억제 효능
PRRS 바이러스 음성인 3주령의 자돈 18두를 3개의 시험군(투여군 4두, 비투여 공격접종 대조군 4두, 비투여 음성대조군 2두)으로 나누어 그룹별로 격리 사육하였다.
시험 대상균으로써 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112을 사용하였다. 시험 대상균의 준비를 위하여 MRS 액체 배지를 제조하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 멸균된 증류수로 세척하였고 적정량의 생리식염수에 부유시켜 시험에 사용하였다.
PRRS 바이러스 (LMY주) 공격접종 7일 전부터 공격접종 후 21일까지 투여군 자돈에 매일 2 ml의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 (1 x 1010 CFU/ml )을 비강을 통하여 분무 투여하였고, 균주의 투여방법은 자돈의 비강으로부터 약 1 cm 거리에서 균주액을 한쪽 비강에 1 ml씩 총 2 ml을 스프레이(spray gun)를 이용하여 분무 투여하는 방법으로 하였다. 비투여 공격접종 대조군과 음성대조군의 자돈에는 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법에 의하여 투여하였다.
바이러스 공격접종을 위하여 투여군과 비투여군에서 무작위로 선발한 자돈 각 4두씩을 마취시켜 안정시킨 후, 비강에 바이러스액을 점적하여 공격 접종하였다. 한쪽 비강에 1 ml씩 총 2 ml을 접종하고, 각 자돈에 접종된 총 바이러스 양은 5 x105 TCID50의 바이러스 역가를 가진다. 투여군과 비투여군에 남은 각 4두씩의 자돈은 공격접종한 자돈과 24시간 격리한 후 재합사시시켜 접촉감염이 이루어지도록 하였다.
공격접종 후 21일간 임상증상을 관찰하고 계획된 스케줄에 따라 가검물(혈액, 폐세정액, 비강 및 구강 스왑, 폐조직 등)을 채취하였으며, 특히 폐세정액은 시험기간 동안 일주일 간격으로 채취하였다. ELISA 및 real-time RT-PCR법을 이용하여 IgA의 농도와 공격접종 바이러스의 RNA를 검출하고 그 역가를 산출하였다.
시험결과를 표 7 내지 9에 나타내었다.
표 7
구분 그룹 공격접종 후 혈액 내 PRRSV 항원 양성율A (검출 바이러스 역가)B
0일 2 일 4 일 5 일 7 일 10 일 14 일 21 일
CJL-112 투여군 공격접종군 0/4(0) 3/4 3/4(2.54) 4/4 1/4(3.62) 4/4 3/4(4.44) 4/4(4.96)
접촉감염군 0/4(0) 0/4 0/4 3/4 0/4(0) 0/4 2/3(4.10) 2/2(3.72)
CJL-112비투여 대조군 공격접종군 0/4(0) 1/4 1/4(3.67) 2/4 3/4(3.42) 2/4 4/4(4.06) 1/3(3.94)
접촉감염군 0/4(0) 1/4 2/4(0) 1/4 0/4(0) 1/3 3/3(4.60) 2/2(4.82)
음성대조군 0/2(0) 0/2 0/2(0) 0/2 0/2(0) 0/2 0/2(0) 0/2
A양성 두 수/시험군 동물 두 수
Blog10TCID50
표 7에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 투여한 접촉감염군 자돈의 혈액 내 바이러스 검출시기가 비투여 공격접종 대조군에 비하여 4일 정도 지연되는 경향을 나타내었다.
표 8
구분 그룹 공격접종 후 주간 증체율
1주 2주 3주 4주
CJL-112 투여군 공격접종군 0.90 0.84 1.16 1.95*
접촉감염군 1.15 1.58 0.90 2.55
CJL-112비투여 대조군 공격접종군 0.75 1.30 0.83 0.36
접촉감염군 0.70 1.78 1.33 2.25
음성대조군 0.80 1.56 2.51 5.08
* p < 0.05 by two-tailed Student's t-test, 비투여 공격접종 대조군과 비교한 결과
또한, 표 8에 나타난 바와 같이, PRRS 바이러스 공격접종 시 비투여군의 유의적인 증체율 감소가 확인된 반면, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 투여한 공격접종군 자돈의 증체율이 감염 후 3주~4주 기간에 유의적으로 증가함을 확인하였다.
표 9
구분 그룹 폐세정액 내 PRRSV 특이적인 IgA 농도A
0일 4일 7일 14일 21일
CJL-112 투여군 공격접종군 0.055 -0.120 -0.018 -0.038 1.033*
접촉감염군 -0.007 -0.095 -0.100 -0.027 0.478
CJL-112비투여 대조군 공격접종군 -0.148 -0.192 -0.162 0.001 0.487
접촉감염군 -0.140 -0.210 -0.083 0.015 0.207
음성대조군 -0.153 -0.130 -0.230 -0.163 0.057
* p < 0.05 by two-tailed Student's t-test, 비투여 공격접종 대조군과 비교한 결과
ASample-to-positive ratio (S/P ratio), (가검시료 평균OD-음성대조 평균OD)/(양성대조 평균OD-음성대조 평균OD)
마지막으로, 표 9에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 투여한 공격접종군의 폐세정액내 PRRSV 특이 IgA 항체가가 비투여 대조군에 비하여 높게 나타났다.
