CN101861387A

CN101861387A - 新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

Info

Publication number: CN101861387A
Application number: CN200980000314A
Authority: CN
Inventors: 姜寅惠; 朴敏兑; 赵英郁; 崔香; 申秀安
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2009-08-17
Publication date: 2010-10-13
Anticipated expiration: 2029-08-17
Also published as: MY143179A; BRPI0902902A2; WO2010064772A1; US20100135962A1; JP2011509653A; JP5079885B2; CN101861387B; US8148131B2; KR20100062734A; KR101070938B1

Abstract

本发明涉及新型噬菌体，更具体地，本发明涉及对引起禽伤寒的鸡沙门氏菌(SG)和引起鸡白痢的鸡白痢沙门氏菌(SP)具有特异杀菌活性的噬菌体。另外，本发明还涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的组合物，其用于预防或治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病。另外，本发明还涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的家畜饲料和饮用水、消毒剂和清洁剂。

Description

新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

技术领域

本发明涉及新型噬菌体，更具体地，本发明涉及对引起禽伤寒(FowlTyphoid)的鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum，SG)和引起鸡白痢(Pullorumdisease)的鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum，SP)具有特异杀菌活性的噬菌体。另外，本发明还涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的组合物，其用于预防或治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(infectiousdiseases)。另外，本发明还涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的用于家畜的饲料和饮用水、消毒剂和清洁剂。

背景技术

沙门氏菌是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的一个属，其特征为革兰氏阴性、兼性厌氧、无芽孢形成、杆状细菌且大多数菌株均通过鞭毛活动。沙门氏菌基因组的平均GC含量为50-52％，这与大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella)相似。沙门氏菌属是在家畜和人中引起传染的病原微生物。作为沙门氏细菌的一种，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)具有多个血清型，包括沙门氏菌鸡血清型(Salmonella Gallinarum)、沙门氏菌鸡白痢血清型(Salmonella Pullorum)、沙门氏菌鼠伤寒血清型(Salmonella Typhimurium)、沙门氏菌肠炎血清型(Salmonella Enteritidis)、沙门氏菌伤寒血清型(SalmonellaTyphi)、沙门氏菌猪霍乱血清型(Salmonella Choleraesuis)和沙门氏菌德尔卑血清型(Salmonella derby)(Bopp CA，Brenner FW，Wells JG，Strokebine NA.Escherichia，Shigella，Salmonella.In Murry PR，Baron EJ，et al eds Manual ofclinical Microbiology.7th ed.Washington DC American Society forMicrobiology 1999；467-74；Ryan KJ.Ray CG(editors)(2004)。其中，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritis)是人和动物二者的病原体，伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)是特异于人的病原体，猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)和德尔卑沙门氏菌(Salmonelladerby)是特异于猪的病原体，鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌是特异于禽的病原体。所述各种血清型都会在相应的物种中引起疾病，对农民和/或消费者产生严重的不良影响。

由沙门氏菌引起的家禽疾病为禽伤寒(FT)，其由鸡沙门氏菌(下文称为SG)病原体引起。禽伤寒(FT)是家禽(如鸡和鸭)的败血症，其病程可能为急性或慢性的，并伴有高死亡率。最近报道禽伤寒常常发生在欧洲、南美洲、非洲和东南亚，并且其破坏性逐渐增加。韩国自1992年开始有FT爆发的报道，FT在褐色蛋鸡中引起的经济损失非常严重(Kwon Yong-Kook.2001 annualreport on avian diseases.information publication by Naional Veterinary Research& Quarantine Service.March，2001；Kim Ae-Ran et al.，The prevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4)：347～353)。鸡白痢也是由一种沙门氏细菌，即鸡白痢沙门氏菌(下文称为SP)引起的。鸡白痢发生在任何年龄或季节，但雏鸡特别容易感染此病。上世纪期间，鸡白痢是通过鸡蛋在世界和韩国的1-2周龄或更年幼雏鸡中传播的严重疾病。在上世纪八十年代，其发病率急剧降低。然而，在九十年代其发病率又开始增加。

在韩国，禽伤寒和鸡白痢的爆发从上世纪九十年代开始增加，给农民造成了经济损失。为此，尽管其功效尚不确定，但已经从2004年开始在用于烤焙的鸡(broiler)中使用减毒活SG疫苗以预防禽伤寒(Kim Ae-Ran et al.，Theprevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parentstock in Korea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4)：347～353)，然而由于存在由鸡蛋传播传染病的风险，不允许活疫苗用于蛋鸡。遗憾的是，与禽伤寒不同，对于鸡白痢仍没有在商业上可行的预防策略。因此，迫切需要预防禽伤寒和鸡白痢的新方法。

噬菌体是仅感染并破坏细菌，并且仅能在宿主细菌内进行自我复制的一种特殊类型的病毒。噬菌体由被蛋白质外壳包围的核酸遗传物质(单链或双链DNA或RNA)构成。噬菌体有三种基本的结构类型：有尾部的二十面头部、无尾部的二十面头部和丝状体。根据其形态结构和遗传物质对噬菌体进行分类。根据其尾部结构，具有二十面体头部和作为遗传物质的线状双链DNA的噬菌体被分成三个科：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)和短尾噬菌体科(Podoviridae)，其特征分别在于收缩性尾部、无收缩性的长尾和无收缩性的短尾。可以根据其头部形状和成分以及外壳的存在对具有无尾部的二十面体头部和并以RNA或DNA为遗传物质的噬菌体进行分组。根据其大小、形状、外壳和细丝(filament)成分对以DNA为其遗传物质的丝状噬菌体进行分组(H.W.Ackermann.Frequency of morphologicalphage descriptions in the year 2000；Arch Virol(2001)146：843-857；ElizabethKutter et al.Bacteriophages biology and application；CRC press)。在感染过程中，噬菌体附着在细菌上，并将其遗传物质注入到所述细胞中。之后，噬菌体进入两个生命周期之一：裂解性或溶源性周期。裂解性噬菌体接管所述细胞的运转以制备噬菌体组分，然而使细胞破裂或裂解，以释放新的噬菌体颗粒。溶源性噬菌体将其核酸并入到宿主细胞的染色体中，将其作为一个单元进行复制，而不破坏所述细胞。在某种情况下，溶源性噬菌体可以被诱导进入裂解周期(Elizabeth Kutter et al.Bacteriophages biology and application；CRCpress)。

在发现噬菌体后，人们最初对于其在传染病治疗中的应用给予了极大地信心。然而，在广谱抗生素得到广泛使用后，噬菌体因具有特异靶标谱而被认为是不必要的。但是，抗生素的误用和滥用使得人们对抗生素耐性和食品中残留抗生素的不良影响的担忧增加(Cislo，M et al.Bacteriophage treatmentof suppurative skin infections.Arch Immunol.Ther.Exp.1987.2：175-183；Kimsung-hun et al.，Bacteriophage；New Alternative Antibiotics.biological researchinformation center，BRIC)。特别地，加入到动物饲料以促进生长的抗生素类生长促进剂(AGP)诱导抗生素耐性，因此最近提出禁止使用抗生素类生长促进剂(AGP)的禁令。欧盟从2006年开始禁止使用所有抗生素类促生长剂(AGP)。韩国已经禁止使用一些AGP，并且正在考虑限制使用所有的AGP。

