KR102327753B1 - 면역 증진, 항바이러스 및 항균 활성을 가지는 유산균 YH-Lpro-37 및 이의 용도 - Google Patents
면역 증진, 항바이러스 및 항균 활성을 가지는 유산균 YH-Lpro-37 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항바이러스 활성, 면역 관련 사이토카인의 발현 유도능, 항균 활성, 내산성 및 내담즙성이 있는 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 균주 및 이의 배양액은 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물, 항균용 조성물, 프로바이오틱스 조성물, 사료첨가제 등의 소재로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 면역 증진, 항바이러스 및 항균 활성을 가지는 유산균 YH-Lpro-37 및 이의 용도에 관한 것이다.
역사를 통틀어 신종 및 재발 감염병은 새롭게 등장한 지카 바이러스, 인플루엔자, SARS 및 에볼라 바이러스와 같은 가장 공포스러운 바이러스의 일부로부터 유래하였고, 과거에서 지금까지 커다란 세계적 문제가 되고 있다. 인플루엔자 유행 [1918년 스페인(H1N1), 1957년 아시아(H2N2), 1968년 홍콩(H3N2), 2009년 멕시코(H1N1pdm)]으로부터 세계 어딘가에서 처음 나타난 새로운 감염이 적합한 상황하에서 며칠 또는 몇 주 안에 전 대륙을 횡단할 수 있음을 알 수 있었다. 대부분의 새로운 감염은 자연에 이미 존재하는 병원균에 의해 발생하거나, 불명확한 상태에서 발생하거나, 자연 선택 또는 새로운 숙주 개체로의 감염 기회로부터 발생하는 것으로 보인다. 드문 경우, 새로운 변종이 진화하고 새로운 질병을 일으킬 수도 있다. 그러므로, 이러한 바이러스 감염과 발생을 전 세계적으로 줄이거나 예방할 수 있는 대안적이며 무해한 방법을 발견하는 것이 중요하다. 이를 위해 새롭게 진화하는 바이러스나 끊임없이 재발하는 바이러스에 대한 보다 정확한 바이러스 진단을 위한 민감하고 특이적인 방법이 필요하며, 이는 궁극적으로 적절한 항바이러스 후보물질들을 확인하는데 도움이 된다.
프로바이오틱스 요법은 I형 인터페론 등 사이토카인의 생성과 분비를 증가시켜 바이러스에 대한 선천적 및 적응형 면역체계 요소들을 강화하고 활성화시키는 효과가 있다. I형 인터페론 경로에서 오는 신호는 다양한 사이토카인의 분비를 증가시켜, 선천적인 면역 체계를 강화시키고 바이러스와 같은 병원체 침입에 대한 특정 면역 체계를 활성화시킨다. 프로바이오틱스는 장 점막을 통해 영향을 미쳐 병원성 미생물의 성장을 억제하고 국소적인 미생물총(microbiota)의 구성과 활성에 영향을 미치며 숙주 체내의 국소 및 전신 면역반응을 높일 수 있다.
프로바이오틱스는 장 내에 살고있는 박테리아 사이의 적절한 균형을 유지함으로써 인간에게 이로운 살아있는 미생물이다. 인간과 동물의 소화관에서 유제품을 전형적으로 발효시키는 락토바실러스 및 비피도박테리움 같은 프로바이오틱 박테리아는 면역체계의 균형을 맞출 수 있고 특이적 및 비특이적인 면역반응을 높일 수 있다. 프로바이오틱스는 바이러스와 같은 병원균에 대한 인체의 방어에서 면역조절 박테리아로서 중요하다. 이전의 연구에서 락토바실러스 사케이(Lactobacillus casei) Shirota, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG, 락토바실러스 루테리(L. reuteri) 및 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum) 균주로 대표되는 다양한 유산균 종이 치사량의 인플루엔자 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 가지고 있음이 보고되었다. 감염병에 대한 프로바이오틱스의 효과는 아직 미개척이 많지만, 예방의학으로의 강력한 움직임은 프로바이오틱스 요법 개발의 중요성을 높였다.
한편, 한국등록특허 제1999531호에는 '면역 활성, 항바이러스 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 페로렌스 SRCM102283 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0012569호에는 '항바이러스 및 항세균 활성을 갖는 락토바실러스 및 그의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '면역 증진, 항바이러스 및 항균 활성을 가지는 유산균 YH-Lpro-37 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 새롭게 분리 동정한 젖산균인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주가 내산성 및 내담즙성이 있고, 항바이러스 활성이 있는 사이토카인의 발현을 유도하며, 인플루엔자바이러스, 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬병바이러스 및 단순포진바이러스에 대한 항바이러스 활성 및 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 대장균, 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에 대한 항균성이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 면역증진 및 항바이러스 활성을 가지며, 항균성, 내산성 및 내담즙성이 있는, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을, 인간을 제외한 면역 증진이 필요한 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역 증진 및 항바이러스 활성의 증진 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주는 인플루엔자바이러스, 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병바이러스, 단순포진바이러스에 대해 항바이러스 활성을 가지며, 다양한 병원성 세균에 대한 우수한 항균성, 내산성 및 내담즙성을 가지고 있으므로, 바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 조성물, 항균용 조성물, 프로바이오틱스 제제, 사료첨가제 등의 소재로 다양하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 분리한 유산균들의 항바이러스 활성을 RAW264.7 세포에서 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 YH-Lpro-37 균주의 계통도이다.
도 3은 RAW264.7 세포에서 VSV-GFP, PR8-GFP, NDV-GFP, HSV-GFP 바이러스에 대한 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 항바이러스 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 사이토카인 분비 유도 효과를 IFN-β 및 IL-6의 발현량 분석을 통해 평가한 결과이다.
