CN109735508B - 新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，本发明提供了新的沙门氏菌噬菌体、其组合物、它们的制备方法和应用，本发明所述新的沙门氏菌噬菌体为肌尾噬菌体BP‑66(Myoviridae sp.BP‑66)、保藏编号CCTCC NO：M2015146，肌尾噬菌体BP‑63(Myoviridae sp.BP‑63)保藏编号CCTCC NO：M2015145，长尾噬菌体BP‑12(Chilikevirus sp.BP‑12)保藏编号CCTCC NO：M2015141。本发明所述新的噬菌体为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性，具有较广的宿主范围，低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；所述噬菌体的DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；于培养液中室温下稳定存活，4℃下超过6个月；而且在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可实现大规模工业生产。本发明所述沙门氏菌噬菌体能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源。

Description

新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用

本申请为申请号201510308565.0，申请日2015年06月09日，发明名称为“新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用”的分案申请。

技术领域

发明属于微生物技术领域，具体涉及新的沙门氏菌噬菌体性、其组合物以及它们的制备方法和应用。

背景技术

沙门氏菌被认为是目前世界范围内最重要的食源性致病菌之一，据资料统计，我国发生的食源性疾病，70％-80％是由沙门氏菌引起的。由于沙门氏菌血清型众多，在自然界分布广泛，可通过污染蛋类、肉类、奶类等食品导致人类食物中毒；家禽被沙门氏菌感染后出现禽伤寒、禽副伤寒、鸡白痢等疾病。沙门氏菌属目前有肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌2个种。有资料报道，截止2007年底有2700种以上的血清型，分属46个O群，而我国检测到的血清型达290种以上。现今生产中抗生素的滥用使许多细菌出现了耐药性，而耐药菌株在临床病人中不断增多，特别是多耐药株，将严重地危及到感染病人的治疗效果。这使得沙门氏菌病原菌的防治面临严峻挑战。

噬菌体是一类细菌依赖性病毒，可以侵染细菌，并在菌体内繁殖使细菌裂解而杀灭细菌。噬菌体作为细菌的天然克星，在控制细菌感染方面有着突出的优越性。早在20世纪初，用噬菌体治疗细菌感染就取得过积极的效果。因其对于特异性宿主菌具有裂解作用，因此可考虑到将噬菌体作为一种抗细菌感染的制剂来使用。

李梦哲(宽谱沙门氏菌噬菌体STP4-a的发酵制备及其在蛋鸡体内的抑菌研究[D].中国海洋大学硕士学位论文,2014)发现沙门氏菌噬菌体STP4-a可识别沙门氏菌，其裂解率为80.04％；包红朵等(腐败希瓦氏菌噬菌体的性质和防腐应用研究[D].中国海洋大学硕士学位论文,2012.)发现沙门氏菌噬菌体PSA-6a可裂解5株沙门氏菌及1株大肠杆菌。

CN200980000314.9公开了新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物，以用于治疗和预防鸡沙门氏菌的传染病的治疗；CN201010508259.9公开了一株沙门氏菌噬菌体及其应用，以用于控制沙门氏菌对食品和器具的污染。

目前，如何丰富广谱性噬菌体资源，寻找强裂解性新的噬菌体是本技术领域对于沙门氏菌病原菌防治中急需解决的问题。而从污水中筛选烈性噬菌体是研发新型抑菌制剂以促进噬菌体疗法发展的一条有效途径。

发明内容

针对以上技术情况，本发明提供了新的沙门氏菌噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用，本发明所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)、肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)或长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)，

其中所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，

所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015145；

所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。

作为本发明实施方案之一，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

经测序发现肌尾噬菌体BP-66与肌尾噬菌体BP-63具有相同的核苷酸序列，它们之间却具有不同的特性，例如包括但不限于：1、噬菌体之间的压力耐受性几乎相差两倍；2、在裂解谱测定中，对于DT193A这株细菌，肌尾噬菌体BP-66能裂解，但是肌尾噬菌体BP-63不能裂解；3、在同一浓度的裂解能力上，肌尾噬菌体BP-66的裂解能力更高。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63、长尾噬菌体BP-12是从加拿大蒙特利尔污水处理厂中分离出的。其中，

肌尾噬菌体BP-66的生物学特征为：在电子显微镜下观察BP-66噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有短收缩尾部与线性双链DNA(图4)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。

肌尾噬菌体BP-63的生物学特征：在电子显微镜下观察BP-63噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有短收缩尾部与线性双链DNA(图5)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)。

长尾噬菌体BP-12的生物学特征：在电子显微镜下观察BP-12噬菌体形态发现，其为有尾噬菌体，无折叠，具有长且无收缩尾部与线性双链DNA(图6)，基于其独特的大小及形态，根据病毒分类国际委员会(ICTV)定义，该噬菌体被系统分类为长尾噬菌体科(Siphoviridae)。

肌尾噬菌体BP-66全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，噬菌体BP-66与肌尾噬菌体科的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，噬菌体BP-66鉴定为肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)。肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)具有如SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

肌尾噬菌体BP-63全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，BP-63噬菌体序列与可对比噬菌体序列相似度均较低，小于70％。依其形态特征可将BP-63噬菌体分类为肌尾噬菌体科(Myoviridae)，但序列比对结果显示其与已知噬菌体亲缘关系均较远，无法进行匹配。因此BP-63可鉴定为肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)。肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

长尾噬菌体BP-12全基因组序列大小为40kb(图7)。将序列与局部序列排比检索基本工具中现存的所有噬菌体序列进行比对。通过BLAST程序计算比对的显著差异。采用核酸比对程序(mega blast)搜索相似度较高的序列以及更多不相同的序列。结果表明，BP-12噬菌体与长尾噬菌体科Chilikevirus属的相似度最高。结合形态特征和全基因组序列分析，BP-12噬菌体鉴定为长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)。所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus BP-12)具有如SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

本发明所述述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12不含毒力基因或不良基因，其中所述的不含毒力基因或不良基因是指不包括表6所记载的毒力基因或不良基因。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体(Myoviridae)BP-63或长尾噬菌体BP-12不识别非致病性细菌；

作为实施方案之一，所述非治病性细菌包括肌尾噬菌体BP-63不可识别的57株非致病性细菌、肌尾噬菌体BP-66不可识别的56株非致病性细菌、或长尾噬菌体BP-12不可识别57株非致病性细菌，其中肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12均不识别的非致病性细菌包括54株非致病性细菌；其中上述所述的非致病性细菌是指表9所具体记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12所不识别的非致病性细菌。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12不识别非宿主性致病性细菌。

作为本发明实施方案之一，所述非宿主性致病性细菌为184株非宿主性致病性细菌；以上所述非宿主性致病性细菌是指表10所记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12所不识别的非宿主性株致病性细菌。

作为本发明实施方案之一，本发明的另一目的在于提供了所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12在裂解沙门氏菌范围中的应用。

作为本发明实施方案之一，所述的沙门氏菌包括肌尾噬菌体BP-63可裂解的35株血清型肠道沙门氏菌、肌尾噬菌体BP-66可裂解的38株血清型肠道沙门氏菌、或长尾噬菌体BP-12可裂解的22株血清型肠道沙门氏菌。其中，所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12都可裂解的包括43血清型肠道沙门氏菌；其中以上所述的血清型肠道沙门氏菌是指表7所记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12可裂解的血清型肠道沙门氏菌株。

作为本发明实施方案之一，所述沙门氏菌还包括肌尾噬菌体BP-63可裂解的22株不同血清型肠道沙门氏菌、肌尾噬菌体BP-66可裂解的25株不同血清型肠道沙门氏菌、或长尾噬菌体BP-12可裂解的24株不同血清型肠道沙门氏菌；其中肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12均可裂解的包括25株不同血清型肠道沙门氏菌；其中以上所述的不同血清型肠道沙门氏菌是指表8所示记载的肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12可裂解的血清型肠道沙门氏菌。

作为本发明实施方案之一，所述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的浓度为108PFU/ml、107PFU/ml、106PFU/ml、105PFU/ml。

作为实施方案之一，本发明还提供一种肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的制备方法，所述制备方法包括：

1-1)采集加拿大蒙特利尔污水处理厂水样离心取上清液，然后与LB液体培养基与处于对数期的沙门氏菌均匀混合，于37℃过夜培养，富集噬菌体；

1-2)将样本富集液离心，取上清液除菌得到含有噬菌体的滤液，取滤液与其宿主沙门氏菌菌液均匀混合，静置使其与细菌表面的受体充分结合；

1-3)将上述混合液加入半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上进行培养，形成噬菌斑后取噬菌斑，接种于液体培养基中，加入沙门氏菌菌液并混匀过夜培养，3500rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态；

1-4)重复步骤3)的操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑，即得肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12。其中，所述噬菌体为肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12，其中肌尾噬菌体BP-66的保藏编号为CCTCC NO：M2015146，肌尾噬菌体BP-63的保藏编号为CCTCC NO：M 2015145，长尾噬菌体BP-12保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。

经过核苷酸测序，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

其中所述肌尾噬菌体BP-66和肌尾噬菌体BP-63具有相同的核苷酸序列。

本发明进一步还提供一种肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的发酵方法，所述方法包括：2-1)取肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12的菌落，接种到LB培养液中振荡得到宿主菌悬液；

2-2)将菌悬液稀释转接到LB培养液，振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度；

2-3)调节噬菌体BP-66或BP-12的发酵初始pH值为6、噬菌体BP-63发酵初始pH值为2；

2-4)采用火焰接种法接种，向LB液体培养基中分别接入噬菌体和对数期宿主菌液并发酵，发酵过程中通入无菌空气，并加入消泡剂；

2-5)发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液取出并离心，上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存，即得。

作为本发明实施方案之一，所述制备或发酵方法中，所述LB培养液或LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

作为本发明实施方案之一，本发明还提供一种噬菌体的组合物，所述组合物含有肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12中的任意两种或三种的组合物。

作为示例性的说明，如肌尾噬菌体BP-66和肌尾噬菌体BP-63的组合物、肌尾噬菌体BP-66和长尾噬菌体BP-12的组合物、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的组合物，以及肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的组合物，它们的之间的比例关系可以由本领域技术人员结合本发明以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。

作为进一步的实施方案之一，所述噬菌体组合物包括含有肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12；作为更进一步的实施方案之一，所述组合物中肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的生物量比为1：1：1。

本发明述肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12在噬菌体效价、裂解沙门氏菌的最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、温度及压力对噬菌体存活的影响、存活稳定性等方面具有如下的生理特性：具有较高的效价(参见表1)其中长尾噬菌体BP-12、肌尾噬菌体BP-63及BP-66感染肠道沙门氏菌的最佳MOI分别为0.00007、0.1及0.1；并具有高度亲和性及裂解能力的烈性噬菌体，可迅速裂解沙门氏菌(表2)；所述噬菌体BP-66在pH为6时生长活性所受影响最小，BP-63最适pH为2，BP-12则为6(表3)；对温度的热稳定性均相对较好，同时对压力的耐受性较好；适宜4℃低温存放。

而且肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12无毒力基因或不良基因；对沙门氏菌的裂解范围：供试噬菌体具有较宽的宿主范围，可识别除2270号菌株以外所有44株不同血清型的肠道沙门氏菌。而且在不同浓度下与沙门氏菌的互作，在低浓度下依然对宿主菌具有裂解性。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12对非致病性细菌的裂解：仅与大肠杆菌有限的几株菌株(29株供试菌株中的3株)反应。更进一步地、所述长噬菌体BP-12及本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12的组合物无法识别除1株苏云金芽孢杆菌及5株大肠杆菌外的其余非致病性细菌。

本发明肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别173株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株。

本发明的所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12具有如下的优势：其为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围且在低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；其DNA无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存6个月。本发明未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本发明肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。

现有技术中，李梦哲(2014)发现沙门氏菌噬菌体STP4-a仅识别沙门氏菌，其裂解率为80.04％；包红朵等(2011)发现沙门氏菌噬菌体PSA-6a可裂解5株沙门氏菌及1株大肠杆菌。本发明中3株沙门氏菌噬菌体鸡尾酒组合可裂解43株沙门氏菌，裂解率可达97.7％，且可识别1株苏云金芽孢杆菌及5株大肠杆菌，具有更强的裂解性及更宽的宿主谱。因此本发明具有更为优质的技术效果。

近年来，随着抗生素的滥用，细菌对其耐药性逐渐增强，尤其是病原菌耐药菌株的出现，对经济造成损失的同时也极大威胁着人类健康，克服细菌耐药性已成为目前的关注重点。本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物对细菌具有专一且较强的杀灭能力，本领域技术人员可以根据本发明的记载及本领域常识将本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物制备成应用于医疗，检测，消毒及食品防护等方面的各种产品加以工业应用。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物可以由本领域技术人员根据本发明的记载和本领域常识制备成应用于治疗或预防由沙门氏菌引起的感染性疾病的药剂或试剂。可被沙门氏菌感染的寄主包括人类、家畜(猪、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭、鹅等)，以及各种兽类、鱼类、鼠类等。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物的产品形式可包括但不限于以载体携带、浓缩注射或药剂浸泡等形式施用于被防治的寄主体表、口部、直肠、胸膜内部等部位；作为实施方案之一，所述载体携带形式包括但不限于口服含水性载体、口服无水性载体、乳膏制剂等；浓缩注射形式包括但不限于疫苗注射、胸膜腔注射、经脉注射等；药剂浸泡形式包括但不限于气雾剂、漂洗剂等。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63及长尾噬菌体BP-12可选取一株或多株被制备成作为有效成分应用于沙门氏菌的快速检测试剂或试剂盒。其包括但不限于以试纸、试剂盒等形式对目标样本中的沙门氏菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，可有效确保检测的灵敏度。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、以及长尾噬菌体BP-12或其组合物被制备常作为有效成分应用于环境消毒的各种产品，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、医疗设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、LB培养基、氯游离水等。