这些逐渐增加的对抗生素使用的担忧已经使人们再度提起对作为抗生素替代物的噬菌体兴趣再次兴起。在美国专利第6485902号中公开了控制大肠杆菌O157:H的7种噬菌体(2002年申请-Use of bacteriophages for control ofEscherichia coli O157)。在美国专利第6,942,858号中公开了用于控制多种微生物的两种噬菌体(2005年由Nymox申请-Compositions containingbacteriophages and method of using bacteriophages to treat infections)。许多公司已经积极尝试利用噬菌体开发各种产品。BI food system(欧洲)开发了用于预防由单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)引起的食物中毒的食品添加剂，命名为Listex-P100，这是得到美国FDA批准的首个噬菌体产品。研发的产品LMP-102也是基于噬菌体的抗单核细胞增生李斯特氏菌的食品添加剂，并被批准GRAS(公认安全)级。在2007年，OmniLytics生产的基于噬菌体的洗剂被开发用于预防屠宰过程中牛肉的大肠杆菌O157污染，并得到美国农业部(USDA)的食品安全监督服务局(FSIS)的批准。在欧洲，产胞梭菌(Clostridium sporogenes)噬菌体NCIMB 30008和Clostridiumtyrobutiricum噬菌体NCIMB 30008分别在2003年和2005年被注册为抗梭菌的饲料防腐剂。这些研究表明，目前正在对作为将噬菌体作为抗人畜共患病病原体的抗生素而用于家畜产品中进行深入的研究。

发明内容

技术问题

为了解决由于广谱抗生素的使用引起的问题，本发明人从自然源中分离了新型沙门氏菌噬菌体，并鉴定了其形态、生化特性和遗传特性。本发明人发现，所述噬菌体对鸡沙门氏菌(SG)和鸡白痢沙门氏菌(SP)具有特异杀菌活性而不影响有益细菌，并且具有良好的耐酸性、耐热性和耐干燥性，并因此除了可应用于能够用于预防或治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(特别是禽伤寒或鸡白痢)的组合物中外，还可以应用于各种控制沙门氏菌的产品中，例如家畜饲料和饮用水、消毒剂和清洁剂，从而完成本发明。

技术方案

本发明的一个目的是提供对鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的新型噬菌体。

本发明的另一个目的是提供用于预防和治疗由鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的组合物，该组合物包含作为活性成分的所述噬菌体。

本发明的另一个目的是提供包含作为活性成分的所述噬菌体的家禽饲料和饮用水。

本发明的另一个目的是提供包含作为活性成分的所述噬菌体的消毒剂和清洁剂。

本发明的另一个目的是提供利用包含作为活性成分的所述噬菌体的组合物来预防和治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(禽伤寒或鸡白痢)的方法。

有益效果

本发明的新型噬菌体对鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有特异抗菌活性，该噬菌体还具有优异的耐酸性、耐热性和耐干燥性，因此，其可用于预防和治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病(包括禽伤寒或鸡白痢)，还可用于控制鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。

附图说明

图1为ΦCJ1的电子显微镜照片，其中ΦCJ1符合长尾噬菌体科的形态型，特征为等轴衣壳(isometric capsid)和非收缩性长尾；

图2为所分离的噬菌体ΦCJ1的SDS-PAGE结果，其中显示了所述噬菌体的蛋白图谱，包括约38kDa和49kDa的主要蛋白和约8kDa、17kDa、80kDa和100kDa的其它蛋白(参见作为标记的蓝色plus 2预染标准物(Invitrogen))；

图3为所分离的噬菌体ΦCJ1的PFGE结果，其显示全基因组大小约为61kbp(使用5kbp DNA大小标准物(Bio-rad)作为大小标记)；

图4为利用ΦCJ1基因组DNA的各对引物对进行PCR的结果，其中，A、B、C和D泳道(A：利用引物对SEQ ID Nos.6和7进行PCR扩增，B：利用引物对SEQ ID Nos.10和11进行PCR扩增，C：利用引物对SEQ ID Nos.8和9进行PCR扩增，D：利用引物对SEQ ID Nos.12和13进行PCR扩增)分别具有约660bp、1.3kbp、670bp和1.8kbp的PCR产物；

图5为噬菌体ΦCJ1的一步式培养试验的结果，其中(A：鸡沙门氏菌，B：鸡白痢沙门氏菌)所述噬菌体在鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌中具有102或更大的裂解量(burst size)。

图6为噬菌体ΦCJ1的功效试验(清除试验，clearing assay)的结果，其中(A：鸡沙门氏菌，B：鸡白痢沙门氏菌，MOI(感染倍数)：每个宿主细胞的噬菌体接种数)由于噬菌体ΦCJ1具有较高效率的感染性，其能够有效裂解宿主细胞。

图7为噬菌体ΦCJ1的耐酸性试验结果，显示噬菌体在pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0和9.0时存活噬菌体的数量，其中，与对照相比，噬菌体ΦCJ1在pH 2.5时仍保留其活性，但在pH 2.1时完全丧失其活性。

图8为噬菌体ΦCJ1的耐热性试验结果，表明在37℃、45℃、53℃、60℃、70℃和80℃和0、10、30、60、120分钟的时间点时存活噬菌体的数量，其中，即便在70℃温育2小时后噬菌体ΦCJ1依然保持其活性，但在80℃暴露10分钟后其活性下降，但仍然具有活性；和

图9为利用加速真空干燥器(SVD)在60℃持续120分钟进行的噬菌体ΦCJ1耐干燥性试验的结果，其中，比较干燥前后病毒滴度的变化从而检测其相对稳定性，显示其活性降低至10²。

最佳实施方式

一方面，本发明涉及对鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的新型噬菌体。

本发明的噬菌体符合长尾噬菌体科的形态型，其特征在于等轴衣壳和非收缩性长尾，并且全基因组大小为61kbp，主要结构蛋白的大小为38kDa和49kDa。

本发明的噬菌体具有可选择感染鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的能力，即具有这些细菌的种特异性。

此外，本发明噬菌体在遗传上具有大小约为61kbp的全基因组，并且所述全基因组可包含由SEQ ID Nos.1-5所示的核酸分子。

本文所使用的术语“核酸分子”包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子，作为核酸的基本结构单元，术语“核苷酸”包括天然核苷酸及其糖或碱基被修饰的类似物。

此外，本发明的噬菌体具有耐酸性和耐热性的生化特性，其中，所述噬菌体可以在pH 2.5-pH 9.0的宽范围pH环境中和37℃-70℃的高温环境中稳定存活。此外，本发明的噬菌体还具有耐干燥性，从而即使在高温干燥后(60℃持续120分钟)仍能稳定保持其存活性。这种耐酸性、耐热性和耐干燥性的特性也允许本发明的噬菌体在各种温度和pH环境下生产用于由SG和SP引起的家禽疾病的预防性或治疗性组合物，以及包含作为活性成分的所述噬菌体的其它产品。

本发明的发明人收集了鸡屠宰场的污水样品，并从其中分离出对SG和SP具有特异杀菌活性和上述性质的本发明噬菌体，将其命名为噬菌体ΦCJ1，并于2008年10月24日保藏在韩国微生物培养中心，保藏号为KCCM10969P。