도 5는 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 예방 효과를 분석한 것이다.
도 6은 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 사이토카인 분비 유도 효과를 혈청(serum), 기관지 폐포 세척액(BALF) 및 소장액(SIF)에서 분석한 결과이다.
도 7은 효소 처리한 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37) 상층액의 항바이러스 활성을 RAW264.7 세포에서 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 YH-Lpro-37 균주의 계통도이다.
도 3은 RAW264.7 세포에서 VSV-GFP, PR8-GFP, NDV-GFP, HSV-GFP 바이러스에 대한 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 항바이러스 활성을 분석한 결과이다.
도 4는 RAW264.7 세포에서 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 사이토카인 분비 유도 효과를 IFN-β 및 IL-6의 발현량 분석을 통해 평가한 결과이다.
도 5는 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대한 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 예방 효과를 분석한 것이다.
도 6은 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37)의 사이토카인 분비 유도 효과를 혈청(serum), 기관지 폐포 세척액(BALF) 및 소장액(SIF)에서 분석한 결과이다.
도 7은 효소 처리한 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주(Lpro-37) 상층액의 항바이러스 활성을 RAW264.7 세포에서 분석한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 면역증진 및 항바이러스 활성을 가지며, 항균성, 내산성 및 내담즙성이 있는, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주를 제공한다.
본 발명에서는 돼지의 대장 샘플로부터 유산균 균주를 분리하였고, 분리된 유산균 중 항바이러스 활성이 뛰어난 균주를 선발하였으며, 이를 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.)으로 동정한 것이다. 동정된 리모시락토바실러스 속 균주는 우수한 항바이러스 활성, 면역 증진과 관련된 사이토카인의 발현을 유도하는 효과, 항균 활성, 내산성 및 내담즙성을 가지고 있는 것으로 확인되었고, 상기 균주를 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주로 명명한 후, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2021년 04월 28일에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 14552BP).
리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.)은 Zheng 등(Int J Syst Evol Microbiol. (2020) 70(4):2782-2858)에 의해 25개 속으로 재분류 된 락토바실러스 속 중 하나로, 재분류 전 락토바실러스 루테리(L. reuteri)로 명명되었던 종을 포함하는 그룹이다.
본 명세서에서 용어 "항바이러스(antiviral)"는 바이러스의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명에 따른 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주에 있어서, 상기 항바이러스 활성은 바람직하게는 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus) 및 단순포진바이러스(Herpes simplex virus)에 대한 항바이러스 활성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인플루엔자바이러스는 이에 한정되는 것은 아니나, H1, H3 및 H5 아형의 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다.
인플루엔자바이러스는 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae)에 속하며 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS의 여덟 개의 네가티브 센스 RNA 단편을 갖고 있는 바이러스이다. 이 중 외피 단백질을 이루고 있는 두개의 단백질 헤마글루티닌 (hemagglutinin)과 뉴라미니다아제(neuraminidase)는 면역항체를 유도하는데 중요한 면역원이며, 이들은 항원의 대/소변이(antigenic shift and drift) 과정을 통해 변형되는 특징을 갖고 있다. 이런 독감 바이러스의 변화는 동일 아종내의 다른 독감 바이러스에 대하여 형성된 면역도 회피할 수 있게 할 수 있으며, 일반적으로 독감 바이러스에 의해 유도된 면역은 단기간에 소실되기 때문에 매 시즌에 유행이 예측되는 바이러스에 대하여 새로이 면역을 유도해야 한다.
수포성구내염바이러스(VSV)는 대부분의 포유류 세포를 감염시키고 감염된 세포의 전체 단백질 중 최대 60%의 바이러스 단백질을 발현하는 음성 가닥(negative stranded) RNA 바이러스이다. 자연적으로, VSV는 돼지, 소 그리고 말을 감염시키며 입과 발 주위에 수포병(vesicular disease)을 유발한다. VSV에 의한 인체 감염이 보고되었지만, VSV는 인간에서 심각한 증상을 유발하지는 않는다.
뉴캐슬병(Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제 1종 가축 전염병으로 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상과 산란계에서 산란율 저하로 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 매년 발생주의보를 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 뉴캐슬병의 주요 증상은 처음에는 닭이 졸기 시작하여 콧물, 기침 등의 호흡기 증상이 나타나고 녹색 설사를 하다 죽는다. 또한, 적절한 백신을 하지 않은 경우 백신 항체가가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되기도 하고 예방 접종을 했더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타나기도 한다.
단순포진바이러스(HSV)는 투명액으로 가득 차있는 수포형태로 나타나는 통증을 수반한 피부 또는 점막 병변을 일으키는 원인이다. 단순포진바이러스 1형(HSV-1)은 주로 입, 얼굴 및 눈을 감염시킨다. 단순포진바이러스 2형(HSV-2)은 주로 생식기 및 엉덩이를 감염시킨다. 그러나, 1형 및 2형 혈청형 각각은 모든 부위에서 감염을 일으킬 수 있다. 단순포진바이러스에 의한 1차 감염은 일반적으로 감염 부위에 약한 발열 병변을 발생시킨다. 치료기간은 평균적으로 8일 내지 12일이며, 이 기간에 바이러스가 신경절로 이동하여 이곳에서 잠복상태로 지내게 된다. 잠복상태의 바이러스는 육체적 또는 감정적 스트레스, 추위, 열, 면역기능 저하 또는 분명치 않은 원인 등을 포함한 여러가지 원인에 의해 다시 활성화될 수 있다. 활성화되면 이로 인해 2차 감염 발생을 유발한다.
