WO2010064772A1 - 신규한 박테리오파아지 및 이를 포함하는 항균 조성물 - Google Patents

신규한 박테리오파아지 및 이를 포함하는 항균 조성물 Download PDF

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WO2010064772A1
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bacteriophage
salmonella
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φcj1
kbp
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PCT/KR2009/004582
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박민태
조영욱
최향
신수안
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    • C12N2795/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a novel isolated bacteriophage, and more specifically, Salmonella Gallinarum (SG), which causes poultry fever in poultry, and Salmonella Pullorum (SP), which causes polio . It is about a bacteriophage that can be killed.
  • the present invention also relates to a composition for the prevention or treatment of Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • poultry feed, drinking water, cleaning agents and disinfectants comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Salmonella is a Gram-negative, common anaerobic bacterium 1 (conditional anaerobic bacterium) with no enterobacteria, which is a bacilli that do not form follicles, and usually has motility due to pectoral flagella.
  • Gene base constituents of Salmonella are 50-52% GC content, similar to Escherichia coli and Shigella .
  • the genus Salmonella is a pathogenic microorganism that infects not only humans but also various livestock and causes various diseases.
  • Salmonella enterica (Salmonella enterica ) is classified according to the serological distinction of Gallinarum ( Gallinarum ), Florum ( Pullorum ), Typhimurium , Enteritidis , Typhi , It has many serovars , including Choleraesuis , derby , etc. (Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA.Escherichia, Shigella, Salmonella.In Murry PR, Baron EJ, et al.
  • FT Fowl typhoid
  • the disease is caused by Salmonella Gallinarum (SG), acute and chronic epidemic in birds and chickens, and is characterized by high mortality due to sepsis at all ages. Recently, the frequency of occurrence is high in Europe, South America, Africa, and Southeast Asia, and the damage is increasing. Since 1992, it has been spread nationwide mainly on brown laying hen farms (Kwon Yong-guk. Analysis of bird disease in 2000. National Veterinary Research and Quarantine Service in March 2001; Kim Ae-ran et al., 2003 Chubaek-ri, Korea) Poultry Typhoid Infection, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347-353).
  • Chubaekri occurs regardless of age and season, it is characterized by the highest sensitivity in the early spring season. In the past 1 century, the disease has been seriously caused and damaged in chicken chicks less than 1-2 weeks old due to egg transfer from mothers, both domestically and globally. Since then, it has been increasing again (Kwon, Yong-kuk, 2000). Analysis of avian disease search results. National Veterinary Research and Quarantine Information Service March 2001; Kim, Ae-ran, et al., 2003, Chubaekri-gaptypus Infection in Korea, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347-353).
  • Bacteriophage is a single or double-stranded DNA or RNA that consists of a nucleic acid as a genetic material, and the nucleic acid is a simple structure in which the protein envelope is wrapped, with the tail on the icosahedron head and the tail on the icosahedron head. It is divided into three basic structures, filament type. Bacteriophage are classified according to their morphological structure and genetic material.
  • Bacteriophages which have a double linear DNA as a genetic material and consist of icosahedral heads, have a contractile tail type Myoviridae, a long, non-contractable tail Siphoviridae, and a short tail, depending on the shape of the tail. Is classified as Podoviridae. On the other hand, icosahedral heads whose genetic material is RNA or DNA have no tail, and bacteriophages are classified according to the shape of the head, the composition of the head, and the presence or absence of an envelope.
  • filamentary bacteriophages with DNA as a genetic material are classified according to size, shape, envelope and filament composition (HWAckermann.Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146: 843-). 857; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press).
  • bacteriophages When infecting bacteria, bacteriophages are lytic or lysogenic after they adhere to the surface of bacteria and inject their genetic material into cells. If lytic, the bacteriophages break down or lyse the cells by making their own structures using cellular machinery and then releasing new bacteriophage particles. If lysogenic, its nucleic acid is incorporated into the chromosome of a bacterial host cell and replicates with the cell without destroying the bacterium, but under certain conditions it is converted to lytic (Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application.CRC press).
  • AGP antimicrobial growth promoter
  • the bacteriophage can selectively kill only Salmonella gallinarum (SG) and Salmonella florum (SP) without affecting the fungus, as well as confirming excellent acid resistance, heat resistance and dry resistance, Salmonella gallinarum And a variety of products capable of controlling Salmonella gallinarum (SG) and Salmonella florum (SP) together with compositions that can be used for the prevention and treatment of diseases caused by Salmonella florum, in particular poultice fever and Chubaekri, ie poultry Applicable to feed additives, drinking water, barn disinfectants and meat cleaners It was confirmed that the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious diseases comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a poultry feed and drinking water containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a disinfectant and cleaning agent including the bacteriophage as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing and treating Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious disease of poultice fever or Chubaekri using the composition comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • the novel isolated bacteriophage of the present invention has Salmonella gallinarum and Salmonella florum specific killing ability, and has the advantages of excellent acid resistance, heat resistance and dry resistance, and prevents Salmonella gallinarum and Salmonella florum infectious diseases such as gamma typhoid or Chubaekri. And for therapeutic use as well as for the control of Salmonella gallinarum and Salmonella florum.
  • Figure 1 is an electron micrograph of ⁇ CJ1: in a morphotype, sipoviriridae, consisting of an isometric capsid and a long non-contractile tail. Belong
  • Figure 2 shows the SDS-PAGE results of the isolated bacteriophage ⁇ CJ1: the protein pattern of the bacteriophage was observed as the main protein of 38 kDa and 49 kDa, and besides the 8 kDa, 17 kDa, 80 kDa, and 100 kDa proteins. This is observed. Invitrogen's See-blue plus 2 prestained-standard was used as a marker.
  • Figure 3 shows the PFGE results of isolated bacteriophage ⁇ CJ1:
  • the size of the entire genome of ⁇ CJ1 is about 61 kbp. Bio-rad's 5 kbp DNA size standard was used as the size marker.
  • Figure 4 shows the PCR results using each primer set of genomic DNA of ⁇ CJ1.
  • A, B, C and D lanes in turn have PCR outputs of about 660 bp, 1.3 kbp, 670 bp, and 1.8 kbp.
  • Figure 5 shows the results of one-step growth of bacteriophage ⁇ CJ1.
  • Salmonella Gallinarum and Salmonella Pullorum both have a release size of about 10 2 or more.
  • Figure 6 shows the results of the efficiency test (clearing assay) of bacteriophage ⁇ CJ1.
  • MOI multiply of infection
  • Figure 8 shows the results of the heat resistance test of bacteriophage ⁇ CJ1: The number of surviving bacteriophage is shown when placed at 0, 10, 30, 60, and 120 minutes at 37, 45, 53, 60, 70, and 80 ° C. After exposure to 70 hours at 70 ° C., almost no activity is lost. Above 80 ° C., the activity decreases after 10 minutes of exposure but maintains a constant rate of activity.
  • Figure 9 shows the results of the drying resistance test of bacteriophage ⁇ CJ1: It was dried at 60 ° C. for 120 minutes using a speed vacuum dryer (SVD). After drying, the relative stability with the original titer was found to decrease the activity by about 10 2 .
  • the present invention relates to novel isolated bacteriophages having Salmonella gallinarum and Salmonella florum specific killing ability.
  • the bacteriophage of the present invention belongs to a morphotype sipoviriridae with a morphologically icosahedral head and a long non-contractile tail, and has a total genome size. It is 61 kbp, characterized in that it has a major structural protein of 38 kDa and 49 kDa size proteins.
  • the bacteriophage of the present invention selectively infect Salmonella gallinarum and Salmonella florum among Salmonella, and have species specificity that does not infect other species.
  • the bacteriophage of the present invention has a total genome size of 61 kbp, and may include a nucleic acid molecule described in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 5 as part of the entire genome.
  • nucleic acid molecule is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides, which are the basic building blocks of nucleic acid molecules, are modified from sugar or base sites, as well as natural nucleotides. It is a concept that includes analogues.
  • the bacteriophage of the present invention has acid and heat resistant biochemical characteristics, and has acid resistance that stably survives in a wide pH range of pH 2.5 to pH 9.0, and has a temperature in the range of 37 ° C. to 70 ° C., that is, a high temperature. It has heat resistance to survive stably. Moreover, it has drying resistance which stably survives even after high temperature drying (120 minutes at 60 degreeC).
  • acid resistance, heat resistance and drying resistance of the bacteriophage of the present invention applied to a variety of products including a composition for the prevention and treatment of SG, SP-derived diseases of poultry, and a variety of products comprising the bacteriophage as an active ingredient Makes this possible.
  • the present inventors collected a sample from sewage near the slaughterhouse, identified the bacteriophage of the present invention having the same characteristics as above with SG and SP specific killing ability, and named it ⁇ CJ1, and on October 24, 2008 in Korea. It was deposited with the Accession No. KCCM10969P to the microorganism preservation center.
  • the sample was collected from sewage near the slaughterhouse to isolate the bacteriophage lysing the SP from the sample to the host cell, and confirmed that they can specifically lyse the SG and SP.
  • these bacteriophages ( ⁇ CJ1) were observed morphologically through an electron microscope, and it was confirmed that they belonged to a morphotype sipoviride (Siphoviridae) (FIG. 1).
  • ⁇ CJ1 was examined for stability at various pH ranges and temperatures, and not only survived stably in a wide range of pH2.5 to 9.0 and 37 ° C to 70 ° C, but also at high temperature drying (120 minutes at 60 ° C). It has been shown to maintain stability. This means that the bacteriophage ⁇ CJ1 of the present invention can be easily applied to various products capable of controlling SG and SP.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious disease, including poultice or Chubaekri containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • the bacteriophage of the present invention has antibacterial activity that can specifically kill Salmonella gallinarum and Salmonella florum, and thus can be used for the purpose of preventing or treating diseases caused by these bacteria.
  • One particularly preferred embodiment may include antibiotics.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of the disease by administration of the composition
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms of the disease by administration of the composition. It is.