根据本发明的具体实施例，本发明人收集了鸡屠宰场的污水样品以分离裂解宿主细胞SP的噬菌体，并且证实所述噬菌体确实能够特异性地裂解SG和SP。本发明人还进一步在电子显微镜下观察了所述噬菌体(ΦCJ1)，发现其属于长尾噬菌体科的形态型(图1)。

本发明人还分析了所述噬菌体ΦCJ1的蛋白图谱，发现了大小约为38kDa和49kDa的主要结构蛋白。

还分析了所述噬菌体ΦCJ1的全基因组大小，发现其全基因组大小约为61kbp。对其遗传特性的分析结果表明，所述噬菌体在全基因组内包含SEQ IDNOs.1-5所示的核酸分子。在这些结果的基础上，比较与其它种的遗传相似性。结果发现所述噬菌体与已知噬菌体的遗传相似性非常低，这表明所述噬菌体是新型噬菌体。更具体地，使用ΦCJ1特异性引物对，例如SEQ ID Nos.6和7、10和11、8和9、12和13、14和15、16和17以及18和19进行PCR。发现每种PCR产物的大小为660bp、1.3kbp、670bp、1.8kbp、1kbp、1kbp和1kbp。

此外，当用ΦCJ1感染SG和SP时，显示噬菌斑(一个噬菌体对宿主细胞裂解而在软琼脂上产生的清澈区域)具有相同的大小和浊度。观察所述噬菌体ΦCJ1对SG和SP的裂解，发现其对SG和SP的生长具有抑制作用。

此外，测定了ΦCJ1在各种温度和pH条件下的稳定性，结果发现ΦCJ1在pH 2.5-pH 9.0的宽范围pH环境下和37℃-70℃的高温环境下都能稳定存活，即便在高温干燥(60℃持续120分钟)后仍能存活。这些结果表明，可以容易地将本发明的噬菌体ΦCJ1应用于各种用于控制SG和SP的产品中。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的禽伤寒或鸡白痢的组合物，所述组合物包含作为活性成分的所述噬菌体。

本发明的噬菌体对鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性，并因此可以用于预防或治疗由这些细菌引起的疾病。特别地，在优选的实施方案中，可以包含抗生素。

本文所使用的术语“预防”是指包括通过施用所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文所使用的术语“治疗”是指包括通过施用所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

可以应用本发明组合物的传染病的优选实例包括鸡沙门氏菌引起禽伤寒和由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢，但不限于此。

本发明的组合物包含5x10²-5x10¹²pfu/ml的ΦCJ1，优选为1x10⁶-1x10¹⁰pfu/ml。

本发明的组合物还可以进一步包含药学上可接受的载体，并可以与所述载体一起配制，从而提供食品、药物和饲料添加剂。

本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所施用化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。

为了将所述组合物配制成液体制剂，可以使用无菌且具有生物相容性的药学上可接受的载体，例如盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。这些物质可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。此外，还可以向所述组合物中添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂，从而制备可注射制剂(例如水溶液、悬浮液和乳液)，或者口服制剂(例如丸剂、胶囊、粒剂或片剂)。

适合本发明组合物的口服剂型的实例包括片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、水悬液或乳悬液、散剂或粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂。对于诸如片剂和胶囊的制剂，可使用粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰延胡索酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊，除了上述化合物外，还可以进一步使用诸如脂质的液体载体。

对于非口服施用，可以将本发明的组合物配制成用于经皮下、静脉内或肌内途径施用的注射剂，配制成栓剂，或经呼吸道施用的喷雾吸入剂，例如气雾剂。可以通过将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂一起溶解或悬浮在水中，并将所述溶液或悬浮液分装在安瓿或单位小瓶中而获得注射制剂。对于喷剂，例如气雾剂，可以将用于喷射水分散浓缩物或湿粉末的推进剂与添加剂组合使用。

根据另一方面，本发明涉及抗生素，包括用于预防或治疗由鸡沙门氏菌引起禽伤寒和由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢的组合物。

本文所使用的术语“抗生素”是指可应用于动物以杀灭病原体的任何药物，用在本文中作为防腐剂、杀菌剂和抗菌剂的通用术语。与传统抗生素不同，本发明的噬菌体对于鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有高特异性，从而可以杀灭特定病原体而不影响有益细菌，并且不诱导耐性，由此其生命周期相当长。

根据另一方面，本发明涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的家禽饲料或家禽饮用水。

可以将本发明的噬菌体单独制备成饲料添加剂，随后添加到动物饲料中，或直接添加到动物饲料中。本发明的噬菌体可以以液体或干燥形式包含在动物饲料中。所述干燥过程可以通过风干、自然干燥、喷雾干燥或冻干而进行，但并不限于此。基于动物饲料的重量，可以以粉末的形式添加0.05-10重量％，优选0.1-2重量％的本发明噬菌体。

本发明的包含ΦCJ1的饲料可以包括基于植物的饲料，例如谷物、坚果、食品副产物、海草、纤维、药物副产物、油、淀粉、粗粉和谷物副产物；基于动物的饲料，例如蛋白质、矿物质、脂肪、单细胞蛋白质、浮游动物和食品废料，但并不限于此。

本发明的包含ΦCJ1的饲料添加剂可以包含粘合剂、乳化剂、防腐剂(用于防止质量退化)、氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮、硅酸盐(酯)、缓冲剂、着色剂、提取物和用于提高效率的寡糖以及其它饲料预混料，但并不限于此。

此外，提供混合有本发明噬菌体的饮用水可以降低家畜肠内鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌的数量，由此获得不含鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌的家畜。

根据另一方面，本发明涉及包含作为活性成分的所述噬菌体的消毒剂或清洁剂。

为了除去鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌，可将包含作为活性成分的所述噬菌体的消毒剂用于，但不限于，家畜舍、屠宰场、污染区域和其它生产设施上。

此外，包含作为活性成分的所述噬菌体的清洁剂可以涂覆在活家禽的受污染皮肤、羽毛和其它受污染的身体部分，从而除去鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。

另一方面，本发明涉及利用用于预防或治疗由鸡沙门氏菌引起的禽伤寒或由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢的组合物来预防或治疗传染病(由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的禽伤寒或鸡白痢)的方法。

可以将本发明的组合物含在药物制剂中或将其作为动物饲料的成分或在饮用水中施用于动物，优选通过将其作为饲料添加剂混入动物饲料来施用。

可以以通常方式通过各种途径施用本发明的组合物，例如口服或肠胃外途径，特别是口服、经直肠、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、透皮、鼻内和吸入途径。

本发明的治疗疾病的方法包括施用药学有效量的本发明组合物。对于本领域技术人员显而易见的是，医师通过适当的医学判断应当可以确定单日总剂量。对于患者来说，治疗有效量可能根据医学领域熟知的各种因素而变化，包括要获得的应答的种类和程度；患者的状况，例如年龄、体重、健康状况、性别和饮食；施用时间和途径、组合物的分泌率、治疗时间周期、根据是否使用其它试剂的具体组合物等。