본 발명에 따른 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주에 있어서, 상기 항균성은 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 대장균(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에 대한 항균성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주는 pH 2.0의 조건에서도 생존할 수 있어 우수한 내산성이 있고, 담즙산이 5% 함유된 배지에서도 성장할 수 있을 정도의 내담즙성을 가지고 있는 것이 특징이다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물 및 건강기능식품 조성물은, 오르토믹소비리대(Orthomixoviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramixoviridae) 및 허피스비리대(Herpesviridae) 바이러스에 대한 항바이러스 활성, 및 애로모나스 하이드로필라(A. hydrophila), 시트로박터 프룬디(C. freundii), 대장균(E. coli), 엔테로박터 클로아세(E. cloacae), 락토코쿠스 락티스(L.lactis), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis), 세라티아 마르세센스(S. marcescens), 스타필로코쿠스 에피더미디스(S. epidermidis), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis), 클렙시엘라 뉴모니애(K. pneumoniae), 프로테우스 불가리스(P. vulgaris), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 시겔라 플렉스네리(S. flexneri) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에 대한 항균성을 가진 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주를 유효성분으로 함유하므로, 바이러스 및 세균 감염증에 대한 예방, 개선 또는 치료용으로 사용될 수 있다.
상기 조성물이 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물인 경우에, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제의 대표적인 예로는, 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 젤라틴, 글리세린, 아카시아 고무, 알지네이트, 칼슘포스페이트, 칼슘카보네이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물성 오일, 주사가능한 에스테르, 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우리지 등을 들 수 있다. 본 발명의 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 에어로졸, 외용제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 약학 조성물의 제제화 방법은 기술분야에 공지된 통상의 방법에 따라 수행될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물의 투여량, 투여 경로, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명의 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물은 유효성분으로 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물 외에 다른 약학적 활성 성분을 함께 포함하거나, 또는 다른 유효 성분을 포함하는 약학 조성물과 혼합되어 이용될 수 있다.
또한, 상기 조성물이 면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품 조성물인 경우에, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 있는 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제는 포도당, 과당, 말토오스, 슈크로스, 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올과 같은 천연 탄수화물, 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 향미제, 사카린, 아스파르탐산 등의 합성 향미제, 착색제, 펙트산 또는 그의 염, 알긴산 또는 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산화제 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 캔디, 츄잉검, 젤리 및 음료로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태일 수 있다. 면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품 중의 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 또는 상기 배양물의 추출물의 함량은 식품의 형태, 풍미, 맛 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 건강기능식품 전체 중량에 대하여 0.01~30 중량%의 범위일 수 있다. 본 발명의 면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품의 형태, 조성 및 제조방법 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 사료첨가제를 제공한다.
본 발명에 따른 사료첨가제는 면역 증진과 관련되어 있는 사이토카인(INF-β 및 IL-6)의 발현을 유도하는 효과가 있고, 오르토믹소비리대(Orthomixoviridae), 랍도비리대(Rhabdoviridae), 파라믹소비리대(Paramixoviridae) 및 허피스비리대(Herpesviridae) 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주를 유효성분으로 함유하므로, 면역 증진 및 항바이러스 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다. 본 발명의 사료첨가제에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병 예방제와 같은 첨가제가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 분말 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 탄산칼슘, 말분, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 사료첨가제는 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 급여 동물(가축)의 종, 주령, 체중, 및 사육 조건 등에 따라 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을, 인간을 제외한 면역 증진이 필요한 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역 증진 및 항바이러스 활성의 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 동물의 면역 증진 및 항바이러스 활성 증진 방법에 있어서, 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상의 투여량, 투여경로, 투여 시기 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있음이 통상의 기술자에게 명백하다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
용어 "항균(antimicrobial)"은 세균(bacteria)의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명에 따른 항균용 조성물에 있어서, 상기 병원성 세균은 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 대장균(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 중에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
본 발명의 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 장내 유해한 병원성 세균을 억제하고, 항바이러스 및 면역 증강 효과를 나타내므로, 프로바이오틱스 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물은 통상적인 프로바이오틱스 제제의 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양현탁액이거나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 YH-Lpro-37 균주 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 프로바이오틱스 제제로 제조할 수 있다. 담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 프로바이오틱스 조성물에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(corn starch), 콩기름(soybean oil), 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starch glycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone) 중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-시클로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 항바이러스 활성을 가지는 유산균 균주 분리 및 동정
본 발명자는 돼지의 대장 샘플을 혐기적으로 채취하여 희석한 다음 MRS 고체배지에 도말하고 혐기적(Anaerobic system, H2:C02:N2=7:5:88%, Forma Scientific)으로 37℃에서 48시간 배양하였다. 배양 후 출현한 집락을 순수분리하고, -80℃에 보존하여 실험에 사용하였다. 분리된 균주들은 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 분석을 통한 동정이 이루어졌다. 구체적으로, 각각의 분리균주 콜로니의 16S rRNA 증폭을 위하여 프라이머 27F(5'-agagtttgatccctcag-3', 서열번호 1) 및 1492R(5'-ggttaccttgttacgactt-3', 서열번호 2)을 사용하여 처음 사이클은 95℃에서 2분, 30 사이클은 95℃에서 20초, 50℃에서 40초, 72℃에서 1분 30초, 마지막 사이클은 72℃에서 5분 및 4℃에서 10분의 조건으로 PCR (Polymerase chain reaction)을 수행하였다. PCR 산물은 증폭된 유전자(gene)의 크기를 전기영동을 통해 1차적으로 확인하고 시퀀싱을 한 다음 염기서열을 분석하였다.