本发明所述肌尾噬菌体BP-66、BP-63、及长尾噬菌体BP-12或其组合物还被制做成作为有效成分应用于食品防护的各种产品。本发明包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与合成组分联合使用等形式对由沙门氏菌侵染所导致的食品腐坏进行预防，尤其适用于熟食或不宜灭菌的食品。所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于食品除菌剂、食品消毒剂、食品防腐剂等；本发明中合成组分包括但不限于苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、丙酸钙等。

附图说明

图1是肌尾噬菌体BP-66噬菌体平板培养照片；

图2是肌尾噬菌体BP-63噬菌体平板培养照片；

图3是长尾噬菌体BP-12噬菌体平板培养照片；

图4是肌尾噬菌体BP-66噬菌体透射电子显微镜照片；

图5是肌尾噬菌体BP-63噬菌体透射电子显微镜照片；

图6是长尾噬菌体BP-12噬菌体透射电子显微镜照片；

图7是肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12噬菌体基因组大小。

所述肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，

所述肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015145；

所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072；保藏日期为2015年3月23日；保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

以下实例中，所涉及菌株代号均以本公司的命名方式编号。

以下实例中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂7g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

SM液配方为：氯化钠8.5g，硫酸镁2g，1mol/L TrisHCl 50ml，明胶0.25g，蒸馏水1000ml。

肌尾噬菌体P-66、肌尾噬菌体BP-63和长尾噬菌体BP-12的组合物(1：1：1)均为按照实施例13的方法制备。

实施例1肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12的分离纯化

采集加拿大蒙特利尔污水处理厂水样50ml，3500rpm离心10min后取9ml上清液，将其与1ml 10倍LB液体培养基及1ml处于对数期的沙门氏菌(10⁸cfu/ml)均匀混合，于37℃过夜培养，富集噬菌体。将样本富集液3500rpm离心10min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液。取滤液50μl与其宿主沙门氏菌菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h，观察噬菌斑生长情况。在形成噬菌斑的双层平板上，用无菌枪头挑取大而透亮的噬菌斑，接种于5mlLB液体培养基中，加入0.1ml沙门氏菌菌液并混匀，37℃过夜培养，3500rpm离心10min取上清后以细菌滤膜过滤，采用双层平板法观察噬菌斑形态。重复操作3-5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。

自蒙特利尔污水中共分离得到3株沙门氏菌噬菌体，其分别为肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63或长尾噬菌体BP-12。BP-66与BP-63噬菌体在沙门氏菌菌苔上均产生单一的大而透明的圆形噬菌斑，直径为10mm(参见图1、图2)。BP-12噬菌体在沙门氏菌菌苔上产生单一的大而不透明的圆形噬菌斑，直径为11mm(参见图3)；BP-66噬菌体、BP-63噬菌体、BP-12噬菌体透射电子显微镜照片参见图4-6。

肌尾噬菌体BP-66(Myoviridae sp.BP-66)的保藏编号为CCTCC NO：M 2015146，肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)的保藏编号为CCTCCNO：M 2015145，长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。

经过核苷酸测序，所述肌尾噬菌体BP-66具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列；肌尾噬菌体BP-63具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或长尾噬菌体BP-12具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列。图7是肌尾噬菌体BP-66、肌尾噬菌体BP-63及长尾噬菌体BP-12噬菌体基因组大小。

实施例2噬菌体BP-66、BP-63及BP-12效价的测定

用SM液做稀释液，将噬菌体BP-66、BP-63及BP-12原液分别10倍梯度稀释至l0⁷倍。分别取l0⁵、l0⁶及l0⁷稀释度的噬菌体培养液l00μl与其宿主菌多重耐药性鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 700408)菌液300μl均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4ml冷却至47℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于37℃倒置培养6-8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝平均噬菌斑数×稀释倍数×10

从表1可以得出，噬菌体BP-66、BP-63及BP-12培养12h后均具有10⁸PFU/ml以上的效价。

表1连续培养条件下噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的效价

实施例3噬菌体BP-66、BP-63及BP-12对沙门氏菌最佳感染复数(MOI)的测定

挑取肠道沙门氏菌单个菌落，接种到盛有3ml LB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到l0ml LB培养液，37℃160rpm振荡培养至对数前期。按照感染复数比例分别加入噬菌体BP-66、BP-63及BP-12纯培养液和宿主菌(MOI＝噬菌体数量/细菌数量)，加入LB液体培养基使各管总体积相同。在37℃摇床中160rpm振荡培养4h。培养完毕后10000g离心l0min并收集上清，测定噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。

结果如表2所示，噬菌体BP-12效价达到最高(2x10⁸ PFU/ml)时，其MOI＝0.00007；噬菌体BP-63效价达到最高(7.7x10⁹ PFU/ml)时，其MOI＝0.1；噬菌体BP-66效价达到最高(1.4x10⁸ PFU/ml)时，其MOI＝0.1；因而可以确定噬菌体BP-12、BP-63及BP-66感染肠道沙门氏菌的最佳MOI分别为0.00007、0.1及0.1。

表2不同感染复数下噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的效价

实施例4噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的pH稳定性试验

取无菌EP管分别加入不同pH(2、4、6、9)的LB培养基900μl后将上述EP管置于37℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入l00μl菌体纯培养液，恒温反应120min。待反应时间结束后将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。重复实验3次。

结果如表3所示，噬菌体BP-66在pH为6-9的范围内的效价相对较稳定，BP-63的pH范围为2-4，BP-12则为4-6。

表3反应不同时间后噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的pH值稳定性

a.BP-66的pH值稳定性(起始浓度：10⁶PFU/ml)

b.BP-63的pH值稳定性(起始浓度：10⁸PFU/ml)

c.BP-12的pH值稳定性(起始浓度：107PFU/ml)

注：ND：未测定。

实施例5噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的热度及压力稳定性试验

各取l00μl噬菌体纯培养液分装于无菌EP管中，分别于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中作用5min；使用弗氏细胞压碎器使噬菌体置于极高压力条件下(1000psi)放置5min。作用时间结束后取出样品管并立即置于冰浴中冷却，经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。

结果如表4所示，BP-66最适存活温度为50℃，BP-63最适存活温度为60℃，而BP-12最适存活温度为60℃。3株噬菌体对温度的热稳定性相对较好，在60℃水浴作用下仍有较高的效价，但当水浴温度增加至70℃后，其效价难以检查，对温度的耐受性不高，不宜长时间在高温下作用。而供试噬菌体对压力耐受性均较好，在压力为1000psi时仍有较高效价。

表4噬菌体BP-66、BP-63及BP-12于不同温度及压力下的效价

实施例6噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的存活稳定性试验

各取lml噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的纯培养液分装于无菌EP管中，分别于4℃、25℃、37℃下放置，定期经适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。

结果如表5所示，4℃条件下噬菌体BP-66与BP-63可存放259d，且对宿主菌的侵染力均大于95％，BP-12则可存放161d；25℃下噬菌体BP-66与BP-63分别可于168d及126d内保持对宿主的高侵染性，而BP-12仅能维持14d；37℃下噬菌体BP-66与BP-63分别可在15d及37d内维持高侵染性，BP-12则仅可维持2d。说明3株供试噬菌体适宜4℃低温存放。

表5噬菌体BP-66、BP-63及BP-12于不同保存温度下的存活稳定性

实施例7噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的毒力基因或不良基因缺失检测试验

选取65种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因(表6)，通过测定噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有上述毒力基因。

结果显示，3株供试噬菌体均不含有下列毒力基因。供试噬菌体无不良基因。

表6病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因

实施例8噬菌体BP-66、BP-63及BP-12对沙门氏菌裂解范围试验

采用点滴法来测定噬菌体的裂解谱。挑取44株不同血清型肠道沙门氏菌的单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl噬菌体培养液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例为1:1:1)的培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表7所示，BP-66、BP-63及BP-12具有较宽的宿主范围。BP-63可裂解35株血清型肠道沙门氏菌，BP-66可裂解38株，BP-12可裂解22株。更重要的是，含有BP-66、BP-63及BP-12的鸡尾酒(比例为1:1:1)可识别除2270号菌株以外的所有供试沙门氏菌。说明这些噬菌体具有较宽的宿主谱且在噬菌体治疗方面具有极大的应用潜力。

表7 BP-66、BP-63、BP-12的裂解谱测定结果

注：+++：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

实施例9噬菌体BP-66、BP-63及BP-12在不同浓度下与沙门氏菌的互作试验

挑取25株不同血清型肠道沙门氏菌单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。用SM液做稀释液，将噬菌体BP-66、BP-63及BP-12原液分别调整浓度至10⁸PFU/ml、10⁷PFU/ml、10⁶PFU/ml与10⁵PFU/ml后，分别取5μl噬菌体培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表8所示，BP-66可裂解25株细菌，其在10⁸与10⁷PFU/ml浓度下对所有供试菌株均具有强裂解性；BP-63可裂解22株细菌，其在10⁸PFU/ml浓度下对20株细菌菌株具有强裂解性，对2株细菌具有裂解性，对3株细菌无裂解性；BP-12可裂解24株细菌，其在10⁸PFU/ml浓度下对19株细菌具有强裂解性，对5株细菌具有裂解性。

表8a-c不同浓度下噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的交互反应8a.不同浓度下BP-66的交互反应

8b.不同浓度下BP-63的交互反应

8c.不同浓度下BP-12的交互反应

注：⁺⁺⁺：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

实施例10噬菌体BP-66、BP-63及BP-12对非致病性细菌的裂解试验

挑取包括芽孢杆菌属、大肠杆菌等在内的61株非致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表9所示，在本研究中，BP-66、BP-63及BP-12分别与30株供试大肠杆菌菌株中的5株、4株及3株反应，同时BP-12及鸡尾酒组合无法识别除1株苏云金芽孢杆菌及6株大肠杆菌外的其他非致病性细菌。即，BP-63对57株供试细菌无裂解性，BP-66对56株供试细菌无裂解性，BP-12对57株供试细菌无裂解性。这类交互反应对于噬菌体疗法的应用具有极大帮助。

表9沙门氏菌噬菌体及鸡尾酒与61株非致病性细菌的交互反应

注：⁺⁺⁺：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

实施例11噬菌体BP-66、BP-63及BP-12与非宿主性致病性细菌的互作试验

挑取185株非宿主性致病性细菌单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μl噬菌体培养液及含有BP-66、BP-63及BP-12(比例为1:1:1)的鸡尾酒组合培养液滴于平板的不同位置上，加样时各噬菌体培养液间不可接触，以免影响试验结果。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

将噬菌体与非宿主性致病性细菌进行交互反应，结果显示，BP-66、BP-63及BP-12仅可识别185株供试非宿主性致病性细菌中的1株(表10)。

表10沙门氏菌噬菌体及鸡尾酒与185株致病性细菌的交互反应

注：⁺⁺⁺：完全裂解；++：大部分裂解；+：裂解；+/-：微弱裂解；-：未裂解

实施例12噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的发酵制备

挑取肠道沙门氏菌单个菌落，接种到盛有3ml LB培养液的试管中，37℃摇床中160rpm振荡培养12h，得到宿主菌悬液。将菌悬液以1:100比例转接到500ml LB培养液，37℃160rpm振荡培养至对数前期并测定其菌悬液浓度。沙门氏菌噬菌体BP-66、BP-63及BP-12发酵制备的体系为8L，发酵培养基为LB培养基。以3株噬菌体最适pH值为参数调节发酵培养基的初始pH值，其中噬菌体BP-66与BP-12的发酵初始pH值为6，噬菌体BP-63发酵初始pH值为2。采用火焰接种法接种，以其相应的最佳感染复数比例向发酵培养基中分别接入80ml的噬菌体(10⁸PFU/ml)和对数期宿主菌液(10⁹CFU/ml)。发酵过程中通入无菌空气，并加入3‰消泡剂，发酵制备时间为12h。自发酵开始起每2h自取样口取20ml噬菌体与宿主菌的混合液于无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜除菌得到含有噬菌体的滤液并测定其效价，方法参照实施例2。待发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液自取样口取出接入无菌容器中，6000rpm离心15min，取上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存。

由表11可知，噬菌体BP-66与BP-12均于发酵6h时效价达最高，分别为4x10¹⁰ PFU/ml与2.5x10¹⁰ PFU/ml；噬菌体BP-63则于发酵8h时效价最高(3.5x10¹⁰ PFU/ml)。其后3株噬菌体的效价虽有所下降，但整体数量级未发生变化，12h发酵结束后各噬菌体效价均由初始的10⁸PFU/ml升高至10¹⁰PFU/ml，提高了2个数量级。因此，利用发酵法进行噬菌体的大规模工业制备是切实可行的。

表11沙门氏菌噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的发酵动态

实施例13噬菌体BP-66、BP-63及BP-12组合物的制备

分别取效价为1x10⁸ PFU/ml噬菌体BP-66、BP-63及BP-12的原液，将3株噬菌体等体积均匀混合于SM液中，制成BP-66、BP-63及BP-12的1:1:1的鸡尾酒组合。选取实施例8中3株噬菌体对44株不同血清型肠道沙门氏菌具有不同裂解能力的菌株，共33株，挑取其单菌落分别接种于盛有3ml LB的试管中，160rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μl菌悬液分别与半固体培养基混合铺于普通琼脂平板上，分别取5μl噬菌体鸡尾酒组合的培养液滴于平板的不同位置上。待自然风干后37℃培养6-8h，观察结果。试验重复三次。

结果如表12所示，BP-66、BP-63及BP-12分别对该33株沙门氏菌具有不同的裂解能力，其中BP-63可裂解25株供试沙门氏，BP-66可裂解28株，BP-12可裂解12株。而3株噬菌体的鸡尾酒组合可识别所有供试沙门氏菌且将其被裂解能力最大化。说明噬菌体鸡尾酒组合可弥补噬菌体单一应用时宿主谱的局限性。