下文将参考以下实施例对本发明进行更详细的阐述。然而，这些实施例仅出于说明的目的，本发明并不限于这些实施例。

具体实施方式

实施例1：沙门氏菌噬菌体的分离

1-1.噬菌体的筛选和单噬菌体的分离

将来自鸡屠宰场和排水沟污水的50ml样品转移到离心管中，并以4000rpm离心10分钟。随后，利用0.45μm滤器过滤上清。将18ml所述样品滤液与150μl SP振荡培养基(OD₆₀₀＝2)和2ml的10×Luria-Bertani培养基(下文称为LB培养基，蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，终体积为1L)混合。将混合物在37℃培养18小时，并将培养液以4000rpm离心10分钟。利用0.2μm滤器过滤上清。将3ml 0.7％琼脂(w/v)和150μl SP振荡培养基(OD₆₀₀＝2)混合，并铺在LB平板上，并使其转变成固体培养基。在其上涂布10μl培养滤液，并在37℃培养18小时(将0.7％的琼脂用作“上层琼脂”，并在所述上层琼脂上进行噬菌体裂解物的滴定，称为软琼脂覆层法)。

将包含噬菌体裂解物的样品培养液稀释，并与150μl SP振荡培养基(OD₆₀₀＝2)混合，随后进行软琼脂覆层法，从而获得单个噬菌斑。由于单个噬菌斑代表一个噬菌体，为了分离单噬菌体，将一个噬菌斑加入到400μl SM溶液(NaCl，5.8g；MgSO₄·7H₂O，2g；1M Tris-Cl(pH7.5)，50ml；H₂O，终体积为1L)中，在室温下静置4小时，以分离单噬菌体。为了大量纯化噬菌体，从所述单噬菌体溶液中取出100μl上清，并与12ml 0.7％琼脂和500μl SP振荡培养基混合，随后在LB平板(直径为150mm)上进行软琼脂覆层法。当裂解完成后，向平板中加入15ml SM溶液。将平板在室温下温和振荡4小时，以从上层琼脂中洗脱噬菌体。回收包含洗脱噬菌体的SM溶液，并加入终体积为1％的氯仿，均匀混合10分钟。将溶液在4000rpm下离心10分钟。利用0.2μm滤器过滤所获得的上清，并贮存在冰箱中。

1-2.噬菌体的大规模培养

利用SP大量培养所选择的噬菌体。振荡培养SP，将1.5×10¹⁰cfu(集落形成单位)的等分试样在4000rpm离心10分钟，随后将沉淀重悬在4ml SM溶液中。在其中接种7.5×10⁷pfu(噬菌斑形成单位)的噬菌体(MOI：感染倍数＝0.005)，在37℃静置20分钟。将所述溶液接种到150ml LB培养基中，并在37℃培养5小时。加入终体积为1％的氯仿，并将培养溶液振荡20分钟。分别加入终浓度为1μg/ml的Dnase I和Rnase A。将溶液在37℃静置30分钟。分别加入终浓度为1M和10％(w/v)的NaCl和PEG(聚乙二醇)，并再在37℃静置3小时。将所述溶液在4℃以12000rpm离心20分钟，以舍弃上清。将沉淀重悬在5ml SM溶液中，并在室温下静置20分钟。向其中加入4ml氯仿，并混合均匀，随后在4℃以4000rpm离心20分钟。利用0.2μm滤器过滤上清，并通过甘油密度梯度超离心(密度：40％，5％甘油在4℃以35,000rpm离心1小时)纯化ΦCJ1。将纯化的ΦCJ1重悬在300μl SM溶液中，随后进行滴定。

实施例2：检测ΦCJ1对沙门氏菌的感染

为了检测所选噬菌体对其它沙门氏菌种以及SP的裂解活性，利用其它沙门氏菌种进行了交叉感染的试验。结果ΦCJ1没有感染ST(肠道沙门氏菌鼠伤寒血清型，Salmonella enterica Serotype Typhimurium)、SE(肠道沙门氏菌肠炎血清型，Salmonella enterica Serotype Enteritis)、SC(肠道沙门氏菌猪霍乱血清型，Salmonella enterica Serotype Choleraesuis)、SD(肠道沙门氏菌德尔卑血清型，Salmonella enterica Serotype Derby)、SA(肠道沙门氏菌亚利桑那亚种，Salmonella enterica subsp.Arizonae)、SB(肠道沙门氏菌邦戈亚种，Salmonella entericl subsp Bongori))，但特异感染了SG和SP(参见实施例13)。所述结果示于下表1中。利用SG作为宿主细胞产生的噬菌体ΦCJ1具有与利用SP作为宿主细胞所产生的噬菌体相同的噬菌斑大小和噬菌斑浊度，以及相同的蛋白谱和基因组大小。

表1ΦCJ1对沙门氏菌的感染

^*ATCC：全球生物资源中心(The Global Bioresource Center)

^*SGSC：沙门氏菌遗传库中心(salmonella genetic stock center)

实施例3：噬菌体ΦCJ1的形态鉴定

利用0.01％明胶溶液稀释经纯化的ΦCJ1，随后固定在2.5％的戊二醛溶液中。将样品滴在碳包被的云母板(ca.2.5×2.5mm)上并使其适应10分钟后，用无菌的蒸馏水洗涤。将碳膜封装在铜栅(copper grid)上，并用4％的乙酸铀酰染色30-60秒，干燥，并在JEM-1011透射式电子显微镜(80kV，放大倍率为×120,000-×200,000)下观察。结果如图1所示，发现纯化的ΦCJ1具有包括等轴衣壳和非收缩性长尾在内的形态特征，这表明其属于长尾噬菌体科的形态型组。

实施例4：噬菌体ΦCJ1的蛋白谱分析

利用3μl 5×SDS样品溶液处理15μl纯化的ΦCJ1溶液(10¹¹pfu/ml滴定度)，并加热5分钟。将ΦCJ1的总蛋白在4-12％ NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中进行电泳，随后用考马斯亮蓝将凝胶在室温下染色1小时。如图2所示，所述蛋白谱显示观察到作为主要蛋白的38kDa和49kDa的条带，同时还观察到8kDa、17kDa、80kDa和100kDa的条带。

实施例5：噬菌体ΦCJ1的全基因组DNA大小分析

通过超速离心法从纯化的ΦCJ1分离基因组DNA。具体而言，向纯化的ΦCJ1的培养液中分别加入终浓度为20mM、50μg/ml和0.5％(w/v)的EDTA(乙二胺四乙酸，pH8.0)、蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)，并在50℃下静置1小时。加入等量的苯酚(pH8.0)并混合均匀，随后在室温下以12000rpm离心10分钟。将上清与等量PC(苯酚∶氯仿＝1∶1)混合均匀，随后在室温下以12000rpm离心10分钟。将上清与等量氯仿混合均匀，随后在室温下以12000rpm离心10分钟。再次向上清中加入1/10体积的3M乙酸钠和2体积95％的冷乙醇，并在-20℃静置1小时。在0℃以12000rpm离心10分钟后，彻底除去上清，并将DNA沉淀溶解在50μl TE(Tris-EDTA，pH 8.0)中。将所提取的DNA稀释10倍，并测量其在OD₂₆₀的吸光度。将1μg全基因组DNA上样到1％PFGF(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶中后，利用BIORAD PFGE系统程序7(大小范围为25-100kbp；转换时间梯度(switch time ramp)为0.4-2.0秒，线形；正向电压为180V；反向电压为120V)在室温下进行电泳20小时。如图3所示，ΦCJ1的基因组大小约为61kbp。