이러한 결과를 통하여, 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여가 돼지 PRRS 바이러스 특이 항체형성과 바이러스 증식 지연에 영향을 미치고, 바이러스 감염에 의한 체중 감소를 억제하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 7: 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여가 마우스 인플루엔자 감염 시 폐 내 면역반응에 미치는 영향
3주령 BALB/c 마우스 33마리를 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여그룹 16마리와 PBS(phosphate buffered saline) 투여그룹 17마리로 나누어 사육하였다. CJL-112는 MRS 액체 배지를 제조하여 37℃에서 24시간 배양한 후 배양액을 원심분리하여 멸균된 증류수로 세척하였고 다시 3X109cfu/㎖ 의 농도로 멸균증류수에 부유시켜 시험에 사용하였다.
인플루엔자 바이러스의 공격접종 전 10일 동안 2~3일 간격으로 총 6회에 걸쳐 케타민 마취(100 ㎎/kg) 후 90 ㎕ 용량의 CJL-112 부유액을 비강으로 투여하였고 대조그룹에는 PBS를 90 ㎕씩 비강으로 투여하였다.
인플루엔자 바이러스 공격접종을 위하여 케타민 마취(100㎎/kg) 후 마우스 전수 치사량에 해당하는 역가 104.0TCID50/㎖의 인플루엔자 A/NWS/33(N1H1) 바이러스액을 비강으로 마리 당 90㎕ 용량으로 투여한 뒤, 비 접종그룹과 격리 사육하였다.
바이러스 접종 시점을 기준으로 0시간, 6시간, 24시간, 48시간 뒤 그룹별로 4마리의 마우스를 안락사하여 폐를 무균적으로 채취한 후 유제하였다. 단, 0시간 시료채취를 위하여 공격접종을 실시하기 전에 투여그룹 마우스 4마리와 비투여그룹 마우스 5마리를 무작위로 선발하여 사용하였고, 각 폐 유제액 내 싸이토카인과 IgA 농도 측정을 실시하였다.
측정한 싸이토카인 및 IgA 농도를 도 5 에 나타내었다.
측정 결과, CJL-112 투여군에서 비투여군에 비하여 IL-1β(a), IL-2(b), IFN-γ(c), IFN-α(d), Ig A(e)의 농도가 유의적으로 상승하였고 IL-10(f), TNF- α(g) 농도는 유의적으로 하락하였다.
이로써 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 투여가 마우스 폐 내 IL-1β, IFN-γ 및 Ig A 분비 증가를 유도하여 체내 초기면역반응을 활성화시키고, 특히 인플루엔자바이러스 감염 후 IL-2의 분비를 유의적으로 증가시켜 Th1 타입의 세포성 면역반응을 유도함을 알 수 있었다. 또한 바이러스의 사멸에 중요하게 작용하는 IFN-γ의 분비를 신속하고 높은 수준으로 유도함으로써 인플루엔자 바이러스의 제거 및 마우스 생존에 기여하는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2012002839-appb-I000001

Claims (11)

  1. 바이러스 감염 억제 활성을 갖는 수탁번호 KCCM11184P인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) CJL-112.
  2. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 유효성분으로 포함하는, 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 감염성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스는 RNA형 바이러스 또는 DNA형 바이러스인 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 바이러스는 오르쏘믹소바이러스(orthomyxovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 아테리바이러스(arterivirus), 허피스바이러스(herpesvirus), 아데노바이러스(adenovirus)로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 상기 감염성 질환은 조류인플루엔자, 뉴캐슬병, 닭전염성기관지염, 조류뉴모바이러스감염증, 전염성후두기관지염을 포함하는 가금의 질환; 돼지인플루엔자, 돼지생식기호흡기증후군, 돼지유행성설사, 수포성구내염을 포함하는 돼지의 질환; 개인플루엔자, 아데노바이러스 감염증, 개파보바이러스 감염증, 개허피스바이러스 감염증, 개홍역, 광견병을 포함하는 개의 질환; 고양이 칼리시바이러스 감염증, 고양이 허피스바이러스 감염증을 포함하는 고양이의 질환; 말인플루엔자, 말뇌염, 말동맥염바이러스 감염증을 포함하는 말의 질환; 오제스키병, 소바이러스성 설사병, 소 전염성 비기관염을 포함하는 소의 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
  6. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료 첨가제 또는 음용수 첨가제.
  7. 제1항의 락토바실러스 퍼멘텀 CJL-112 또는 제1항의 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 바이러스로 인한 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 감염성 질환은 조류인플루엔자, 뉴캐슬병, 닭전염성기관지염, 조류뉴모바이러스감염증, 전염성후두기관지염을 포함하는 가금의 질환; 돼지인플루엔자, 돼지생식기호흡기증후군, 돼지유행성설사, 수포성구내염을 포함하는 돼지의 질환; 개인플루엔자, 아데노바이러스 감염증, 개파보바이러스 감염증, 개허피스바이러스 감염증, 개홍역, 광견병을 포함하는 개의 질환; 고양이 칼리시바이러스 감염증, 고양이 허피스바이러스 감염증을 포함하는 고양이의 질환; 말인플루엔자, 말뇌염, 말동맥염바이러스 감염증을 포함하는 말의 질환; 오제스키병, 소바이러스성 설사병, 소 전염성 비기관염을 포함하는 소의 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 투여는 경구적 또는 비경구적 경로를 통해 수행되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비경구적 경로는 비강 또는 안구인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 비경구적 경로를 통한 방법은 상기 동물에게 분무접종을 통해 투여되는 것인 방법.
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