表12噬菌体BP-66、BP-63及BP-12组合物的裂解谱测定结果

序列表

<110> 菲吉乐科（南京）生物科技有限公司

<120> 新的噬菌体、其组合物以及它们的制备方法和应用

<130> LAC181271P

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 52437

<212> DNA

<213> 肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp. BP-63)

<400> 1

acttagaggc gtctatatgt atgatccggt ttatctcttt attaatatca gaaccggatg 60

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tcgaactgta tcacccggac gacctgaagt acaacaccat ttcccacgaa ggcattcacg 4800

taatgtcatc gctgatgaac tatgtagggc ttaaatacga cccagaaaac gatgaatggt 4860

acgcatatca gcatgatttc atcgtaaatg ccatttgtaa ggcccatgac gagtatatag 4920

agcgtcaaaa aacgccaaaa actaagccaa aaatcgaaac aggtaaccat cctgcaatac 4980

tgccacaaga cgtaatgaac tcgcttttga ctgacactac tggggacttt taggtgatta 5040

atataatctt cgcaatgggc caaaatgggg aattcgggtt atctccggag tttatgaagc 5100

atcaggttga ctcgtgtaag accatggatg aggttcgtgc gcttcctaaa tcgggtctcc 5160

cttggaaatg tccgtcagat atgctctttt tcaggactat gactaattca attgcgtcag 5220

aaccaggcta taatgcgtat cagcaactac gtggacagtt cccaaatgac cagttgcgaa 5280

acatgatagc agatgtaact gtaaaaatgg tcgggcatag tgtattgtta gccggtcgta 5340

atacgtatat gactatgagt ctgcctatgt cagcccacag aatactgctg cctgtatctc 5400

gtcagattat ggcttcagaa ggctacaata atttgggtga gatggcagca gaccttgaat 5460

ccagaggtac tgacgtctgg attgtaggcg gtgccgagtt gatactttcg gcccttgaag 5520

agcatgcaaa agacttactc cgtatcgaca acatgtttat cagtacaatc aagcaatcag 5580

gtccaagtga tattttaatg gattgtagca aattaatgat gtacattgat agcgacttca 5640

cttataatga tgaatatgtt gataacaaac aagttctgat acaacggtac aggagtttac 5700

acaaatgaac atcataatcg aggggcccga caatgctggt aaaagtacac ttattgagtt 5760

ccttaaatct catactggcc gcagtgttat tcataatact gttgataaag accccgaatc 5820

ggtcatggct aaacaggcca aagaaaacgc gttggagggc gattgcattt atgaccgtag 5880

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taatgtatca catgtagcag atatgtgtga caacgccatc gttatctttt gtatgccgcc 6000

tgttgaaaag gtactggcaa ctacaaaaga cgagatgcct ggcgttgtgg aaaatcttga 6060

ggcgttatac aatcagtatg acaacctcat tgacgagctg gttatgatga gtaagcagtt 6120

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cgaacgtatt aataaggagt ggaacaaatg agcccagtat acaatacctc agtcacgctg 6240

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gagctggaat atcgcacagg tgagatgttc agcagtgcac taaactggta cttgtgcaag 6540

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gaaattgcta aaggctgggc gcatgtacag atgctgcaag agcatatctg caagctggaa 6660

agctgcaata aagacgcgtc tgagcttatt actgcctata agcgacagat taacgacctg 6720

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ctgtaaccca caacgggcag attgcatatt acggaggcca tagcgaacat ccgatgtgca 7080

ctcacctgta caacgctatc acaaccatat ccgacgaaaa cgttattaag tacggaaaag 7140

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agggtgcgga gattcacgtt ctgctgatgg atgagcttac tcacttcaca gaaacgatgt 8100

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ggccactgcc actcatcttt tgtgggtcaa accctggtgg tgttggtcat aactgggtta 8220

agcgcacttt cgtaactgct gctcctccga tgaaaatcgt taagcaggaa aaacgcgaag 8280

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tgaaagaggg tgactgggat attgttgctg gtggtgcgct tgacgacgta tggtcaacca 8460

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ggggttctac tcacccgttc tctgttggta tctgggctat cgcaaatggt gcctcgctta 8580

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ggtatgggtg ctctgaaaaa gaagctaaca ggggtattaa gctatctgct gccgaagtcg 8700

ctcaaggtgt tcttcgccta caggaaaatc tgcaggctgg tggctggatt caaagtaacg 8760

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cgagaataaa tggcttagag ctattccgtc agcttctgaa aaatgttaag atggacgaaa 8940

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taaatatggg acggtaaaat gtcgataacc ccaagcagca cgccgaacgt cggataccag 9180

cgtcctgagc tgactaagaa cgctggtaag taccgaatga ttaaggactg catcgagggt 9240

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tggcgagaag agtatcgcaa cggtaaagtg atgctcactc aagttgtcat ttgcgaacag 9720

ataccgggtg ttactgatgg ctttcagcaa gactacacac ccgtgtggcg tcacctttac 9780

ctggatgaag aaggcaattg caaccagtct ttgtgggtca ataagggcga caagaacgcg 9840

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aatggcttac cgttgaagtt tattccgttc cagtttattg gttctgaaac aaacagcgct 9960

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ccgtttgaag cgatgaagca aaaagaagca cagatgattg caatcggtgc tcgtctgatt 10260

cgtgagaatg gtaaggtaga acgacgcgaa gttgagatta agaatgaagc tgcatctgaa 10320

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gtagcaaaag aagcagaaaa gaacgctcaa gcagctaaga acagcgatgg gcaggaaaat 10680

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atataggatt gtaaaattat ggcacttaaa acagttgtaa ctgaccttac cgaagttgat 10920

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gctgaagaag aacgcgcacg tcgtgagcgt gatgttgaat ctcttgagcg ctctatcaaa 11160

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ccggcactta ttatgccaca catcaaggcc cgactgcgcg ctcaggaaat tgatggtaag 11340

tggcgtacta ctgtcgtgga tgttatgggt aacccgactg ctacaacgcc agatgaacta 11400

gtggaacata tgcgcgctga taagcagttt gcacctcttg tgcgtggaac caaggctggc 11460

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tggggcaaat aatttatgtc actgtatatt tttaacgaac aagtacgttc taccgccacc 11640

gaactggttg accaggacgt acagaagttt aacgaagctt ctgcaggtac ccttattctg 11700

ggtaaccagt acgtaatcgg tgattacgtt gagcaggcaa tgtggcagct ggttgacggt 11760

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gcatctgctg caatgttcca ggattacctg aacaccactg ctgcatgtct ggtagctgct 12000

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atcaccatgc agaacctgaa caaagtcaac gcgaagatgg gtgaccgttc tcagcagatt 12120

cgtgcgtaca tcatgcactc tactgcgttc cactccctca tcgaccaggc tatcaacaac 12180

acagaacacc tgttccagat tggtgacctg aacgtgtaca aagacttcct gggtcgtcgt 12240

tatgtcgttt ccgacatccc ggctctggtt gatggcgccg gtgcttccgc taagtaccgc 12300

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ggtgttatgt tgctggctaa gtctgcaatc taacccacaa acgggactaa caaaaggcga 12600

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acttgctgga ggctttctat ggcatacaca cttgttgtgg aagacggttc aattgttccg 12720

ggtgctaact cgtatgttag cactgcagaa gttgatgagt ttatcactaa cgaaggtatt 12780

ctcattcaac caggaactga cccgtactac caagctgcca aagcagctat ccgacttgat 12840

aaccagttta actggctagg tcgtaaggtc agcaaaacac agagcatggc ttggccccgt 12900

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ctggcacagc tttatatgat ggccagtgta ttgagctacg acggtgaaga aggtgtgcgt 13020

agcgaccagg ctttgcgccg taagaaagtt ggtaacctgg agattgaata cttcgactcc 13080

aaatcaggcg ttaccggtgc aactgacctt tggacgtcag acgtcagggc catgctcaag 13140

caccttgtgg gtgcatcact gagagcgcgg agagtataat gattcgtata cgccttgaac 13200

gtcgcgacaa acaaaagttc gagttcacct accgtgcctt taagtcgttt gaaggtcaag 13260

gcgtatcagt aggtgttcat ccagagcaca acagacgtat aaatcccagg gaccgtataa 13320

caaacgccga gctagcaatg gtgcatgagt acggtcttaa cggcctgcca gaacgaagct 13380

ttcttcgtag tgctgttggt ggcaggggta aaggccgaca ggcaataaac aaagctttcc 13440

gcgataatgt acctgctgtt ctcagaggaa gcatgactgc gcatgagctt aacgacaaaa 13500

taggtcgtat gcttgttgac gctgttcacg acagaatgga cagtgacgtg ccacctccta 13560

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ttcgctaatg aaggataaaa cctttgtagc attaacagat gttcttctcc gaaatgattc 13740

acgcttacca aacggcgact tcgaagacga atatacagct gcaaagtatc tgtgtaacat 13800

tcaacctggt gcagctacta accagcctaa cctgttgact aaagacgatg gcgagcatga 13860

gttcccacgt attgcgatat actgtggaca agaactaaag ctcggagact tcgttatata 13920

cgaagaccag ccataccgtg tattccgtat cgacccatgg agtcgtcatg gccactacta 13980

cgttacagca attctccata aaggacctca gggagctcgt tcagaagctt ttaacattac 14040

ctgacggtgc atgcattatt ggtgaagagt ctggtacagt tgatggtacg ccgtatgttt 14100

atctgcgtcc tggtgatgct tatgacttcg gacctcctag aaccagacaa ggctctgacg 14160

gctttgagta cgtcagcaag ccaatgatga cagctgtacg tattacagct gtcggtaaga 14220

atgctgctga gctaatgcgt aagctacaca tagcgctggg tagttcacca gctaagcagt 14280

ttaaccgttt acggcattat gcaataacca aaatatcgaa gattgataat gtcggtggtg 14340

ctattggtgc aggctatgct cagaagtcaa tgctgactgt tgatattagc tatgtgcata 14400

aagttaaaat tgagcaaccg tacatctaca aggttgacat cacttgtatg gatgacaacg 14460

gtaacaaagc gactggtaca gtagaggaac cgtaatggca actgaagtag acccggaact 14520

gcaagcgcag ctggataagc taaccactgc tgtccagctc attcatgact tcggtatgtc 14580

aggcgaccca aacatcccta acccggaagg cggtgtcata cgcacgctcg aaggcattaa 14640

cgctgcaatc aatgaagcta taccaaactt tgaaaacgct aacgaagctg ctatccaggc 14700

gcgtgctgct cgtgacgcgg ctattgcagc caaagaagct gcagaaacgg cagctgaaca 14760

ggccacagta gcttcgacgt cagcaatcta tgagtacggc aacgttgcaa gtgcagctac 14820

cgtaactata cctgctgcat ctaaaacaat tgtcagcctt actcttaacc agccaaacac 14880

cgtaattaat atcggtggtg tatctgaccc gtctactgtt gcgcgtcaga ttactattgc 14940

tattaagcaa ggcactggtt ctaacaaggt gacttcttgg gatccaagaa taaaatgggc 15000

caacaacagg aagcccgttc tgtcattcct tgtgggttac acagatgttg ttacgttgct 15060

gacctttgac tcaggcgcaa cttggatggg tttctttaac ggtggatgga ttaaataatg 15120

cacacgatgt tgcttaaaga cggatcagac catcgagcta atgtcgaaag ccttatcgaa 15180

ggtcaccacc attttcttga gcgcaatact ggcagaactg acgacgctac gcgtcagcac 15240

tatatcttca atccagaagg agtagtgtcg aacaaccgcc attttattgc acacaccatg 15300

atggagtatc aacctaacgg tgatgctccg tctgaaagtc agtcgctgct aatactcggc 15360

gaaattcacg cgtaccttgc tactaaggaa cagcggtacc ttgacaaagc aattgagtac 15420

ttcaatgctt acgtcaagta ctattacgag ggggacccaa tccctgatac tcctcgtcgc 15480

tggatcgcta actggctttg taatggcaaa gagcctgtgc tagccagctt cccaatcaac 15540

cctgattcac caacacaagg cggctataaa aatgtgccag ttaaatttgt taacggcaaa 15600

gcacaaatcc ctcatggttc tcctttctgg ggcgagtacc tggatgttgc tacttgggcc 15660

cacaggggac acatggcttg gcctgctatt aatggtggtg tccgtgttat taaaaataaa 15720

gttgactggg acgatattta caacaattat cgcatcacta ccatgccagc tgacccgtgg 15780

aatcagttag cctggattga ctggccgagg tatctgggtg aaccaagcta cactgtggac 15840

tggtctgctg ctgaacctcc tgtacatctc atcgagtata ttgttgcatg gaccaataac 15900

aagattggtg ttctacctgg caaaaacgat gagctatggg gaggtgagat tcttgagact 15960

ggactgcctg attctcgcag aggtgagatt caactccgtg accatactat caacggtgtg 16020

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aatgctgctg atgctgagtt gtggttctgt gactgctgct atatgctgtg gcgaattact 16200

aacgagcaaa agtattacaa cgcttggcaa gctgtcctgt ttacactgga ggagtatatt 16260

gacatcgata aacaagacca gttcttccga caagacactc acgcgtcgtc tccgtttact 16320

gatggtatct cttatgattg gtcttatcct gaactggcac aagctatata ttcacgtgat 16380

gaaaatggtt atatagttct gcgtcagaac gaaaaagctc aatcatctct ggagcaacag 16440

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cgtactgaca tactcgacaa cagacgtggc aacactgttc gtatgactat acctgatagt 16800

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ctgacgtata cttctacagg tccgttgtgc atcaaagtaa ctgacgcgca aggctggagc 16920