实施例6：噬菌体ΦCJ1的遗传分析

为了分析纯化的ΦCJ1的遗传特征，利用限制性酶EcoR V和Sca I对5μgΦCJ1基因组DNA进行处理。利用EcoR V酶切载体pBluescript SK+(Promega)，并用CIP(小牛肠碱性磷酸酶)处理。经酶切的基因组DNA和载体以3∶1的比例混合，并在16℃连接5小时。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中。将转化的细胞涂布在含氨苄青霉素和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB平板上，以进行蓝/白斑筛选，由此选出两个克隆。将所选克隆在含氨苄青霉素的培养基中振荡培养16小时。随后，利用质粒提取试剂盒(Promega)提取质粒。

利用M13正向和M13反向引物对通过PCR确定质粒克隆，并选择1kbp或更长的插入片段，利用M13正向和M13反向引物对对其序列进行分析。结果如SEQ ID NOs.1-5所示.。利用NCBI blastx程序进行序列相似性分析，结果示于表2中。

如表2所示，ΦCJ1在SEQ ID NO.1的前部分序列中显示与噬菌体TLS的Dcm具有36％的序列相似性，后部分序列中显示与洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)噬菌体BcepNazgul的DR0530-样引发酶(DR0530-likeprimase)具有31％的序列相似性。SEQ ID NO.1的后部分序列显示与沙门氏菌噬菌体Det7的尾突蛋白具有34％序列相似性。与已知噬菌体的蛋白比较显示出低相似性，并且通过NCBI blastn程序对SEQ ID NOs.1-5的碱基序列进行分析，结果显示没有序列相似性。这些结果表明ΦCJ1是新型噬菌体。

表2：ΦCJ1与其它噬菌体的序列相似性比较

实施例7：ΦCJ1-特异性引物序列的构建

为了鉴定ΦCJ1，构建了ΦCJ1-特异性引物。在SEQ ID NO.1的基础上，构建PCR引物对SEQ ID NOs.6和7以及SEQ ID NOs.10和11。另外，还在SEQ ID NO.2的基础上，构建了PCR引物对SEQ ID NOs.8和9以及SEQID NOs.12和13。另外，还在SEQ ID NO.3、4和5的基础上，构建了各引物对SEQ ID NOs.14和15、SEQ ID NOs.16和17以及SEQ ID NOs.18和19。利用各引物对SEQ ID NOs.6和7、SEQ ID NOs.10和11、SEQ ID NOs.8和9、SEQ ID NOs.12和13、SEQ ID NOs.14和15、SEQ ID NOs.16和17以及SEQ ID NOs.18和19进行PCR。向预混物(Bioneer)中加入0.1μg噬菌体基因组DNA、0.5pmol引物，并将终体积调整至20μl。利用30个如下循环进行PCR：94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃聚合1分钟。当使用SEQ ID NOs.3和4以及SEQ ID NOs.7和8作为引物对时，可以分别获得约660bp和1.3kbp的PCR产物。另外，当使用SEQ ID NOs.5和6以及SEQ IDNOs.9和10作为引物对时，可以分别获得约670bp和1.8kbp的PCR产物。结果示于图4中。另外，当使用SEQ ID NOs.14和15、SEQ ID NOs.16和17以及SEQ ID NOs.18和19作为引物对时，可以获得约1kbp的PCR产物(数据未显示)。

实施例8：噬菌体感染效率的试验

为了检测噬菌体ΦCJ1的感染效率，进行了一步式生长培养试验。

将50ml SG培养液(OD₆₀₀＝0.5)在4000rpm离心10分钟，并重悬在25ml新鲜的LB培养基中。向其中接种纯化的噬菌体(MOI＝0.0005)，并静置5分钟。然后将反应溶液在4000rpm离心10分钟，并将细胞沉淀重悬在新鲜的LB培养基中。在37℃培养细胞时，每10分钟收集两份细胞培养液样品，并在12000rpm离心3分钟。对获得的上清进行连续稀释，并按照软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，并进行噬菌体裂解物的滴定。ΦCJ1是既能感染SG，又能感染SP的噬菌体。因此，对SP进行同样的试验。SG和SP的一步式培养试验的结果显示102或更高的裂解量。结果示于图5中。

实施例9：噬菌体功效的检测

为了检测液体培养基中ΦCJ1对SG的功效，进行了各种条件下的澄清试验(clearing assay)。向250ml烧瓶中加入35ml LB培养基，以1∶1、1∶100和1∶10000的细胞比例向其中接种单个噬菌斑的噬菌体和SG细胞，然后在37℃以200rpm进行培养。在每个时间间隔监测OD₆₀₀的变化。结果，观察到ΦCJ1对SG和SP的抑制作用。结果示于图6中。

实施例10：噬菌体的pH稳定性试验

为了检测ΦCJ1在低pH环境下(例如鸡胃)中的稳定性，在宽pH水平范围(pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0)内进行了稳定性试验。制备了浓度为2M的各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH 2.1、pH 4.0、pH 5.5、pH 6.4))、柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5、pH 3.0、pH 3.5)、磷酸钠缓冲液(pH 6.9、pH 7.4)、Tris-HCl(pH 8.2、pH 9.0))。将100μl pH溶液与等量的噬菌体溶液(1.0X10¹¹pfu/ml)混合，使各pH溶液的浓度为1M，并在室温下静置1小时。对反应溶液进行连续稀释，并按照软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，并进行噬菌体裂解物的滴定。比较滴定度在不同pH下的变化，以测定相对稳定性。结果显示，所述噬菌体没有丧失其活性，并且直至pH 2.5都保持稳定。然而，在pH 2.1时，其活性丧失。结果示于图7中。

实施例11：噬菌体的热稳定性试验

为了测定噬菌体在用作饲料添加剂时对配制过程中产生的热的稳定性，进行了以下试验。将200μl的ΦCJ1溶液(1.0×10¹¹pfu/ml)分别在37℃、45℃、53℃、60℃、70℃和80℃静置0分钟、10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。对所述溶液进行连续稀释，并按照软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，并进行噬菌体裂解物的滴定。比较滴定度随温度和暴露时间的变化，以测定相对稳定性。结果表明，直到在70℃暴露2小时，所述噬菌体都没有丧失其活性。然而，在80℃或更高温度下暴露10分钟后，所述噬菌体活性急剧下降，但仍稳定保持一定活性。结果示于图8中。

实施例12：噬菌体的干燥稳定性试验

为了测定噬菌体在用作饲料添加剂时对配制过程中干燥条件的稳定性，进行了以下试验。基于热稳定性试验的结果，本试验在高温干燥条件(60℃持续120分钟)下进行。利用加速真空(加速-真空浓缩器5301，Eppendorf)对200μl的ΦCJl溶液(1.0X10¹¹pfu/ml)进行干燥。在4℃将所得的沉淀完全悬浮在等量的SM溶液中持续1天。对反应溶液进行连续稀释，并按照软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，并进行噬菌体裂解物的滴定。比较滴定度在干燥前后的变化，以测定相对稳定性。结果显示其活性降低至10²。结果示于图9中。

