KR102244979B1 - 박테리오파아지 c2를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의용도 - Google Patents

Abstract

본 발병은 박테리오파아지 C2를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

박테리오파아지 C2를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의용도 {Pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of poultry typhus comprising bacteriophage C2 and uses thereof}

본 발병은 박테리오파아지 C2를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Salmonella Gallinarum(Sal. Gallinarum 또는 SG)은 닭에서 빈혈, 설사, 탈수, 장벽의 출혈 등의 증상을 일으키는 급, 만성의 패혈증 질환인 가금티푸스를 일으킨다. 가금 티푸스는 오염된 사료나 닭의 음용수로부터 감염이 되는 것으로 알려져 있으며 보균계가 수직감염(난계대 감염)을 통해 병을 전파시키는 특징을 가지고 있다. 닭의 전 연령에서 발병 가능하며 이환율 및 사망률은 약 60~100%로 높게 나타나는데, 숙주 감수성, 영양상태, 집단 관리 및 Salmonella 독성 등에 영향을 받는다. 또한 Salmonella는 면역세포의 왕성한 활동이나 항생제 투입 등으로 숙주 내 증식이 불리해 지면 숙주세포 내로 침투가 가능한 특징이 있기 때문에 항생제 등 보통의 치료법으로는 완전한 치료가 어려운 점이 있다.

현재 대부분의 북미 및 유럽 국가에서는 미국의 국가 가금류 개선 계획(National Poultry Improvement Plan, NPIP)에 따라 효과적인 통제정책과 감시 및 도축 계획으로 가금티푸스가 거의 사라진 상태이나, 남미 및 동남아시아 등에서는 여전히 발생빈도가 높은 것으로 보고되고 있어서 가금류 농가에 경제적인 손실을 초래한다. 한국의 경우 1992년에 가금티푸스가 처음 발병한 이후로 전국으로 퍼져나가서 가금류에서 가장 심각한 질병 중 하나가 되었다. 지난 18년간 닭에서의 법정가축전염병은 4,764개의 농장에서 37백만두에서 발생하였고, 가금티푸스의 경우 1,295개의 농장에서 13백만두에서 발생하였으며, 이는 전체 법정가축전염병 농장수 및 발생두수에서 각각 약 27%와 36%를 차지하고 있다. 전체적으로 가금티푸스의 발생두수는 감소하는 편이나 2018년 6월 현재 전체 법정가축전염병 발생두수 대비 가금티푸스의 발생두수는 약 32%에 이를 정도로 여전히 닭 농장에서 중요한 법정가축전염병으로 간주되고 있다(농림축산검역본부 법정가축전염병 발생통계). 한국에서 병의 급속 전파 이유 중 하나는 갈색 계란을 낳는 닭에 대한 선호도가 높은 것인데, 갈색 계란을 낳는 종이 백색 계란을 낳는 종 보다 병에 대한 저항성이 훨씬 떨어지며 이는 닭의 품종간 가금티푸스에 대한 유전학적으로 저항성이 다르기 때문이다.

가금티푸스의 예방을 위해 백신과 항생제를 이용해 왔으나, 백신은 국내에서 2001년부터 산란계에 생균백신 접종이 허용되어서 농장에서는 2회의 접종이 정례화 되어 적용이 되고 있지만, Salmonella 균의 낮은 면역원성, 수직 감염, 비장과 간 등의 숙주세포로 침투하여 증식하는 등의 특성 때문에 백신 접종에도 불구하고 가금티푸스를 완전히 막을 수는 없다. 항생제는 세계적으로 1950년대 초부터 닭의 생산성 향상, 성장촉진, 질병 발생률 감소 등을 목적으로 사용해 왔으며 대량 사육을 가능하게 해주었다. Penicillins, amynoglysoside, fluoroquinolones 등을 사용해 왔지만 저항성 야외균주의 발현과 계란에 잔류약제 이행, 내성과 오남용 문제에 따라 항생제 사용을 제한하고 있다. 현재 유럽 등 선진국에서는 사료에 항생제 첨가를 제한하거나 금지하였으며, 덴마크에서는 2006년에 성장촉진용 항생제와 항생제 사료 첨가를 금지하였고, 국내에서도 2011년에 사료에 항생제 첨가를 금지하였다. 이로 인한 항생제 대체제가 필요한 실정이고 현재 Salmonella를 제어하기 위해 박테리오파지(파지), 유산균, 정유, 박테리오신, 유기산 등이 사용되고 있다. 그 중 박테리오파지는 특정 병원체만을 표적으로 하며 숙주에서 자체 복제하여 높은 증식성으로 숙주를 사멸시킬 수 있어서 즉각적인 항균 효과를 기대할 수 있으므로 항생제 대체제로 활용될 수 있다. 또한 자연계에 존재하는 수가 박테리아보다 10배 정도 많아 찾기가 용이하고 경제적이다. 현재 Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp.와 같은 세균에 의한 질병 치료를 위한 박테리오파지 연구 진행이 보고 되었다.

박테리오파지와 숙주 세균은 서로 생존을 위해 경쟁하는 관계이며, 숙주가 되는 세균은 종종 돌연변이(mutation) 또는 변종(variant)의 형태로 박테리오파지의 감염으로부터 살아남게 된다. 이는 피할 수 없는 현상이며, 이러한 문제를 줄이기 위해 다양한 특성을 가지는 박테리오파지들을 칵테일로 적용하는 것이 효과적인 유해균 제어의 방법으로 이용되고 있다. 칵테일에 포함되는 박테리오파지의 선정은, 먼저 많은 박테리오파지를 분리하고, 이들 사이의 무작위적인 조합을 통해 효과를 확인하고 있으나, 체계적이지 못하고, 비효율적인 문제를 가지고 있어, 칵테일 제조용 박테리오파지의 분리 및 선정에 새로운 접근법이 필요하다.

본 발명의 목적은 가금티푸스 원인균인 Sal. Gallinarum을 효과적으로 사멸 시킬 수 있는 새로운 파지 cocktail를 제작하는 것이며, 칵테일 구성 박테리오파지 분리 및 선정을 위해 공진화(co-evolution)의 아이디어를 접목하였다. 이를 위해 먼저, 29개의 농장 분리 SG를 사멸하면서, 백신 균주인 Sal. Gallinarum 9R에는 영향을 끼치지 않는 박테리오파지 S8을 분리하였고, 단계적으로 파지에 대한 저항성 균을 분리하고 다시 이를 사멸시키는 파지들(C2(S8 저항성 균주 사멸 파지)와 Th1(S8 및 C2 저항성 균주 사멸 파지))를 개발함으로써 저항성 균에 대한 사멸능력을 높이고자 하였다. 상기 연구를 통해 3종(S8, C2, Th1)의 SG 사멸 파지들이 순차적으로 분리되었고, 다양한 특성분석과 whole genome sequencing을 통해 이들이 새로운 파지들이며, 장시간 배양에서 서로 상보적으로 작용하며, 칵테일 조합이 매우 효과적으로 Sal. Gallinarum 증식을 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 가금티푸스의 원인균인 Sal. Gallinarum을 제어하기 위해 하수와 분변 샘플으로부터 공진화의 아이디어를 접목하여 파지 3종을 순차적으로 분리 하였다. 이를 위해 먼저, Sal. Gallinarum의 생균 백신인 Sal. Gallinarum 9R에는 영향을 끼치지 않으면서 나머지 wild type SG 29 종류의 균주를 사멸시키는 박테리오파지 S8을 분리하였고, S8 파지 저항성 Sal. Gallinarum RSG7을 이용하여 파지 C2를 분리하였고, S8과 C2에 동시에 저항성을 가지는 Sal. Gallinarum RSG14을 이용하여 파지 Th1을 분리하였다. 상기 서로 특성이 다른 박테리오파지들(S8, C2, Th1)을 칵테일로 조합하여 Sal. Gallinarum에 처리한 결과, 단일 파지 접종 보다 Sal. Gallinarum 증식을 효과적으로 억제할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 항균 활성을 가지는 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)을 제공할 수 있다.

상기 박테리오파아지 C2는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에 대하여 항균 활성을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

상기 조성물에 박테리오파아지 Th1(기탁번호 KCTC13874BP) 또는 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P)를 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 조성물에 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생균 백신을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생균 백신은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 9R일 수 있다.

상기 가금류는 닭, 오리, 칠면조, 매추리, 물새, 비둘기, 카나리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.

상기 사료 첨가제에 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P) 또는 박테리오파아지 Th1 (기탁번호 KCTC13874BP)를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 박테리오파아지 C2를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 서로 특성이 다른 박테리오파지들(S8, C2, Th1)을 칵테일로 적용하여 Sal. Gallinarum에 처리한 결과 단일 파지 또는 2종의 파지 조합을 사용 했을 때 보다 3종의 파지 칵테일을 사용 한 경우의 증식 억제의 시너지 효과가 있었다. 특히 상기 박테리오파지는 Sal. Gallinarum 백신 균주인 9R(Sal. Gallinarum 512)을 사멸시키지 않으면서 나머지 29종류의 Sal. Gallinarum을 사멸시키는 효과가 있었다. 따라서 Sal. Gallinarum에 대한 생균백신의 효능을 해치지 않으면서 파지 병행 사용을 할 수 있는 효과가 있다. 또한 Sal. Gallinarum에만 특이적인 감염 능력이 있는 C2와 달리 S8과 Th1은 Sal. Enteritidis, Sal. Typhimurium, E. coli(O157:H7포함)를 에도 감염능력이 있는 효과가 있었다. 따라서 상기 박테리오파지는 Sal. Gallinarum 외에도 Enterobacteriaceae에 속한 다른 균들을 사멸 시킬 수 있는 효과가 있다. 동물실험 결과 박테리오파지를 접종하지 않은 군은 14일 후 생존율이 0%인 반면에 박테리오파지를 접종한 군은 14일 후 생존율이 50%로 증가하는 효과가 있었다.