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gagattaagc agttctcgtt tgtactgcct gacggcgtta atacgtcgac aagtattagc 17100

tggtactgtg tgaatgatgt tccgcctcgc tataactggc caattggtta tacgattaag 17160

tatcgtctta ctttctcggc tgataacccg tacacagcta agcttggcga ctgtactgtg 17220

ctggactatg agaatgataa ccttgcttac acgccaggtg ttattccgtt ctccaacatt 17280

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tatccgtttg tctttacgca tgacgatact gcagcaggta caatcaggct gaacaacatg 17400

gttaactttt tgtacgattc tcagcaatgg tactttaaga agtttggtca gctaggtcct 17460

ggcgcatctg cttttatctg gaaccgttgg gataacttta aatacggtgt acctgatacg 17520

tttaccatgt atcactgggg taatggtagt gcatggtcag gttaccagcc tcgtgcttat 17580

ttctccgcag cacgtggatg gtatgagcta gtaaaccgtg gtaagccagt tccgagtaag 17640

cttattgctt atgtggataa ctggtcaaaa tggttgcttg acttcatgga aaggtcagga 17700

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gacataactg gtattccggg gcatgtaatg gatggtggtt ggtcaccagc gttacgcctt 17940

gaaactggtt caggacctga aagcaacgcc atgtactatg gtttttactc tggcgaaata 18000

ttacgagggt tgggcttata cctgctgtac aaaaacaaag gggctaaagc agatatttat 18060

gatttaggcc cgtaaccact atttacttaa ctgaggcgcc agcctataat aagctggcgc 18120

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gtcaattgct gttggtgagt ttacaactct gtcagcagca gtagccccgg tagacgcgga 18360

cgacgttact gtattgtggg aaagcaatgc acctgacaaa gccactgttg atggttcagg 18420

tcgtgttcag ggtatcaaag ttggttcagc aactattact gctaaatcca agcttgaccc 18480

ttccaaaacc gatactgtag caattacggt aactgctccg cctgtggccg tcactggtgt 18540

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tgtgctgcct gctggcgcta ctaacaaagc tgttacctac gaatcaaacg accaggctaa 18660

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tgtcaaaaca gctgatggca gcttcactga caccgcgtca gtaactgtta ctgctgagta 18780

aggagctgat tgatgtcgct tccacttaat gaggttgtcg acgtacagtt cagtaagagc 18840

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aacgctactg agcgtggtat ggcatggaaa tctagcgacc cggacgttat cactgttgat 19020

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ccgcctgttg tacacgttac aggagttgag tttcttactc agtcgcctct taacgttaat 19440

atcggaagca cagctgggac tagtattcgt atatcgccag aagacgccac tgacaaaaca 19500

gtgacgtatg aaagcagtgt acctgatgta gcaactgtgg atactgacgg aaatgttact 19560

ggtattacag ctggtaatgc cactgttact gttaagacga atgacggtga taagactgac 19620

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attactgatg ctgccaacga cttgtaccaa gatgcccgtg acagactcat gggcgacggt 24960

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ttggatgata ttcagcttcc acaggtagtg tctactgtcc tcgaaggaac aagggacttt 25260

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gacatgtttg gctttaactt acgaggcata ttctgatgat atttaccaca actgctttcc 25800

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gacgttgcag tgtctacatc gtcgacaaaa cagcctaccc gtcagtttgg ccgcgcgtta 26160

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ttgactgaat ccaaccgtta taagttggcg tcaggcacct gggattacgt ccgtctctct 26340

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gaccaggttg ctgctgccaa caaggctacc tggtctatac aagacaataa actcaatatc 26700

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ttgttataac gcttgaacca aagaaaggcg acccgtgctt acttcttgtt gctgacagat 27360

gtattgacgt atggtatgag ctggctgaaa acgctatacc aggtgacttc cgacagaacg 27420

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tatactatgg actgggtaca tgacctggac tatggcattg actggttcgg actaatggag 27900

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ggagttagtt ctatcgagag ctttacccta agcttcgacc ctgactcacg tcacgctgtt 28020

tattcggttg aggttaatga tatttaccac aacacaacct ctattaacag aagtattaat 28080

ttaaccggag aaaactgatg ggctctgtaa ctagcacagg ctatgttccc gtcaagctcg 28140

acgactggat cagcagattc gaaacgctct tccgtcgtgt gtatggcgcg gatattgatt 28200

tgtcagctaa gtctgctgac ggacaaatgg ttggtattct ggcgcagatg tttgcagacc 28260

aggacgagca agttgcaatt ctgttttcta tgcttgaccc taaccaggca tctggtgtat 28320

acgtagacca gttccttgcc tacgtagcgc ttcagcgtaa aggcgagatg tcaacgctgt 28380

tgaccagggt taagattgaa ggtgaccgta acactattat acgtactcct tactatgtaa 28440

ctgacagctc gaataacgtg taccagctta actccactgt tgcgctggat gataacggtg 28500

tagtcgaaac aagcttcagt tctgttaaga ctggccgctt tgtcgtactt gcaaacgatg 28560

agcttaaacc acagaccatc gtttctggtg tgcgtaaagt taccaacatg caagtgtcgt 28620

ctggcggtgc gtccactgag ctcgactctg aggcaataga ccgtgcgtat aactcttacg 28680

gcaaacctgg cacgaacagc ttagacggta ttgttgctga gattcgtcag atgactgatg 28740

ttatcgcgtg taacggttac gagaacgaag aagatactcg ggacccgtta actggcttac 28800

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tcttccgtcg taagactaat ggctgtaagc agattggcac tgtgtcttat cagattacgg 28920

ataagtcagg tacacagcgc acaatgaaat ggagtcagcc tacttatgtt gaggcttatg 28980

cttcacttgt tgtagcccgt aaggaactgt ttaccgacgt ttccgaggaa cttattaaga 29040

atgctattct gtccaaggta tacaatatcg gtgaagaggt atcaacctat gaacttggcc 29100

agctgattca agaagcgaat ggcgtaagcc ccaacttcta catcaaaact ttctttgtgg 29160

gtaaatcagc taatccgtcg acagatacga ttctgcgtat cactgctctt gagcgtgcaa 29220

tattcactgc agaccgtatc actattgcag tggtgaatgc tgatggctga atatcataaa 29280

ctacttattc aacagtacgc tgataagcca aaagctgttg caactattaa gggcttcgat 29340

gatgcaattc agggtatctg ggacggcgcc caacaagttg ttgatagcct taatatcgat 29400

aaagctttcg gtaaaggtct tgataatgtt gcagcccgcg tcggcgcatc tcgtgttctc 29460

aagaaaggcg tagaccgtaa gttcttcggc tttaccaaca aagtaccaga tgtgcttggc 29520

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aacatgcaag acggtactat gccgtatcta attgacttcc tgattgaatt cttcggaatg 29700

aataacttcg ttataactga caacgaagat atgacaatga ctctggagat atacagtact 29760

ctgacaccac ttaagcaagt gctgattcag aactacgata tacttccgcg ccccacaggg 29820

gtaaagattg aacttaacac gagcgttgac gttacggata gtctgtatcg ttatgctact 29880

gtaaacttac cagcacaggt gaatgtatat ggctgatgta caaacaagac ccgataacga 29940

catcttcgcc agctccgcgg gtactggtga actgctgccg ttcggtgacc ttgctcgtgg 30000

ctggggtgca acccttggct actctgaagg tattcctccg atggagtggt ttaactttat 30060

cggtaaccgt actgacaaag gtatccacta catccttcag cagggtgttg atgtatgggt 30120

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atggtcatac tcttacgggc ctgataataa acctactgca tctgagctgg gcattaacca 30600

ggacttcatc cctatggatg gttctgactc aatccgcggc aacttaggta ctgtaggctg 30660

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ccgagtaact accacaaata gctttatttt atgtgagaat ggtgttagag tatattcacc 31020

taacaacccg cagcctatcg atacttcagc cggtaacgtt cggggtattc gactcggcgc 31080

tcgtattgct gctggtgtat ccgagtcaac gttctaccct gggcatgtaa tgactggctg 31140

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ttatatcaac ggcacttgga ttaacgtaag caacgtatcg taaaggttta ttatgactaa 31260

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cattgtaaat gctggtgcaa tcttcctcaa ggatgaggaa ggtcgcgact ggtataatct 31380

cgcaaaagag ttcgctgtca aatacgaagg tgcaacgttc ttgcaggtag ataagaacgg 31440

agttgtaatt gctgcacata ccgacccaac tatgttccat cctgtgggtt gcgatatggt 31500

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taaagagttt acgcttaacg caccaatgat gaaggagatt gctcgtgagc gtaaagaaca 31620

agctctgtcc atcgcttcga ccaaggtaag tgttttacgc gacacagttg atagtggcaa 31680

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ggaagaacag gcttgggttg aaggacaact cgacactgaa gaagatgagg aacgtattat 32220

cgctctccat aaattccgtg ccgatttgtt gctgcttgtt atgtcagatg cgccgcatat 32280

cgactggcct gtacgaccgt aactaattgc taccagcaag cttgtgcagt tgctggtagt 32340

gtttctttta cgcttgagtc gtgctataat ccactctggg tatacaataa accggagata 32400

tgggatgttt gactacaacg acaagtcttc ccttattggc cagtttgtgg cttgggtaac 32460

aataacagta agtactttat cactaagtga ttggggtact cttatcggta tactaagttc 32520

cttggtgatg ctgattgttg ttacgtataa ccaaacacgg cgaaccaaaa ttatgtcgga 32580

ttattacaat cgtaagaagc cgatagagga tgaagtcgca tcgaaagaag aggtgttgcg 32640

tgagtctgaa atcagcagcg actaaaggag gttgtagcgt gctcgctatc atcgggcttg 32700

tattgtcgat gacaagtacg catgtacgta ctaataaaga aggtcttgaa ataatcggta 32760

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tccacggtaa agatatgaac acgaaccagt tcagcgccat gacctctatg gtatttaacc 33000

atggttgcac tagactccgt aagaacaagg atggttcacc taccaaaata tatactgctg 33060

ctcgtaaaca aaactggact gaaatgtgta accgcataac tgactgggat atgggtggta 33120

agtacagggg cttgacaata cgtaagcaaa aggaaaaagc gctatgtcta aaaccggtgc 33180

aataattgca gttattctcg gcctcgccat tgtgttcctg tctttgtggg tacgtgagct 33240

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gcataattaa ctggagtaac aaaggggccg agtgatggcc cctttattta ttagcgtttt 33720

cctttcagct cgttatactg cgcacatgca gcacacagca ctgtaccggg taaaagctga 33780

cgtcgttttt cttcaatgtc ttccccacac tggtagcacg tcagcgggct tactccggtg 33840

tatcttactc ggttcgatag tgctgcgtcc cgggcaactt gttcagcttc agaagccata 33900

tcagtaatgt ccgatgtgcg catagtctca atcattattt tccctcttct tcacaataca 33960

gggtttctaa ttcatcgcat agctgttgcg tccagtaatc atcctcgcca cgtatctgga 34020

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cgtctagtat ctccttcgcc cttaatttaa gcgtttcatc tacctcatac tctaaaccta 34200

tattagacat attatagacc tttaattagt gtgcctctgc ccagttactt tctatcttag 34260

catcagtaag aacaggaaca cgaagcggta acacagtttc catgacccgt acgaaatcat 34320

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cgacatccgg tacgaaacaa gcacgaagga gtggtcccag tattttgtgt cgagacggta 35040

tattctgcag attagggtca gatgagctaa accgaccact aacggttcca ccgtcatcac 35100

cgcgcatttg atggaattga ccgtgaagga agccatttgt attcatcccc aatatatagc 35160

cacgaataaa cgtggactgg attttctcat aagacttaat ctcagacacc agttccgcaa 35220

acggatggtg caagcctgct aagaagtctg ccgtaaacga cggattgccc gccgctgttc 35280

tgaagtactc cagacctaaa tggtcaaatg caagagctaa gtccggaccg gagttaacgt 35340

taatgttaaa gccaatctgg tctttaatct gctggtgcat tttccttatt tcagcgctaa 35400

gcgtatcatc cgcctctttg gctttgtcaa ggtcaacacg cacacctgca aaacgcatct 35460

taagcattaa tggaatgagc ttgcactcca tatagaatac gtctgttaaa caccagcgac 35520

ttaacaaagg ccactgggct ttgataatgt gtattggtaa gtcggcgtca gattcagcat 35580

agtaacccac aagacgagga ggcgttttgt agatgtactt tctggcttca cctgttggct 35640

tacagccata agcgtctgaa atccattggt acatctcggc tgagtcttta ccttcgccta 35700

catactttcg tccaagtcct tcaagtgcaa cacgcgcgcc tgggtcaagt aatgcttccg 35760

cgaattgtac atccatgcac aatcctttaa cttccacgcc ttctgctgca agccagccca 35820

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ggtagtaagc tttgaagccg ttgtccgtag cgatactaac tccaacgata tgaccctccc 36000

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cattttgagc gcctgactac ccaggcctat tctttccatg cctttagcca gtttactcat 36300

ctgactaata acacagttga acggtttact aaacttagtc gactggaact taatgtcgac 36360

ggacatcttt ggaataatct tatctggtaa gtctgccttt gcagttgact cgcctgttat 36420

ctccagaata gcctgacctt cgtcgtaccc agtaagctgg tccatgactt ccaggaactc 36480

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ggctgctagt accggagcat ccatctgtac accatccgca aagccgaaga acatctggcc 36600

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ccgaagcccc gctccatctt atacggccat ttggagtttg atgtttggca ttggtttgta 37260

cttctcaacc attggcgtaa catcggcagg agtgaagtca aacactgaca cgtcgtaaat 37320

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gatacgttgc aggaaaatct ttgccgcatc gatatgattc tgatagatat gataatcacc 37440