  • Salmonella gallinarum infectious diseases to which the composition of the present invention can be applied are preferably, but are not limited thereto, examples of poultice fever and Salmonella florum infectious diseases.
  • composition of the present invention comprises 5 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 12 pfu / ml of ⁇ CJ1, preferably 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 10 pfu / ml of ⁇ CJ1.
  • composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, and may be formulated with the carrier to provide food, pharmaceutical and feed additives.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not irritate an organism and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • Acceptable pharmaceutical carriers in compositions formulated as liquid solutions are sterile and physiologically compatible, including saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injectable solutions, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and One or more of these components may be mixed and used, and other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostatic agents may be added as necessary.
  • Diluents, dispersants, surfactants, binders and lubricants may also be added in addition to formulate into injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Oral dosage forms comprising the composition of the present invention as an active ingredient include, for example, tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, preparation powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, syrups or elixirs. can do.
  • lactose For formulation into tablets and capsules, lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, binders such as cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, stearic acid masne It may include a lubricating oil such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax, and in the case of a capsule, it may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • a lubricating oil such as calcium, calcium stearate, sodium stearyl fumarate or polyethylene glycol wax
  • a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • Formulations for parenteral administration comprising the composition of the present invention as an active ingredient, for injection, such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, a suppository injection method or aerosol for spraying by inhalation through the respiratory system It can be formulated as.
  • injection such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection, a suppository injection method or aerosol for spraying by inhalation through the respiratory system It can be formulated as.
  • the compositions of the present invention may be mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions, which may be formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed dispersion or wet powder.
  • antibiotic refers to an agent that is provided to an animal in the form of a drug to kill bacteria, and generically refers to preservatives, fungicides and antibacterial agents. Since the bacteriophage of the present invention has a very high specificity for Salmonella gallinarum and Salmonella florum compared to conventional antibiotics, the fungi are not killed, they can kill only certain pathogens, and do not induce drug resistance, In comparison, life cycling can be provided as a new novel antibiotic.
  • the present invention relates to poultry feed and drinking water comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Animal feed of the present invention may be prepared by separately producing a bacteriophage in the form of a feed additive, mixed with the feed, or directly added during the preparation of the feed.
  • Bacteriophage in the feed of the present invention can be either liquid or dry. Drying methods may be, but not limited to, ventilation drying, natural drying, spray drying and freeze drying.
  • Bacteriophage of the present invention may be mixed in the form of a powder of 0.05 to 10% by weight, preferably 0.1 to 2% by weight of the feed in powder form.
  • the feed containing ⁇ CJ1 includes plants, cereals, fruits, food processing by-products, algae, fiber oils, pharmaceutical by-products, oils, starches, gourds, grain by-products, and the like. Proteins, inorganics, fats and oils, minerals, fats and oils, unicellular protein, zooplankton, food leftovers, and the like are not limited thereto.
  • Feed additives containing ⁇ CJ1 in the present invention include binders, emulsifiers, preservatives, etc., added to prevent quality deterioration, and amino acids, vitamins, enzymes, probiotics, flavors, silks, etc.
  • White nitrogen compounds, silicates, buffers, colorants, extractants, oligosaccharides, and the like, in addition to the feed may include a mixture, but is not limited thereto.
  • the present invention is to provide a disinfectant and cleaning agent comprising the bacteriophage as an active ingredient.
  • Disinfectants containing the bacteriophage as an active ingredient can also be used for spraying for removal of Salmonella gallinarum and Salmonella florum, which can be used in active areas of poultry, poultry slaughterhouses, poultry mortality areas, poultry cooking sites and cooking facilities. It is not limited.
  • the cleaning agent containing the bacteriophage as an active ingredient may be used to remove Salmonella gallinarum and Salmonella florum, which may be buried or infected on the skin surface, feathers and body parts of live poultry.
  • the present invention provides a method for preventing or treating Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious disease of poulticepus or Chubaekri in poultry using the composition for the prevention or treatment of Salmonella gallinarum or Salmonella florum infectious disease. It is about.
  • composition of the present invention may be administered to an animal in the form of a pharmaceutical formulation, or may be administered through a method of feeding the animal's feed or mixed with negative drinking water, preferably mixed with the feed in the form of a feed additive to be administered. Can be.
  • the route of administration of the composition of the present invention may be administered via various routes orally or parenterally as long as it can reach the target tissue, and specifically, oral, rectal, topical, intravenous, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, It may be administered in a conventional manner via transdermal, nasal, inhalation, and the like.
  • the treatment method of the present invention includes administering a composition of the present invention in a pharmaceutically effective amount. It will be apparent to those skilled in the art that a suitable total daily dose may be determined by the practitioner within the correct medical judgment.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient, along with the type and severity of the response to be achieved, the patient's age, body weight, general health, sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, and specific composition It is desirable to apply differently depending on various factors including drugs used or co-used and similar factors well known in the medical field.
  • the samples were transferred to a 50 ml centrifuge tube at a slaughterhouse and nearby sewage treatment plant, and centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter.
  • 150 ⁇ l of SP shake culture (OD 600 2) and 2 ml of 10 X Luria-Bertani medium (hereinafter referred to as LB medium, tryptone 10 g; yeast extract 5 g; NaCl 10 g; final volume 1 L) 18 ml of the filtrate was mixed. After incubating for 18 hours at 37 ° C., the culture was centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes and the supernatant was filtered using a 0.2 ⁇ m filter.
  • Selected bacteriophage were subjected to mass culture using SP.
  • the SP was shaken and cultured to 1.5 X 10 10 cfu (colony forming unit), centrifuged at 4000 rpm for 10 minutes and resuspended in 4 ml SM solution.
  • DNase I and RNase A were added at a final concentration of 1 ⁇ g / ml and left at 37 ° C. for 30 minutes.
  • NaCl and PEG polyethylene glycol
  • the supernatant was removed after centrifugation for 20 minutes at 4 °C, 12000 rpm.
  • the precipitate was resuspended in 5 ml SM solution and left at room temperature for 20 minutes. 4 ml chloroform was added thereto, mixed well, and centrifuged at 4 ° C. and 4000 rpm for 20 minutes.
  • the supernatant was filtered through a 0.2 ⁇ m filter to purify ⁇ CJ1 through ultracentrifugation (35,000 rpm, 1 hour, 4 ° C.) using a glycerol density gradient method (density: 40%, 5% glycerol). Purified ⁇ CJ1 was resuspended in 300 ⁇ l SM solution and titer was measured.
  • ⁇ CJ1 is ST (Salmonella enterica Serotype Typhimurium), SE (Salmonella enterica Serotype Enteritis), SC (Salmonella enterica Serotype Choleraesuis), SD (Salmonella enterica Serotype Derby), SA (Salmonella enterica subsp. Arizonae), SB (Salmonella enterica subsp Bongori ) was specifically infected with SG and SP without infection (see Example 13). The results are shown in Table 1 below. ⁇ CJ1 produced using SG as a host showed the same lytic plaque shape, degree of transparency of lysate formed, protein pattern and genome size as produced in SP.
  • ⁇ CJ1 Purified ⁇ CJ1 was diluted in 0.01% gelatin solution and fixed with 2.5% glutaraldehyde solution. It was dropped on a carbon-coated mica plate (ca. 2.5 X 2.5 mm) and acclimated for 10 minutes, and then washed with sterile distilled water. The carbon film was placed on a copper grid and dyed in 4% uranyl acetate for 30-60 seconds, and dried, followed by a transmission electron microscope (JEM-1011 transmission electron microscope, 80 kV, magnification X 120,000). X 200,000). As a result, the shape of the separated ⁇ CJ1 is shown in Fig. 1, which is a morphotype sipoviride consisting of an isometric capsid and a long non-contractile tail. (siphoviridae).
  • Genomic DNA of ⁇ CJ1 purified through ultracentrifugation was extracted.
  • the purified ⁇ CJ1 culture medium contained ethylenediaminetetraacetic acid (EDH), proteinase K, and SDS (sodium dodecyl sulfate) at final concentrations of 20 mM, 50 ⁇ g / ml, and 0.5%, respectively.
  • EDH ethylenediaminetetraacetic acid
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the extracted DNA was diluted 10-fold and absorbance was measured at OD 260 to determine the concentration.
  • PFGE pulse-field gel electrophoresis
  • BIORAD PFGE system No. 7 size range 25-100 kbp; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape; forward voltage It was developed for 20 hours at room temperature using 180 V; reverse voltage 120 V.
  • the genomic DNA of ⁇ CJ1 was about 61 kbp, as shown in FIG. 3.
  • ⁇ CJ1 5 ⁇ g of genomic DNA of ⁇ CJ1 was simultaneously treated with EcoR V and Sca I restriction enzymes.
  • pBluescript SK + Promega
  • CIP calf intestinal alkaline phosphatase
  • Two transformants were transformed using conventional blue-white colony selection on LB plates containing ampicillin and X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside). Colonies were selected. Selected colonies were shaken for 16 hours in a culture medium containing empicillin. Here plasmid was extracted using a plasmid purification kit (Promega).
  • the plasmids were cloned by PCR using the M13 forward and M13 reverse primer sets, and the fragment size was 1 kbp or more, and the base sequences were analyzed using the M13 forward and M13 reverse primer sets.
  • the gene base sequences thus obtained are shown in SEQ ID NOs: 1-5.
  • the results of analyzing the similarity of detoxification sequences using the NCBI blastx program are shown in Table 2.
  • ⁇ CJ1 shows 36% similarity to the Dcm of bacteriophage TLS, E. coli bacteriophage, and 31% similarity to DR0530-like primase of Burkholderia cepacia phage BcepNazgul. Showed.
  • the detoxification sequence of SEQ ID NO: 1 showed 34% similarity to the tail spike protein of salmonella phage Det7 in the reverse direction.