도 1은 S8 (A), C2 (B), Th1 (C)에 대한 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지이다.
도 2는 S8 (A), C2 (B), Th1 (C)에 대한 일단증식곡선 결과이다.
도 3은 S8 (A), C2 (B), Th1 (C)에 대한 제한 효소 분해 패턴으로, 레인 M: 1kb DNA 마커; 레인 1: S8 with HincⅡ; 레인 2: S8 및 PvuⅡ; 레인 3: S8의 미처리 된 DNA; 레인 4: C2는 HincⅡ; 레인 5: C2 및 ClaⅠ; 레인 6: C2의 미처리된 DNA; 레인 7: Th1과 EoRⅠ; 레인 8: Th1과 EcoRⅤ; 레인 9: Th1의 미처리된 DNA이다.
도 4는 SDS 폴리 아크릴아미드 겔 전기영동으로 S8, C2 및 Th1의 구조 단백질을 분리하고, 쿠마시 블루로 염색한 결과로, 레인 M: 분자 질량 표지자; 레인 1: S8; 레인 2: C2; 및 레인 3: Th1이다.
도 5은 Sal. Gallinarum HJL 488을 이용하여 액체배지 상에서 각각의 파지에 의한 증식 억제 효과 결과로서, (A) S8, (B) C2, (C) Th1이다.
도 6은 Sal. Gallinarum HJL 488을 이용하여 액체배지 상에서 S8, C2 및 Th 1 파지 칵테일에 의한 증식 억제 효과 결과이다.
도 7은 고체배지에서 박테리오파지 S8, C2 및 Th 1 파지 칵테일에 의한 증식 억제 효과 결과이다.
도 8은 Gegenees를 사용한 전체 게놈 수준 분류 (BLASTN)이다.
도 9은 상온 및 4 ℃ 안정성 시험 결과이다.
도 10은 -80, -196 ℃의 필터 멸균 액에 대한 안정성 시험 결과이다.
도 11은 -80, -196 ℃에서의 PEG 침전에 대한 안정성 시험 결과이다.
도 12은 -80, -196 ℃에서의 CsCl 구배에 대한 안정성 시험 결과이다.
도 13은 -80, -196 ℃에서의 투석 된 CsCl- 구배에 대한 안정성 시험 결과이다.
도 14은 도전 감염에서 상태지수화 결과이다.
도 15은 도전 감염에서 닭 배설물 내 박테리오파지 제거 농도 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

가금티푸스의 원인균인 Sal. Gallinarum을 제어하기 위해 하수와 분변 샘플로부터 공진화의 아이디어를 접목하여 파지 3종을 순차적으로 분리 하였고 실제 적용을 위한 특성분석을 진행 하였다. 특히 효과적인 Sal. Gallinarum의 효과적인 제어를 위해 여러 종류의 서로 특성이 다른 박테리오파지들(S8, C2, Th1)을 칵테일로 적용하였는데, 이 때 칵테일에 포함 될 파지들을 분리할 때 S8 파지 저항성 Sal. Gallinarum RSG7을 이용하여 파지 C2를 분리하였고, S8과 C2에 동시에 저항성을 가지는 Sal. Gallinarum RSG14을 이용하여 파지 Th1을 분리하고 특성을 분석하였다.

본 발명은 항균 활성을 가지는 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)을 제공할 수 있다. 상기 박테리오파아지 C2는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에 대하여 항균 활성을 가질 수 있다. 본 발명자들은 Sal. Gallinarum의 효과적인 제어를 위해 여러 종류의 서로 특성이 다른 박테리오파지들(S8, C2, Th1)을 분리 정제하였고, 상기 박테리오파지들(S8, C2, Th1)을 Sal. Gallinarum에 처리한 결과, 두 개의 박테리오파지인 S8 및 Th1 보다 C2가 Sal. Gallinarum의 증식을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다 (도 6).

상기 박테리오파아지 C2는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에 대하여 항균 활성을 가질 수 있다.

본 발명은 또한 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC P)를 포함하는 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공 할 수 있다.

상기 조성물에 박테리오파아지 Th1(기탁번호 KCTC13874BP) 또는 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535 P)를 추가로 더 포함 할 수 있다.

상기 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC P); 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC P) 및 박테리오파아지 Th1; 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC P) 및 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535 P); 또는 박테리오파아지 S8(KCTC18535P), 박테리오파아지 C2 및 박테리오파아지 Th1를 포함할 수 있다.

파지의 숙주범위 확인 실험에서는 공통적으로 Sal. Gallinarum 백신 균주인 9R(Sal. Gallinarum 512)을 사멸시키지 않으면서 나머지 29개 Sal. Gallinarum(약 96%) 균주를 사멸시키는 것을 확인 하였다. 생균백신으로 사용되고 있는 9R 백신은 2001년 국내로 수입된 이후 산란계의 가금티푸스 발생을 현저히 줄여주었다. 그러나 Salmonella 균의 낮은 면역원성, 수직 감염, 비장과 간 등의 숙주세포로 침투하여 증식하는 등의 특성 때문에 백신 접종에도 불구하고 가금티푸스를 완전히 막을 수는 없다. 그러므로 본 발명에서는 9R 백신을 사멸시키지 않으면서 다른 Sal. Gallinarum 균들을 사멸시킬 수 있는 목적에 맞는 3종의 파지를 선별하였고, 이는 현재 널리 쓰이고 있는 Sal. Gallinarum에 대한 생균백신의 효능을 해치지 않으면서 파지 병행 사용의 가능함을 보여 주었다.

3종의 파지에 대해서 다양한 균으로 숙주범위를 본 결과 Sal. Gallinarum에만 특이적인 감염 능력이 있는 C2와 달리 S8과 Th1은 Sal. Enteritidis, Sal. Typhimurium, E. coli(O157:H7포함)를 에도 감염능력이 있는 것으로 나타났다. 다른 Sal. Gallinarum 파지에 비교한 결과 Kim [한국가금학회지, 2017. 44(3): p. 181-187.]등이 분리한 Sal. Gallinarum파지 10종 중 9종이 Sal. Gallinarum과 Sal. Enteritidis 모두를 감염시킬 수 있었고, Jeong[Journal of microbiology and biotechnology, 2013. 23(10): p. 1478-1483.]등이 분리한 Sal. Gallinarum 파지 3종중 1종은 Sal. Gallinarum, Sal. Enteritidis, Sal. Pullorum 을 감염시킬 수 있었고 나머지 2종은 이를 포함해 Sal. Typhimurium과 E. coli(O157:H7 미포함)까지 감염 시킬 수 있는 것으로 보아 Sal. Gallinarum 파지는 Sal. Gallinarum 외에도 Enterobacteriaceae에 속한 다른 균들을 사멸 시킬 수 있음을 알 수 있었다 (표 2 및 표 3).

Sal. Enteritidis, Sal. Typhimurium은 사람에게 식중독을 일으킬 수 있는 균들이며, 오염된 동물유래 음식물 섭취가 원인이다. 또한 E. coli(O157:H7포함)는 돼지에서 설사 등의 증상을 일으키는 균으로 감염된 돼지에 폐사, 성장률 저하 등을 일으키고 있으며, 사람에게도 문제가 되기 때문에 치료 및 예방비용으로 높은 경제적 손실을 가져오고 있다. 본 논문에서 개발된 파지 3종 중 C2와 Th1은 상기 언급된 균들에 대하여 모두 사멸 능력을 가지므로 Sal. Gallinarum에만 국한되지 않는 넓은 범위의 예방제제로서의 활용 가능성이 있다.

분리된 3종의 파지는 형태학상 Ackermannviridae family(S8), Podoviridae family (C2)와 Siphoviridae family(Th1)에 속하는 것을 확인 하였다 (도 1).

S8은 Sal. Gallinarum HJL488을 숙주로 이용할 때 infection cycle이 약 60분정도이고, burst size는 약 1,000이며, C2는 Sal. Gallinarum RSG7을 숙주로 이용할 때 infection cycle이 약 100분정도이고 burst size는 약 1,230 이고, Th1은 Sal. Gallinarum RSG14을 숙주로 이용할 때 infection cycle이 약 45분정도이고 burst size는 약 360으로 확인되었다 (도 2).

S8과 C2는 HicII 외의 다양한 제한효소에 저항성을 가지는 것을 확인할 수 있었고, Th1은 EcoRⅠ과 EcoRⅤ에 의해서 digest 되는 것으로 확인되었다 (도 3).

S8은 약 43.0Kda외 9개의 구조단백질이 관찰 (약 89.2, 78.5, 73.5, 67.6, 33.5, 28.2, 23.5, 18.0, 2.8Kda) 되었고, C2는 약 37.0Kda외 8개의 구조단백질이 관찰 (약 142.3, 100.0, 72.0, 52.0, 34.8, 29.1, 27.6, 22.5Kda) 되었다. 그리고 Th1은 약 32.2Kda외 6개의 구조단백질이 관찰 (약 115.3, 60.0, 37.0, 35.7, 23.0, 19.8Kda) 되었다. S8의 약 43.0Kda, C2의 약 37.0Kda, Th1의 약 32.2Kda의 구조단백질은 annotaion table과 각각의 유사파지 genome에 비교 해본 결과 각각 Major capsid protein, Capsid and scaffold, Mature head 기능을 하는 것으로 추정된다(도 4).

S8은 접종 4시간 후 MOI 1과 10의 실험군에서 각각 0.21, 0.19 수준의 OD600 값의 흡광도를 보인 반면 S8을 접종하지 않은 control의 경우 0.8 수준에 도달하였다. 그리고 C2는 접종 2시간 후부터 MOI 1과 10의 실험군 에서 각각 0.02 수준의 상당히 낮은 OD600 흡광도를 보인 반면 C2를 접종하지 않은 control의 경우 OD600가 0.6 수준에 도달하였다. 마지막으로 Th1은 접종 4시간 후 MOI 1과 10의 실험군 에서 각각 0.17, 0.15 수준의 OD600 흡광도를 보인 반면 Th1을 접종하지 않은 control의 경우 OD600가 0.8 수준에 도달하였다. 한편으로 적용한 MOI에서 S8, C2, Th1 각각의 파지 접종 후 각각 6, 21, 9시간 경과 후부터 SG488의 regrowth를 확인할 수 있었다(도 5).