实施例13：测定噬菌体对野生型SG/SP的感染

除了在本发明中使用的SG(SG RKS4994)和SP(SP RKS2242)外，还测定了噬菌体ΦCJl对首尔国立大学兽医药学院鸟类疾病实验室(Laboratory ofAvian Disease，College of Veterinary Medicine，Seoul National University)分离的韩国野生型SG(15株)和SP(5株)的裂解活性。将150μl各菌株的振荡培养液(OD₆₀₀＝2)与10μl的ΦCJl溶液(10¹⁰pfu/ml)混合，并按照软琼脂覆层法在37℃培养18小时，测定噬菌斑的形成。发现噬菌体ΦCJl对野生型SG和SP具有100％的裂解活性。结果示于表3中。

表3对韩国野生型SG和SP的裂解活性

^*SG/SP来源：首尔国立大学兽医药学院鸟类疾病实验室

实施例14：噬菌体的毒性试验

通过评价其在蛋鸡中的安全性、残留量和蛋鸡的鸡蛋，对用于预防禽伤寒的噬菌体ΦCJ1进行毒性试验。将蛋鸡分为3组以进行致病性试验和鸡蛋试验，并检测临床体征的存在和盲肠粪中噬菌体的含量。

对于致病性试验，将13只褐色蛋鸡分为ΦCJ1-处理组(8只)和对照组(5只)。使用饲料和ΦCJ1(每克饲料10⁸pfu或更高)的混合物饲养ΦCJ1-处理组，而对照组仅用饲料饲养，并且在噬菌体处理后持续3周检测产蛋率和临床体征。如表4所示，ΦCJ1-处理组和对照组分别显示约42％和50％的产蛋率。另外，还检测了噬菌体处理后的临床体征，结果表明在ΦCJ1处理24天后没有观察到呼吸道和消化道损伤，也没有观察到异常活性。结果显示ΦCJ1处理没有产生副作用。

对于鸡蛋检测，在ΦCJ1处理后第3天、第6天和第9天收集10枚鸡蛋，用70％的乙醇洗涤鸡蛋表面并打碎鸡蛋。混合蛋黄和蛋白，用45ml PBS将5ml混合液稀释到10^-1、10^-2和10^-3。在25ml各稀释溶液中加入10⁶cfuSNUSG0197，并在37℃温育3小时，通过离心分离细胞。将500μl上清和100μl SNUSG0197(10⁹cfu/ml)相互混合，并按照上层琼脂糖覆层技术平铺在胰蛋白酶大豆琼脂平板上。在37℃温育18小时后，清点噬菌斑的数量以计算每ml鸡蛋中噬菌体的数量。如表5所示，在第3天、第6天和第9天收集的17枚鸡蛋中都没有发现ΦCJ1。

接着，检测ΦCJ1处理后临床体征的存在和盲肠粪中ΦCJ1的含量。在ΦCJ1处理3周后对经测试的蛋鸡进行安乐死，并进行尸检以测定肝脏、脾脏、肾脏和卵巢中是否存在明显损伤。利用无菌棉签在无菌条件下收集肝脏样品，并平铺在Mac Conkey琼脂平板上，以检测鸡沙门氏菌的存在。还收集盲肠粪以测定鸡个体中的ΦCJ1含量。简而言之，将1g盲肠粪悬浮在9mlPBS中，并以15000g离心30分钟。利用PBS将1ml上清稀释至10^-1-10^-4，将500μl稀释液和100μl SG0197(10⁹cfu/ml)相互混合，并按照上层琼脂覆层技术，将其平铺在10×胰蛋白酶大豆琼脂平板上。在37℃温育18小时后，清点噬菌斑的数量以计算每g盲肠粪中噬菌体的数量，将连续稀释的倍数计算在内。结果表明，在检测期间没有观察到任何异常临床体征，并且每克盲肠粪测量到约3.7×10⁴pfuΦCJ1，这表明所述噬菌体通过胃后在肠中仍存活。

检测了噬菌体在器官中的分布。简而言之，将10只SPF雏鸡(11天龄)分成两组，每组5只。在3天中，处理组用补充有10⁸pfuΦCJ1(每克)的饲料饲养，对照组仅用饲料饲养。处死雏鸡，收集肝脏、肾脏和盲肠粪，并检测ΦCJ1存在与否。用等体积PBS乳化收集的每份肝脏、肾脏和盲肠粪。将1ml肝脏和全部量的肾脏和盲肠粪转移到1.5ml试管中，并以15,000rpm离心15分钟。利用PBS将1ml上清稀释至10^-1-10^-4，将500μl稀释液和100μlSG0197(10⁹cfu/ml)相互混合，并按照上层琼脂覆层技术，将其平铺在10×胰蛋白酶大豆琼脂平板上。在37℃温育18小时后，清点噬菌斑的数量以计算每克盲肠粪中噬菌体的数量，将连续稀释的倍数计算在内。如表6所示，在肝脏和肾中脏没有观察到ΦCJ1，但在盲肠粪中观察到了ΦCJ1。

表4.ΦCJ1处理后的平均产蛋率

表5.ΦCJ1的存在率

收集日	ΦCJ1	对照
收集日	ΦCJ1	对照	第3天	0/7	0/5
第6天	0/8	0/7	第3天	0/7	0/5
第6天	0/8	0/7	第9天	0/2	0/1
总数	0/17	0/13	第9天	0/2	0/1

表6.ΦCJ1-处理组的器官中噬菌体的存在

实施例15：噬菌体的功效试验

为了评价ΦCJ1对预防和治疗SG的功效，使用鸡进行了功效试验。

将20只褐色蛋鸡(1天龄)分成10个实验组，每组10只(ΦCJ1处理组和非处理组)。在第1周，用补充有10⁷pfuΦCJ1(每克)的饲料和补充有10⁷pfuΦCJ1(每ml)的饮用水饲养试验鸡。1周后，用500μl TSB将10⁶cfu SG0197(每只鸡)和10⁷pfu(MOI＝10)噬菌体混合，并在冰上静置1小时或更短，然后通过口服施用。测定2周内的死亡率。对存活的鸡进行尸体解剖，检测是否存在明显的损伤，并分离细菌。如表7所示，发现ΦCJ1处理组显示出显著高于非处理组的保护率(P＜0.05)。

表7.使用鸡进行的ΦCJ1功效试验

	ΦCJ1-处理组	非处理组
	ΦCJ1-处理组	非处理组	存活	8	3
死亡率	20％	70％	存活	8	3
死亡率	20％	70％	临床体征	1/8	1/3
SG重分离	0/8	0/3	临床体征	1/8	1/3
SG重分离	0/8	0/3	保护率	70％	20％

工业应用性

本发明的噬菌体对鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性而不影响有益细菌，并且具有优异的耐酸性、耐热性和耐干燥性，并由此可以应用于抑制或预防由鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌引起的禽伤寒和鸡白痢，并可用于控制鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。例如，所述噬菌体可以作为活性成分，应用至用于预防或治疗由鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的组合物，家禽饲料和饮用水、清洁剂和消毒剂。