  • the detoxification sequence was not highly homologous to a known bacteriophage protein, and sequence numbers 1 to 5 were analyzed by DNA sequence using the NCBI blastn program. Thus, ⁇ CJ1 was determined to be a newly isolated bacteriophage.
  • a ⁇ CJ1 specific primer was prepared. Based on SEQ ID NO: 1 primer set of SEQ ID NO: 6 and 7, SEQ ID NO: 10 and 11, primer set of SEQ ID NO: 8 and 9, SEQ ID NO: 12 and 13 based on SEQ ID NO: 2. In addition, PCR was performed by preparing primer sets of SEQ ID NOs: 14 and 15, SEQ ID NOs: 16 and 17, and SEQ ID NOs: 18 and 19 based on SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively. Primers were added to the pre-mix (Bioneer) so that 0.1 ⁇ g of bacteriophage whole genomic DNA and 0.5 pmol were adjusted to a final volume of 20 ⁇ l.
  • the treated experimental culture was diluted in steps, and 10 ⁇ l of the diluted solution of each step was dropped by soft agar overlay method, followed by incubation at 37 ° C. for 18 hours to determine titer. Since ⁇ CJ1 is a bacteriophage that is simultaneously infected with SG and SP, the same experiment was conducted for SP. When SG and SP were used as host cells, one-step growth showed that the burst size was more than 10 ⁇ 2. Detailed results are shown in FIG. 5.
  • Stability studies were conducted at various pH ranges (pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.2, 9.0) to determine the stability of ⁇ CJ1 at low pH in chicken stomachs.
  • Various pH solutions sodium acetate solution (sodium acetate buffer (pH 2.1, pH 4.0, pH 5.5, pH 6.4)), sodium citrate buffer (sodium citrate buffer (pH 2.5, pH 3.0, pH 3.5)), sodium phosphate solution ( Sodium phosphate buffer (pH 6.9, pH 7.4)) and Tris solution (Tris-HCl (pH 8.2, pH 9.0)) were each prepared at 2 M.
  • the treated experimental culture solution was diluted in steps, and 10 ⁇ l of the diluted solution in each step was dropped by soft agar overlay method, followed by incubation at 37 ° C. for 18 hours to determine titer. After drying, the relative stability with the original titer was found to decrease the activity by about 10 2 . The results are shown in FIG. 9.
  • ⁇ CJ1 has lytic activity against SG and SP of wild isolates of our country isolated from SG (SG RKS4994) and SP (SP RKS2242) used in the experiments, and SG and SP, respectively, I checked it.
  • Toxicity was evaluated by assessing the safety, retention, and egg-flood of ⁇ CJ1 in laying hens as a bacteriophage for the prevention of poultice.
  • the laying hens were divided into three groups: pathogenicity test, egg-shell test, and presence of lesions and phage concentration in cecum.
  • Nangye for testing was 10 to 5 ml dose ⁇ CJ1 mixture 3 days, 6 days, and then the surface of the eggs 10 and out jipran in 2 days a mixture of egg yolk and egg white to blue and the washing with 70% ethanol in PBS 45ml -1, Dilute to 10 ⁇ 2 , 10 ⁇ 3 .
  • SNUSG0197 10 6 cfu was added to 25 ml of each diluting solution, followed by incubation at 37 ° C. for 3 hours, followed by cell separation by centrifugation.
  • the concentration of ⁇ CJ1 collected and administered to the caecum was measured for each individual, which was suspended in 9 ml of PBS and centrifuged at 15000 g for 30 minutes, and then 1 ml of the supernatant with PBS 10 -1 to 10 After diluting to -4 , 500 ⁇ l of diluent and 100 ⁇ l of SG0197 (10 9 cfu / ml) were mixed and plated by a top-agar overlay method on 10 ⁇ tryptic soy agar medium. After culturing at 37 ° C. for 18 hours, the number of plaques formed was counted and the number of bacteriophages per gram of the cecum was calculated in consideration of the dilution factor.
  • the internal organ distribution of the bacteriophage was divided into two groups of five 11-day-old SPF chicks divided into two groups, each containing 10 8 pfu of ⁇ CJ1 feed grams in the dosing group and ⁇ CJ1-free feed in the control group for 3 days. After sacrifice, the liver, kidney and cecum were collected to check for the presence of ⁇ CJ1. 1 ml of liver was collected after emulsification by adding the same amount of PBS as the collected liver, kidney, and cecal stools, and centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes in 1.5 ml tube.
  • Table 4 ⁇ Average scattering rate when ⁇ CJ1 was administered> ⁇ CJ1 control 1 day Feed starts 2 days 3 days 7 5 6 days 8 7 7 days 3 3 8th 6 4 9th 2 One 10 days 3 3 13th 11 8 14 days 15th 10 7 16th 17 days 6 6 20 days 11 7 21st 22 days 9 4 23rd 24 days 6 3 Spawn rate 42.2% 50.8%
  • the bacteriophage of the present invention have no specific killing ability of Salmonella gallinarum and Salmonella florum, and do not kill the fungi, and are excellent in acid resistance, heat resistance, and dry resistance, and therefore, Salmonella gallinarum and Salmonella florum infectious diseases, particularly poultry fever and Chubaeklyi It can be widely used for prophylactic and therapeutic purposes, antibiotics, animal feed.

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Abstract

본 발명은 신규 분리된 박테리오파아지(bacteriophage)에 관한 것으로, 더욱상세하게는 가금에서 가금티푸스를 일으키는 살모넬라 갈리나룸과 추백리를 일으키는 살모넬라 플로럼을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파아지에 관한 것이다. 또한 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물 관한 것이다. 뿐만 아니라 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 가금용 사료, 음용수, 세척제 및 소독제에 관한 것이다.

Description

[규칙 제26조에 의한 보정 23.10.2009]　신규한 박테리오파아지 및 이를 포함하는 항균 조성물
본 발명은 신규 분리된 박테리오파아지(bacteriophage)에 관한 것으로, 더욱상세하게는 가금에서 가금티푸스를 일으키는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum, SG)과 추백리를 일으키는 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum, SP)을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 박테리오파아지에 관한 것이다. 또한 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 뿐만 아니라 및 상기 박테리오파아지를 유효 성분으로 포함하는 가금용 사료, 음용수, 세척제 및 소독제에 관한 것이다.
살모넬라균은 장내균과의 그람 음성의 보통 혐기성 세균 1속(조건 무산소균임)으로 아포를 형성하지 않는 간균이며, 보통 주모성 편모에 의한 운동성을 갖는다. 살모넬라균의 유전자 염기 구성 성분을 보면 GC 포함 정도가 50-52%로 대장균(Escherichia coli)과 쉬겔라(Shigella)와 유사하다. 살모넬라균 속은 사람에게뿐만 아니라 여러 가축에 감염하여 다양한 질병을 일으키는 병원성 미생물이다. 살모넬라종인 살모넬라 엔테리카(Salmoneall enterica)는 혈청학적 구별에 의한 구분을 통해 갈리나룸(Gallinarum), 플로럼(Pullorum), 타이피뮤리움(Typhimurium), 엔테리티디스(Enteritidis), 타이피(Typhi), 콜레라수이스(Choleraesuis), 더비(derby) 등을 포함한 많은 혈청종(serovar)를 가진다(Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al eds Manual of clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999;467-74 ; Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.). 이들 중 가금에 특이한 갈리나룸과 플로럼, 사람에게 특이한 타이피, 돼지 특이의 살모넬라 콜레라수이스와 더비, 그리고 질병을 일으키는 대상 동물이 다양한 인수공통 혈청종인 살모넬라 엔테리티디스과 살모넬라 타이피뮤리움 등이 질병을 일으켜 농가와 소비자에게 막대한 피해를 주기도 한다.
가금에서 살모넬라균이 일으키는 질병의 예로써 가금티푸스(Fowl typhoid, FT)가 있다. 이 질병은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum 이하 SG로 명명함)이 원인체로 닭 및 칠면조 등의 조류에서 발생하는 급?만성의 전염병으로 모든 일령에 나타나는 패혈증에 의한 높은 폐사율이 특징이다. 최근에 유럽, 남미, 아프리카 및 동남아시아 등지에서는 발생빈도가 높은 것으로 보고 되어 그 피해가 증가되고 있다. 국내에서는 1992년 이래로 주로 갈색 산란계 농장에 전국적으로 확산되어 왔다(권용국. 2000년도 조류질병 검색결과 분석. 국립수의과학검역원 정보지. 2001년 3월 ; 김애란 외, 2003년 국내 원종계 및 종계의 추백리-가금티푸스 감염실태, Korean J Vet Res(2006) 46(4) : 347~353).
추백리(Pullorum Disease) 또한 살모넬라균이 원인이 되는 질병으로써 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum 이하 SP로 명명함)에 의하여 발병된다. 추백리는 일령, 계절에 관계없이 발병하지만, 초생추 시기에 가장 감수성이 높은 것이 특징이다. 지난 1 세기 동안 국내는 물론 전세계적으로 모계로부터 난계대 전염에 의한 1-2 주령 미만의 일령 병아리에서 발생 및 피해가 심각하였던 질병으로 지난 `80년대 이후에 그 발생이 매우 감소하였으나 근년 90년대 중반 이후 다시 증가하는 추세에 있다(권용국. 2000년도 조류질병 검색결과 분석. 국립수의과학검역원 정보지. 2001년 3월 ; 김애란 외, 2003년 국내 원종계 및 종계의 추백리-가금티푸스 감염실태, Korean J Vet Res(2006) 46(4) : 347~353).
우리 나라에서는 ‘90년대 이후 가금티푸스와 추백리의 발병이 증가하고 있는 추세로 농가에 큰 경제적 손실을 주고 있다. 이 때문에 2004년부터 약독화된 SG 생균 백신을 육계(broiler)에 사용해 가금티푸스에 대하여 예방하려 하였지만(김애란 외, 2003년 국내 원종계 및 종계의 추백리-가금티푸스 감염실태, Korean J Vet Res(2006) 46(4): 347~353), 백신의 효과에 대한 사용자의 의구심이 제기되고 있으며, 산란계 (Layer)에서는 난계대 전염 우려로 생균 백신의 사용이 불허되고 있다. 가금티푸스와는 달리 추백리의 경우에는 현재 상업화된 예방책은 없다. 따라서 가금티푸스와 추백리를 예방할 수 있는 방법 모색이 시급한 상황이다.