그 후, 분리된 균주들의 항바이러스 활성을 검증하였다. 간단하게, 마우스 대식세포주인 Raw264.7 세포를 12-well 플레이트에 8x105 cells/well로 분주한 후 분리된 락토바실러스 속 균주들을 5x105 CFU/10 ㎕로 처리하였다. 음성 대조구는 MRS 배지만을 처리하였고, 락토바실러스 속 균주 처리 12시간 후 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus, VSV)와 녹색형광단백질(GFP)을 융합한 VSV-GFP (MOI: 0.005)를 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 세척한 후 배지를 교체하고 12시간 및 19시간 후에 바이러스 감염정도를 형광측정을 통해 평가하였다.
2. 유산균 균주의 내산성, 내담즙성 및 병원성 세균에 대한 길항능력 분석
내산성 실험을 위하여, 유산균 균주를 각각의 pH 1.0 내지 pH 6.5로 조정한 희석액(생리식염수)에 접종하여 180분간 느리게 진탕하였다. 진탕액 1 ㎖을 MRS 배지에 도말하고, 37℃, 48시간 배양하여 나타난 콜로니를 계산하였다. 내담즙성 실험을 위하여, 유산균주를 Bacto oxgall(Difco)의 농도를 0 내지 0.5%(w/v) 농도로 첨가한 MRS 배지에 도말하고, 37℃, 48시간 배양하여 나타난 콜로니를 계산하였다.
병원성 세균에 대한 길항능력 시험은 페이퍼 디스크(8mm, Yoyo Roshi Kaisha, Japan)를 이용하여 억제환의 직경(mm, diameter)을 측정하였다. 실험에 사용한 지시균주는 KCTC(한국생명공학연구원 생물자원센터)에서 분양받은 16종이며, 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila) KCTC 2358, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1021, 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii) KCTC 2006, 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae) KCTC 2361, 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis) KCTC 1913, 대장균(Escherichia coli) KCTC 2441, 대장균 KCTC 2571, 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) KCTC 2208, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) KCTC 2579, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) KIMsp14, 살모넬라 티피(S. typhi) KIMsp.16, 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium) KCTC 1925, 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) KCTC 2172, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) KCTC 2008, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1621 및 스타필로코쿠스 에피더미디스(S. epidermidis) KCTC 1917이다. 분리균주는 MRS 액체배지에서, 지시균주는 TSA 고체배지에서 배양한 후 사용하였다. 약 24시간 배양한 지시균주의 농도를 106-7 CFU/㎖로 조정하여 Mueller-Hinton agar 배지에 100 ㎕ 도말 건조한 후, 분리균주의 배양액 30 ㎕를 멸균된 디스크에 접종하여 48시간 배양하였다. 대조구는 멸균증류수를 동량 사용하였다.
3. 세포 및 바이러스
RAW264.7 (ATCC® TIB-71™), HeLa (ATCC® CCL-2™) 및 MDCK (ATCC CCL-34, NBL-2) 세포들은 37℃, 5% 이산화탄소 농도 조건 하에서, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; Gibco, USA) 및 1% 항생-항균용액(#15240-062, Gibco)을 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; Invitrogen, USA) 배지에서 유지시켰다.
GFP와 결합한, 인플루엔자바이러스 A (A/PuertoRico/8/34(H1N1)) (PR8-GFP), 뉴캐슬병바이러스(NDV-GFP) 및 도전감염에 사용된 인플루엔자바이러스 A 아형 [{A/PR/8 /34(H1N1)}, {A/Aquaticbird/Korea/W81/2005 (H5N2)}, {A/Philippines/2/08(H3N2)}]를 10일째 되는 닭 배아의 요막강액에 접종하여 증식시켰다. GFP와 수포성구내염바이러스, 단순포진바이러스를 각각 결합한 VSV-GFP 및 HSV-GFP는 Vero 세포 (ATCC® CCL-81™)에서 증식시켰다.
4. 바이러스 역가 측정
바이러스 역가는 VSV-GFP, PR8-GFP, HSV-GFP는 Vero 세포를, NDV-GFP는 HeLa 세포를 이용하여 표준 용균반검사(plaque assay)를 일부 변형하여 측정하였다(Chowdhury, M.Y.E., et al., Plos One, 2014. 9(4):e94051; Kim, J.H., et al., BMC Complement Altern Med, 2016. 16:265). 바이러스 증식을 정량하기 위하여, VSV-GFP에 감염된 세포로부터 감염 후 12시간과 24시간째에 배양 상층액을 각각 채취하였고 바이러스 역가는 Vero 세포에서 결정하였다. PR8-GFP, NDV-GFP 및 HSV-GFP 역가 측정의 경우에는, 지정된 시점에 세포들을 회수하고 -70℃로 얼렸다가 상온으로 녹이는 과정을 5회 반복한 후 그 역가를 PR8-GFP와 HSV-GFP는 Vero 세포에서 NDV-GFP에 대해서는 HeLa 세포에서 결정하였다.
5. IFN-β 및 전염증성 사이토카인 검출을 위한 EILSA
전염증성 사이토카인의 유도에 대한 YH-Lpro-37 균주의 효과는 생체 외 실험(in vitro)에서 상업용 ELISA 키트를 이용하여 검증하였다. RAW264.7 세포에서 쥐(murine)의 인터루킨-6 (interleukin-6, IL-6) 및 인터페론-베타 (interferon-β, IFN-β) 측정은 이전의 방법(Wadsworth, T.L. and D.R. Koop, Biochem Pharmacol, 1999. 57(8):941-949)에 따라 수행되었다. RAW264.7 세포에 YH-Lpro-37 균주의 live 배양액(5x106 CFU/㎖) 또는 YH-Lpro-37 균주의 배양 상층액을 처리하였다. 처리 후 12시간과 24시간째에 각각 수집한 배양 상층액을 2,500xg, 4℃, 10분의 조건으로 원심분리하여 정제하였으며, 쥐의 IFN-β ELISA 플레이트(PBL Interferon Source, USA) 또는 IL-6 ELISA 플레이트(BD Bioscience, USA)에 분주하였다. 각 실험은 3번 반복 시행되었다.