액체배지 실험에서는 S8, S8+Th1, Th1 군은 접종 후 8시간 후에 OD600 값이 각각 0.20, 0.24, 0.19로 SG488의 regrowth가 시작됨을 확인 할 수 있었고, S8+C2, C2는 접종 후 16시간에 OD600 값이 각각 0.33과 0.61로 증가하였다가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. C2+Th1 은 OD600 값이 0.00~0.06 사이를 유지하였다. 마지막으로 3개 조합인 S8+C2+Th1은 접종 후 24시간까지 OD600값을 0.00을 유지 하는 것을 알 수 있었다(도 6). 고체배지 실험방법에서도 유사한 결과가 나왔는데, 실험 후 20시간 후 최종 regrowth된 colony 수는 S8, S8+Th1, Th1 군에서는 too numerous to count(TNTC), S8+C2, C2는 각각 평균 103.60, 130, C2+Th1는 9.60, 3개 조합인 S8+C2+Th1에서는 10.80 개의 colony를 확인 할 수 있었다(도 7). 이러한 결과들은 3종의 파지를 cocktail로 적용 시 가장 좋은 Sal. Gallinarum 증식 억제능을 보이며, 3종의 파지들이 증식억제에서 서로 상보적으로 작용하는 것을 확인하였다. 즉 액체배지 및 고체배지상에서 파지 증식 억제 실험 결과로 봤을 때 단일 파지(또는 2종)의 파지 조합(단일 파지 접종 또는 칵테일 파지 접종 모두 총 접종 파지양은 MOI=1로 사용; 즉, 만약 SG 농도가 3x10e7 cfu/ml이라면, 단일 파지 접종의 경우 단일 파지로 3x10e7 pfu/ml 정도; 2종 파지의 경우 각각 1.5x10e7 pfu/ml (2종의 박테리오파지 비율은 1:1); 3종 파지의 경우 각각 1x10e7 pfu/ml (3종의 박테리오파지 비율은 1:1:!) 정도로 접종)을 사용 했을 때의 OD600값 및 CFU counts가 2-3종의 파지 칵테일을 사용한 경우보다 유의미하게 낮으므로 혼합파지 접종군의 증식억제가 더 효과적임을 확인할 수 있었다.

Amino acid sequences를 이용한 Gegenees 프로그램(도 8)과 Phylogenetic tree Classification의 DNA ligase 측면에서 봤을 때 S8, C2, Th 1을 다른 bacteriophage와 구분 지을 수 있었다. Whole genome sequencing 분석에서는 3개 파지 모두 cell lysis 관련 효소가 발견 되었으므로 [S8(Cell wall-associated hydrolases), C2(lysin), Th1(endolysin)] 용균성 파지로서 유해균 조절에 적합하였다.

S8은 37℃ TA MOI 10조건에서 7-8 * 10¹⁰ pfu/ml 정도의 titer를 얻었고, C2는 37℃ TA MOI 5 조건에서 5-6*10¹⁰pfu/ml 정도의 titer를 얻을 수 있었다. 그리고 Th1은 37℃ TA MOI 1조건에서 1-2*10¹¹ pfu/ml정도의 titer를 얻을 수 있었다 (표 10). 이는 첫번째로 TA 배지에는 NB이외에 파지의 숙주 흡착을 도와줄 수 있는 2가 양이온(cation)들이 들어있기 때문에 다른 배지 보다는 TA에서의 titer값이 높다고 볼 수 있고, 두번째로 온도조건에 따라서 숙주인 Salmonella 균의 최적 성장 온도인 37℃(병원성 미생물 도감, 식품의약품안전처)보다 낮은 30℃에서 더 높은 titer를 얻을 수 있었으므로 숙주의 최적성장온도와 상관없이 파지마다 배양 최적적합온도가 다르다고 판단이 된다.

S2는 실온에서는 240일 동안 4개의 샘플(filter sterilized stock, PEG precipitation, CsCl-gradient, dialysised CsCl)이 0.6~1log PFU/ml값이 감소하였고, 4℃에서 진행한 실험에서는 0.2~0.9log PFU/ml값이 감소하였으며, -80℃에서는 전체적으로 동결보존제 첨가군 중에서는 DMSO 10% 첨가한 샘플이 2.6~9.1log PFU/ml 정도로 높은 감소값을 보였고 샘플 형태중에서는 CsCl 샘플이 6.0~9.1log PFU/ml 정도의 높은 감소값을 나타내었다. -196℃에서는 CsCl 샘플이 0.8~4.1log PFU/ml 정도로 감소한 반면에 다른 조건에서는 0.09~2.5log PFU/ml 정도의 감소를 보였다 (도 9 내지 13).

C2는 실온에서는 240일 동안 4개의 샘플(filter sterilized stock, PEG precipitation, CsCl-gradient , dialysised CsCl)이 0.9~3log PFU/ml값이 감소하였고, 4℃에서 진행한 실험에서는 0.2~1.4log PFU/ml값이 감소하였다. -80℃에서는 Dialysised CsCl 샘플이 0.3~2.3log PFU/ml 정도의 감소값을 나타낸 반면, 다른 군에서는 0.1~1.1log PFU/ml 정도의 감소값을 나타냄을 확인하였다. -196℃에서는 전체적으로 0.2~1.2log PFU/ml 정도의 감소값을 보였다 (도 9 내지 13).

Th1은 실온에서는 240일 동안 4개의 샘플(filter sterilized stock, PEG precipitation, CsCl-gradient , dialysised CsCl)이 1.2~3.1log PFU/ml값이 감소하였고, 4℃에서 진행한 실험에서는 0.5~0.8log PFU/ml값이 감소하였다. -80℃에서는 전체적으로 0.06~1.4log PFU/ml 정도의 감소값을 나타내었고, -196℃에서는 전체적으로 0.1~0.7og PFU/ml 정도의 감소값을 보였다(도 9 내지 13).

생동물실험 결과로는 균 1 x 10⁷ cfu/수, 파지 2 x 10⁷ pfu/ml 조건에서 공격접종 14일 후 생존률 50% 결과가 나왔고 파지공급을 하지 않은 군에서는 공격접종 12일 후 생존률 0%의 결과가 나왔다. 다른 Sal. Gallinarum 파지 동물실험 데이터에 비교 하였을 때, 균 1 x 10⁸ cfu, 파지 10⁸ pfu/ml 조건에서 공격접종 21일 후 생존률 L13 75%, ST4 70%, SG3 50% 결과가 나왔고 파지공급을 하지 않은 군에서는 공격접종 21일 후에도 생존율 40%의 결과가 나왔 (도 14). 본 논문의 동물실험 결과 생존율이 비교적 낮다고 볼 수 있지만, 사멸율 측면에서는 공격접종 12일 후부터 사멸률이 100%이므로 참고논문에 쓰인 공격 주에 비해 닭의 빠른 사멸을 야기한 것을 알 수 있다.

상기 조성물에 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생균 백신을 추가로 더 포함할 수 있다.

상기 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생균 백신은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 9R일 수 있다.

상기 가금류는 닭, 오리, 칠면조, 매추리, 물새, 비둘기, 카나리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화되어 수의의약품으로 제공될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제 화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명은 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 개선용 사료 첨가제를 제공할 수 있다.

상기 사료 첨가제에 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P) 또는 박테리오파아지 Th1를 추가로 더 포함할 수 있다. 자세하게는 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP); 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP) 및 박테리오파아지 Th1 (기탁번호 KCTC13874BP); 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP) 및 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535 P); 또는 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P), 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP) 및 박테리오파아지 Th1 (기탁번호 KCTC13874BP)를 포함할 수 있다.

축산, 수산업에서 사용되는 사료 첨가용 항생제는 질병의 예방 목적으로 사용되고 있는데, 예방 목적의 항생제 투여는 내성균 발생 가능성을 높이고 가축에 잔류하는 항생제가 사람에게 전달될 수 있어서 문제이다. 항생제가 육류를 통해 인체에 흡수되면 항생제 내성을 유발해 질병의 확산을 부를 수도 있다. 또한, 사료에 섞여 먹이는 항생제의 종류가 많고 이는 다제 내성균 발생 확률이 높아지는 문제점이 있기 때문에 좀 더 자연 친화적이면서도 기존의 항생제의 사용에서 발생한 문제를 해결할 새로운 사료 첨가용 항생물질로서 본 발명의 박테리오파아지 S8(KCTC18535P), 박테리오파아지 C2(기탁번호 KCTC13875BP) 및 박테리오파아지 Th1(기탁번호 KCTC13874BP)을 이용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제에는 식물성으로 곡물류, 근과류, 식품가공 부산물류, 조류, 섬유질유, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류, 곡물 부산물류 등이 있으며, 동물성으로 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단밸질, 동물성 플랑크톤류, 남은 음식물 등이 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명의 사료 첨가제에는 품질 저하를 방지하기 위해 첨가되는 결착제, 유화제, 보존제 등이 있고, 효용 증대를 위하여 첨가되는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소화합물, 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 이에 한정된 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 사료 첨가용 조성물을 포함하는 사료를 제공할 수 있으며, 본 발명의 사료는 박테리오파지를 사료 첨가제 형태로 따로 제조하여 사료에 혼합시키거나, 사료 제조 시 직접 첨가시켜 제조할 수 있다.

본 발명은 박테리오파아지 C2(기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스의 방제용 소독제를 제공할 수 있다.

상기 가금티푸스 방제용 소독제에 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P) 또는 박테리오파아지 Th1(기탁번호 KCTC13874BP)를 추가로 더 포함할 수 있다.

가금티푸스 방제용 소독제는 본 발명의 박테리오파아지 C2(기탁번호 KCTC13875BP)를 액상으로 희석하여 가금류 근거지에 살포 할 수 있으며, 그 방법은 기존 방법에 준한다.

본 발명은 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 항생제를 제공할 수 있다.

상기 항생제에 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P) 또는 박테리오파아지 Th1(기탁번호 KCTC13874BP)를 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항생제"는 약제 형태로 동물에게 제공되어 균을 사멸시킬 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것이다. 본 발명의 박테리오파지는 기존 항생제에 비하여 살모넬라 갈리나룸에 대한 특이성이 매우 높으므로, 익균은 죽이지 않고, 특정 병원균만 사멸시킬 수 있고, 약물 내성을 유도하지 않아, 기존의 항생물질에 비하여 제품수명(life cycling)이 긴 신규 항생제로서 제공될 수 있다.