한편, 박테리오파아지는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능하다. 박테리오파아지는 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA가 유전물질로써 핵산을 구성하고 있으며, 이 핵산을 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조로 20면체의 머리에 꼬리가 있는 형태, 20면체 머리에 꼬리가 없는 형태, 그리고 필라멘트형의 3가지 기본형 구조로 나뉜다. 박테리오파아지는 형태학적인 구조, 유전물질에 따라서 분류된다. 이중 선형의 DNA를 유전물질로 가지고 있고 20면체 머리로 구성된 박테리오파아지는 꼬리의 모양에 따라 수축성 꼬리 형태의 마이오비리데(Myoviridae), 길고 수축성이 없는 꼬리의 시포비리데(Siphoviridae), 그리고 짧은 꼬리의 포도비리데(Podoviridae)로 분류된다. 반면 유전물질이 RNA 또는 DNA을 가진 20면체 머리에 꼬리가 없는 박테리오파아지는 머리의 형태, 머리의 구성 성분 및 외피 유무에 따라 분류된다. 마지막으로 DNA를 유전물질로 가진 필라멘트 형태의 박테리오파아지는 크기, 모양, 외피 및 필라멘트 구성 성분에 따라 분류된다(H.W.Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146:843-857 ; Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application; CRC press).
세균을 감염시킬 때 박테리오파아지는 세균의 표면에 달라붙어 자신의 유전물질을 세포 내로 주입한 후 용균성(lytic) 또는 용원성(lysogenic)을 띠게 된다. 용균성인 경우 박테리오파아지가 세포 기구들을 이용하여 자신의 구조물들을 만든 후 새로운 박테리오파아지 입자들을 방출시킴으로써 세포를 파괴하거나 용해한다. 용원성인 경우 자신의 핵산을 세균 숙주세포의 염색체에 편입시켜 세균을 파괴하지 않고 세포와 함께 복제되지만 일정 조건이 되면 용균성으로 전환된다 (Elizabeth Kutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC press).
박테리오파아지의 발견 이후 이를 감염질병 치료제로 이용하기 위한 연구가 진행되었지만 광범위한 숙주범위(broad target spectrum)를 갖는 항생제의 특성에 비해 숙주특이성(specific target spectrum)을 갖는 박테리오파아지가 경쟁에서 밀려나 관심을 받지 못했다. 하지만 항생제의 오?남용으로 항생제 내성균의 문제가 심각해 지고, 식품내의 항생제 잔류에 의한 인체에 미칠 영향에 대한 우려가 더해지고 있다(Cislo, M et al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol.Ther.Exp. 1987.2:175-183 ; 김성훈 외. 박테리오파아지, 새로운 대체항생제. biological research information center. BRIC). 특히 동물의 성장촉진을 위해 사료에 첨가하는 항생제(antimicrobial growth promoter, AGP)가 항생제 내성유발의 주요원인임이 밝혀짐에 따라 AGP의 사용을 금지하는 정책들이 입안되어 유럽연합은 2006년부터 모든 AGP의 사용이 금지되었고 한국은 2009년 현재 일부 AGP의 사용금지가 시행되고 있으며 향후 2013~2015년에 전면금지가 예상되고 있다.
이러한 흐름을 바탕으로 박테리오파아지의 연구가 다시 관심을 모으고 있다. 박테리오파아지를 이용하여 E.coli O157:H 균을 통제하기 위한 박테리오파아지 7개가 2002년도에 미국 특허등록(미국 등록특허 제6,485,902호 - Use of bacteriophages for control of Escherichia coli O157)되었으며, Nymox 사에서는 다양한 종의 미생물을 통제하는 박테리오파아지 2종에 대하여 2005년도에 미국 특허등록(미국 등록특허 제6,942,858호)를 받았다. 박테리오파아지에 관한 연구가 활발히 진행됨에 따라 산업계에서 또한 박테리오파아지를 이용한 다양한 상품을 개발하고 있다. 유럽의 EBI food system 사는 박테리오파아지를 이용하여 리스테리아균에 의한 식중독을 방지하는 식품첨가제 제품인 Listerix-P100을 개발하여 최초로 미국 FDA의 승인을 받았고 동일한 개념의 리스테리아균 통제 식품첨가형 박테리오파아지 제품 LMP-102를 개발하여 GRAS(Generally regarded as safe)의 인증을 받았다. 또한 2007년에는 OmniLytics 사에서 도축과정 중에 E.coli O157이 소고기 제품으로 오염되는 것을 막기 위한 세척액으로 박테리오파아지를 이용한 제품이 개발되어 USDA's Food Safety and Inspection Service(FSIS)로부터 승인되었다. Clostridium sporogenes phage NCIMB 30008과 Clostridium tyrobutiricum phage NCIMB 30008는 각각 2003년과 2005년에 유럽에서 사료보존제로써 등록되어 사료 내 오염된 클로스트리디움균의 통제를 목적하는 제품으로 개발되었다. 이러한 연구는 박테리오파아지는 항생제 치료가 어려운 세균의 통제나 축산물 등에 오염된 인수공통 전염균 등을 식품단계에서 통제할 수 있는 연구가 지속적으로 이루어지고 있음을 보여준다.
본 발명자들은 과거 항생제와 같이 광범위한 숙주범위의 문제점을 해결하기 위해, 가축의 주요질병을 일으키는 살모넬라 병원균에 감염하는 박테리오파아지를 자연계에서 신규 분리하고, 이들의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인한 결과, 상기 박테리오파아지가 이들이 익균에는 영향을 주지 않고 살모넬라 갈리나룸(SG) 및 살모넬라 플로럼(SP)만을 선택적으로 사멸시킬 수 있을 뿐만 아니라, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어남을 확인함으로써, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼에 의해 유발되는 질환, 특히 가금티푸스 및 추백리의 예방 및 치료 목적으로 이용할 수 있는 조성물과 함께 살모넬라 갈리나룸(SG) 및 살모넬라 플로럼(SP)을 통제할 수 있는 다양한 제품, 즉 가금 사료 첨가제, 음용수, 축사 소독제 및 육가공 세척제에도 적용이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼에 대하여 특이적 사멸능을 갖는 신규한 박테리오파아지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 가금용 사료 및 음용수를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 소독제 및 세척제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 가금에서 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 가금티푸스 또는 추백리를 예방 및 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 신규 분리된 박테리오파아지는 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 특이적 사멸능을 가지며, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어난 장점을 가져, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 가금티푸스 또는 추백리의 예방 및 치료 용도로 이용이 가능할 뿐만 아니라 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼의 통제 용도로 이용이 가능하다.
도 1은 ΦCJ1 의 전자 현미경 사진이다 : 형태학상 정이십면체의 머리(an isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리(a long non-contractile tail)로 구성된 형태형(morphotype), 시포비리데(siphoviridae)에 속한다
도 2는 분리된 박테리오파아지 ΦCJ1의 SDS-PAGE 결과이다 : 박테리오파아지의 단백질 패턴을 나타낸 것으로 38 kDa 와 49 kDa 의 주 단백질로 관찰되고 그외에도 8 kDa, 17 kDa, 80 kDa, 그리고 100 kDa 의 단백질이 관찰된다. 인비트로젠(Invitrogen) 사의 See-blue plus 2 prestained-standard를 마커로 사용하였다.
도 3은 분리된 박테리오파아지 ΦCJ1의 PFGE 결과이다 : ΦCJ1의 전체 게놈의 크기는 약 61 kbp 정도이다. 바이오라드(Bio-rad)사의 5 kbp DNA size standard를 크기 마커(size marker)로 사용하였다
도 4는 ΦCJ1의 게놈 DNA의 각 프라이머 세트를 이용한 PCR 결과를 나타낸 것이다.
A; 서열번호 6와 7번 프라이머 세트로 PCR 증폭, B; 서열번호 10과 11번 프라이머 세트로 PCR 증폭, C; 서열번호 8와 9번 프라이머 세트로 PCR 증폭, D; 서열번호12과 13번 프라이머 세트로 PCR 증폭. A, B, C 그리고 D lane 차례로 약 660 bp, 1.3 kbp, 670 bp, 그리고 1.8 kbp 정도의 PCR 산출물을 가진다.
도 5. 박테리오파아지 ΦCJ1의 one-step growth 실험 결과이다.
A; Salmonella Gallinarum, B; Salmonella Pullorum. Salmonella Gallinarum과 Salmonella Pullorum에서 모두 약 102 이상의 방출크기를 가진다.
도 6. 박테리오파아지 ΦCJ1의 efficiency test (clearing assay) 결과이다.
A; Salmonella Gallinarum, B; Salmonella Pullorum. 다른 범례; MOI (multiply of infection : 숙주세포 한 마리당 박테리오파아지가 감염되는 수). 모두 숙주세포에 대한 박테리오파아지 ΦCJ1의 감염비율이 높을수록 효율적으로 숙주세포를 용균시킨다.
도 7. 박테리오파아지 ΦCJ1의 내산성 실험 결과이다 : pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.0, 9.0에서의 생존 박테리오파아지 수를 나타낸다. Control과 비교하여 pH 2.5 까지는 박테리오파아지 ΦCJ1의 활성을 잃지 않으나 pH 2.1에서는 활성을 완전히 잃는다.
도 8. 박테리오파아지 ΦCJ1의 내열성 실험 결과이다 : 37, 45, 53, 60, 70, 80℃에서 0, 10, 30, 60, 120 분마다 시간별로 장치해 두었을 때 생존 박테리오파아지 수를 나타낸다. 70℃에서 2 시간까지 노출이 되어도 활성을 거의 잃지 않는다. 80℃ 이상에서는 10 분 노출 후 활성이 감소하지만 일정 비율 활성을 유지한다.