6. 동물실험
6주령의 암컷 야생형 B57BL/6NHsd 마우스(16±1 g)를 생체 내 실험(in vivo)에 사용하였다.
생존율 분석을 위하여, 60마리의 마우스를 도전감염 바이러스(H1N1, H5N2 및 H3N2)에 따라 3개의 주된 그룹으로 나누었다. 모든 세트(H1N1, H3N2 및 H5N2 그룹)는 음성 대조군(PBS 그룹), 양성 대조군(IFN-β 그룹), YH-Lpro-37 균주 live 배양액 및 YH-Lpro-37 균주 배양 상층액의 4개의 세부그룹으로 나누었고, 각 세부그룹은 5마리의 마우스로 구성하였다. H1N1 감염군은 폐 바이러스의 적정을 위하여, 또 다른 24마리의 마우스들을 4개의 세부그룹으로 나누었고, 각 세부그룹은 6마리의 마우스로 구성하였다. 각 그룹으로부터 폐 조직을 도전감염 후 3일째 되는 날과 5일째 되는 날에 무균적으로 적출하였다. 상기 마우스들에 대해 YH-Lpro-37 균주 live 배양액 100 ㎕ (5x108 CFU/㎖)와 YH-Lpro-37 균주 배양 상층액 100 ㎕를 21일 동안 매일 경구로 투여하였다. IFN-β는 바이러스 감염 12시간 전에 비강 내로 투여하였다. 음성 대조군 그룹에 대해서는 100 ㎕의 PBS를 경구로 투여하였다. 모든 마우스에 대해 1MLD50 (50% mouse lethal dose)의 H1N1, H5N2 또는 H3N2를 비강 내로 감염시켰다. 해당 마우스들을 13일 동안 관찰하였고, 체중 감소와 생존 여부를 매일 지정된 시간에 측정하였다. 생존율은 사망여부로 결정하거나, 25%의 체중감소 시점을 기준으로 판단하였다. H1N1에 감염된 그룹에 속하는 6마리의 마우스에서 감염 후 3일째 되는 날과 5일째 되는 날에 폐에 있는 바이러스 역가를 측정하기 위하여 임의선택으로 각 그룹당 3마리씩을 희생시켰으며, 각 그룹에 대한 또 다른 5마리의 쥐들은 생존 평가를 위해 이용하였다. 본 실험에서는 동물의 고통을 최소화하기 위한 모든 노력을 기울였으며, 최종 관찰 후 모든 살아있는 쥐들에 대해서는 5분 동안 이산화탄소를 주입하여 인도적으로 죽음에 이르게 하였다. 본 동물 실험은 주식회사 바이오리더스의 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and use Committee)의 승인을 받아 적절한 조건 하에 수행되었다.
7. 폐 바이러스 역가의 결정
폐 바이러스의 적정은 이전의 방법(Quan, F.S., et al., J Virol, 2007. 81(7):3514-24)에서 일부 변형한 TCID50 (50% tissue culture infectious dose) 검정을 이용하였다. 간단하게, 폐 조직들을 항생 그리고 항진균 용액 (Gibco, USA)을 포함하는 PBS에서 균질화하였으며 세포 잔해물을 제거하기 위해 12,000xg에서 원심분리하였다. 그 후 모든 샘플들을 즉시 연속적으로 10배 희석시켰으며, 37℃의 습한 대기에서 5% 이산화탄소 하에 1시간 동안 MDCK 세포와 함께 배양시켰다. 그 후 혈청의 보충 없이, L-1-tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone-(TPCK-) 트립신 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 포함하는 중충배지로 교체하였으며. 감염된 세포들을 72시간 동안 배양하였다. 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)가 관찰되었으며, 바이러스 역가는 Reed and Muench method로 계산하였고 이를 log10 TCID50/폐 조직(lung tissue)으로 표현하였다(Zhao, G., et al., Virol J, 2010. 7:9).
8. 혈청, 기관지 폐포 세척액(BALF) 및 소장액(SIF) 내 사이토카인 측정
6주령 C57BL/6NHsd 암컷 32마리 마우스들을 각 그룹당 8마리씩, 4개의 그룹으로 나누었다: YH-Lpro-37 live 배양액에 대한 PBS 그룹 8마리, YH-Lpro-37 live 배양액 그룹 8마리, YH-Lpro-37 상층액에 대한 PBS 그룹 8마리, YH-Lpro-37 상층액 그룹 8마리. 마우스들에 대해 YH-Lpro-37 live 배양액과 YH-Lpro-37 상층액을 각각 100 ㎕ (live 배양액 5x108 CFU/㎖) 씩 3주간 경구로 투여하였다. 대조군은 PBS 100 ㎕를 경구로 투여하였다. 각 그룹으로부터 4마리의 마우스들을 투여 12시간 및 24시간 후에 임의적으로 골라, 혈청, 기관지 폐포 세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF) 및 소장액(Small-Intestinal Fluids, SIF)을 아래 서술한 바와 같이 채취하였다.
혈청: 본 과정은 생물안전도(biosafety level)-2에 해당하는 실험실에서 수행되었다. 혈액 샘플들은 안와정맥총(retro-orbital plexus)으로부터 채취하였고, 혈청은 원심분리에 의해 분리된 후 -20℃ 조건 하에서 보관되었고 이후 ELISA에 이용하였다.
BALF: BALF는 이전의 방법(Weeratunga, P., et al., J Microbiol, 2016. 54(1):57-70; Daubeuf, F. and N. Frossard, Curr Protoc Mouse Biol, 2012. 2(2):167-175)에서 일부 수정하여 수집하였다. 간단하게, 마우스의 폐를 Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; Sigma-Aldrich) 1 ㎖로 4번 세척한 다음 이를 모으고, 즉시 -20℃ 하에서 보관시킨 다음 이후 ELISA에 이용하였다.