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cattaaaaca gttccttttg agccgggtta acgtgtgcgt cgatgatggc ctggatgtca 38160

ggtgctttcc atccttcagg tttaacaatg tcctggccag acttatgctt actgttgctt 38220

gcatcaggct tagcacgttc tttcgccatg ttagcagctt gtaccgcatc ccatgcagcg 38280

tcaagtggcc agttgttgtt tgcgcaccag gtaatcaggt ggataattaa ctgggccaga 38340

cggtcgcaat gagtgtcttc agtatcctta acgtatacaa taaggccatc agcatcgaaa 38400

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cctgtcgtca atacgtttac gtttacacag acccgtgctc gtccgcttgt aaactcttcc 41340

agtgcggctt cacgttcttt ctttgtaaga ccgccatgca caactacagt ctgccaacct 41400

cgcagattaa actcgtctgc tatgttgtgg gcgtgctcaa cacttgtggc aaatacaaga 41460

acgtggttcc tgtctttacc gtagtgcatc atctcacgaa tagccgcgac tgttatacta 41520

tgttggttgg ctaccttctc aagctctgac gggatgtagt cacccatcct ttcaccaaca 41580

ttactggtgt caatcttggt taacactttc ttgttgacca ggcgtgacag gaagccttca 41640

tttaccaacc tggtgaatgc gtcaggtgtt gtaaggtcat agcagatgtc ggtaaatata 41700

ccacagtcca gcaagtggcc acctgcaagg cgatatggag ttgctgtgag tcctgttacc 41760

tttaccttag gattaagctc tttgaagtga gcaataacct tacggtatgt tgtttcagac 41820

ttctcaggaa caagatgggc ttcgtcaatg aatataagat taaacttacc tgcttcttcc 41880

aggttcttaa taattgactg taccgatgct acaacgatac ggcctgaaaa gtctttatgt 41940

cctgcacctg aagagtatat tgatactggt gcttgtggcc agtgacgaac aatcgctttg 42000

gcgtcttgtt caaccagctc cttgacgtga gtcagtataa gaatacgctg acgtggatag 42060

ctggtaagaa tatccttcat cagcatacca agcacaggtg atttgcctga acctgttggc 42120

atgacaataa gtgggttacc actataagaa ttgaagtacg accaccaagc tgtgaccgct 42180

tcttgttgat accagcgagc ttcaaaagcc atttaacgtc tcctcattaa ctacatatat 42240

tataccactt ccttgtggtg atgtatactt ttattttaag gaaagtttaa cgggcttctc 42300

atcctgtggg aagacatcag cagggcgata ctcatcgcaa gccgctaatt gctcttcgat 42360

tgtttcgagc tctttctggt gcttgttgca gtaccacact ttgccctgaa gcggtttact 42420

gtaatggcag gttctgcagt tcctgtctgg cattgctcct ttgtggcaca ggtgatggta 42480

ttcgcacatc cctggcttgc actcccacca gataggtgat tcagaaatct tcggcatatc 42540

caaaccagat tccgcatata caacagcctc cgctttactc agctgtatgt cgctttccag 42600

taagtcaatc tcgaccacct caaaatacat ctcatcagtg ttcttgttga ttgcaatata 42660

cacagcttga ttcagcttaa gcttccgcat gtatacctgc atctgggcgt agtgtaccgg 42720

cttacttgct ttaacagact tgagcttgac taactcttta aacgacttat cgccatgcgt 42780

cttgaattca gcaagtgccc atacgccttt gtatttgatc acacagtcac aagacccaga 42840

gaatatgcca ttgaattcat gtatgcgcca ttgcttacca gtcttaggat tgacgtccag 42900

cacttcgtca catacggaac gaagccactt tacaattctg ctttcttcaa ggttaccgcg 42960

ttcaaacaga cgaagttgct tagccgtaaa cttctccttg aacgaccagt gcagtacatg 43020

ccaaagatag cgatagcagt tgtgccctat ctgcgatgct ccaagatgcc cgcgtcgttc 43080

ttctctttcg tgggcttcga ctatcttgat gtcaatacgt ttctgcaggt cgtcaaacgg 43140

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aatgagcgac ggcatttgcc atgctatctt tccatttgga ttgtgaagct gtatgtgcca 43260

atgcaactac acgtaccagg ttaaggttgg ctatcagcat gtcagcgcaa tgttcgcacg 43320

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tattagctaa ggtgtttatc tcgctatgaa tagttagagc gttcttgagg ctattaggca 43440

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cttcacaagc tatacgcata aaccgcctgt cccacttgtc catcttcttc ttttgcatgg 43620

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ttttctagta agtcggtaga agtcagttca acaataccca gcgcacgaca cagcgcagac 43980

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ttcgggatag ggtcaaaaga ctgttgcggt tcgacggtag agctgttgaa gtttaattca 44220

gccattgttt ggtatcctgt ttaagtttaa tttaatttcg tttaacgctt taccggcagc 44280

gttcggccgt gatgcttatt atacgccact ttttatcatg gcgtaaacac ttttattcgc 44340

cggttccttt ctcagcttga gcggctttct tcgccatcca ggcttggtgc ttctctttcg 44400

attcgtctga accgatttta gtaagctgca cgttcgggtc ttcgtcctgc atctgttctg 44460

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ccagctcacg acctggtgcg ttacggcact tagcttccca ttggtagtca ggctgggtct 44640

ggatgtagcg ctcgctgtta ccgttggcgt caggcgcagt catacgtaaa gcaagcaccg 44700

catccatcag gtacggcaac tgcttaggta gctgttggcc aggcataaga ggtgagtaca 44760

gcattgcacc agtaacctcg tccttgttct tctcaagctt gcacaagtat gcaacgctga 44820

aaggcaagtc acggaactga cgcatgatgt acatcatctt gtcgttggtg ttaccatacg 44880

cctgtcgttt gtcattaacc tgtgacttct cgtagtccag acaaacttca gccacatctg 44940

acagcgaatc aaaaatcaga tgctcatact tctgcgcatc cttactttcg gtaagccatt 45000

tgtacaaagc cagaatgtcg ttgaacgtat tgattggtgt agagtcgatg tcagcgtctg 45060

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tttctacggc ttgtttagta gatacaatct gaaccattaa tgatagtcct cgtaaagtga 45240

ttcttcatcg cagtacatac gataaagagc ttcttcggct tcttccaggg tgtcaaactc 45300

ctcgccacag acggagtatt ttgtgggttc atcgaatgac tcgacgatgt gccagtcatg 45360

atgaataccg tatgtccaca agtcgcagtc gtcttttaca acaagcttac gtgtggaacg 45420

aaattgtgct agagtattga tgctcatatt ctctctcctc atgtgtatag aggtattata 45480

caccacttac atggggtaag tacactacta ttttacacta acagcttgac acgatagccg 45540

tgacaaaccg aggttggcta tgacgccatc gagcaatact cctgcatgtt cttcgttgta 45600

tgcttctacc cacaagggga tggtgacgcc cttcagatgg tcgctgtaca cgttgaacct 45660

atatacctgt ttgtgtgctt tgtcaacacg tacaacagta aggttgccat cctcgtaagg 45720

aggaagctca acgcctttct tactccagaa gttacggaac tcagcactat taacaatgcc 45780

atgtacaaca cgttctgtaa gctctgtttt gaggtcagca cgtgcctttg tactgataaa 45840

gaaacgacaa gagaagaaag cattgacgtt tagcacatca accgcgtaca caacgttatg 45900

ctcttcagca gttggtgctt tataaacaat atatttagtt ttgaacaggt ccatagtact 45960

ctccagggag gaagactggc gggcttgcac ccgcctaagt tattacagca gttctgcttt 46020

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aacaactgac tgacgacgac gttccagctc tttctcaact tccaggtcga ggcgtgctga 46140

cgcttcacgc agtaagtctt caacctgctg acggcgctga tacttgttaa agtcaggtac 46200

atcaaccagc catttgagag ttgcagtgtt gtagccagaa gtattggctg cacttacaga 46260

cacaacatca acaagcttgg taccgttaag ctccggatag ttaacattgc gaacgtcaac 46320

aaccgctttg tcacctacac ttactttgcc gatgtacttg taagtgtaca cacgaccatt 46380

cggttcaaac ttaacaccaa caaacttcag tttgtcgtct gcaataactt cttcctcaac 46440

tttgaagttg attgcagtat tcttgacagg tgcagccgct ttgagcttag cgaccatgta 46500

ctgttcggaa tgagacggac ggcacagacg gaagacgtct tcattgtagg tcagccagtt 46560

accggtctca tccacgcatg caatctgatt agtgccatcc agcgaacgaa cgcccggacg 46620

attcttctca acacgataca gcttaccttc tttcaggtta gcgtaagaac ggcgggcgat 46680

accccagttg tgtttttcag attcatactt agcgaaacgg tcaacactga agttctgctt 46740

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ggcatacact ttgccctgcg tcaacaggga agtgtttccc tcgtcgacac agataacaaa 46860

acccagagct tcgtgtgctt taccgctgcg gtcaaatact gtagtcattt cttgtttcct 46920

tgtataccag tttaattgta tgccagagtt attccctgcg catgtgcttt attgcttaac 46980

cgttaaagac attatagcac tagtgagtgg tgaagtacac atttatttta aggcagaagt 47040

gcaaatagca tcacacaaac aataatgagc acggtcgtag tcttcaaaca agaacacttc 47100

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atccatagcc tggtccttgt tcttgtacgg gtcccaaata agctggaagc ctgacccaca 47220

aaggagacat cccttgagct ccggaagagt tgactccttc acagtcacat tacaaatctt 47280

agccagttta gcacgagaat ctagagtact catttacgtt tacctttacg tttgtgtagc 47340

ggagtatatg ttttcttcgg tacgccgaac atggccgcat atgtaccgac ttctttcttt 47400

gttggcttat ccacaatctc gtcaatcacg attaagtcat ggttgatatt gcgaaagact 47460

tcagctgctc ttttctcaac aggagtaaag tcaataacca gctctttgcc tatcaggctt 47520

tctttgaact tgtcaaatag ccatttgtca cgcggaccag gattgccaat aaacataaca 47580

cgcacctgct tattgtccat ggatgatata ccccgttatt tgtgttgcca ggtataaacc 47640

gtataccaca cacccaacta gtatggcatc aagaatcaga tgagccatct tcacgcttga 47700

cctccggaag aaatgagtta tcagccttga tcagtaagtt acggctgtta accacttcca 47760

ggctgatacc atcatttttg tgggttacac gaataaatgc aacaccatca gcctgtgcct 47820

gctcaatagc tttattcagc acaacattat cctgtaccat atgacgtaca cgaggaagga 47880

tattgcaaag aggttccatc tcatccattc ctgcagtacg catgactgac ttgagaatgc 47940

caagatgatg tttataacgg tcttcaagat tatacttctt gctgttatgc tttagttctg 48000

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cacaagcttc tggtctagcg agcggttaac cttctgctca accttgagtt taccaggtac 48300

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gcgttcaaga cgtgctttaa tggtccggcg taacgtctcc tggtcagctt tcgcttgtgc 48420

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ttagtagaca ataattattg aacattgtac gtagtgcctg gcccgcaaca atatccgtta 48600

cgtctattat accactttta gtggtgacgc gtaaagcttt ttctttcttt gttttctcca 48660

caaatgcaat gctgatgatt tcttccgcat gaattacgtg gatggtacct gcaaactcac 48720

cagccttagc tggtgcctgg tacactaacg acatagacgg ttggttactc acttaattac 48780

tcctatttat ataagtccat ccagttacga tactcgtcat aaaacctgtc aaactcgttt 48840

ttggtgagtg caatagcaac accatttacc agatgcatgg ttcttgtttt gatgttgaca 48900

tacatgacgt tgctgtacgg gaacaagcta ccgtcattgt cagtgaagta agtcggtgta 48960

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aaagtaacaa agtgctgtac aattacctgt tcgtcggtat taggactgac gccctgaaag 49200

gtcttgagtg tgtgaaacat tggttgtatc tccttaacag aatgtaagtc tattatgtat 49260

ataaaggagg ggaaagtaaa tagatataaa tgtataaaat acataaaagt ctatttactc 49320

tggtttaata acgtgtatat aatgagagcc tcacaaacaa gaggagagac tcaatgataa 49380

agccaaaact gttgcggcac attcgcaacg gtattaagct actagctgaa ggtaatgaat 49440

acgcctgcaa gcaacgcggt attacaaaag tcggcctgtt caataaagag ctaccaactc 49500

gatactttac caaatcaccc ttaacactcg tacctgcagc ggagtactat aaagaccccg 49560

aagcagctcg ggctaaaatc aaggaaggtc ttgaccgact tgtagaggaa ggctatttga 49620

cagtacgtca acacactgaa tcatcttatt actacaagcc aacttctaag gtaaccagca 49680

atgacaatga cgagtcagcc gagtgatatt ctcggtctga aatactttaa gccagaaggg 49740

attccccaag tcttcaaaga tatgaagcgc tgggctatct ttgagctgac gtacgaagac 49800

gagaccctcg aagttcaatc caaacctaag aaacctgcaa gagcgccatc aggccgttcc 49860

ttcagcacaa ctgtgcctga agagtggatg actttcgacg acgccctgac acgttgtatc 49920

cgcaatcgtg aaatgaagat taaagctgta cagggtaaca tcacctttgt gccggctttg 49980

attgttcctc gccagtggta ctttgttgac ctggacaacc atgaagataa tccagacatt 50040

gaagctaccc acaaagcgat aattgagggg actcgtggcg cttatgccga gacgtcaatc 50100

tctggcaaag gtcaacacat cgcaatccct ttaccatgga ctgcagcaac atctaaagag 50160

aaagacgacc agctggacat caaaatccag aaggctgaga tgttcctggt aatgacaggc 50220

aatgtattga gtgagttcaa tgctaatcct gtttcagccc gtgaatggca tgcagcaatt 50280

gagaagttct ttcttgaatc aagcgcacct gacattgatg ttgagtttga gcaagacgaa 50340

gactgtggcg aagagtacga caaagagctg tacgaacagt tagccgacaa tactcgctgg 50400

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cacaacttgt ctgttgacaa gtaccatcag tggttcagcc gtgtaggtaa gactgtgctg 50640