본 발명은 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

상기 박테리오파아지 S8(기탁번호 KCTC18535P), 박테리오파아지 C2(기탁번호 KCTC13875BP) 및 박테리오파아지 Th1 (기탁번호 KCTC13874BP)를 포함하는 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 약학적 제제의 형태로 동물에게 투여되거나, 가축의 사료 또는 음수에 혼합하여 이를 섭식시키는 방법을 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 사료첨가제의 형태로 사료에 혼합되어 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입 등을 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단의 범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 감염 가금류에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 연령, 체중, 일반 건강 상태, 암수 여부 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 수의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 일 구체적인 예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 사용된 균 및 배양

박테리오파지(파지) 분리 및 특성분석을 위해 Salmonella Gallinarum(Sal. Gallinarum) 30주, Salmonella Typhimurium(Sal. Typhimurium) 30주, Salmonella Enteritidis(Sal. Enteritidis) 20주, Escherichia coli(E. coli) 16주와 실험실 보유 레퍼런스 균 29주를 사용하였다(표 2, 3). 위 균들은 Tryptic soy broth(TSB; Difico, USA)와 TA soft agar(0.4% agar in TA broth; 8g nutrient broth, 5g NaCl[86mM], 0.2g MgSO4·7H20[0.8mM], 0.05g MnSO4[0.3mM], and 0.15g CaCl2[1.0mM] per 1L, pH 6.0) 및 TSB agar(1.5 %)plates를 이용해 37℃에서 배양하였다.

<실시예 2> 파지 분리 및 증식

10ml의 샘플에 동량의 1X TSB와 1ml의 Sal. Gallinarum bacterial overnight culture를 첨가하여 37℃에서 12시간 배양하였다. 원심분리기를 이용하여 42,748 x g으로 5분간 원심분리한 후 0.2μm 필터(ADVANTEC, Japan)로 여과한 상등액 100μl을 SM buffer(50 mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgSO4, pH7.5)에 단계별 희석 하였다. 희석액 100μl를 bacterial overnight culture 200μl와 함께 50℃로 유지한 4ml TA soft agar에 넣고 섞은 후 미리 만들어서 굳힌 TSA plate위에 붓고 굳힌 다음, 37℃ 에서 12시간 배양하고 single clear plaque을 확인 하였다. 순수 분리된 박테리오파지의 증식과 농축은 plate elution, PEG(Polyethyleneglycol[10%, NaCl 1M]) precipitaion, CsCl(Caesium chloride) 초원심분리기를 이용한 방법에 준해 진행하였다. 이 과정으로 Sal. Gallinarum HJL 488을 host로 사용하여 2015년 6월 중순에 덕진공원의 토양, 하수로 부터 파지 S8을 분리 하였다.

<실시예 3> S8(또는 S8과 C2) 저항성 Sal. Gallinarum 돌연변이 선별

TA broth 10ml에 Sal. Gallinarum HJL 488 overnight culture를 접종(2% inoculum)후 약 3시간 배양(shaking incubator, 160rpm, 37℃)하여 OD600값이 0.3정도에 도달했을 때, MOI(multiplicity of infection) 1로 S8 파지를 접종하였다. 21시간 후 배양된 regrowth bacteria를 TSA plate에 streaking하고 S8 phage filtered-stock(10⁸pfu/ml)을 떨어뜨린다. 배양된 샘플 중 S8에 의해 저항성 있는 colony를 확인하여 4~5번 계대배양 하였다. 최종 screening된 S8에 저항성 있는 Sal. Gallinarum HJL 488 유래 돌연변이균주(RSG7)을 다음 실험에 사용하였다(표 1). 유사한 방법으로 S8과 C2에 저항성이 있는 Sal. Gallinarum HJL 488 유래 돌연변이균주(RSG14)을 Th1의 분리에 이용하였다.

<실시예 4> C2와 Th1 선별

C2는 RSG 7을 이용하여 2016년 12월 중순에 피그앤피플농장의 분뇨로부터 분리하였고 Th1도 mutant screening을 통한 S8과 C2에 저항성 있는 Sal. Gallinarum HJL 488을(RSG 14라 명명)이용하여 2017년 4월 중순 동일한 샘플로부터 분리하였다 (표 1).

Isolation of bacteriophages

Phage name	Host name	Source
S8	Sal. Gallinarum HJL 488	sewage
C2	RSG 7(resistant to S8)	animal fecal
Th1	RSG 14(resistant to S8+C2)	animal fecal

<실시예 5> 파지가 감염 가능한 숙주범위 확인실험

분리된 파지의 host range를 결정하기 위해 TA soft agar(0.4%, 5ml)에 실험에 이용된 균 각각의 bacterial overnight culture 200 ml를 넣고 TSA plate 에 overlay 하여 굳힌다. 그 위에 filtered phage stock (SM buffer에서 희석된 최종농도 10⁸pfu/ml) 을 10 μl 떨어트리고 37℃ incubator 10~12 시간 배양 후 결과를 관찰 하였다. 전체 균에 대해서 dotting assay와 plaque forming method를 모두 이용하였다. Sal. Gallinarum HJL 488을 indicator strain으로 이용하여 sewage 샘플에서 파지 S8을 분리하고, 3차례의 single plaque isolation 단계를 거쳐 파지 S8을 순수 분리 하였다. filter sterilized stock(10¹⁰ PFU/ml 이상)을 SM buffer에 10⁴, 10⁶, 10⁸ 배로 희석하여 dotting assay를 하였고, 총 80종의 salmonella strain에 적용한 host infectivity 시험 결과 30종의 Sal. Gallinarum에서 백신주인 9R를 제외한 나머지 29종의 균에 대해 사멸능이 있는 것으로 나타났고, 30종의 Sal. Typhimurium중 10종을 사멸시킬 수 있으며 20종의 Sal. Enteritidis중 14종을 사멸시킬 수 있는 것으로 나타났다. 그리고 Bacillus 및 E. coli 등 총 45개의 그램 양성과 그램 음성의 표준균주와 분리균주 대상으로 진행하였는데, S8은 Salmonella와 O157을 포함한 특정 E. coli serotype에 대해서만 사멸능을 보였다. positive 결과의 경우 plaque 여부까지 확인하였으나 negative는 희석배수 어디서든 plaque을 볼 수 없었다(표 2, 3).

파지 S8에 저항성을 가지는 Sal. Gallinarum RSG7을 분리하였고, 이를 대상으로 RSG7 사멸 파지 C2를 분리하였다. 위와 같은 방법으로 C2를 이용하여 총 80종의 Salmonella strain에 적용하여서 host infectivity 시험 결과 30종의 Sal. Gallinarum에서 백신주인 9R를 제외한 나머지 29종의 균에 대해 사멸능이 있는 것으로 나타났고, 30종의 Sal. Typhimurium과 20종의 Sal. Enteritidis는 사멸시킬 수 없는 것으로 나타났다. 그리고 Bacillus 및 E. coli 등 총 45개의 그램 양성과 그램 음성의 표준균주와 분리균주 대상으로 진행하였는데, 사멸능을 볼 수 없었다. positive 결과의 경우 plaque 여부까지 확인하였으나 negative는 희석배수 어디서든 plaque을 볼 수 없었다(표 2, 3).

파지 S8과 C2 모두에 저항성을 가지는 Sal. Gallinarum RSG14을 분리하였고, 이를 대상으로 RSG14 사멸 파지 Th1을 분리하였다. 위와 같은 방법으로 Th1을 이용하여 총 80종의 salmonella strain에 적용하여서 host infectivity 시험 결과 30종의 Sal. Gallinarum에서 백신주인 9R를 제외한 나머지 29종의 균에 대해 사멸능이 있는 것으로 나타났고, 30종의 Sal. Typhimurium중 2종을 사멸시킬 수 있으며 20종의 Sal. Enteritidis중 2종을 사멸시킬 수 있는 것으로 나타났다. 그리고 Bacillus 및 E. coli 등 총 45개의 그램 양성과 그램 음성의 표준균주와 분리균주 대상으로 진행하였는데, Th1은 Salmonella와 O157을 포함한 특정 E. coli serotype에 대해서만 사멸능을 보였다. positive 결과의 경우 plaque 여부까지 확인하였으나 negative는 희석배수 어디서든 plaque을 볼 수 없었다(표 2, 3).

Host range analysis

Salmonella indicator		Bacteriophage name
		S8	C2	Th1
SG group	471	+	+	+
	470	+	+	+
	469	+	+	+
	468	+	+	+
	467	+	+	+
	466	+	+	+
	465	+	+	+
	464	+	+	+
	463	+	+	+
	462	+	+	+
	481	+	+	+
	484	+	+	+
	486	+	+	+
	487	+	+	+
	480	+	+	+
	485	+	+	+
	488	+	+	+
	479	+	+	+
	483	+	+	+
	482	+	+	+
	510	+	+	+
	511	+	+	+
	512	-	-	-
	513	+	+	+
	514	+	+	+
	515	+	+	+
	516	+	+	+
	517	+	+	+
	518	+	+	+
	519	+	+	+
ST group	416	+	-	+
	405	+	-	-
	407	+	-	-
	395	-	-	-
	399	+	-	-
	392	+	-	+
	393	+	-	-
	398	+	-	-
	404	+	-	-
	406	+	-	-
	343	+	-	-
	314	-	-	-
	364	-	-	-
	357	-	-	-
	335	-	-	-
	370	-	-	-
	371	-	-	-
	362	-	-	-
	367	-	-	-
	368	-	-	-
	299	-	-	-
	301	-	-	-
	304	-	-	-
	305	-	-	-
	297	-	-	-
	298	-	-	-
	290	-	-	-
	292	-	-	-
	288	-	-	-
	289	-	-	-
SE group	386	-	-	-
	373	+	-	-
	377	+	-	+
	378	+	-	-
	382	+	-	+
	385	+	-	-
	376	+	-	-
	383	+	-	-
	375	-	-	-
	384	-	-	-
	344	+	-	-
	345	+	-	-
	346	+	-	-
	347	-	-	-
	348	-	-	-
	349	+	-	-
	351	+	-	-
	352	+	-	-
	360	+	-	-
	361	-	-	-