序列表

<110>CJ第一制糖株式会社

<120>新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

<130>0PA09059

<150>KR10-2008-0121500

<151>2008-12-02

<160>19

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>1355

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM10969P

<400>1

cggaagcgtc agatctggaa tcacagttca acggctggct gcagggtaac ctgctcgtca 60

tcgtggaaga actgaaaacc gacgacaagc acacactgct ggaacgaatg aagccgatga 120

tcaccaacaa gcgcattcaa atccagcaga aaggtatcga ccagacgacc ggcgataacc 180

gtgcaaactt tatctgtttc tcaaaccacc gcgactgcgt gccgattaaa cgtaacggcc 240

gccgctatgc catgctgtac acggcgcaac agagcgttga agacctgcag cgcgacgaca 300

tgccgccgga ttatttctat cgtctgtatg agtgggctga caacggcggc tgggcggtca 360

tcgcacactt cctgtctgaa tacgagatac cggatgaatt caacccgaaa acattctgtc 420

agcgtgcacc ggagacatcc agccagcgcg aagcggaaaa agtatcactg ggacgcgttg 480

aacaggaaat catggaagct gtagacagcg agatgccggg attctgtgac ggatggatca 540

gcagttacca cctgaccaaa ctgctggaaa gcaaagggct ggaacgcttc ctgccaccga 600

acaagcgcaa acagaccctg gaggacatcg gctacgtgca gcaccctaac ctgaataacg 660

gacgtgtgaa caatgcgatc gcgggggaag gtaagccgcg cctgtacgtc gataaaatcc 720

gtaaagacct gctgaatatc aaagcaccgg gggaaattgc cgatatgtac tggaagtcgc 780

agaacccgtt tgcgggaggt gcggtgtgac taaacgtgct gtgtttctgt atgacgtgac 840

gggcatcgct gcccgtccat ggatagatgc cggatatgaa tgctggttat tcgacgggca 900

acatcctaaa ggtattacgc gtgaaggtaa catggtgaaa gtcgggatgt ggtttcacca 960

tgaccagtgt gatgaacatg cggaatggat aaaaagtcag gttataaacg ccgaaatcgt 1020

aatcggattt ccggagtgta ctgatctgac tgtcgccggc gcgcgttggt ggaaagacaa 1080

acgagaagcg gatccggatt ttcagaacaa ggcaaaatgt cttgcactgc tcgttgaaaa 1140

ggtcggtaat gcactggaat gtccatggtg ctttgaaaat ccggtgggag cattatcaaa 1200

tttatacaga ttgccggatt tcacgtttaa cccttgcgac tatgcaggtt atttagactg 1260

tgactcgccg caccccattt atccggaagt ttacccggtt caggatcgct ataataaaaa 1320

cacctgtatc tggtgcggta acggctttgt acagc 1355

<210>2

<211>1930

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM10969P

<400>2

ggtgtcgtaa caagtgtcgc cggactaacc ctgtatttga gtgaccctgt agaattactg 60

cccggttata cctatagtat tactctaaca ggccgtctgg gtacactgga aaatgtacct 120

atcacttccg gtgtagacga attcagtgtg gtgttacaat cagtaccgga tcaagaggtt 180

tatacagggt ggatgcgtga ccgtacagcc tatgtgattc gcactgacga cgagcgtaca 240

aaactcgcta tgctagttca gagtatggag ccatcagggc gtgacaacaa ctatcaggta 300

gggttaacgt gcatcaatta cgatgcacgt tattatcagg atgataaata accacccatg 360

aaaaaaaaaa ctaaccccgc ttcggcgggg ttttgttatg tattaaaatt aaagtgagta 420

tgttacataa cttccatctg gttttttagc cagcaatctc aatgccccat cacttccgaa 480

gaagaaacct atagatgagt tatgctctaa agcactctct ggtaattgtg aagacgcaac 540

aggtatgctc atatgcttaa agcctaagcg attaagctga aactcaccta cacgtacacc 600

gtcctggatt gctgaaagct taactatact tgcctcacct cctggcgttg ccacttggca 660

atctgctgtc ataagcaatg atgggtttgt tgtgcccccc attgctggac gcatagccag 720

ggtcatggtg ttatcaccat gctgtacgtt tatgtttcca ccctgaatat cgccaacata 780

cgtacacaat aatttttttg tcccactccc agcacatgaa acattgctaa tctctgaaga 840

aggcgcatat accgcatatc cttgcgtggt atatgcatgt accattactc ctctcaaacg 900

actcccaccc tcacaaacaa tctggtttaa gttagtaagg tctttatttg ccccaatcac 960

tgttatcttg gtgatatcat tgtttgtacc tctgtcgaaa atcccctctt tatgggcctc 1020

ataggttaca atattatcaa tgatattttt ttgcccatcc caccacgcac caatccccat 1080

gcaatcacgc gtaatgatat tgcgtatgat gtgctgagta ggtaaatgga accacgggta 1140

ttcagccaga gtgtaatcgt ctatacgttc ggttggcgac cctgtgtcag cattaacatc 1200

aatcccatcg taataacatt gaatcgtagt tatattatca aacaccagtc ggtagtttct 1260

tgcggaacgt ccgcctatct cattctggta agtcttaaca cctgattcgc cgacacgata 1320

cgagataagg tcgcgcacgc caccatcgtg atcgtcacca ccgtcatttc tgataaataa 1380

aactgcagag ccagaaccat atttaatctc cccgccaacg accttattgc cggtccccca 1440

ctcagttgtg tgatggttct cgaacgtaat tccagactcc caggcaataa aattacgtgg 1500

agattcaact aaaatgtgat tgcagagagt gaaaagatac cctcccatag tagcttctgg 1560

atgagtaacc ttgatattat tagcggagtt tacacgtaag gtggcaccag caacctggtt 1620

tttaatggaa tcaggaaggg acgcccaaat gtcatggtca ttaacattag gtttataccc 1680

cttgtctaga cgctgagtaa ccgacgctaa taccgtggtc gggtttgtca cccagttccc 1740

attatcatca aaacggtata cagtataagg agttgttttg gtgtgaatgt gcggtgaaat 1800

aattctggaa ccactaccta agttattaaa gttgaggact ccatcaccaa taaacttagc 1860

tttacagtcg attgttaaca cctttccgcc aaaatcaact gtctcgttgt cggtgaatgt 1920

atagtcgcgg 1930

<210>3

<211>958

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM10969P

<400>3

tttcgaactt ctgaacgccg cgagtcagtg cgtatttagt cacccagata gtctcagcat 60

gaagtgatgc gctgaccagg agggtgagga gtgatacaca gcacttagta atcatgagac 120

gggcctaaag atggtaaata agtgaaactg gcacatacat tcaacgcatc accgggtact 180

accacctctt gcccattatt agttacatca agccagaaac atctataatt ttctcctaac 240

ttttcaacaa tcgtcattgg gcactgcggg ttagatggta aacaaacggt ctgccctata 300

ttaaactctt tcatctcgta cactccgcga ttaattattt tatactttag accaaagaaa 360

accgcacgtc aatgcggtaa ttcgtcgccg ttatcacatt tcacaatgtt aacccggcgg 420

cttgctgtcg tcacagccat taagataaga tcaccccctg tcggttgtga ctaactgaat 480

actagcccac cttacccaga ccgtcaatct ttcctgcaac gattgcggcg taaattgcgg 540

tggccgagtt aagcgggtcg acaccgtgac agtcgataat ggtcagcatc tgatcgatcg 600

ctttgttgcg ttctgtacga agcggacgga attcttgcaa cttgtctaaa atcaggtcac 660