도 9. 박테리오파아지 ΦCJ1의 내건성 실험결과이다 : 스피드 베큠 드라이어(speed vacuum dryer, SVD)를 이용하여 60℃에서 120 분 동안 건조 처리한 것이다. 건조 후 원래 타이터와 상대적인 안정성을 비교하였을 때 활성이 약 102 정도 감소하는 것을 알 수 있었다
하나의 양태로서, 본 발명은 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 특이적 사멸능을 갖는 신규 분리된 박테리오파아지에 관한 것이다.
본 발명의 박테리오파아지는 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid) 및 수축성이 없는 꼬리(long non-contractile tail)를 갖는 형태형(morphotype) 시포비리데(siphoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 61 kbp이며, 38 kDa 및 49 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명의 박테리오파아지는 살모넬라균들 중 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼을 선택적으로 감염시키며, 다른 종들에는 감염하지 않는 종 특이성을 갖는다.
또한, 본 발명의 박테리오파아지는 전게 게놈 크기가 61 kbp이며, 서열번호 1 에서 서열번호 5로 기재되는 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)를 포함하는 개념이다.
또한, 본 발명의 박테리오파아지는 내산성 및 내열성의 생화학적 특징을 가지는데, pH 2.5 내지 pH 9.0 의 넓은 pH 범위에서 안정하게 생존하는 내산성을 가지며, 37℃ 내지 70℃ 범위의 온도, 즉, 높은 온도에서도 안정하게 생존할 수 있는 내열성을 가진다. 또한 고온 건조(60℃에서 120분)한 후에도 안정하게 생존하는 내건성을 가진다. 이러한 내산성, 내열성 및 내건성은 본 발명의 박테리오파아지를 가금의 SG, SP 유래 질병의 예방 및 치료용 조성물, 그리고 박테리오파아지를 유효 성분으로 포함하는 다양한 제품에 적용함에 있어, 다양한 온도 및 pH 범위의 적용이 가능하게 한다.
본 발명자는 도계장 근처의 하수로부터 시료를 채취하여, SG 및 SP 특이적 사멸능을 갖고 상기와 같은 특징을 같은 본 발명의 박테리오파아지를 동정하고, 이를 ΦCJ1로 명명하고, 2008년 10월 24일 한국미생물보존센터에 기탁번호 제 KCCM10969P 호로 기탁하였다.
본원의 구체적 실시예에 따르면, 도계장 근처의 하수로부터 시료를 채취하여 시료에서 SP를 숙주세포로 SP를 용균하는 박테리오파아지를 분리하고, 이들이 SG와 SP를 특이적으로 용균시킬 수 있음을 확인하였다. 또한, 이들 박테리오파아지(ΦCJ1)를 전자현미경을 통해 형태학적으로 관찰한 결과, 형태형(morphotype) 시포비리데(siphoviridae)에 속하는 것을 확인하였다(도 1).
또한, ΦCJ1의 단백질 패턴을 분석한 결과, 박테리오파아지의 주요 구조단백질로서 38 kDa과 49 kDa의 단백질을 포함하는 것으로 나타났다.
또한, ΦCJ1의 전체 게놈 크기를 분석한 결과, 61 kbp 크기를 갖는 것을 확인하였다. 이들의 유전적 특성을 분석한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 5의 핵산 분자를 전체게놈의 일부로서 포함하는 것을 확인하였으며, 이들을 바탕으로 타종간 유사성을 비교한 결과, 현재까지 알려진 박테리오파아지와 유사성이 매우 낮아, 신규 분리된 박테리오파아지임을 확인하였다. 유전적 특성을 좀 더 구체적으로 분석한 결과, ΦCJ1에 특이적인 프라이머 세트(primer set), 즉 서열번호 6과 7번, 서열번호 10과 11번, 서열번호 8과 9번, 서열번호 12와 13번, 서열번호 14와 15번, 서열번호 16과 17번, 서열번호 18과 19번 프라이머 세트로 PCR을 진행하였을 때, 특정 크기의 PCR 산출물, 660bp, 1.3kbp, 670bp, 1.8kbp, 1 kbp, 1 kbp 및 1 kbp 정도의 PCR 산출물이 얻어지는 것을 확인하였다.
또한, ΦCJ1을 SG 및 SP 에 감염시켰을 때, 용균반(phage plaque로 soft agar에서 하나의 박테리오파아지에 의해 숙주세포가 용균되어 형성되는 clear zone)의 크기와 탁도 등이 동일하며, 이들을 용균시킴으로써 SG 및 SP의 성장을 억제시킴을 확인하였다.
또한, ΦCJ1을 다양한 pH 범위 및 온도에서 안정성을 조사한 결과, pH2.5 내지 9.0 및 37℃ 내지 70℃ 범위의 넓은 범위에서 안정하게 생존하는 할 뿐만 아니라, 고온 건조(60℃에서 120분)시에도 안정성을 유지하는 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 박테리오파아지 ΦCJ1을 SG와 SP를 통제할 수 있는 다양한 제품으로의 적용이 용이하다는 것을 의미하는 것이다.
다른 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 가금티스 또는 추백리의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 박테리오파아지는 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 항균 활성을 가지므로, 이들 균들에 의해 유발되는 질병을 예방하거나 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다. 구체적으로 바람직한 한 양태로써 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"이란 조성물의 투여로 질병을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.
본 발명의 상기 조성물을 적용할 수 있는 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병의 예로는 가금티푸스, 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예로는 추백리인 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 조성물은 5 x 102 내지 5 x 1012 pfu/ml 의 ΦCJ1 을 포함하며, 바람직하게는 1 x 106 내지 1 x 1010 pfu/ml 의 ΦCJ1 을 포함한다.
본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품 및 사료첨가제로 제공될 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항생제"는 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것이다. 본 발명의 박테리오파아지는 기존 항생제에 비하여 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼에 대한 특이성이 매우 높으므로, 익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있고, 약물 내성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파아지를 유효 성분으로 포함하는 가금용 사료 및 음용수에 관한 것이다.
본 발명의 가축용 사료는 박테리오파아지를 사료첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 사료 내 박테리오파아지는 액상 또는 건조상태 모두 가능하다. 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및 동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리오파아지는 분말형태로 사료 중량의 0.05 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합될 수 있다.
본 발명에서의 ΦCJ1을 포함하는 사료에는 식물성으로는 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물부산물류 등이 있으며, 동물성으로는 단밸질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단밸질, 동물성플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명에서의 ΦCJ1을 포함하는 사료 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며 이에 한정된 것은 아니다.
또한 음용수에 혼합하여 공급함으로써 지속적으로 장내 살모넬라 갈리나룸 혹은 살모넬라 플로럼의 숫자를 감소시킬 수 있으며, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 청정 가축 생산을 모색할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 소독제 및 세척제를 제공하는 것이다.
상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 소독제는 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 제거를 위한 살포에도 활용되어 가금의 활동 영역, 가금 도축장, 가금 폐사 지역, 가금 조리 장소 및 조리 설비에 사용될 수 있으며 장소는 이에 국한된 것은 아니다.
또한 상기 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 세척제는 살아있는 가금의 피부 표면, 깃털 및 신체 각 부위에 묻어있거나 혹은 감염 가능한 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼을 제거하는데 사용될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 이용하여 가금에서 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병인 가금티푸스 또는 추백리를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 살모넬라균에 감염하는 박테리오파아지의 분리
1-1. 박테리오파아지 스크리닝 및 단일 박테리오파아지 분리
도계장 및 근처 하수 종말 처리장 시료 50 ml 원심분리관으로 옮겨 4000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 상등액을 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. SP 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕ 와 10 X Luria-Bertani 배지(이하 LB 배지라고 명명함, tryptone 10 g ; yeast extract 5 g ; NaCl 10 g ; 최종부피가 1 L 되도록) 2 ml 에 시료 여과액 18 ml 을 섞어주었다. 이를 37℃에서 18 시간 동안 배양한 후 배양액을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상등액을 0.2 ㎛ 필터를 이용하여 여과하였다. LB plate에 0.7% 한천(agar) (w/v) 3 ml, SP 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕을 섞어 부어 굳힌 후 그 위에 시료 배양 여과액 10 ㎕를 떨어뜨려 37℃ 에서 18 시간 동안 배양하였다(0.7% 한천을 이용해 고체 배지 위에 붙는 것을 탑-아가(top-agar)라고 하고, 탑-아가에서 성장하는 숙주세포를 이용해 박테리오파아지가 용균하는 것을 관찰하는 방법을 소프트 아가 오버레이(soft agar overlay) 방법이라고 정의한다.
용균이 일어난 시료 배양 여과액을 적당히 희석하여 SP 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕ 섞은 후 소프트 아가 오버레이를 진행하여 단일 용균반을 획득하였다. 하나의 용균반에는 하나의 박테리오파아지로 이루어 졌다고 보기 때문에 단일 박테리오파아지를 순수분리 하기 위해 하나의 용균반을 취해서 400 ㎕ SM 용액 (NaCl, 5.8 g ; MgSO47H2O, 2 g ; 1 M Tris-Cl (pH7.5), 50 ml ; H2O, 최종부피가 1 L 되도록)에 넣고 4 시간 동안 실온에 정치하여 단일 박테리오파아지를 순수분리하였다. 분리된 박테리오파아지를 대량확보하기 위해 단일 박테리오파아지 용액의 상등액 100 ㎕를 취한 후, 0.7% 한천 12 ml, SP 진탕 배양액 500 ㎕ 와 혼합하여, 150 mm 지름의 LB 배지에서 소프트 아가 오버레이를 실시하였다. 완전히 용균이 일어난 plate에 15 ml SM 용액을 부운 후, 4 시간 동안 실온에서 살며시 흔들어 주어 탑-아가 속의 박테리오파아지를 유출시켰다. 박테리오파아지가 유출된 SM 용액을 회수한 뒤 최종부피의 1%가 되도록 클로로포름(chloroform)을 첨가해서 10 분간 잘 섞어준 후, 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하였다. 여기서 얻어진 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 냉장 보관하였다.