Broad host range analysis

	Species		Test Strain	S8	C2	Th1
Gram positive	B. cereus		ATCC 14579	-	-	-
	B. licheniformis		JCM 2505	-	-	-
	B. subtilis		JCM 1465	-	-	-
	B. licheniformis		scc 125037 b123	-	-	-
	Staph aureus		ATCC 14458	-	-	-
	L. monocytogenes		EGDe	-	-	-
	Staph. aureus		ATCC 12600	-	-	-
Gram negative	Salmonella	S. Typhimurium	ATCC 14028	+	-	-
		SG group isolates		29/30	29/30	29/30
		ST group isolates		10/30	0/30	2/30
		SE group isolates		14/20	0/20	2/20
	E. coli	F group isolates		0/16	0/16	1/16
		0157:H7	ATCC 43890	+	-	-
			ATCC 35150	+	-	-
			ATCC 3204-92	+	-	-
			ATCC 43894	-	-	-
			ATCC 43895	-	-	-
			ATCC 43888	-	-	+
		others	011 2ac	+	-	-
			0157-NM-0482	+	-	-
			0167	-	-	-
			01	-	-	-
			0169	-	-	-
			JM 109	-	-	+
			XL-1 BLUE	-	-	+
			BW 25113	-	-	+
			#30 (lab isolates)	-	-	-
			#104 (lab isolates)	-	-	-
			#106 (lab isolates)	-	-	-
	Cronobacter sakazakii		ATCC 29544	-	-	-
	Klebsiella pneumoniae		26-46	-	-	-
	Pseudomonas fluoresens		21-55	-	-	-
	Pseudomonas chloroaphis		18-36	-	ND	ND

<실시예 6> 전자현미경 관찰

CsCl-Purified phage stock과 2% uranyl acetate를 이용해 nagative staning을 진행하였다. Transmission Electron Microscopy (Bio-TEM; Hitachi, Tokyo, Japan)을 이용해 형태학적 특성을 관찰하였다(acceleration voltage of 100kV and 200,000x maganification). S8은 head 직경 92.0 ±2.4 nm(n=5), tail 길이 105.7 ±1.4nm(n=5)이며 바이러스 명명 국제 위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses; ICTV)의 기준에 따르면 형태학상 long contractile tail을 가지고 있는 Caudovirales class의 Ackermannviridae family로 확인되며 tail 끝부분에 bubble-like한 구조가 보인다. 그리고 C2 는 head 직경 112.2 ±3.1nm(n=5), tail 길이 25.8 ±0.3nm(n=5)이며, short noncontractile tail을 가지고 있는 Caudovirales class의 Podoviridae이며, Th1은 head 직경 153.7 ±1.5nm(n=5), tail 길이 376.5 ±0.8nm(n=5)이며, long noncontractile tail을 가지고 있는 Caudovirales class의 Siphoviridae로 확인되었으며, thin tail fiber가 관찰되었다(도 1).

<실시예 7> 일단증식곡선 관찰

Bacterial overnight culture를 준비해 TA broth 20ml에 1% 접종하였다. 약 3시간 배양 시(160rpm, 37℃) OD600가 약 0.3이 되었을 때(4*10⁸cfu/ml) 파지 MOI(multiplicity of infection)를 약 0.01로 접종 하고 5분정도 상온에서 배양한 뒤 원심분리를(26162xg, 5min, 4℃) 진행하였다. 그리고 pellet에 동량의 TA broth를 첨가해 shaking incubator(160rpm, 37℃)에서 배양하며 5-10분 단위로 시료를 채취하여 double agar overlay 방법을 이용해 plaque수를 확인하였다. S8은 Sal. Gallinarum HJL488을 숙주로 이용할 때 infection cycle이 약 60분정도이고, burst size는 약 1,000이다. 그리고 C2는 Sal. Gallinarum RSG7을 숙주로 이용할 때 infection cycle이 약 100분정도이고 burst size는 약 1,230 이며, Th1은 Sal. Gallinarum RSG14을 숙주로 이용할 때 infection cycle이 약 45분정도이고 burst size는 약 360으로 확인되었다 (도 2).

<실시예 8> 제한효소 패턴 분석

Genomic DNA 분리 후, 다양한 제한효소 처리를 통해 digestion pattern 분석하였다. 파지 DNA분리는 filtered PEG sample을 준비해 원심분리(42,748 x g, 2h, 4℃)하고 DNase와 SDS 처리 후 ExgeneTM Cell SV DNA purification kit (GeneAll Biotechnology Co. LTD., Korea)를 이용하여 분리하였고 nanospectrophotometer(BioTek reader; BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT) 로 농도를 확인 하였다. 다양한 제한효소 처리를 통해 digestion pattern을 분석하였다. 제한효소(HincⅡ, PvuⅡ, BamHⅠ, PstⅠ, EcoRⅠ, EcoR Ⅴ, HindⅢ, ClaⅠ, Enzynomics, South Korea) 1 unit과 DNA, buffer, distilled water(d.w)를 섞어서 37℃에서 3시간 동안 배양하였고 0.8% agarose gel에 loading후 EtBr(Ethidium bromide) staining을 이용해 band를 확인 하였다. S8과 C2는 HicII 외의 다양한 제한효소에 저항성을 가지는 것을 확인할 수 있었고, Th1은 EcoRⅠ과 EcoRⅤ에 의해서 digest 되는 것으로 확인되었다 (도 3).

<실시예 9>　SDS-PAGE

파지 CsCl purified 샘플(약 1*10¹¹ PFU/ml)을 이용하여 42,748 x g 로 2시간 동안 원심 분리하였다. 얻은 pellet에 50μl의 sample buffer(10% SDS, 0.5% bromophenol blue, 0.5 M Tris HCl, 25% glycerol, β-mercaptaethanol, pH 6.8)를 넣고 재부유 시킨 후 85℃에서 7분동안 열을 가하였다. 파지 structural protein은 12% SDS PAGE gel에서 분석 하였고 Coomassie brilliant blue R250 (sigma)를 이용해 staining 하였다. S8은 약 43.0Kda외 9개의 구조단백질이 관찰 (약 89.2, 78.5, 73.5, 67.6, 33.5, 28.2, 23.5, 18.0, 2.8Kda) 되었고, C2는 약 37.0Kda외 8개의 구조단백질이 관찰 (약 142.3, 100.0, 72.0, 52.0, 34.8, 29.1, 27.6, 22.5Kda) 되었다. 그리고 Th1은 약 32.2Kda외 6개의 구조단백질이 관찰 (약 115.3, 60.0, 37.0, 35.7, 23.0, 19.8Kda) 되었다. S8의 약 43.0Kda, C2의 약 37.0Kda, Th1의 약 32.2Kda의 구조단백질은 annotaion table과 각각의 유사파지 genome에 비교 해본 결과 각각 Major capsid protein[, Capsid and scaffold, Mature head 기능을 하는 것으로 추정된다 (도 4).

<실시예 10> 액체배지상에서 파지 증식 억제 실험

TA broth 10ml에 Sal. Gallinarum HJL 488 또는 Sal. Gallinarum HJL 512(9R) bacterial overnight culture를 접종(2% inoculum)후 약 3시간 배양(shaking incubator, 160rpm, 37℃)하고 OD600가 0.3정도에 도달했을 때 다양한 MOI(1, 10)으로 3종의 파지 각각(S8, C2, Th1)을 접종하였다. 시료는 매 2시간 마다 1ml씩 취해서 큐벳에 넣고 spectrophotometer(Biochrom Libra S22 Visible Spectrophotometer, USA)로 흡광도를 측정 하였다. S8은 접종 4시간 후 MOI 1과 10의 실험군에서 각각 0.21, 0.19 수준의 OD600 값의 흡광도를 보인 반면 S8을 접종하지 않은 control의 경우 0.8 수준에 도달하였다. 그리고 C2는 접종 2시간 후부터 MOI 1과 10의 실험군 에서 각각 0.02 수준의 상당히 낮은 OD600 흡광도를 보인 반면 C2를 접종하지 않은 control의 경우 OD600가 0.6 수준에 도달하였다. 마지막으로 Th1은 접종 4시간 후 MOI 1과 10의 실험군 에서 각각 0.17, 0.15 수준의 OD600 흡광도를 보인 반면 Th1을 접종하지 않은 control의 경우 OD600가 0.8 수준에 도달하였다. 한편으로 적용한 MOI에서 S8, C2, Th1 각각의 파지 접종 후 각각 6, 21, 9시간 경과 후부터 SG488의 regrowth를 확인할 수 있었다 (도 5).

<실시예 11> 파지 칵테일 효능 실험

액체배지 실험 방법에서는 Sal. Gallinarum HJL 488 overnight culture를 TA broth에 2% inoculum 한 후 OD600값이 약 0.3에 도달 했을 때, 100배 희석해서 3개의 단일 파지와 혼합 파지 조합으로 파지농도를 MOI 1로 접종하였다. sample은 매 2시간 마다 1ml씩 취해서 cuvette에 넣고 spectrophotometer로 OD600값을 측정 하였다. 고체배지 실험 방법에서는 SG488 bacterial overnight culture를 fresh TA media에 2% inoculum 한 후 OD600값이 약 0.3에 도달 하였을 때, 10배 희석해서 3개의 단일 파지와 혼합 파지 조합으로 파지농도를 MOI 1로 한 후 double agar overlay 방법을 이용해 20시간 배양하고 그 위에 자란 저항성 colony의 개수를 측정하였다. 액체배지 실험에서는 S8, S8+Th1, Th1 군은 접종 후 8시간 후에 OD600 값이 각각 0.20, 0.24, 0.19로 SG488의 regrowth가 시작됨을 확인 할 수 있었고, S8+C2, C2는 접종 후 16시간에 OD600 값이 각각 0.33과 0.61로 증가하였다가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. C2+Th1 은 OD600 값이 0.00~0.06 사이를 유지하였다. 마지막으로 3개 조합인 S8+C2+Th1은 접종 후 24시간까지 OD600값을 0.00을 유지 하는 것을 알 수 있었다(도 6). 고체배지 실험방법에서도 유사한 결과가 나왔는데, 실험 후 20시간 후 최종 regrowth된 colony 수는 S8, S8+Th1, Th1 군에서는 too numerous to count(TNTC), S8+C2, C2는 각각 평균 103.60, 130, C2+Th1는 9.60, 3개 조합인 S8+C2+Th1에서는 10.80 개의 colony를 확인 할 수 있었다(도 7). 이러한 결과들은 3종의 파지를 cocktail로 적용 시 가장 좋은 Sal. Gallinarum 증식 억제능을 보이며, 3종의 파지들이 증식억제에서 서로 상보적으로 작용함을 보여주는 결과들이다.