gagaaatatc caccccaaaa cctacatttt cttcaatact cctcatcaca atgacccaca 720

ttgacagata cattactctt actttagtcc aaccctcttt cgacgatgaa tcgaaccatt 780

cacactcagt accaactggc ggcagaccgg taccgtccca cttttcgccg cgcagcagtt 840

tttcaagcct ttttcgacca tcaagttgat gtcaacaaag tatcggctac cgcggtagtc 900

aaatcgaaca ccgaaaggtt cgttcagaca ccatgtttta acgccaagtt tggtgata 958

<210>4

<211>999

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM10969P

<400>4

cacgaacgtc tgcgcgtcgg taagaaaacc atgatgggcg gagcgtacaa actggcgctg 60

aacggtacgt acggcaacag taacaacgag tacagcccgt tttatgaccc gatgtacacg 120

atgaaaatca ccatcaatgg tcagttgtcg ctgtgtatgc tcgtcgaaca gttaatcaaa 180

gtgcccgggc tgcgtatggt ccagtgcaac accgacggta tcactttcca ctgccccgtt 240

gaatatgtcg accatgctca caacctgcgc ctgtggtggg aacaactgac gaaactcgaa 300

ctggaagaga caaggtacag tagatttttc atcagagatt gtaataacta catcgcagaa 360

cttgaataac tacattgctt gcgatagagt gttagcaaaa gggagaaacg ttatgacacc 420

tatcgcaggc ttgaaaaaca aaccttgtat ctattccatc ttgaacaaag tcaacggtaa 480

gatttatgta gggaaaacta aatgcttata tcgtcgttgc taccagtatt tgggcgcatt 540

taaaaacaaa agtcagggaa agataaatca atatctgttg aactctttcg aaaaatatgg 600

aattgataat tttgaaatgt taccgatcga gttttgtgat atttcaaaaa tcgatgagcg 660

agaactttac tggatatccg aacttagaac tacggaaaaa aataaaggtt acaatcttcg 720

attagactca tctaccggta tgattaccca ccgaagaacc tcggagaaaa taagtaataa 780

cctgaaaaaa caatgggctg ccggtgtaag agattcgcat tcagacaaac tgaaagaatc 840

ttggaaaaat aatcctcaac gtaaaactat ccaaagtgaa ttgttcacga agtataaaac 900

taaatattgt tatgttattc atttgcctga ctcatcatgt ttagttttga attataaagg 960

gttgaaatca atgaaactac atacctctgt acttagttg 999

<210>5

<211>999

<212>DNA

<213>噬菌体KCCM10969P

<400>5

cgatgcatgt cgcatttaat tgtgttacag cgtattcaat cgcccgtccg ccggatgaaa 60

acgatccgcg tacggaagaa acgaaatggt caacgcccgg gatagtgaac gggctgcacg 120

tgacacgctg acctgatggc gggttgttat gcatccacca gtcataatca gcggccagta 180

cgacgtcagg ctgtgatatg agatagcagg cgttgtttac agcgatttta aagcagtcct 240

gtgcgttcac ccactcaatc tgtgcctgtg tgagcgacgg acccgtagcg acgcacagaa 300

cgcgcattaa cgcaccacct cggcggtgaa cggtacaaca acggtctgca ggtaccattc 360

gtcatcacga ccttctgtct cgatgcgcac gcccgttggt tgaccgtaat tgatgcacgg 420

atccgcccat tgcccctcga atgcctgtac aagctgttcg cacagttcgt cgttcgggaa 480

tacaccctgc tgcattggcg taaagacgtt cacataagcg ataccgatac ggtcacggcg 540

gcgcgatacg ccttcaccgc ccagggtggt aattccaccg gcgttaaact gcacggtgag 600

tcgaacccag gtatcagttg ttttcggatc gtatttctcg ccgtcaattt ccaccccgtc 660

aacaatcaga ccgagattca gcaaacgggt ggtgatcacg gcgcggatat cattaatcgt 720

cacgattgat agccctgtaa ttagtagaat gtgtgaaacg cgtaatttca atctgcacag 780

cacgatccac aaaaccagcg ggtgattgtt gtgaccagcc gttattcagt cggttaatgt 840

aaggcgtatt gttggtgata taaatgacgc ctttcgatgg ttcataagtt aatatgtcag 900

ccagcccgga cgactgcttt gactgtgctg acgcaacatc accttttgac ccgtcattgc 960

ctgttggtgc tgtaccagct gatacccacc agtttgcag 999

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

cgtcagatct ggaatcacag 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

cgtccgttat tcaggttagg 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

ggtgtcgtaa caagtgtcgc 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

gcttatgaca gcagattgcc 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

cctgctcgtc atcgtggaag 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

gccgttaccg caccagatac 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

ccctgtagaa ttactgcccg 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ccgcgactat acattcaccg 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

ctttcgaact tctgaacgcc 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

tatcaccaaa cttggcgtta 20

<210>16

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

cacgaacgtc tgcgcgtcg 19

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>17

caactaagta cagaggtat 19

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>18

tcgatgcatg tcgcatttaa 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>19

ctgcaaactg gtgggtatca 20

Claims

1.对鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的噬菌体，其属于长尾噬菌体科的B1形态组，特征为等轴衣壳和非收缩性长尾，该噬菌体的全基因组大小为61kbp，主要结构蛋白的大小为38kDa和49kDa。

2.如权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体具有图1所示的形态。

3.如权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体的全基因组包含选自由SEQ ID NOs.1、2、3、4和5组成的组中的一种或多种核酸分子。

4.如权利要求1所述的噬菌体，其中利用选自由SEQ ID NOs.6和7、SEQ ID NOs.8和9、SEQ ID NOs.10和11、SEQ ID NOs.12和13、SEQ ID NOs.14和15、SEQ ID NOs.16和17以及SEQ ID NOs.18和19组成的组中的一对或多对引物对进行PCR时，所述噬菌体产生的PCR产物为约660bp、670bp、1.3kbp、1.8kbp、1kbp、1kbp和1kbp。

5.如权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体在pH 2.5-pH 9.0的pH范围内具有耐酸性，在37℃-70℃的温度范围内具有耐热性，在60℃持续120分钟时具有耐干燥性。

6.如权利要求1所述的噬菌体，其保藏号为KCCM10969P。

7.用于预防或治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病的组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的噬菌体。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，由鸡沙门氏菌引起的疾病为禽伤寒，由鸡白痢沙门氏菌引起的疾病为鸡白痢。

9.如权利要求7所述的组合物，其中所述组合物被用作抗生素。

10.动物饲料或饮用水，其包含作为活性成分的权利要求1-6中任一项所述的噬菌体。

11.消毒剂或清洁剂，其包含作为活性成分的权利要求1-6中任一项所述的噬菌体。

12.权利要求1所述的噬菌体或权利要求7所述的组合物用于治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌在除人以外的动物中引起的传染病的方法。