1-2. 박테리오파아지의 대량배양
선별된 박테리오파아지를 SP를 이용하여 대량배양을 실시하였다. SP를 진탕 배양하여 1.5 X 1010 cfu(colony forming unit)가 되도록 분주하여 4000 rpm 에서 10 분간 원심분리한 후 이를 4 ml SM 용액에 재부유시켰다. 여기에 박테리오파아지를 7.5 X 107 pfu (plaque forming unit)로 접종해 MOI(multiplicity of infection)=0.005로 만든 후 37℃에서 20 분간 정치하였다. 이를 150 ml LB 배지가 들어있는 플라스크에 접종한 후 5 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 최종 부피의 1%가 되도록 클로로포름을 첨가하고 20 분간 흔들어 주었다. DNase I과 RNase A를 각각 최종농도 1 ㎍/ml 되도록 첨가하고 30 분간 37℃에 정치시켰다. 최종 농도가 각각 1 M과 10% (w/v)이 되도록 NaCl과 PEG(polyethylene glycol)를 넣어 준 뒤 4℃에서 3 시간 추가 정치시켰다. 4℃, 12000 rpm 에서 20분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 5 ml SM용액으로 침전물을 재부유시킨 후 20 분간 실온에 정치시켰다. 여기에 4 ml 클로로포름을 첨가한 후 잘 섞어주고 4℃, 4000 rpm에서 20 분간 원심분리하였다. 상등액을 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 글리세롤(glycerol) 밀도 구배법(밀도:40%, 5% 글리세롤)을 이용한 초원심분리(35,000rpm, 1시간, 4℃)를 통하여 ΦCJ1을 정제하였다. 정제한 ΦCJ1은 300 ㎕의 SM 용액으로 재부유 한 후 타이터를 측정하였다.
실시예2 : ΦCJ1의 살모넬라균 감염 여부 조사
선별된 박테리오파아지가 SP 외에 다른 종의 살모넬라균에 대하여 용균 활성을 하기 위해 다른 종의 살모넬라균에 교차감염을 시도하였다. 그 결과 ΦCJ1은 ST(Salmonella enterica Serotype Typhimurium), SE(Salmonella enterica Serotype Enteritis), SC(Salmonella enterica Serotype Choleraesuis), SD(Salmonella enterica Serotype Derby), SA(Salmonella enterica subsp. Arizonae), SB(Salmonella enterica subsp. Bongori) 에는 감염하지 않고 SG와 SP에 특이적으로 감염하였다 (실시예 13 참조). 그 결과는 아래 <표 1>과 같다. SG를 숙주로 이용하여 생산한 ΦCJ1은 SP에서 생산된 것과 동일한 용균반 모양, 형성된 용균의 투명성 정도, 단백질 패턴 및 게놈 크기를 보였다.
표 1 < ΦCJ1의 살모넬라균 감염여부>
Sero type Strain name 용균반 형성유무 Sero type Strain name 용균반 형성 유무
SG SGSC 2293 O SE SGSC 2282 X
SP SGSC 2294 O SC ATCC 13312 X
SGSC 2295 O SD SCSG 2467 X
ST ATCC 14028 X SGSC 2468 X
LT2 X SA ATCC 13314 X
UK1 X SB ATCC 43975 X
* ATCC : The Global Bioresource Center
* SGSC : salmonella genetic stock center
실시예3 : ΦCJ1의 형태관찰
정제된 ΦCJ1을 0.01% 젤라틴 용액에 희석한 후, 2.5% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 용액으로 고정하였다. 이를 carbon-coated mica plate(ca.2.5 X 2.5 mm)에 떨어뜨려 10 분간 적응시킨 후, 멸균증류수로 세척하였다. 카본 필름(Carbon film)을 copper grid에 끼워 4% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)에서 30-60 초간 염색하고, 건조를 수행한 후, 투과전자현미경(JEM-1011 transmission electron microscope, 80kV, 배율 X 120,000 ~ X 200,000)으로 검경하였다. 그 결과 분리된 ΦCJ1의 형태는 <도 1>과 같으며, 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid)와 수축성이 없는 꼬리(a long non-contractile tail)로 구성된 형태형(morphotype) 시포비리데(siphoviridae)에 속하는 것을 알 수 있었다.
실시예4 : ΦCJ1의 단백질 패턴 분석
1011 pfu/ml 타이터(titer)의 정제된 ΦCJ1 용액 15 ㎕와 5X SDS 시료 용액 3 ㎕을 섞은 후 5분간 끓였다. 이를 4-12% NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen 사) 젤에서 ΦCJ1의 전체 단백질을 전개하였다. 쿠마시블루(coomasie blue) 염색 용액을 이용하여 젤을 1 시간 동안 상온에서 염색하였다. 그 결과 단백질 패턴은 <도 2>와 같이 38 kDa와 49 kDa의 주요 단백질이 관찰되었다. 그 외에도 8 kDa, 17 kDa, 80 kDa, 그리고 100 kDa의 단백질이 관찰되었다.
실시예5 : ΦCJ1의 전체 게놈 DAN 크기 분석
초원심분리를 통해 정제된 ΦCJ1의 게놈 DNA를 추출하였다. 구체적으로 정제된 ΦCJ1 배양액에 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid(pH8.0)), 프로테네이즈 케이(proteinase K), 그리고 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 각각 최종 농도로 20 mM, 50 ㎍/ml, 그리고 0.5% (w/v) 되도록 첨가한 후 50℃에서 1 시간 동안 정치하였다. 동일양의 페놀(phenol (pH8.0))을 첨가 후 잘 섞어준 후 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 취해서 동일양의 PC(phenol:chloroform=1:1)를 첨가하고 잘 섞어준 후 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 취해서 동일양의 클로로포름을 잘 섞어준 후 실온에서 12000 rpm으로 10 분간 원심분리하였다. 상등액을 취한 후 3 M 초산나트륨(sodium acetate)을 전체 부피의 1/10로 섞고 2배 양의 차가운 95% 에탄올(ethanol)을 첨가한 후 -20℃에서 1 시간 정치시켰다. 0℃에서 10 분간 12,000 rpm으로 원심분리 후 상등액을 완전히 제거한 후 바닥의 DNA를 50 ㎕ TE(Tris-EDTA (pH 8.0)) 용액에 녹였다. 추출한 DNA를 10배 희석하여 OD260에서 흡광도를 측정해 농도를 측정하였다. 1 ㎍ 전체 게놈 DNA를 1% PFGE (pulse-field gel electrophoresis) 아가로즈 젤에 로딩한 후 BIORAD PFGE system 7번 프로그램(size range 25-100 kbp ; switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape ; forward voltage 180 V ; reverse voltage 120 V)을 이용하여 상온에서 20 시간 동안 전개하였다. ΦCJ1의 게놈 DNA의 크기는 <도 3>에서 보는 것과 같이 약 61 kbp 정도이었다.
실시예6 : ΦCJ1의 유전적 특성 분석
분리한 ΦCJ1의 유전자적 특성을 알아보기 위해서 ΦCJ1의 게놈 DNA 5 ㎍를 EcoR V와 Sca I 제한효소로 동시에 처리하였다. 벡터로는 pBluescript SK+ (Promega 사)를 EcoR V 제한효소로 자른 후 CIP(calf intestinal alkaline phosphatase) 처리한 것을 사용하였다. 절편된 게놈 DNA와 벡터의 양이 3:1이 되도록 반응조건을 맞추어 섞은 후 16℃에서 5 시간 동안 라이게이션(ligation)을 진행하였다. 이를 대장균의 한 종인 DH5α 세포에 도입시켰다. 이렇게 형질전환 된 전환체를 엠피실린(ampicillin)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside)이 포함된 LB plate에서 통상의 청백 콜로니 선별법을 통해 2개 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 엠피실린이 포함된 배양배지에서 16 시간 동안 진탕 배양하였다. 여기서 플라스미드 정제키트 (Promega 사)를 이용하여 플라스미드를 추출하였다.
상기 플라스미드들을 M13 forward와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 클로닝 여부를 확인하였으며 삽입조각 크기가 1 kbp 이상 되는 것을 골라 M13 forward 와 M13 reverse 프라이머 세트를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 이렇게 수득한 유전자 염기서열이 서열번호 1 ~ 5에 나타나 있다. 이를 NCBI blastx 프로그램을 이용하여 해독염기서열의 유사성을 분석한 결과가 <표 2>에 제시되어 있다.
<표 2>에서 보는 바와 같이 ΦCJ1은 서열번호 1의 해독염기서열의 앞부분은 대장균 박테리오파아지인 bacteriophage TLS의 Dcm과 36%의 유사성을 보이며 뒷부분은 Burkholderia cepacia phage BcepNazgul의 DR0530-like primase와 31% 유사성을 보였다. 서열번호 1의 해독염기서열의 경우에는 역방향으로 salmonella phage Det7의 tail spike protein과 34% 유사성을 보였다. 이렇듯 해독염기서열이 알려진 박테리오파아지의 단백질과 상동성이 높지 않았으며, 더욱이 서열번호 1 ~ 5 번을 NCBI blastn 프로그램을 이용하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 염기서열의 상동성은 보이지 않았다. 따라서 ΦCJ1은 신규 분리된 박테리오파아지로 판단되었다.