aaagagatgc aacgtgacgg cttattcgtt aagaccaagt ttgctcttga catcaacaaa 50700

gagttagcca agaattcagg tgtctccctg gctgagaacg ttgagttcaa ggtcaacgac 50760

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gctgagatac aggataacat atctcctgct aacagggtta acgactatgc catcggcaca 50880

gctcttaaca tcctgagcaa ctgcgccggt cgcaagtatg tttgtccagt aggcggtcat 50940

gctaacttcc tggtaaccaa catcattctt gtgggtggtt catctatcgg taaatcgctg 51000

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ccgtcatacc attcagtcca gttgttctat cctgaatttg gtctggcttt aggttcaggc 51180

ttacgcatga atcctaacaa cccggacaac tttcagaaag ctctgatgga cgcttcaacc 51240

aagcgtaagg ttggcggtat tctgacaggt atcaaacgtg ctaatgctga taatgatgtc 51300

aagacagtaa gcgaaccatg ttactctatc ctgggcgact ccactcaaga gcttatcctt 51360

gacaacaccc gtaagcaaga cttctcaagt ggctttttgc cccgcttcct gttcatcccg 51420

aactacgaac gagcggagtt tgcaaaacct gagaaggtag gacgtcgcca gcagattcgc 51480

cgtactcaat tctccaaaga actgattgag aagctggaag caatcgctta tgtgaatgct 51540

atcccgccta acggtaaact aaggcacgac ccgattccta tttacgacga gtcggacgat 51600

gatgacttcc tgtacgagta ccagtgcaat attaatgaca tgcgccagta ttacagggac 51660

aacgaagtag catctgcctt tgtgggccga atgggtgagt atgttttcaa tatagcagca 51720

ctgatcgggt tactcgacaa ctgggatgct cctgtaatga ccagggacaa catcgaatgg 51780

gcttacaaat acgttcttcg ttgtataacc gcctgggtca ataacacaag cagaatagtc 51840

gcacctccga ctactaacgc cgaagtagtg gacggcttcc tcaaagtcta cagggatatt 51900

ttggcccttt acgccaaaag cggatggaac ggtattgtta agcattatcc tgaaggtgtt 51960

gtgagaagta tccgagaaga acacctccag atgaatggtt taagcatata tgctattcgt 52020

caatctttaa gctggtttaa atcaaattat ggttttaata tcacagctaa taataaagtc 52080

attgacggaa tgctacagga catgattgac caggactatt tagcggttca aatatataag 52140

cccacaagag gccgaactgc taacatttac tgcctgacag agcgaggata tgacactgct 52200

aagaaactaa aataagtaag taaatcaagg gcttgggtaa ttgtaaaaat cctaagccct 52260

tattttttaa gcttatttta caaactgatt aatatttaaa ctataattaa atatatgggc 52320

tataagagta tgattttatt actcttttac taaccataat atatgggctc cttataaaag 52380

attaaggggg taaaaaaggg ggtacaagta ccggataaaa gggggtatat atttatt    52437

<210> 2

<211> 52437

<212> DNA

<213> 肌尾噬菌BP-66(Myoviridae sp. BP-66)