<실시예 12> whole genome sequencing

12-1. S8 whole genome sequencing

Genomic DNA를 이용하여서 whole genome sequencing (Macrogen Inc., South Korea)을 진행하였다. PacBio RS System(Pacific Biosciences, California, USA)을 사용하였고, depth of coverage는 1,282x 이다. Open reading frames(ORF)찾기는 RAST 2.0, Glimmer 3.02, ORF finder를 사용 하였고, functional annotation은 BLASTP(NCBI) 프로그램을 이용하였다. tRNA 유전자를 찾기 위해 ARAGORN v1.2.36을 사용하였다. Functionally annotated 된 ORFs 를 이용하여 CGview 프로그램으로 Circular form을 만들었고, Easyfig 프로그램으로 다른 파지 genome과의 유사성을 비교 하였다. S8의 classification은 ICTV(International Committte on Taxonomy)의 Ackermannviridae에 속한 다른 파지들과 CoreGenes, Gegenees 프로그램을 통해 분석 하였고 phylogenetic tree는 Phylogeny.fr의 "one click" 프로그램을 통해서 구성하였다. S8의 whole genome sequence는 GenBank에 deposit 하였다(Accession number KY630163). S8은 158,432bp의 Length와 44.5%의 GC content를 가지고 있다. Total read는 512,348bp 이며 coverage graph 상으로는 중간에 gap이 없으며 전체적으로 duplication이 없어서 high coverage를 보이지는 않고 있다. 그로 인해 repeat sequence를 보유하지 않는 구조를 이루는 것으로 판단 되며 총 208개의 ORF(134개 forward strand, 69 reverse strand)와 5개의 tRNA를 가지고 있다. BLASTP 프로그램을 바탕으로 하여서 5개의 functionally annotated group으로 나누었다. [host infection(Phage tail fibers), phage structual protein(baseplate wedge subunit, tail sheath protein, major head protein), host lysis(Cell wall-associated hydrolases), replication and transcription of DNA (Ribonuclease HI, Gp55 T4-like sigma factor involved in late, Phage-associated DNA primase, Ribonucleotide reductase of class Ia, Single stranded DNA-binding protein, Thymidylate synthase, DNA ligase, Phage-associated homing endonuclease, putative serine/threonine protein phosphatase, dexA exonuclease, terminase DNA packaging enzyme large, Sliding clamp DNA polymerase accessory protein, Phage endoribonulcease translational repressor)and other funtions(Phosphate starvation-inducible protein PhoH_, dCMP deaminase, Phage virulence-associated VriC protein, Phage rIIA lysis inhibitor )](표 4).

Functional grouping of annotated ORFs in the bacteriophage S8

Functional Group	ORF	Putative function	%Identity(Blastn)	Homologous Phage (Protein Accession No.)
host infection	153	Phage tail fibers	99%	Cba120(YP_004957867.1)
phage structual protein	42	baseplate wedge subunit	100%	Cba120(YP_004957774.1)
	166	tail sheath protein	99%	Cba120(YP_004957855.1)
	174	major head protein	99%	Det7(YP_009140190.1)
host lysis	43	Cell wall-associated hydrolases	98%	38(YP_009220929.1)
replication and transcription of DNA	12	Ribonuclease HI	99%	PhiSH19(YP_007008063.1)
	13	Gp55 T4-like sigma factor involved in late	99%	PhiSH19(YP_007008061.1)
	27	Phage-associated DNA primase	99%	vB_SalM_SJ3(YP_009030328.1)
	35	Ribonucleotide reductase of class Ia	99%	Cba120(YP_004957779.1)
	52	Single stranded DNA-binding protein	99%	Cba120(YP_004957765.1)
	59	Thymidylate synthase	94%	Marshall(YP_008771765.1)
	74	DNA ligase	99%	PhaxI(YP_007002682.1)
	82	Phage-associated homing endonuclease	99%	Det7(YP_009140307.1)
	90	putative serine/threonine protein phosphatase	98%	Cba120(YP_004957729.1)
	94	dexA exonuclease	99%	Cba120(YP_004895191.1)
	165	terminase DNA packaging enzyme large	99%	ViI(YP_004327532.1)
	191	Sliding clamp DNA polymerase accessory protein	99%	PhiSH19(YP_007008088.1)
	195	Phage endoribonulcease translational repressor	83%	Ag3(YP_003358624.1)
other funtions	34	Phosphate starvation-inducible protein PhoH_	100%	Ag3(YP_007002723.1)
	85	dCMP deaminase	100%	Cba120(YP_004957733.1)
	157	Phage virulence-associated VriC protein	99%	Cba120(YP_004957863.1)
	113	Phage rIIA lysis inhibitor	99%	PhaxI(YP_007002641.1)

S8 full genome sequence를 이용하여서 다른 sequence와의 alignment를 통해 blast search를 한 결과 전체 genome sequence 수준에서 높은 상동성을 보이는 유사파지들(Salmonella phage SFP10, Escherichia phage vB_EcoM_CBA120, Salmonella phage vB_SalM_SJ3, Salmonella phage Det7, Salmonella phage 38, Salmonella phage Vi01)이 보고되었고, EasyFig를 이용해 S8과 유사 파지를 nucleotide 수준에서 유사성이 떨어지는 부분을 서로 비교한 결과 지금까지 발표된 파지와는 다른 strain임을 확인할 수 있었다. 또한 Blast 분석을 통해 S8은 integrase 등의 lysogeny control region을 보유하고 있지 않으므로 virulent phage인 것으로 보이며 항생제 저항성과 병원성에 관여 하는 것으로 알려진 유전자와 유사한 유전자가 확인 되지 않는 것을 알 수 있었다. Amino acid sequences를 이용한 Gegenees 프로그램(도 8)과 Phylogenetic tree Classification의 DNA ligase 측면에서 봤을 때 S8을 다른 bacteriophage와 구분 지을 수 있었다.

12-2 C2 whole genome sequencing

Genomic DNA를 이용하여서 whole genome sequencing (Macrogen Inc., South Korea)을 진행하였다. MiSeq System (Illumina, San Diego, USA)을 사용하였고 depth of coverage는 357x 이다. Open reading frames(ORF)찾기는 RAST2.0, ORF finder, Genmark를 사용 하였고, functional annotation은 BLASTP(NCBI) 프로그램을 사용하였다. Functionally annotated 된 ORFs 를 이용하여 CGview 프로그램으로 Circular form을 만들었고, Easyfig 프로그램으로 다른 파지 genome과의 유사성을 비교 하였다. C2의 classification은 ICTV(International Committte on Taxonomy)의 Podoviridae에 속한 다른 파지들과 CoreGenes, Gegenees 프로그램을 통해 분석 하였고 phylogenetic tree는 MEGA7 프로그램을 통해서 구성하였다. C2는 38,554 bp의 length와 48.91%의 G + C 함량을 가진다. Total read는 13,747,478bp 이며 coverage graph 상으로는 300bp(4874-5177bp)의 direct terminal repeat sequence를 가지고 있다. 총 47개의 ORF(47개 forward strand)가 예측되었고 tRNA를 가지고 있지 않다. BLASTP 프로그램을 바탕으로 하여서 5개의 functionally annotated group으로 나누었다. [host infection(tail fiber protein, host range protein and tail tubular protein A,B), phage structual protein(internal virion protein A,B,C,D, head-to-tail joining protein, capsid and scaffold and minor capsid protein), host lysis(class Ⅱ holin, endopeptidase, dGTP triphosphohydrolase inhibitor and bacterial RNA ploymerase inhibitor), replication and transcription of DNA (T7-like DNA polymerase, helicase, exonuclease, single-strand DNA-binding protein, DNA ligase, Host recBCD nuclease inhibitor, HNS binding protein, DNA-directed RNA polymerase, DNA packaging protein)and other funtions(protein kinase, protein 0.3, YALI0F13211p)](표 5).

Functional grouping of annotated ORFs in the bacteriophage C2

Functional Group	ORF	Putative function	%Identity(Blastn)	Homologous Phage (Protein Accession No.)
tail sturcture for host infection	ORF1	tail fiber protein	73%	SH2(YP_009289339.1)
	ORF41	tail tubular protein A	99%	CICC80001(YP_009152495.1)
	ORF42	tail tubular protein B	96%	EG1(ATW57752.1)
	ORF35	host range protein	96%	phiA1122(NP_848291.1)
phage structual protein	ORF43	internal virion proteinA	99%	T7(NP_042001.1)
	ORF44	internal virion proteinB	96%	EG1(ATW57752.1)
	ORF45	internal virion proteinC	99%	T7(NP_042003.1)
	ORF46	internal virion proteinD (Ⅰ)	98%	Y(AGC35501.1)
	ORF47	internal virion protein D (Ⅱ)	97%	T7(NP_042004.1)
	ORF37	head-to-tail joining protein	98%	CICC80001(YP_009152491.1)
	ORF38	capsid and scaffold	99%	64795_ec1(YP_009291508.1)
	ORF40	capsid and scaffold protein	88%	YP_009152494.1
	ORF36	minor capsid protein	93%	T7(NP_041997.1)
host lysis	ORF2	class Ⅱ holin	96%	64795_ec1(YP_009291520.1)
	ORF22	lysin,N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase	99%	64795_ec1(YP_009291491.1)
	ORF4	endopeptidase	97%	64795_ec1(YP_009291522.1)
	ORF13	dGTP triphosphohydrolase inhibitor	71%	T7(NP_041962.1)
	ORF19	bacterial RNA ploymerase inhibitor	100%	T7(NP_041969.1)
replication and transcription of DNA	ORF27	T7-like DNA polymerase	99%	YpsP-G(AFK13511.1)
	ORF23	helicase	99%	T7(NP_041977.1)
	ORF31	exonuclease	99%	YpsP-G(AFK13515.1)
	ORF21	endonuclease	98%	phiA1122(NP_848275.1)
	ORF20	single-strand DNA-binding protein	99%	T7(NP_041970.1)
	ORF14	DNA ligase	88%	T7(NP_041963.1)
	ORF30	Host recBCD nuclease inhibitor	96%	T7(NP_041987.1)
	ORF28	HNS binding protein	66%	E-2(YP_009226192.1)
	ORF11	DNA-directed RNA polymerase	99%	YpP-R(AFK13398.1)
	ORF3	DNA packaging protein	99%	EG1(ATW57757.1)
	ORF5	DNA packaging	99%	YpP-R(AFK13442.1)
other funtions	ORF10	protein kinase	89%	CICC80001(YP_009152464.1)
	ORF6	protein 0.3	92%	YpP-Y(AFK13391.1)