표 2 <ΦCJ1의 염기서열과 다른 박테리오파아지의 해독염기 서열 상동성 비교>
Organism protein Aceession number Subject location Query location identies E value
1 Bacteriophage TLS Dcm AAR09305 34 - 211 827-1351 66/181 (36%) 4e-28
Burkholderia cepacia phage BcepNazgul DR0530-like primase AAQ63375 591 - 799 6-635 70/220 (31%) 2e-18
2 Salmonella phage Det7 tailspike protein CA078738 194-700 1926-430 178/510 (34%) 4e-76
Salmonella phage SETP3 tail component protein ABN47332 1-357 469-584 38/119 (31%) 5e-09
3 Pseudomonas phage D3 Orf65 NP_061561.1| 67-151 826-587 32/89 (35%) 0.010
Pseudomonas phage PA11 hypothetical protein ORF003 YP_001294596.1 61-92 826-732 18/32 (56%) 0.039
4 Pseudomonas phage 73 putative DNA polymerase YP_001293408 403-519 4-357 43/118 (36%) 6e-14
Bacillus cereus E33L GIY-YIG catalytic domain -containing protein YP_085011 2-109 440-769 38/110 (34%) 2e-10
5 Phage phiJL001 gp77 YP_224001.1| 38-130 627-328 36/100 (36%) 3e-06
Pseudomonas phage 73 hypothetical protein ORF019 YP_001293426.1 53-132 988-770 32/80 (40%) 7e-07
실시예7 : ΦCJ1 특이적 프라이머 염기서열 제작
ΦCJ1을 동정하기 위하여 ΦCJ1 특이적인 프라이머를 제작하였다. 서열번호 1을 바탕으로 서열번호 6과 7, 서열번호 10 와 11의 프라이머세트, 서열번호 2를 바탕으로 서열번호 8과 9, 서열번호 12 와 13의 프라이머세트를 제작하였다. 또한 서열번호 3, 서열번호 4, 및 서열번호 5을 바탕으로 각각 서열번호 14 와 15, 서열번호 16 과 17, 및 서열번호 18 과 19의 프라이머세트를 제작하여 PCR을 진행하였다. 0.1 ㎍의 박테리오파아지 전체 게놈 DNA와 0.5 pmol이 되도록 프라이머를 pre-mix (Bioneer 사)에 첨가하고 최종부피가 20 ㎕이 되도록 맞추었다. 이를 denaturation; 94℃ 30 초, annealing; 60℃ 30 초, polymeration; 72℃ 1 분 의 조건으로 30 cycles PCR을 진행하였다. 그 결과 서열번호 6 과 7, 서열번호 10 과 11을 프라이머 세트로 이용했을 경우 <도 4>에서 보는 바와 같이 각각 약 660 bp 와 1.3 kbp 정도의 PCR 산물을 수득하였다. 서열번호 8와 9, 그리고 서열번호 12와 13을 프라이머 세트로 이용했을 경우도 <도 4>에서 보는 바와 같이 각각 670 bp 와 1.8 kbp 정도의 PCR 산물을 수득하였다. 또한 서열번호 14와 15, 서열번호 16과 17, 그리고 서열번호 18과 19를 프라이머 세트로 이용했을 경우 도면에는 싣지 않았지만 모두 1 kbp 정도의 PCR 산물을 수득하였다.
실시예8 : 박테리오파아지의 감염능력 확인
ΦCJ1의 감염 능력을 확인하기 위하여 one-step growth 실험을 진행하였다.
SG 배양액(OD600=0.5) 50 ml을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리 한 후 새로운 LB 배지 25 ml에 재부유했다. 여기에 분리한 박테리오파아지를 MOI=0.0005로 접종한 후 5 분간 정치시켰다. 반응액을 4000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 균체를 분리한 다음 이를 다시 새로운 LB로 재부유 시켰다. 이후 37℃에서 배양하며 10 분 간격으로 2개씩 배양액을 수집하여 12000 rpm에서 3 분간 원심분리하여 상등액만을 취하였다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이방법으로 각 단계의 희석액을 10 ㎕ 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. ΦCJ1은 SG와 SP에 동시 감염하는 박테리오파아지이므로 이와 같은 실험을 SP에 대해서도 똑같이 진행하였다. SG와 SP를 숙주세포로 이용하였을 때 one-step growth 결과를 보면 방출크기(burst size)는 10^2 이상임을 알 수 있었다. 자세한 결과는 <도 5>와 같다.
실시예9 : 박테리오파아지의 효능 확인
ΦCJ1의 액체 배지 상에서의 SG에 대한 효능을 알아보기 위해 다양한 조건으로 clearing assay 실험을 수행하였다. 250 ml 플라스크에 35 ml의 LB 배지를 넣은 후 분리된 박테리오파아지 단일 용균반: SG의 세포수 비율을 1:1, 1:100, 1:10000 조건으로 접종하였다. 접종 후 37℃에서 200 rpm으로 배양하며 시간 별로 OD600의 변화를 측정하였다. 그 결과 ΦCJ1의 용균에 의한 SG와 SP의 성장 억제를 관찰할 수 있었다. 실험 결과는 <도 6>에 나타나 있다.
실시예10 : 박테리오파아지의 pH에 따른 안정성 조 사
ΦCJ1이 닭 위장 내 낮은 pH에서 안정성을 알아보기 위하여 다양한 pH 범위(pH 2.1, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.4, 6.9, 7.4, 8.2, 9.0)에서 안정성 조사 실험을 하였다. 다양한 pH 용액(소디움아세테이트 용액(Sodium acetate buffer (pH 2.1, pH 4.0, pH 5.5, pH 6.4)), 소디움시트레이트 용액(Sodium citrate buffer (pH 2.5, pH 3.0, pH 3.5)), 소디움포스페이트 용액(Sodium phosphate buffer (pH 6.9, pH 7.4)), 트리스 용액(Tris-HCl (pH 8.2, pH 9.0))을 각각 2 M로 제작하였다. pH 용액 100 ㎕와 동량의 1.0 X 1011 pfu/ml 타이터의 박테리오파아지용액을 섞어 각 pH 용액의 농도가 1 M이 되게 한 후, 1 시간 동안 상온에서 정치하였다, 이들을 단계 희석하고, 소프트 아가 오버레이(soft agar overlay) 방법을 이용하여 각 단계의 희석액을 10 ㎕ 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 원래의 ΦCJ1의 타이터와 비교하여 pH 변화에 따른 타이터 변화를 통하여 상대적 안정성을 확인하였는데, 실험 결과 pH 2.5까지는 활성을 잃지 않고 매우 안정적임을 알 수 있었다. 하지만 pH 2.1에서는 활성을 잃었으며 그 결과는 <도 7>에 제시하였다.
실시예11 : 박테리오파아지의 온도에 따른 안정성 조사
박테리오파아지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파아지의 제형 과정에서 발생하는 열에 대한 안정성을 확인하기 위한 실험을 하였다. 1.0 X 1011 pfu/ml 타이터의 ΦCJ1의 용액 200 ㎕ 를 37℃, 45℃, 53℃, 60℃, 70℃, 그리고 80℃의 온도 조건 하에서 각각 0 분, 10 분, 30 분, 60 분, 120 분 동안 장치시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이방법으로 각 단계의 희석액 10 ㎕ 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 원래 타이터와 온도 및 노출 시간 변화에 따른 상대적 안정성을 확인하였는데 70℃에서 2 시간까지 노출이 되어도 활성을 많이 잃지 않는 것을 알 수 있었다. 하지만 80℃이상에서는 10 분 노출 후 활성이 급격하게 감소하지만 일정 비율 활성을 유지한다. 그 결과는 <도 8>에 제시하였다.
실시예12 : 박테리오파아지의 건조에 대한 안정성 조사
박테리오파아지의 제품 제형 중 사료 첨가제로 이용할 경우 박테리오파아지의 제형 과정에서 발생하는 건조 조건에 대한 안정성을 확인하였다. 내열성 확인 실험을 통해 도출한 결과를 바탕으로, 60℃ 120 분 조건 하에서의 고온 건조 실험을 진행하였다. 1.0 X 1011 pfu/ml 타이터의 ΦCJ1의 용액 200 ㎕를 스피드 베큠(Speed vacuum, Speed - Vacuum Concentrator 5301, Eppendorf)을 이용하여 건조하였다. 건조 후 얻어진 펠렛(pellet)을 초기 용액과 동량의 SM 용액를 넣어 4℃에서 하루 동안 완전히 재부유시켰다. 처리한 실험 배양액을 단계 희석하여, 소프트 아가 오버레이 방법으로 각 단계의 희석액을 10 ㎕ 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균 여부를 통해 타이터를 측정하였다. 건조 후 원래 타이터와 상대적인 안정성을 비교하였을 때 활성이 약 102 정도 감소하는 것을 알 수 있었다. 그 결과는 <도 9>에 제시하였다.
실시예13 : 박테리오파아지의 야생 분리주 SG/SP에 대한 감염범위 조사
ΦCJ1이 실험에 사용된 SG(SG RKS4994)와 SP(SP RKS2242) 이외 서울대학교 수의과대학 조류질병학실에서 분리한 우리 나라의 야생 분리주 SG와 SP 각각 15주와 5주에 대하여 용균 활성이 있는지 여부를 확인해 보았다. 각 균주의 진탕 배양액 (OD600=2) 150 ㎕을 섞어 소프트 아가 오버레이 방법을 진행하여 1010 pfu/ml 타이터의 ΦCJ1의 용액 10 ㎕ 씩 떨어뜨린 뒤 37℃에서 18 시간 동안 배양하여 용균반 형성 유무를 관찰하였다. 야생 분리주 SG와 SP에 대하여 100% 용균율을 보이는 것을 확인할 수 있었고 그 결과는 <표 3>와 같다.