<400> 2

acttagaggc gtctatatgt atgatccggt ttatctcttt attaatatca gaaccggatg 60

aaaaaaattt acgccggcga aaaataataa aaaaccggac tgataaataa atctgtagac 120

gtttacacta taaaaaagat gtgttacaat atttatcaat gttgctgatt accaaaactt 180

tgaattgtat acgaggctga ataaatggtt aatataagac agaaaggaca gaactttgag 240

cgcaaaatgg ctaagaagtt caatagctcg ttcggattaa ctgttgagcg caatcttcaa 300

cagtctatta atggcgggga tgacttgctg ggtgtaccgt ttttcagtgt tgaactgaag 360

aagcacaaca ccaagtctat cggaacatgg tggagacagt gtgcggcgtc ggcaaaggct 420

cagaacaaga tgccagtgct tatatacgaa ctaccaagaa aacagcctac cgtggtgatg 480

aataaggctg atgtgattga ctgttttcca agtggcacga cttttaacga ggcatcgaac 540

cgcctctttg tgggtttagt agaattaaca tgggaacaat tttgccgggt ctacaactat 600

tacgttgcgc ccggcactca atatcacgtc aattaatctt gtttcagctc gtcacaaatg 660

acacgctgat ttttggcagg tataatacca agatttagta aggtgtatgg actatcggcg 720

acgcattgtt caacggtagt ccattcaggt ttggattcaa caatttcgta attacagtcg 780

tgagctgcaa tacatgttga cagtattaag ccaatcacaa gtaatctcca tcaaccagaa 840

actcaaacaa ttggttgtaa acgttgcaac ctttagcgaa agagctttca gcaggtttac 900

cgtcgcggac aatcatcata tactcaccgc catggatgtc cacccagtat tgcatgccac 960

ctttgaccgg attacgttgc agaaatttaa acattattta ctcctgattc caagtttatt 1020

caataaccaa attgtcatgt caacccatgt taacggtaca gttttcgggg gttgataatc 1080

ccagcagctt gcagttcttt gtatttctgc ttggcgccgc tccgcttcgc gtaataccgc 1140

atcgtcagaa gtgccggcag aaaaaagatc ggtaacacca gataaatcgc gttgattaac 1200

acgtcgagca atgtcatata aatcatcctt agaaaacata agccaatacc ataaaaatta 1260

tcagaaagat cccaaccagc ttcctcatag cccgaccttc agcatatgca ggattcacaa 1320

cagaatactc aacaacatgt ttacagcgga ccataaggcc tccacttgtg ggttaattca 1380

atcatgagga cttttggcaa atcctcattg ttgaatcact ccatcattac ctgaactatt 1440

attatacact ctttattgaa gcgggtaaac acctttcctc catttgtgcg tttagcccca 1500

gattttagag ctgactggca ccagacatgc cactcctcaa ctgtcaagaa tttttgttca 1560

gctttgggtg gcaatccatt ggcaaggtct accgtagtaa atttgactag tggcatcact 1620

tgacctcaaa ttttgactcg tcatattccg gatcagtcac gtcccgggta gcacaatttt 1680

tgattgcctc ccagtaacgt tgggcatcat caccatcgac ataaactgtc cagtggccgt 1740

aaccaccttc aaatctgtcc caggcttgtt cccagacttt gccatcttcc agcttgtacc 1800

aagttggacg actgtcaaac tcgcggattg gatggtaccc catcaaagga ttcatcaggt 1860

caataatgtc ttcccgacta atctcctggt tctcccacaa caccgtcatg aattgctcaa 1920

acttgaaggc gtttggcaga actttgatga cttcaccatc acgatatacg gtataggtgc 1980

catcttcgca ttttgcactg tacatgtttc tctctcttgt tgtgaataat ttcaatcatg 2040

aactatcaca attttggata gttcattgtt gaaactatgc taactttgtt gcgatctgaa 2100

ttgtcagcct gaaatcttcc atcaagttat caaactcttt ggaaccacca acagcatcag 2160

atatttgatc tttcacaatt tgggcatttg attccagtaa ttcaatcagg tgcgccaatt 2220

cgtcttcagt caatttcaga tctttcataa tgcatccacc caagccataa cttttgccag 2280

tcttacaacg tcttcatggt ctcgctcgcc atcagaaaat tcgctggcga tgatacccat 2340

aattgacgcc agattcatgt tgatgatgta tgagtgttcc cgcacttcat caattcctga 2400

atctatcacc aattccgcaa attcctgcga accttcatcc cattcagccc aatactgctc 2460

agcataaaag tccagttctt ttttcatctc aatatcagtc attttgatta ctcctcagaa 2520

cctgaaaatt tgtcgtcaat ggcttcaaca atataatcaa gagttgaagt gtgagaacta 2580

tcagaaaaag tgcccatctt ctctaactca atcatcatat cccgcaaggc catcgcctgg 2640

tctttggtca gtttgatttt aagcatgttt ctctcctgtt gattgtgaat aatttcaatt 2700

gatggcacta cttgagtgcc atctcaaaaa ttactcagtt tcttgttctt caatttcagg 2760

tttttcttca gtcttaggtt tttcgcctgt tactgatttg ccctcagtca ctttaccaga 2820

ttttacatca ttacggtaat aggacatata ggattggaca acacgttttg ccctaatatc 2880

atccgcttcc atcccacagg ctttcatggc atcagccagc gccaatttgg aatcttcttt 2940

gtccatcaaa ttgtaatcct tgaatactgc atagcaggta tctttggttg acggaccgga 3000

tgaagttttg cgggtgccac ctgcagatgc acgtgatgcc gcaactttga cctcttcaac 3060

ttccagttgg ttaagctcat caaacaaggc tttcaccagc acttcttttg agtctttgac 3120

acttacagaa ctttcatcat taagggactt gatcatctta atgatttggt tattggcaaa 3180

gtactgcagg ctatccatct gcactacaat agtcccaaga ctttcagtag tcagaccaga 3240

ttttacagac tcgacagaaa aggcggaagt caggtaaacg tagttagtag cagtcatttt 3300

gatgtatcct cgtcaataga attttggtaa gcgccaatcc ctggcaagta agtccaaaca 3360

tgacaacttt tgtcaagctg tcatgattga aatcacttca atttgttaag tattttggtc 3420

aatagctcaa ctctttcttc ctggtcagta gggtcaaagt tttcaattga ctccttccag 3480

tcctccagca gttccttttc attaaatatt gaaatgtcaa gaaattcaac caataactca 3540

acttcttttt tagtcaattt caaatctttc atcttgtatg accctcttac ccttgatatt 3600

tgactacttg cgactggatg aaatcaacac aatcttccac gtccattgat tcaaaatctg 3660

gaactggtcc attattaatg ttgacacacc atagcccttc attacaatca taccaaagcg 3720

tatagttgtc tttcataata gttactcctg ctattagttt ccaggcgtgg ctactgcttc 3780

caatagccac tagttgaaac tattaccagc gttactatca acaagaaaca tgttaccaaa 3840

ttgttaaaga gcggtctggt actattcgac caggtaaagt tgatgtttgc gcatcttgac 3900

gacacgcgcc agacaagacg cttgacacat tcatcattcg tcttgatgta ataattatag 3960

gccagtcaat caatgttgta cataaaagaa ttgcaagttt atgcaagttt ttagaaatga 4020

taatcacttg cgattgagag tggttctcgt atgcaattga tatagtttcg catgtaatta 4080

ctcacttcaa aatggtcggc aggggttata atcacatagg ggtgccactt aaaggagccg 4140

gcgaaattat ttataaaaat ataatttcaa tctgaattat agacgctttg tgttataacg 4200

gccgaagtag ttcatacggt aattgtatca atcgcaatag ttaccaaagt aatcatttca 4260

attgaaatag gtgcggcggg gggtaatttc gcaggggtgc tacctgccag gagccagcaa 4320

aattttttat tttttggtat tttctcctta tcaggaccaa tcatcatcag agtaatacgg 4380

caggagctaa ccttttgctt aacacaataa taagtgaagc ccctctaaaa attttttata 4440

tttttcggaa attgtgtaga cactcactaa aaagtggtgt actttctctc ctccacgcgc 4500

tatcattaat gtgaatcatc aaacggcctc acggtctcct acttgtgggt aacattatga 4560

aaattgttca attagagcca tatccgcctc aattggctat cgtttgtagc gaaaaagagc 4620

acgaagagct ccaaaaactg atggatttgc ctgattttgg caactggaat gaccgggaaa 4680

cgcgtaatgc atctactttt acgttcactc gcgttaacta tccgtacctg ttaattgtcg 4740

tcgaactgta tcacccggac gacctgaagt acaacaccat ttcccacgaa ggcattcacg 4800

taatgtcatc gctgatgaac tatgtagggc ttaaatacga cccagaaaac gatgaatggt 4860

acgcatatca gcatgatttc atcgtaaatg ccatttgtaa ggcccatgac gagtatatag 4920

agcgtcaaaa aacgccaaaa actaagccaa aaatcgaaac aggtaaccat cctgcaatac 4980

tgccacaaga cgtaatgaac tcgcttttga ctgacactac tggggacttt taggtgatta 5040

atataatctt cgcaatgggc caaaatgggg aattcgggtt atctccggag tttatgaagc 5100

atcaggttga ctcgtgtaag accatggatg aggttcgtgc gcttcctaaa tcgggtctcc 5160

cttggaaatg tccgtcagat atgctctttt tcaggactat gactaattca attgcgtcag 5220

aaccaggcta taatgcgtat cagcaactac gtggacagtt cccaaatgac cagttgcgaa 5280

acatgatagc agatgtaact gtaaaaatgg tcgggcatag tgtattgtta gccggtcgta 5340

atacgtatat gactatgagt ctgcctatgt cagcccacag aatactgctg cctgtatctc 5400

gtcagattat ggcttcagaa ggctacaata atttgggtga gatggcagca gaccttgaat 5460

ccagaggtac tgacgtctgg attgtaggcg gtgccgagtt gatactttcg gcccttgaag 5520

agcatgcaaa agacttactc cgtatcgaca acatgtttat cagtacaatc aagcaatcag 5580

gtccaagtga tattttaatg gattgtagca aattaatgat gtacattgat agcgacttca 5640

cttataatga tgaatatgtt gataacaaac aagttctgat acaacggtac aggagtttac 5700

acaaatgaac atcataatcg aggggcccga caatgctggt aaaagtacac ttattgagtt 5760

ccttaaatct catactggcc gcagtgttat tcataatact gttgataaag accccgaatc 5820

ggtcatggct aaacaggcca aagaaaacgc gttggagggc gattgcattt atgaccgtag 5880

cgctgttata tctgagtata tctattgcct ggttcttcaa cgtacgcctg tcatcaatat 5940

taatgtatca catgtagcag atatgtgtga caacgccatc gttatctttt gtatgccgcc 6000

tgttgaaaag gtactggcaa ctacaaaaga cgagatgcct ggcgttgtgg aaaatcttga 6060

ggcgttatac aatcagtatg acaacctcat tgacgagctg gttatgatga gtaagcagtt 6120

cttcatttac gactggactg ttgaagaaga tggtcctgaa gcagctctcg aatacatcaa 6180

cgaacgtatt aataaggagt ggaacaaatg agcccagtat acaatacctc agtcacgctg 6240

tccgcaaccg taagcggcgt caacaagaca gttactgtgg gttcaactaa cccaaacctg 6300

acaggcgaag acctgctgcg cctggccaaa cgtgcacttg aagataacga agtaactggt 6360

actgaaggcg ttaacattga aattaacgtc gaaggatgtc cgcacagcat cagtattgct 6420

acctcttcat tgcctgaaga cgagactcgt gaacagctgg aaattaaaaa gttcaacgat 6480

gagctggaat atcgcacagg tgagatgttc agcagtgcac taaactggta cttgtgcaag 6540

gcttcaaact acgctggcgc tcctatgtca gaccgtatgt tagctgatat gtcagcacgt 6600

gaaattgcta aaggctgggc gcatgtacag atgctgcaag agcatatctg caagctggaa 6660

agctgcaata aagacgcgtc tgagcttatt actgcctata agcgacagat taacgacctg 6720

cagcaactga tgggtaaacg cgctgaagaa tatgaggctg agattcgcag tcttaatggt 6780

acagctgttg ctaacaaccg tgctttcagc gaagagcgta aagcgcttat cgcccagcgt 6840

gacgctgaaa aacgtcgtgc agacgacctg gcagaccgtc ttaactttat ccgtaagcac 6900

atggatgcta tggaaggggt aatctgatgg acctgttcga tatggtcgaa catcctgaag 6960

taaacggctt ggcggaagct aagcctttta actgggatga attcgtagca ggcaaacctg 7020

ctgtaaccca caacgggcag attgcatatt acggaggcca tagcgaacat ccgatgtgca 7080

ctcacctgta caacgctatc acaaccatat ccgacgaaaa cgttattaag tacggaaaag 7140

aggtaatgcc ttttcttgta gatgaacgcg gttacttcga aggtaaatgg ttcccgtttc 7200

tggtagaaat ggcctaaaaa ccggataaat ataaaggcgt ctaagctagt tcttcatctg 7260

tataagctac ttattcgcct ttctactgta gactttctca tcatctctct agacacttca 7320

tttttatatt ctgtttactt acttcgcgta actcgttata atcccgacta tccggattaa 7380

cgaggacgat accaatggca aaaccgaaaa aaacccgtga ggcaacagaa gagctgttgg 7440

ccactatgcg acgtatccaa ctggacccgt tggaagttat gcaacgagct atcatccttg 7500

ctgaacgtga agacgactat aaagcaatga tggatggtgc gcttggtgtt atgccgtaca 7560

tgtatcctaa gctgaaagag tccgttgtta aagctgacat cgaccagaac ttgtctggca 7620

atggcgttag cctgaatatt acgatcggtg accagaaagt ggtagacgtt actgaggaag 7680

agtaataaat gaaccttgac tttcacctgc atgacagaca aggtgccgct ctacagtctc 7740

aggcaactga gattctgtac ggtggcgctg ctggtggtgg taagtctcac cttatgcgtg 7800

taatgtcgat tatcatgtgc tgcatgatac ctgacttgca gatttacctt ttccgccgaa 7860

actataacga ccttacggct aaccacatgg ttggtcccac aagttatcct gccttgctgg 7920

atggtatgtg caaagctggc aagtgcaaga ttaactactc gagcaacacg attaaattct 7980

ggaacggtgc gaacatcaaa ctctgtcacc tccagtacga aaaagatatt tatacctacc 8040

agggtgcgga gattcacgtt ctgctgatgg atgagcttac tcacttcaca gaaacgatgt 8100

accgcttctt gcgtaaccgt gtccgactcg gtgctctcaa agtacctgag aactttttcc 8160

ggccactgcc actcatcttt tgtgggtcaa accctggtgg tgttggtcat aactgggtta 8220

agcgcacttt cgtaactgct gctcctccga tgaaaatcgt taagcaggaa aaacgcgaag 8280

gcggtatggc tcgtcagtac attccggcta agatgactga taaccctacg ctgatggaaa 8340

acgaccctga ctacggtgac cgtcttgaag gtcttggtga cccggctctt gttgctgcga 8400

tgaaagaggg tgactgggat attgttgctg gtggtgcgct tgacgacgta tggtcaacca 8460

agtgtattct gccgcgtatg cgtattccga aaggctggac tatcgaacgt tctcttgact 8520

ggggttctac tcacccgttc tctgttggta tctgggctat cgcaaatggt gcctcgctta 8580

cagacgacga aggcaatgag tactttattc cgcgtggttc aattatacgt atagctgaat 8640

ggtatgggtg ctctgaaaaa gaagctaaca ggggtattaa gctatctgct gccgaagtcg 8700

ctcaaggtgt tcttcgccta caggaaaatc tgcaggctgg tggctggatt caaagtaacg 8760

ttaatcctgg tccggcggat agtcagattt atgcgtgcaa ggaaaaagac gttgagacta 8820

tcgcgaagaa aatggaagac gaaggcgtaa cctgggtcaa ggccgacaag tcacaaggtt 8880

cgagaataaa tggcttagag ctattccgtc agcttctgaa aaatgttaag atggacgaaa 8940

cggaaaagcc gggcatttat ttcatggaaa actgtccagc agccataaac acgttgccgg 9000

ttctgccgcg tgacaagaac aacacggaag atgtcgacac gaactctgaa gaccacgtat 9060

acgatgattg tcgttacatg gtgttgcgtg gcatcaaccg ttatactacc aagctcaaaa 9120

taaatatggg acggtaaaat gtcgataacc ccaagcagca cgccgaacgt cggataccag 9180

cgtcctgagc tgactaagaa cgctggtaag taccgaatga ttaaggactg catcgagggt 9240

caggaagctg ttaaagcacg cggtgatttc tacttgcccc gtcctgaccc tacgaactgc 9300

acagaagaaa acatgatgcg gtataattcg tacctgcgtc gcgctgtgtt ctacaacgta 9360

ctgcagcgaa ctctttcggg tatgactggc ctggtattcc agcagcagcc tgagatgcta 9420

atgcctgacg atatggaagt gctgaaagta aatatcgacg gtgcaggcat tggtgctatt 9480

cagcaaatgc gtaagtgctt caagtctgtt ctggcttttg gtcgagcagg tctgttgact 9540

gacttcccta aagcacgtat cggtgagttt ggcgagtcca ttggctttac ccgtaaagag 9600

ctgatggacg gagatgtaca gccgacagta acgctgtata tgccatggca gattataaac 9660

tggcgagaag agtatcgcaa cggtaaagtg atgctcactc aagttgtcat ttgcgaacag 9720

ataccgggtg ttactgatgg ctttcagcaa gactacacac ccgtgtggcg tcacctttac 9780

ctggatgaag aaggcaattg caaccagtct ttgtgggtca ataagggcga caagaacgcg 9840

cagaacgtct ccggtggtgc gttgtatgtc acgcaagaaa atgttgtctt acgcgactcc 9900

aatggcttac cgttgaagtt tattccgttc cagtttattg gttctgaaac aaacagcgct 9960

gagattgacc ctccgccgat gtacgactta gctgtgctta atattgcaca ctaccgtaac 10020

tctgctgact acgaagagtc atgcttcgta acaggtcaac ccacagtatg ggcgtctggt 10080

cttactgagg catgggttga agatgttctg aagggtgaac tgcgactcgg ttcgtttggt 10140

ggtattccgc tgccggctaa cgccgctgta ggtattatcc agaccaaccc taacacccag 10200

ccgtttgaag cgatgaagca aaaagaagca cagatgattg caatcggtgc tcgtctgatt 10260

cgtgagaatg gtaaggtaga acgacgcgaa gttgagatta agaatgaagc tgcatctgaa 10320

gcttcgctta tcgtaactgt tgcgcagaac gttgaagctg cttatcgtaa agcaatcgaa 10380

tggtgtggcc tgttctacgg acaccctaaa gaagaaatta cgattaacct cagctacaac 10440

ttcatctata gccagttgac ttatcaagaa cgtcagcaac tggttaacga atggattgcc 10500

ggtgctatca cgtttagtga gatgcgtagc aatcttaaac aggctggcat tgctaagctc 10560

accgacgaag aagccaagaa gctaattgat gaagagctgg ctgaacgcga tgcgcgtgag 10620

gtagcaaaag aagcagaaaa gaacgctcaa gcagctaaga acagcgatgg gcaggaaaat 10680

aatccagaaa aaactgaata aagctattta ctttcggttt acctggctat ataatccttc 10740

atgtcaaccg cgcaacagcc ggccacgaga gtctgcaggg ctcagtggat ttcggatggc 10800

tggctgcgcg gtttgaccaa aacctgttca gagcccactt gagtggattg agcccctctc 10860

atataggatt gtaaaattat ggcacttaaa acagttgtaa ctgaccttac cgaagttgat 10920