SIF: 마우스의 소장에서 이전의 방법(Lefrancois, L. and N. Lycke, Curr Protoc Immunol, 2001. Chapter 3: Unit 3 19.)에 따라 채취하였다. 간단하게, 마우스를 경추 탈구로 안락사시킨 다음 중앙선을 따라 절개를 시행하고 피부를 수축시키도록 하였다. 소장을 다른 조직들로부터 분리시키기 위하여 맹장(cecum)으로부터 1 cm 위에서 절제하였다. 그런 다음, 절제된 소장을 HBSS 500 ㎕를 이용하여 매우 조심스럽게 씻어낸 후, 원심분리를 시행하고, 해당 액을 즉시 -20℃ 조건 하에 보관시킨 다음 이후 ELISA에 이용하였다.
9. YH-Lpro-37 균주 상층액에 대한 효소 처리
7가지 종류의 효소들을 준비하고 YH-Lpro-37 상층액을 표 2에서 언급한 조건에 따라 처치하였다.
10. 통계분석
데이터는 적어도 세번 이상의 독립적인 실험을 수행한 후 이의 평균±표준편차로 표현하였다. 그룹 간 차이는 분산분석(analysis of variance, ANOVA)에 의해 분석되었고, 평균은 Student's t-검정을 사용하여 비교하였다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001. 생존 시간은 GraphPad Prism 6.0을 통해 로그-순위 검정법(og-rank tests)을 이용해 비교하였다.
실시예 1. 분리균주 YH-Lpro-37의 항균성 및 특성 분석
생균제용 균주개발을 위해 돼지 대장 샘플로부터 분리한 유산균들의 항바이러스 활성을 비교한 결과, 도 1에서와 같이 YH-Lpro-37 균주가 가장 우수한 항바이러스 활성을 나타내었다. 이에 상기 YH-Lpro-37 균주의 동정을 위하여 16S rRNA(서열번호 3) 유전자 서열을 분석하고, 상기 염기서열에 기초하여 MEGA 프로그램을 사용하여 neighbor-joining method를 이용해 bootstrap을 1,000회 반복하여 계통학적 분석을 수행한 결과, 본 발명에서 분리한 YH-Lpro-37 균주는 리모시락토바실러스 루테리(Limosilactobacillus reuteri)와 99.8% 유사도를 보여주었다(도 2). 이에, 상기 YH-Lpro-37 균주를 리모시락토바실러스 속(Limosiactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주로 명명하고, 내산성, 내담즙성, 병원성 세균에 대한 항균력 및 효소 활성 등의 특성을 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 YH-Lpro-37 균주가 pH 2.0에서도 높은 생존율을 보여 상당한 내산성을 보이고 있음을 알 수 있었으며(표 3), 담즙산이 5% 함유된 배지에서도 성장할 수 있을 정도로 담즙산 내성이 높음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 YH-Lpro-37 균주는 장내 질병에 주로 관련되는 것으로 알려진 병원성 세균들에 대해 우수한 항균 능력을 나타내었다(표 4).
실시예 2. YH-Lpro-37의 항바이러스 활성:
in vitro
분석
YH-Lpro-37 균주의 live 배양액과 상층액의 항바이러스 효과를 평가한 결과, YH-Lpro-37을 처리한 그룹은 바이러스만 감염시킨 그룹(VSV-GFP, PR8-GFP, NDV-GFP, HSV-GFP)과 비교하여 GFP의 발현이 유의하게 감소되어 있었음을 보여주었다(도 3). 바이러스 역가 측정의 결과 또한 GFP 형광 감소 패턴과 일치하는 결과를 보여주었다. YH-Lpro-37 live 배양액을 처리한 그룹의 바이러스 역가는 바이러스만 감염시킨 그룹(VSV-GFP, PR8-GFP, NDV-GFP, HSV-GFP)의 바이러스 역가와 대비하여 각각 2.8, 2.38, 2.36 및 2.47배 감소되어 있었으며, 유사하게, YH-Lpro-37 상층액을 처리한 그룹 또한 바이러스만 감염시킨 그룹과 비교하여 바이러스 역가가 각각 2.36, 2.43, 2.19 및 2.25배 유의한 감소를 보였다(도 3). 또한, YH-Lpro-37을 처리한 세포들은 모든 바이러스에 대해, 바이러스만 감염시킨 그룹이 높은 세포 사멸을 보이는 것에 비해 바이러스 감염 후 24시간 이내 대부분 70% 이상의 생존율을 보여주었다(데이터 표시 안함). 종합하면, 이러한 결과들은 RAW264.7 대식세포에서 YH-Lpro-37이 VSV-GFP, PR8-GFP, NDV-GFP 및 HSV-GFP 증식을 억제하는 능력이 있음을 보여주는 것이다.