C2 full genome sequence를 이용하여서 다른 sequence와의 alignment를 통해 blast search를 한 결과 전체 genome sequence 수준에서 높은 상동성을 보이는 유사파지들(Enterobacteria phage T7, Escherichia phage CICC 80001, Escherichia phage 64795_ec1, Enterobacteria phage 13a, Yersinia phage phiA1122, Salmonella phage Vi06) 이 보고되었고, EasyFig를 이용해 C2와 유사 파지를 nucleotide 수준에서 유사성이 떨어지는 부분을 서로 비교한 결과 지금까지 발표된 파지와는 다른 strain임을 확인할 수 있었다. C2는 전체적으로 T7과 높은 유사성(84.6%의 total identity using BLASTN), tail fiber protein(ORF1)에서는 T7에 대해 9%의 total identity를 갖는다. 반면에, Salmonella phage JL2 및 Citrobacter phage SH2의 전체 genome에 대해 각각 72%의 total identity를 갖지만, tail fiber protein(ORF1)에서는 JL2 및 SH2에 대해 각각 30 % 및 28 %의 total identity를 가지고 있다. 파지 genome은 universal mosaicism를 보여 주며, 근본 원인으로 수평 유전자 전달은 파지 genome 진화에 중요한 역할을 하였다고 여겨진다. 이 바이러스 군의 진화는 숙주 범위 돌연변이의 초기 획득이며 새로운 숙주 세포 환경의 유전적 조절이 뒤 따른다. 따라서 파지 C2 게놈은 수평 유전자 교환으로 인한 모자이크를 보여줌을 추측 할 수 있으며 진화 과정을 설명하는 데 중요한 역할을 하고 있다. C2 amino acid sequences를 이용한 Gegenees 프로그램(도 8)과 Phylogenetic tree Classification의 RNA Polymerse 측면에서 봤을 때 C2를 다른 bacteriophage와 구분 지을 수 있었다.

12-3. Th1 whole genome sequencing

Genomic DNA를 이용하여서 whole genome sequencing (Macrogen Inc., South Korea)을 진행하였다. MiSeq System (Illumina, San Diego, USA)을 사용하였고 depth of coverage는 131x 이다. Open reading frames(ORF)찾기는 RAST2.0, ORF finder, Genmark를 사용 하였고, functional annotation은 BLASTP(NCBI) 프로그램을 사용하였다. tRNA 유전자를 찾기 위해 ARAGORN v1.2.36을 사용하였다. Functionally annotated 된 ORFs 를 이용하여 CGview 프로그램으로 Circular form을 만들었고, Easyfig프로그램으로 다른 파지 genome과의 유사성을 비교 하였다. Th1의 classification은 ICTV(International Committte on Taxonomy)의 Siphoviridae에 속한 다른 파지들과 CoreGenes, Gegenees 프로그램을 통해 분석 하였다. Th1은 110,466bp의 Length와 39.21%의 GC content를 가지고 있으며, total read는 14,519,022bp 이다. 총 142개의 ORF(41개 forward strand, 101 reverse strand)와 21개의 tRNA를 가지고 있다. BLASTP 프로그램을 바탕으로 하여서 5개의 functionally annotated group으로 나누었다. [host infection(tail fiber protein, tail fibers protein 1,2, putative phage tail protein, tail protein Pb3, 4, minor tail protein, major tail protein, putative tail protein), phage structual protein(major head protein precursor, putative prohead protease, portal protein), host lysis(endolysin, holin, cell wall hydrolase SleB), replication and transcription of DNA(homing endonuclease, H-N-H-endonuclease F-TflV, DNA ligase, putative replicative DNA helicase, putative DNA replication primase, DNA polymerase, putative ATP-dependent helicase, terminase large subunit)and other funtions(receptor-binding protein, receptor-blocking protein)](표 6).

Functional Group	ORF	Putative function	%Identity(Blastn)	Homologous Phage (Protein Accession No.)
host infection	72	tail fiber protein	99%	T5-like chee24(ASU01536.1)
	119	tail fibers protein 1	97%	vB_SenS_PHB06(AVQ09853.1)
	120	tail fibers protein 2	98%	vB_SenS_PHB06(AVQ09852.1)
	121	putative phage tail protein	100%	SPC35(YP_004306607.1)
	122	tail protein Pb4	100%	SPC35(YP_004306608.1)
	123	tail protein Pb3	99%	SPC35(YP_004306609.1)
	128	minor tail protein	100%	SPC35(YP_004306614.1)
	129	major tail protein	99%	SPC35(YP_004306615.1)
	134	putative tail protein	100%	SPC35(YP_004306621.1)
phage structual protein	133	major head protein precursor	100%	SPC35(YP_004306619.1)
	134	putative prohead protease	100%	SPC35(YP_004306620.1)
	136	portal protein	100%	SPC35(YP_004306622.1)
host lysis	31	endolysin	99%	Stp1(ARQ96246.1)
	32	holin	100%	Shivani(YP_009194686.1)
	70	cell wall hydrolase SleB	100%	AKFV33(YP_006382380.1)
replication and transcription of DNA	22	homing endonuclease	74%	SP01(ATI99492.1)
	40	H-N-H-endonuclease F-TflV	64%	T5(YP_006879.1)
	104	DNA ligase	99%	vB_SenS_PHB06 (AVQ09870.1)
	107	putative replicative DNA helicase	99%	AKFV33(YP_006382421.1)
	108	putative DNA replication primase	100%	SPC35(YP_004306594.1)
	109	DNA polymerase	100%	SPC35(YP_004306595.1)
	111	putative ATP-dependent helicase	100%	SPC35(YP_004306597.1)
	138	terminase large subunit	100%	SPC35(YP_004306624.1)
other funtions	140	receptor-binding protein	100%	SPC35(YP_004306626.1)
	141	receptor-blocking protein	100%	AKFV33(YP_006382458.1)

Th1 full genome sequence를 이용하여서 다른 sequence와의 alignment를 통해 blast search를 한 결과 전체 genome sequence 수준에서 높은 상동성을 보이는 유사파지들 (Enterobacteria phage SPC35, Salmonella phage NR01, Enterobacteria phage DT57C, DT571/2, Escherichia phage bV_EcoS_AKFV33)이 보고되었고, EasyFig를 이용해 Th1과 유사 파지를 nucleotide 수준에서 유사성이 떨어지는 부분을 서로 비교한 결과 지금까지 발표된 파지와는 다른 strain임을 확인할 수 있었다. 그리고 Th1 amino acid sequences를 이용한 Gegenees 분석을 통해 Th1을 다른 bacteriophage와 구분 지을 수 있었다(도 8).

<실시예 13> 배양조건 최적화

Liquid culture 방법을 이용 하였으며, S8은 37℃, TA broth, MOI 1, 5, 10 조건에서, Th1는 37℃, TA broth, MOI 0.1, 1, 5 조건 에서, C2는 30℃와 37℃ LB, TA, TSB, BHI broth, MOI 0.1, 1, 5 조건에서 배양(shaking incubator, 160rpm, 37℃)하였다. S8은 37℃ TA MOI 10조건에서 7-8*10¹⁰ pfu/ml 정도의 titer를 얻었고, C2는 37℃ TA MOI 5조건 에서 5-6*10¹⁰pfu/ml 정도의 titer를 얻을 수 있었다. 그리고 Th1은 37℃ TA MOI 1조건에서 1-2* 10¹¹ pfu/ml정도의 titer를 얻을 수 있었다 (표 7)

phage name	volume(ml)	culturing temperature (℃)	culture	inoculation OD	MOI	time after inoculation(h)	OD after inoculation	titer(PFU/ml)
S8	20	37	TA	0.231	1	6	0.165	5.25*1010
				0.258			0.198	5.65*1010
				0.244			0.212	5.05*1010
				0.233			0.207	4*1010
				0.128			0.089	3.35*1010
				0.422		8	0.318	6.35*1010
				0.122			0.318	4.35*1010
				0.409		4	0.353	7.85*1010
	500			0.155	5	6	0.161	4*1010
	20			0.243			0.156	5*1010
				0.218			0.129	3*1010
				0.158			0.104	3*1010
				0.163			0.124	3*1010
				0.215			0.091	3.7*1012
				0.219			0.143	5.8*1010
				0.271			0.193	6.75*1010
				0.230			0.150	5*1010
				0.249			0.175	6.35*1010
				0.120			0.128	3*1010
				0.408			0.305	1.01*1011
				0.118		8	0.285	4*1010
				0.393		4	0.284	7.65*1010
				0.239	10	4	0.196	3.2*1010
				0.293		6	0.261	5.95*1010
				0.228			0.166	4.5*1010
				0.276			0.273	3.8*1010
				0.133			0.170	3.7*1010
				0.457			0.284	7.8*1010
				0.126		8	0.322	4.8*1010
				0.420		4	0.262	8.5*1010
C2	10	30	LB	0.309	0.1	4	0.023	6.53*1010
					1		0.020	7.76*1010
					10		0.049	6.00*1010
			TA	0.315	0.1		0.018	1.18*1011
					1		0.011	9.33*100
					10		0.012	7.16*1010
			TSB	0.323	0.1		0.011	5.36*1010
					1		0.010	6.60*1010
					10		0.008	4.33*100
			BHI	0.320	0.1		0.006	6.03*100
					1		0.001	7.23*1010
					10		0.006	2.80*1010
		37	LB	0.307	0.1		0.075	3.83*1010
					1		0.045	3.13*1010
					10		0.056	3.76*1010
			TA	0.311	0.1		0.040	3.80*1010
					1		0.012	4.00*1010
					10		0.016	5.83*1010
			TSB	0.317	0.1		0.020	2.73*1010
					1		0.010	2.46*1010
					10		0.013	2.56*1010
			BHI	0.313	0.1		0.031	5.06*1010
					1		0.016	5.16*1010
					10		0.014	5.93*1010
Th1	10	37	TA	0.301	0.1	4	0.196	1.75*1011
				0.306			0.269	1.63*1011
				0.403		6	0.226	2.20*1011
				0.409			0.263	2.15*1011
				0.301		4	0.258	2.09*1011
				0.306			0.227	1.66*1011
				0.403		6	0.243	1.90*1011
				0.409			0.241	1.95*1011
				0.301	1	4	0.142	1.76*1011
				0.306			0.125	1.35*1011
				0.403		6	0.136	1.39*1011
				0.409			0.175	1.39*1011
				0.301		4	0.257	1.48*1011
				0.306			0.211	1.57*1011
				0.403		6	0.201	2.23*1011
				0.409			0.213	2.31*1011
				0.301	5	4	0.154	1.22*1011
				0.306			0.157	1.03*1011
				0.403		6	0.215	1.63*1011
				0.409			0.222	1.58*1011
				0.301		4	0.336	1.12*1011
				0.306			0.300	1.29*1011
				0.403		6	0.366	1.18*1011
				0.409			0.359	1.47*1011