표 3 <우리 나라 야생 분리주 SG, SP에 대한 용균 형성 여부 조사>
Sero type Strain name ΦCJ1 용균반형성 유무 Sero type Strain name ΦCJ1 용균반형성 유무
SG SNU SG1 O SG SNU SG11 O
SNU SG2 O SNU SG12 O
SNU SG3 O SNU SG13 O
SNU SG4 O SNU SG14 O
SNU SG5 O SNU SG15 O
SNU SG6 O SP SNU SP1 O
SNU SG7 O SNU SP4 O
SNU SG8 O SNU SP5 O
SNU SG9 O SNU SP8 O
SNU SG10 O SNU SP11 O
* SG/SP source : 서울대학교 수의과대학 조류질병학실
실시예14 : 박테리오파아지의 독성 평가
가금티푸스 예방용 박테리오파아지로써 ΦCJ1의 산란계에서의 안전성, 잔류 및 난계대 평가를 통하여 독성 평가를 진행하였다. 산란계 실험은 총 3개로 다시 나누어 병원성 시험, 난계대 시험, 그리고 병변유무 및 맹장변 내 파지 농도조사를 진행하였다.
병원성 시험은 산란중인 갈색산란계 13수를 ΦCJ1 투여군에 8수, 대조군에 5수를 할당하고 투여군은 ΦCJ1을 사료와 혼합하여 공급 (사료 g 당 108 pfu 이상) 하고, 대조군에는 파지를 함유하지 않은 사료를 공급하여 산란율 및 임상증상 여부를 파지 투여시점으로부터 3주간 관찰하였다. 그 결과는 아래 <표 4>과 같이 ΦCJ1 투여군은 약 42% 대조군은 약 50% 산란율을 보였다. 또한 파지 투여 후 임상증상 관찰 결과 ΦCJ1 투여 후 24일간 관찰한 결과 호흡기 및 소화기의 이상 증상은 관찰되지 않았으며 활동성에서도 대조군과 차이를 보이지 않아 ΦCJ1 투여에 의한 문제는 없다는 것을 관찰하였다.
난계대 시험은 ΦCJ1 투여 3일, 6일, 9일에 집란한 계란 10개 내외의 표면을 70% 에탄올로 세척 및 파란하여 난황과 난백을 혼합한 후 혼합액 5 ml을 PBS 45ml로 10-1, 10-2, 10-3 까지 희석하였다. 각 희석액 25ml에 SNUSG0197 106 cfu를 첨가하여 37℃에서 3시간 배양한 후 원심분리로 균체 분리 하였다. 상층액 500 ㎕와 SNUSG0197 100 ㎕(109 cfu/ml) 를 혼합하여 tryptic soy agar plate에 탑-아가 오버레이 방법으로 도말한 후 37℃에서 18시간 배양한 후 플라크의 개수로부터 계란 1ml 당 파지의 수를 계산하였다. 그 결과는 아래 <표 5>와 같이 3일, 6일 9일에 집란한 계란 17개에서 ΦCJ1 유무를 검사한 결과 ΦCJ1이 분리되지 않았다.
산란계에서의 마지막 실험으로 ΦCJ1 투여 시 병변유무 및 맹장변 내 ΦCJ1 농도조사를 하였다. ΦCJ1 투여 3주후 시험계를 안락사 시키고 부검하여 간장, 비장, 신장 및 난포의 육안적 병소 유무를 관찰하였고 간장시료를 면봉으로 무균적으로 채취해 Mac Conkey 한천배지에 도말한 후 살모넬라 갈리나룸 유무도 확인하였다. 또한 맹장변을 채취해 투여한 ΦCJ1 농도를 개체별로 측정하였는데 이는 맹장변 1 g을 9 ml의 PBS에 부유한 후 15000 g에서 30분간 원심 분리한 후 상층액 1 ml을 PBS로 10-1 내지 10-4까지 희석한 후 희석액 500 ㎕와 SG0197 100 ㎕(109 cfu/ml)를 혼합하여 10x tryptic soy 한천배지에 탑-아가 오버레이 방법으로 도말하였다. 이를 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 형성된 플라크 수를 세고 단계별 희석배수를 고려하여 맹장변 그램당 박테리오파아지 수를 산출하였다. 그 결과 관찰기간 동안 특이적인 임상증상이 관찰되지 않았고, 맹장변에서는 맹장변 g 당 약 3.7 x 104 pfu의 ΦCJ1이 측정되었다. 이로써 사료로 공급한 파지가 위를 통과하여 장에까지 도달하고 있음을 알 수 있었다.
박테리오파아지의 내부장기 분포 조사는 11일령 SPF 병아리 10수를 5수씩 2개군으로 나누어 투약군에는 ΦCJ1 사료 그람 당 각각 108 pfu 를 첨가한 사료를 대조군에는 ΦCJ1 을 첨가하지 않은 사료를 3일간 공급한 후 희생시켜 간장, 신장 및 맹장변을 채취하여 ΦCJ1 유무를 확인하였다. 채취한 간장, 신장 및 맹장변과 동량의 PBS를 첨가하여 유제한 후 간장은 1 ml를 채취하였고, 신장과 맹장변은 모두를 1.5ml tube에 넣어 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 상층액 1 ml을 PBS로 10-1 내지 10-4까지 희석한 후 희석액 500 ㎕와 SG0197 100 ㎕(109 cfu/ml)를 혼합하여 10x tryptic soy 한천배지에 탑-아가 오버레이 방법으로 도말하였다. 이를 37℃에서 18시간 동안 배양한 후 형성된 플라크 수를 세고 단계별 희석배수를 고려하여 맹장변 그램당 박테리오파아지 수를 산출하였다. 그 결과 <표 6> 과 같이 간장 및 신장에서는 ΦCJ1이 관찰되지 않았으며, 오직 맹장변에서만 관찰되었다.
표 4 <ΦCJ1 투여시 평균 산란률 조사>
ΦCJ1 control
1일 사료 급이 시작
2일
3일 7 5
6일 8 7
7일 3 3
8일 6 4
9일 2 1
10일 3 3
13일 11 8
14일
15일 10 7
16일
17일 6 6
20일 11 7
21일
22일 9 4
23일
24일 6 3
산란률 42.2% 50.8%
표 5 <ΦCJ1의 분리 빈도 조사>
집란일 ΦCJ1 control
3일 0/7 0/5
6일 0/8 0/7
9일 0/2 0/1
합계 0/17 0/13
표 6 <ΦCJ1 투여군의 장기에서의 분리 유무 조사>
시험계 ΦCJ1 투약군 대조군
간장 신장 맹장변 간장 신장 맹장변
1 - - + - - -
2 - - + - - -
3 - - + - - -
4 - - + - - -
5 - - + - - -
실시예15 : 박테리오파아지의 효능 평가
ΦCJ1의 SG에 대한 예방 및 치료 정도 가능성을 보기 위하여 닭에서 효능 평가 실험을 진행하였다.
1일령 갈색산란계 20수를 10수씩 10개 시험군(ΦCJ1투약군 + 무투약 공격군 1개)에 할당하였고, 시험계에 ΦCJ1 을 g당 107 pfu를 혼합한 사료와 ml당 107 pfu 를 혼합한 음수를 1주일 간 공급하였고, 1주일째에 수당 SG0197 106 cfu와 각 파지 107 pfu (MOI=10) 를 500㎕의 TSB에 혼합한 후 얼음에 박았다가 1시간 이내에 구강으로 접종하였다. 2주간 폐사율을 관찰하였고, 생존한 시험계는 부검하여 병변유무 확인하였고, 세균을 분리하였다. 그 결과는 <표 7>과 같으며, ΦCJ1투약군은 무투약군 대비 유의적으로 높은 (P<0.05) 방어율을 보이는 것을 알 수 있었다.
표 7
ΦCJ1 투약 공격군 무투약 공격군
생존수 8 3
폐사율 20% 70%
병변 1/8 1/3
SG 재분리 0/8 0/3
방어율 70% 20%
본 발명의 박테리오파아지는 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 특이적 사멸능을 가져 익균을 사멸시키지 않으며, 내산성, 내열성 및 내건성이 뛰어나므로, 살모넬라 갈리나룸 및 살모넬라 플로럼 감염성 질병, 특히 가금티푸스와 추백리의 예방 및 치료 목적의 치료제, 항생제, 가축용 사료 등에 광범위하게 이용될 수 있다.
Figure PCTKR2009004582-appb-I000001

Claims (12)

  1. 살모넬라 갈리나룸(Salmonella Gallinarum)과 살모넬라 플로럼(Salmonella Pullorum) 특이적 사멸능을 갖고, 형태학상 정이십면체의 머리(isometric capsid) 및 수축성이 없는 꼬리(long non-contractile tail)를 갖는 형태형(morphotype) B1, 시포비리데(siphoviridae)에 속하고, 전체 게놈 크기가 61 kbp이며, 38 kDa 및 49 kDa 크기의 단백질을 주요 구조단백질로 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지.
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 형태학적으로 도 1에 도시된 형태형을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지.
  3. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 핵산 분자를 전체 게놈의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지.
  4. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 서열번호 6과 7번, 서열번호 8과 9번, 서열번호 10과 11번, 서열번호 12와 13번, 서열번호 14와 15번, 서열번호 16과 17번, 및 서열번호 18과 19번으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 또는 그 이상의 프라이머 세트로 PCR을 진행했을 경우 각각 약 660 bp, 670 bp, 1.3 kbp, 1.8 kbp, 1 kbp, 1 kbp, 및 1 kbp의 PCR 산출물을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지.
  5. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 pH 2.5 내지 pH 9.0 범위에서 내산성을 가지고, 37℃ 내지 70℃ 범위에서 내열성을 갖으며, 60℃에서 120분 동안 건조하였을 때 내건성을 갖는 것을 특징으로 하는 박테리오파아지.
  6. 제1항에 있어서, 상기 박테리오파아지는 기탁번호 KCCM10969P인 박테리오파아지.
  7. 제1항의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 살모넬라 갈리나룸 감염성 질병은 가금티푸스이고, 살모넬라 플로럼 감염성 질병은 추백리인 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 항생제로 사용되는 예방 또는 치료용 조성물
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료 또는 음용수.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 박테리오파아지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제
  12. 제1항의 박테리오파아지 또는 제 7항의 조성물을 이용하여 인간을 제외한 동물의 살모넬라 갈리나룸 또는 살모넬라 플로럼 감염성 질병을 치료하는 방법.
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