실시예 3. YH-Lpro-37 처리에 의한 RAW264.7 세포의 사이토카인 유도 분석
사이토카인은 병원성 감염에 대한 숙주 방어의 중요한 매개체이며, 바이러스 감염 중 효과적인 보호를 위해 중요하다. 이에 본 발명자는 RAW264.7 세포에서 IFN-β 및 IL-6의 발현량을 분석하여 YH-Lpro-37의 사이토카인 분비 유도 효과를 검증하였다. YH-Lpro-37이 바이러스 증식을 얼마나 효과적으로 억제할 수 있는지 판단하기 위하여, 먼저 YH-Lpro-37의 상층액이 처치된 RAW264.7 세포에서 IFN-β 및 전염증성 사이토카인인 IL-6의 양을 분석하였다. 그 결과, YH-Lpro-37 live 배양액 또는 상층액이 처리된 RAW264.7 세포들은 IFN-β를 처리한 양성 대조군에서 얻어지는 양과 비교하여 유사한 수준으로 IFN-β 및 IL-6를 분비하는 것을 알 수 있었다(도 4). 이러한 결과는 사이토카인 분비에 의해 결정되는 면역 체계에 YH-Lpro-37이 분명한 효과가 있음을 시사하였다. 또한, 이러한 결과들은 YH-Lpro-37 live 배양액 또는 상층액이 바이러스의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 하는, 세포 내의 항바이러스 상태를 촉진하는 역할을 하는 IFNs 및 전염증성 사이토카인의 발현을 촉진함으로써 항바이러스 반응을 매개할 수 있음을 알려준다.
실시예 4. YH-Lpro-37 항바이러스 활성:
in vivo
도전감염 실험
본 발명자는 YH-Lpro-37의 경구 투여가 인플루엔자 A 바이러스 감염에 대해 예방적 효과를 가지는지 규명하기 위하여, YH-Lpro-37 균주 live 배양액과 상층액 및 PBS(100 ㎕/per head) 각각을 C57BL/6NHsd 마우스에 21일 동안 매일 경구로 투여하였다. 그 후, {A/PR/8/34(H1N1)} 인플루엔자 A 바이러스를 1MLD50으로 감염시켰다. 1마리 당 YH-Lpro-37 (5x107 CFU/100 ㎖)의 최소 유효량은 이전의 실험적 경험에 근거하여 선택하였다(데이터 표시 안함). IFN-β를 투여한 마우스를 양성 대조군으로 하였다. 1,000 unit 유전자 재조합 IFN-β를 바이러스 감염 12시간 이전에 비강 내로 20 ㎕ 접종하였다. 질병률과 사망율은 감염 후 13일 동안 매일 확인하였다.
그 결과, 감염 후 약 4일째 되는 날까지, H1N1 바이러스의 1MLD50로 감염된 PBS 처리 그룹(control)에 있는 마우스 대부분은 노력성 호흡, 호흡곤란을 포함하는 호흡기계 질환의 심한 임상적 양상을 보였다. 또한, 마우스들은 활동성이 줄어들고, 웅크리며, 구부린 자세와 헝크러진 털 등 명확한 임상적 양상을 보였다. 게다가, 감염 후 8일째에 control이 죽음에 이른 점에서 YH-Lpro-37 처리와 무처리 그룹 사이에 현저한 차이가 있음을 알 수 있었다(도 5A). IFN-β와 YH-Lpro-37을 처리한 마우스에서는 감염 후 5일에서 7일 사이에 ≤20%의 체중감소를 보였으며, 감염 후 8일째 되는 날까지 감소된 체중이 이후 회복되는 경향을 보이기 시작하였고, 감염 후 13일째 되는 날까지 정상 체중으로 돌아오는 경향을 보였다(도 5A). 또한, YH-Lpro-37 live 배양액 또는 상층액만을 경구로 접종한 그룹은 대조군과 비교할 때 생존률이 높게 나타났는데, H1N1 인플루엔자 바이러스와 관련하여, YH-Lpro-37의 live 배양액을 처리한 그룹에서는 80%의 생존률, 상층액과 IFN-β를 처치한 그룹에서는 각각 60%의 생존률을 확인할 수 있었다(도 5A).
인플루엔자바이러스는 우선적으로 호흡기계를 경유하여 에어로졸에 의해 전파되고 폐에서 가장 효과적으로 증식되기 때문에, YH-Lpro-37의 폐 바이러스 증식 억제능을 확인하는 것은 중요하다. 폐에서 바이러스 증식을 억제하기 위해서, H1N1에 감염된 실험 그룹에서 감염된 마우스들의 폐 조직을 채취했다. H1N1 바이러스는 대조군 그룹의 폐에서 각각 감염 후 3일째, 5일째 되는 날에 바이러스 역가가 6.12와 5.45 log TCID50/lung으로 나와 효율적으로 증식하고 있음을 확인하였다. 그러나, YH-Lpro-37 live 배양액과 상층액을 처리한 그룹에서 바이러스 역가는 낮게 나타났으며(감염 후 3일째 되는 날과 5일째 되는 날 각각에서 5.41 및 3.29 log TCID50/lung, 5.83 및 4.58 log TCID50/lung), IFN-β를 처리한 그룹에서도 비슷하게 감염 후 3일째 되는 날과 5일째 되는 날 각각에서 5.41 및 3.54 log TCID50/lung으로 바이러스 역가가 나타났다(도 5B). 이러한 결과들은 YH-Lpro-37 live 배양액과 상층액을 경구로 투여하는 것은 폐에 있는 바이러스의 증식을 유의하게 억제하고, 치명적인 인플루엔자 H1N1 바이러스의 감염에 대항하여 마우스의 생존력을 증진시킬 수 있다는 것을 보여주었다.