<실시예 14> 안정성 실험

Filter sterilized stock, PEG precipitation, 초원심 분리를 이용한 CsCl-gradient , dialysised CsCl의 sample 형태를 준비하고 보존온도는 room temperature, 4℃, -80℃(deep freezer), -196℃(liquid nitrogen)로 설정하였고, 50μl 씩 분주해 조건에 따라 보관하였다. -80℃(deep freezer), -196℃(liquid nitrogen) 조건에서는 동결 보존제 첨가를 하지 않은군, 동결보존제(glycerol, DMSO)를 첨가한 군으로 나뉘며 동결보존제는 각각 10, 25, 50%로 첨가하였다. 그리고 보관 후 60일, 120일, 240일 단위로 파지 survival rate를 확인하였다.

14-1. S8 안정성 실험

실온에서는 240일 동안 4개의 샘플(filter sterilized stock, PEG precipitation, CsCl-gradient, dialysised CsCl)이 0.6~1log PFU/ml값이 감소하였고, 4℃에서 진행한 실험에서는 0.2~0.9log PFU/ml값이 감소하였다. -80℃에서는 전체적으로 동결보존제 첨가군 중에서는 DMSO 10% 첨가한 샘플이 2.6~9.1log PFU/ml 정도로 높은 감소값을 보였고 샘플 형태중에서는 CsCl 샘플이 6.0~9.1log PFU/ml 정도의 높은 감소값을 나타내었다. -196℃에서는 CsCl 샘플이 0.8~4.1log PFU/ml 정도로 감소한 반면에 다른 조건에서는 0.09~2.5log PFU/ml 정도의 감소를 보였다(도 9 내지 13).

14-2. C2 안정성 실험

실온에서는 240일 동안 4개의 샘플(filter sterilized stock, PEG precipitation, CsCl-gradient , dialysised CsCl)이 0.9~3log PFU/ml값이 감소하였고, 4℃에서 진행한 실험에서는 0.2~1.4log PFU/ml값이 감소하였다. -80℃에서는 Dialysised CsCl 샘플이 0.3~2.3log PFU/ml 정도의 감소값을 나타낸 반면, 다른 군에서는 0.1~1.1log PFU/ml 정도의 감소값을 나타냄을 확인하였다. -196℃에서는 전체적으로 0.2~1.2log PFU/ml 정도의 감소값을 보였다(도 9 내지 13).

14-3. Th1 안정성 실험

실온에서는 240일 동안 4개의 샘플(filter sterilized stock, PEG precipitation, CsCl-gradient , dialysised CsCl)이 1.2~3.1log PFU/ml값이 감소하였고, 4℃에서 진행한 실험에서는 0.5~0.8log PFU/ml값이 감소하였다. -80℃에서는 전체적으로 0.06~1.4log PFU/ml 정도의 감소값을 나타내었고, -196℃에서는 전체적으로 0.1~0.7og PFU/ml 정도의 감소값을 보였다(도 9 내지 13).

<실시예 15> 동물실험

11주령인 갈색 산란계(hyline brown, 조인주식회사 부화장, 평택시)를 가지고 Control(대조군, 파지 없는 음수 공급, 도전감염), P5-1(파지 저농도[2*10⁵ PFU/ml] 공급, 도전감염, 직후 파지 투여), P5-2(파지 저농도 공급, 도전감염), P7-1(파지 고농도[2*10⁷ PFU/ml] 공급, 도전감염), P7-2(파지 고농도[권장량 100배] 공급, 도전감염, 직후 파지 투여), NC(대조군, 파지와 균 모두 공급하지 않음), PNC1(파지 저농도 공급, 도전감염 없음), PNC2(파지 고농도 공급, 도전감염 없음)의 7 그룹으로 나누고 실험을 진행 하였다(표 8). 파지는 S8과 C2 1:1 혼합 제품을 사용 하였고, 공격주로는 Salmonella Gallinarum, HJL465를 사용 하였다. 공격 접종 농도는 1 x 10^{^7} cfu/수, 공격접종 경로는 PO (경구)로 하였다. 접종 후 2주간 관찰한 후 폐사율, 분변 내 파지 배출 농도를 확인 하였다.

생존율(%) 결과를 보면 NC(대조군, 파지와 Sal. Gallinarum 모두 공급하지 않음), PNC1(파지 권장량[2*10⁵ PFU/ml] 공급, Sal. Gallinarum 도전감염 없음), PNC2(파지 고농도[권장량 100배] 공급, Sal. Gallinarum 도전감염 없음)군의 경우 100%의 생존율을 보였으나 Control(대조군, 파지 없는 음수 공급, 도전감염)군의 경우 공격 접종 12일 후 0%의 생존율을 보였다. P7-1(파지 고농도[2x10⁷ pfu/ml] 공급, 도전감염)군의 경우 공격접종 14일 후 50%의 생존율을 보였고 P5-1(파지 저농도[2x10⁵ pfu/ml] 공급, 도전감염, 직후 파지 투여)과 P7-2(파지 고농도 공급, 도전감염, 직후 파지 투여)은 각각 공격접종 14일 후 20%의 생존율을 보였다. 그리고 P5-2(파지 저농도 공급, 도전감염)의 경우에는 공격접종 14일 후 10%의 생존율을 보였다(표 8).

Survival rate about challenge in chicken

	Group	Phage treat(pfu/ml)	SG challenge (cfu/수)	Number of chichens	공격 접종 후 관찰 (폐사 개체 수) (도전감염 : 11/10)
					01월 05일	6	7	8	9	10	11	12	13	14	생존율(%)
1	P5-1	2x105	1x107	10	0	2	1	3	0	0	1	1	0	0	20
2	P5-2	2x105	1x107	10	0	2	3	3	0	0	0	0	1	0	10
3	P7-1	2x107	1x107	10	0	0	0	3	1	0	0	0	0	1	50
4	P7-2	2x107	1x107	10	0	0	0	4	3	0	1	0	0	0	20
5	Con.	-	1x107	10	0	1	3	2	0	2	0	2	0	0	0
6	NC	-	-	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
7	PNC1	2x105	-	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
8	PNC2	2x107	-	10	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
	총				80마리

상태지수화(0;건강. 활발, 서서 돌아다님, 활기참, 건강, 사료.물 섭취 적극적, 1;가만히 서 있는 편, 움직임 적음, 음수 섭취량 감소, 2;서 있음, 깃털 부풀림, 졸음, 3;구석에 앉아있음, 깃털 부풀리고 있음, 4;졸음, 움츠리고 앉아있음, 자극에 반응 거의 없음, 5;침울, 구석에 웅크리고 앉아있음, 자극에 반응 없음, 6;폐사)의 결과를 보면 Control(대조군, 파지 없는 음수 공급, 도전감염)군의 경우 6의 지수를 보였고, P7-1(파지 고농도 공급, 도전감염)군의 경우 3, P5-1(파지 저농도 공급, 도전감염, 직후 파지 투여)과 P7-2(파지 고농도 공급, 도전감염, 직후 파지 투여)은 각각 약 5 그리고 P5-2(파지 저농도 공급, 도전감염)의 경우에는 5.5의 지수를 나타냈다(도 14). 분변 내 파지 배출 농도는 P7그룹(1.51~6.27log PFU/g)이 P5그룹(0~3.39log PFU/g)에 비하여 대체로 높은 결과를 내었음을 알 수 있었다(도 15).

[수탁 번호]

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC18535P

수탁일자 : 20161228

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13874BP

수탁일자 : 20190628

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC13875BP

수탁일자 : 20190628

Claims (10)

1. 항균 활성을 가지는 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP).
2. 제 1항에 있어서, 상기 박테리오파아지 C2는 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에 대하여 항균 활성을 가지는, 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP).
3. 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는, 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물에 박테리오파아지 Th1 (기탁번호 KCTC13874BP) 또는 박테리오파아지 S8 (기탁번호 KCTC18535 P)를 추가로 더 포함하는, 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 제 3항에 있어서, 상기 조성물에 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생균 백신을 추가로 더 포함하는, 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)의 생균 백신은 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum) 9R인, 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
7. 제 3항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 닭, 오리, 칠면조, 매추리, 물새, 비둘기, 카나리아 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 가금에 효과가 있는, 가금티푸스 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 박테리오파아지 C2 (기탁번호 KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
9. 제 8항에 있어서, 상기 사료 첨가제에 박테리오파아지 S8(KCTC18535P) 또는 박테리오파아지 Th1(기탁번호 KCTC13874BP)를 추가로 더 포함하는, 가금티푸스의 예방 또는 개선용 사료 첨가제.
10. 박테리오파아지 C2(KCTC13875BP)를 포함하는 가금티푸스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 가금티푸스의 예방 또는 치료 방법.

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