다른 인플루엔자 아형에 대한 YH-Lpro-37의 in vivo 항바이러스 활성에 대해서도 실험을 수행하였다. C57BL/6NHsd 마우스에 {A/Aquaticbird/Korea/W81/2005(H5N2)}와 {A/Philippines/2/08(H3N2)를 각각 1MLD50으로 감염시켰다. 그 후 생존율과 체중감소를 13일 동안 기록하였다. 그 결과 예상했던 바와 같이, 무처리 대조군에서는 인플루엔자 감염으로부터 한 마리의 마우스도 살아남지 못하였고, 7일째 혹은 8일째에 모두 죽음에 이르렀다(도 5C-D). 반면, 체중감소에도 불구하고, IFN-β를 처리한 그룹들은 H5N2와 H3N2 바이러스 감염에 대하여 80%의 생존율을 보였다(도 5C-D). 특히, YH-Lpro-37 live 배양액을 처리한 마우스는 H5N2 및 H3N2의 치사량에 대항하여 각각 80%에서 100%에 이르는 보호 효과를 보여주었다. 비슷하게, YH-Lpro-37 상층액을 처리한 마우스들도 H5N2 및 H3N2 바이러스 감염에 대항하여 각각 60%에서 80% 생존율을 나타냈다(도 5C-D). 이러한 결과들은 YH-Lpro-37을 경구로 투여하는 것이 다양한 인플루엔자 아형 바이러스의 감염에 대하여 폭 넓은 방어기능을 향상시킨다는 것을 의미한다.
실시예 5. C57BL/6NHsd 마우스에서 YH-Lpro-37에 의한 사이토카인 발현 유도 분석
YH-Lpro-37 균주에 의한 사이토카인(IL-6, IFN-β, IFN-γ) 및 면역글로불린 A (immunoglobulin A, IgA) 수준을 C57BL/6NHsd 마우스의 혈청(serum), 기관지 폐포 세척액(BALF) 및 소장액(SIF)에서 분석하였다. 그 결과, YH-Lpro-37 live 배양액 또는 상층액을 처리한 마우스의 혈청, BALF 및 SIF 모두에서 높은 IFN-β, IL-6, IFN-γ 및 IgA 수준을 확인할 수 있었다(도 6). 최근의 연구에서 IFN-γ는 항바이러스 활성을 포함하는 1형 INFs로 표현되는 것과 동일한 세포 내 신호 경로 및 동일한 생물학적 활동을 활성화할 수 있다는 것이 보고되었다. 따라서, 상기의 결과를 통해 본 발명의 YH-Lpro-37 균주가 전염증성 사이토카인 및 면역글로불린의 발현을 유도하여 마우스에서 항바이러스 상태를 현저하게 자극할 수 있고, 바이러스의 증식을 억제하고 감염을 예방하는데 기여할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 효소 처리한 YH-Lpro-37 상층액의 항바이러스 활성 분석
효소 처리한 YH-Lpro-37 상층액의 항바이러스 활동을 RAW264.7 세포에서 확인하였다. 그 결과, VSV-GFP에 대하여 YH-Lpro-37 상층액을 처리한 대조군과 비교할 때 리파아제(lipase)를 처리한 YH-Lpro-37 상층액 처리군에서 바이러스 증식이 유의하게 향상된 것을 확인할 수 있었다(도 7). 이러한 결과들은 리파아제를 처리한 YH-Lpro-37 상층액은 바이러스(VSV-GFP) 증식을 억제하는 활성이 무력화된다는 것을 나타낸다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC)
<120> Lactic acid bacteria YH-Lpro-37 having immunity enhancement,
antiviral and antimicrobial activity and uses thereof
<130> PN21079
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<211> 1424
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> Limosilactobacillus sp. YH-Lpro-37
<400> 3
ctcccatggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct 60
gatccgcgat tactagcgat tccgacttcg tgtaggcgag ttgcagccta cagtccgaac 120
tgagaacggc tttaagagat tagcttactc tcgcgagctt gcgactcgtt gtaccgtcca 180
ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atctgacgtc gtccccacct 240
tcctccggtt tgtcaccggc agtctcacta gagtgcccaa cttaatgctg gcaactagta 300
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tcgtttacgg catggactac cagggtatct aatcctgttc gctacccatg ctttcgagcc 660
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ggcacgtagt tagccgtgac tttctggttg gataccgtca ctgcgtgaac agttactctc 960
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tgttgctcca tcaggcttgc gcccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga 1080
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catctgtttc caaatgttat cccccgctcc ggggcaggtt acctacgtgt tactcacccg 1320
tccgccactc actggtgatc catcgtcaat caggtgcaag caccatcaat cagttgggcc 1380
agtgcgtacg acttgcatgt attaggcaca ccgccggcgt tcat 1424
Claims (13)
- 면역증진 및 항바이러스 활성을 가지며, 항균성, 내산성 및 내담즙성이 있는, 기탁번호가 KCTC 14552BP인 리모시락토바실러스 속(Limosilactobacillus sp.) YH-Lpro-37 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus) 및 단순포진바이러스(Herpes simplex virus)인 것을 특징으로 하는 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 항균성은 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 대장균(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus)에 대한 항균성인 것을 특징으로 하는 리모시락토바실러스 속 YH-Lpro-37 균주.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물로서,
상기 바이러스는 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus) 및 단순포진바이러스(Herpes simplex virus) 중에서 선택된 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 약학 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제4항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 증진 및 항바이러스용 약학 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 건강기능식품 조성물로서,
상기 바이러스는 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus) 및 단순포진바이러스(Herpes simplex virus) 중에서 선택된 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 및 항바이러스용 사료첨가제로서,
상기 바이러스는 인플루엔자바이러스(Influenza virus), 수포성구내염바이러스(Vesicular stomatitis virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus) 및 단순포진바이러스(Herpes simplex virus) 중에서 선택된 하나 이상의 바이러스인 것을 특징으로 하는 사료첨가제. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을, 인간을 제외한 면역 증진이 필요한 동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역 증진 및 항바이러스 활성의 증진 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축액, 상기 배양물의 건조물 및 상기 배양물의 추출물 중에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 병원성 세균에 대한 항균용 조성물로서,
상기 병원성 세균은 애로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 대장균(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아세(Enterobacter cloacae), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 스타필로코쿠스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 살모넬라 티피(S. typhi), 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus) 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 병원성 세균에 대한 항균용 조성물. - 삭제
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱스 조성물.
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