gaaggcttcc gtggcctgta tatcaaagac gaagcatctg gtgcattccg tttggacgtt 10980

gaaccagacg aaaaaacgct gaaagaatta gaagacctgc gcaaagaaaa acagcgtatg 11040

gaacagcaca ccaaaaagct tctcgaagaa aagaaaaaag aagctgaacg tgctcgcctg 11100

gctgaagaag aacgcgcacg tcgtgagcgt gatgttgaat ctcttgagcg ctctatcaaa 11160

gagaaacatc aggctgaact ggaacagtat actaatcgtc aggcccagct gcaagctcag 11220

ctggaagcgc aaatggttga taacctggcg ctgaacctgg ctaaccaact ctctgacacc 11280

ccggcactta ttatgccaca catcaaggcc cgactgcgcg ctcaggaaat tgatggtaag 11340

tggcgtacta ctgtcgtgga tgttatgggt aacccgactg ctacaacgcc agatgaacta 11400

gtggaacata tgcgcgctga taagcagttt gcacctcttg tgcgtggaac caaggctggc 11460

ggtggcggtg ccaacggcgg cggagctaat cctggtggga acggcggtgg cgaacagcac 11520

actttcggag gcggggacga ccgcatagca cgtgctcgtg ctaaaatcca aaacacacaa 11580

tggggcaaat aatttatgtc actgtatatt tttaacgaac aagtacgttc taccgccacc 11640

gaactggttg accaggacgt acagaagttt aacgaagctt ctgcaggtac ccttattctg 11700

ggtaaccagt acgtaatcgg tgattacgtt gagcaggcaa tgtggcagct ggttgacggt 11760

atcgctaccc gccgtaatgc ttacgctggt accaacaaag ttgatgcgca gactctgggc 11820

cagattctgg accgctctgt taaaatcgac ggccgtgttg gtcctctgaa cattaccggt 11880

actatgatgc gtcgcatcgg tgcaggtgat actgaaccag cagctgttgt tgctgcacag 11940

gcatctgctg caatgttcca ggattacctg aacaccactg ctgcatgtct ggtagctgct 12000

atcggcgcaa acgctgatgt tgttctggac gtaacttcag gctccggtgc tgctgcaaac 12060

atcaccatgc agaacctgaa caaagtcaac gcgaagatgg gtgaccgttc tcagcagatt 12120

cgtgcgtaca tcatgcactc tactgcgttc cactccctca tcgaccaggc tatcaacaac 12180

acagaacacc tgttccagat tggtgacctg aacgtgtaca aagacttcct gggtcgtcgt 12240

tatgtcgttt ccgacatccc ggctctggtt gatggcgccg gtgcttccgc taagtaccgc 12300

actcttggtc tgaccccgtc tgctgcaata gttcaggtcg gcggcctgta cgacatggtt 12360

acctccgagc aaaccggtgg tgaaaacatc ctgcgtcaga tgcagggtga atacgacttc 12420

aacgtgtcgc tgaaaggcta cagctgggtc ggtcacaaag ctggtcagtc tccgactgat 12480

gaagacctgg ctgctcaggc gtcctggtct aaagttgcga cttccaacaa agacaccgct 12540

ggtgttatgt tgctggctaa gtctgcaatc taacccacaa acgggactaa caaaaggcga 12600

gctgacgagc tcgccttttt ttatttacac gtataaagtt ctggtatata atcggactaa 12660

acttgctgga ggctttctat ggcatacaca cttgttgtgg aagacggttc aattgttccg 12720

ggtgctaact cgtatgttag cactgcagaa gttgatgagt ttatcactaa cgaaggtatt 12780

ctcattcaac caggaactga cccgtactac caagctgcca aagcagctat ccgacttgat 12840

aaccagttta actggctagg tcgtaaggtc agcaaaacac agagcatggc ttggccccgt 12900

actggcctcg gtgcatgtaa tgttgacatc gcggagtctg taattccgcg agaagttaag 12960

ctggcacagc tttatatgat ggccagtgta ttgagctacg acggtgaaga aggtgtgcgt 13020

agcgaccagg ctttgcgccg taagaaagtt ggtaacctgg agattgaata cttcgactcc 13080

aaatcaggcg ttaccggtgc aactgacctt tggacgtcag acgtcagggc catgctcaag 13140

caccttgtgg gtgcatcact gagagcgcgg agagtataat gattcgtata cgccttgaac 13200

gtcgcgacaa acaaaagttc gagttcacct accgtgcctt taagtcgttt gaaggtcaag 13260

gcgtatcagt aggtgttcat ccagagcaca acagacgtat aaatcccagg gaccgtataa 13320

caaacgccga gctagcaatg gtgcatgagt acggtcttaa cggcctgcca gaacgaagct 13380

ttcttcgtag tgctgttggt ggcaggggta aaggccgaca ggcaataaac aaagctttcc 13440

gcgataatgt acctgctgtt ctcagaggaa gcatgactgc gcatgagctt aacgacaaaa 13500

taggtcgtat gcttgttgac gctgttcacg acagaatgga cagtgacgtg ccacctccta 13560

acaccgagct gacagaagaa cgcaaacgcg ggccaggtac acttagagaa tctatgcagt 13620

tgtatgattc gatagggtac aaagttggca gaaactggag gctataatgc tcaagataac 13680

ttcgctaatg aaggataaaa cctttgtagc attaacagat gttcttctcc gaaatgattc 13740

acgcttacca aacggcgact tcgaagacga atatacagct gcaaagtatc tgtgtaacat 13800

tcaacctggt gcagctacta accagcctaa cctgttgact aaagacgatg gcgagcatga 13860

gttcccacgt attgcgatat actgtggaca agaactaaag ctcggagact tcgttatata 13920

cgaagaccag ccataccgtg tattccgtat cgacccatgg agtcgtcatg gccactacta 13980

cgttacagca attctccata aaggacctca gggagctcgt tcagaagctt ttaacattac 14040

ctgacggtgc atgcattatt ggtgaagagt ctggtacagt tgatggtacg ccgtatgttt 14100

atctgcgtcc tggtgatgct tatgacttcg gacctcctag aaccagacaa ggctctgacg 14160

gctttgagta cgtcagcaag ccaatgatga cagctgtacg tattacagct gtcggtaaga 14220

atgctgctga gctaatgcgt aagctacaca tagcgctggg tagttcacca gctaagcagt 14280

ttaaccgttt acggcattat gcaataacca aaatatcgaa gattgataat gtcggtggtg 14340

ctattggtgc aggctatgct cagaagtcaa tgctgactgt tgatattagc tatgtgcata 14400

aagttaaaat tgagcaaccg tacatctaca aggttgacat cacttgtatg gatgacaacg 14460

gtaacaaagc gactggtaca gtagaggaac cgtaatggca actgaagtag acccggaact 14520

gcaagcgcag ctggataagc taaccactgc tgtccagctc attcatgact tcggtatgtc 14580

aggcgaccca aacatcccta acccggaagg cggtgtcata cgcacgctcg aaggcattaa 14640

cgctgcaatc aatgaagcta taccaaactt tgaaaacgct aacgaagctg ctatccaggc 14700

gcgtgctgct cgtgacgcgg ctattgcagc caaagaagct gcagaaacgg cagctgaaca 14760

ggccacagta gcttcgacgt cagcaatcta tgagtacggc aacgttgcaa gtgcagctac 14820

cgtaactata cctgctgcat ctaaaacaat tgtcagcctt actcttaacc agccaaacac 14880

cgtaattaat atcggtggtg tatctgaccc gtctactgtt gcgcgtcaga ttactattgc 14940

tattaagcaa ggcactggtt ctaacaaggt gacttcttgg gatccaagaa taaaatgggc 15000

caacaacagg aagcccgttc tgtcattcct tgtgggttac acagatgttg ttacgttgct 15060

gacctttgac tcaggcgcaa cttggatggg tttctttaac ggtggatgga ttaaataatg 15120

cacacgatgt tgcttaaaga cggatcagac catcgagcta atgtcgaaag ccttatcgaa 15180

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tatatcttca atccagaagg agtagtgtcg aacaaccgcc attttattgc acacaccatg 15300

atggagtatc aacctaacgg tgatgctccg tctgaaagtc agtcgctgct aatactcggc 15360

gaaattcacg cgtaccttgc tactaaggaa cagcggtacc ttgacaaagc aattgagtac 15420

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tggatcgcta actggctttg taatggcaaa gagcctgtgc tagccagctt cccaatcaac 15540

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cacaggggac acatggcttg gcctgctatt aatggtggtg tccgtgttat taaaaataaa 15720

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tggtctgctg ctgaacctcc tgtacatctc atcgagtata ttgttgcatg gaccaataac 15900

aagattggtg ttctacctgg caaaaacgat gagctatggg gaggtgagat tcttgagact 15960

ggactgcctg attctcgcag aggtgagatt caactccgtg accatactat caacggtgtg 16020

tacctgctta actatgctgt taagcttcct gttgaacacg gtggttattt gcttaagcga 16080

aatgaagtat ggcacaacag accggtaaac gttccattgt acggcgagct tcaacgcggt 16140

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gacatcgata aacaagacca gttcttccga caagacactc acgcgtcgtc tccgtttact 16320

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gctgtatggt ttaagtgtaa gccaacagct aagatacgta cagaggtcgg tggcaaagat 16500

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atcttagctg atattcgttc atccactgat tatggtaatg ccactattgc agtgtcttac 16740

cgtactgaca tactcgacaa cagacgtggc aacactgttc gtatgactat acctgatagt 16800

tcgtcaggtg ccattatagg cttttggcta ctggaatctt cccaggcacc tttaaactcg 16860

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gagattaagc agttctcgtt tgtactgcct gacggcgtta atacgtcgac aagtattagc 17100

tggtactgtg tgaatgatgt tccgcctcgc tataactggc caattggtta tacgattaag 17160

tatcgtctta ctttctcggc tgataacccg tacacagcta agcttggcga ctgtactgtg 17220

ctggactatg agaatgataa ccttgcttac acgccaggtg ttattccgtt ctccaacatt 17280

tataaccctg attctaagca gttcgatggt tggcacggta taccttaccc tggctatcag 17340

tatccgtttg tctttacgca tgacgatact gcagcaggta caatcaggct gaacaacatg 17400

gttaactttt tgtacgattc tcagcaatgg tactttaaga agtttggtca gctaggtcct 17460

ggcgcatctg cttttatctg gaaccgttgg gataacttta aatacggtgt acctgatacg 17520

tttaccatgt atcactgggg taatggtagt gcatggtcag gttaccagcc tcgtgcttat 17580

ttctccgcag cacgtggatg gtatgagcta gtaaaccgtg gtaagccagt tccgagtaag 17640

cttattgctt atgtggataa ctggtcaaaa tggttgcttg acttcatgga aaggtcagga 17700

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atggtatcag gactggataa gctgatggac atgcttgtta atgaactgga agaccattac 17880

gacataactg gtattccggg gcatgtaatg gatggtggtt ggtcaccagc gttacgcctt 17940

gaaactggtt caggacctga aagcaacgcc atgtactatg gtttttactc tggcgaaata 18000

ttacgagggt tgggcttata cctgctgtac aaaaacaaag gggctaaagc agatatttat 18060

gatttaggcc cgtaaccact atttacttaa ctgaggcgcc agcctataat aagctggcgc 18120

acccaataag aggattctcc agatggcaaa tcgtactaca gccaaccgtc ctgttaaaga 18180

cgcagacctg cgtcaagagt cggttactca gttcccgtta tccaagccga ccaagcttga 18240

cgagaacgga aaattcattc caaccccggt taccggtgta actgctacac ctaaggctaa 18300

gtcaattgct gttggtgagt ttacaactct gtcagcagca gtagccccgg tagacgcgga 18360

cgacgttact gtattgtggg aaagcaatgc acctgacaaa gccactgttg atggttcagg 18420

tcgtgttcag ggtatcaaag ttggttcagc aactattact gctaaatcca agcttgaccc 18480

ttccaaaacc gatactgtag caattacggt aactgctccg cctgtggccg tcactggtgt 18540

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tgtgctgcct gctggcgcta ctaacaaagc tgttacctac gaatcaaacg accaggctaa 18660

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tgtcaaaaca gctgatggca gcttcactga caccgcgtca gtaactgtta ctgctgagta 18780

aggagctgat tgatgtcgct tccacttaat gaggttgtcg acgtacagtt cagtaagagc 18840

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tctgttacag tgtctcccac aagtgtgaca cttgaagagg gcaagactca acgcctgaca 19200

tacacctatt tacctgctaa tgcagacaaa cctgatttct actggatttc agacgatgag 19260

tctgttgctg tcgttaacga cagcgggctt gtcactgcca ttggagatgg cgaaacaact 19320

gtaaacgtac agtacggtgt tgacagctct atattcgata gctgtactgt aactgttatt 19380

ccgcctgttg tacacgttac aggagttgag tttcttactc agtcgcctct taacgttaat 19440

atcggaagca cagctgggac tagtattcgt atatcgccag aagacgccac tgacaaaaca 19500

gtgacgtatg aaagcagtgt acctgatgta gcaactgtgg atactgacgg aaatgttact 19560

ggtattacag ctggtaatgc cactgttact gttaagacga atgacggtga taagactgac 19620

actcttgaca ttatagtcag ggtgcctgct gtaaatgtta ccggcgtaag tattgacgaa 19680

ggcgatacag cttccatgga agttggggac actcttcagc tacatgccac tgtgactcct 19740

gaaaatgcta ctgacccatc tgttgtatgg agtgctcctg tatcagaagt tgcgtctgtg 19800

actgaagctg gtttggtaac tgctaacgct gcaggcttaa ttgatgttac tgttatcact 19860

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ctggccattt acttggttaa acttactgag tataatggcc ggaaagtcca cccaagaggt 21000

aaacaaaaat gccgttgaat gtaaaccaga ttgtaaacgt tcaactgaac aacactccaa 21060

ctggtatcag caaaggtgac ttcggtaagc tggctctttt aactcaggac cctggcactg 21120

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gcactacgat taccatgaag ttcaaacaag agcctggtat tacaccgaac aacactttaa 21660

cgctcactga agctaacaag tgtaaagcgc tgggtattaa ctggtacacc tactacagca 21720

cctttgctat gcttgcagaa ggtactgtcc tcggtacgtc caagccgccg cgcttctggg 21780

atgaagtaca tggtctcgac tggttctgta atgctgtcca gacttacgtc ttcaactcaa 21840

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ctgcagctgt tgcttgtcag caggctgtcg acaacggctt ggttgcacct ggtatctggt 21960

acggtgatga gtttggtaca ctgtcttatg gtgaccgact cgagacaggt ttctacatct 22020

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tatgcagttg actgaaggct ttgaccagta acaatagagg aaagcacaaa tgactgagcc 22620

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attactgatg ctgccaacga cttgtaccaa gatgcccgtg acagactcat gggcgacggt 24960

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gacatgtttg gctttaactt acgaggcata ttctgatgat atttaccaca actgctttcc 25800

ttgacattat aggtaatgat ggttctggta tttacgactt ggaacctacc tccgaaggta 25860

agcaatcaat atctatttct atcgctggat atacgtataa cattgagttg tactataaca 25920

cggtaggtca gctctggcag gctacagtga ctgacatatc aagtaatgct gtactttgtt 25980

ccagttatgc tttacaatat gggcgtattg cttttggtaa ctgggacacg cgtatagcgt 26040

tgctggtaag tgacaaatcc tccagccgca tcggtcctat gactacagat gacatgggag 26100

gacgttgcag tgtctacatc gtcgacaaaa cagcctaccc gtcagtttgg ccgcgcgtta 26160

aagcttgagg tcagcaacgg taaagatgaa ggcataatca tctcaaatct tcgtgttacc 26220

tttgacattc aaaagggtaa cacgaagcat ccaaataaag cgacaatcac agtgttcaac 26280

ttgactgaat ccaaccgtta taagttggcg tcaggcacct gggattacgt ccgtctctct 26340

gtgggttacg gtcttgacaa catagtttat cgcttgatat tcgaaggcga tattactcgc 26400

gctaatgacc aacgaaacgg ccttgatatt cagactgttc tcgaatgtgg cgatgcccgt 26460

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gaccaggttg ctgctgccaa caaggctacc tggtctatac aagacaataa actcaatatc 26700

attcctaatg actctgttac tgactacgac gttgttgtgc tgtcagaatc atctggtatg 26760

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ctggccattg gtggtctcgt acaagtaaat tctatgttta cacagtacaa cggacagtat 26880

aaaatcgaca ctataagatt tcggggtgac aataaaccga aaggaccgtg gcgtgctgac 26940

ttgacggttc tcggtggaca gttcgcgaag aaagttcgtc gactcaagaa gccacgcaaa 27000

ctgtcgaaga ttgagtatga ctatgttact gaacccggtg ttgaccatac agtaggcgga 27060

ggtagctgat gtcagctatt gattataata cagcaacact tgatgaggca attgaggctg 27120

cactgtttgc tgcaatgatt ggtaagcgcc actgtttacc tggccgcata gtatcgttta 27180

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caccaaacac agaagccaag tttaaagaag ttgacattgg cggcgttaag atgtccaaac 27660

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agcttaaacc acagaccatc gtttctggtg tgcgtaaagt taccaacatg caagtgtcgt 28620

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gcaaacctgg cacgaacagc ttagacggta ttgttgctga gattcgtcag atgactgatg 28740

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cttcacttgt tgtagcccgt aaggaactgt ttaccgacgt ttccgaggaa cttattaaga 29040

atgctattct gtccaaggta tacaatatcg gtgaagaggt atcaacctat gaacttggcc 29100

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gtaaatcagc taatccgtcg acagatacga ttctgcgtat cactgctctt gagcgtgcaa 29220

tattcactgc agaccgtatc actattgcag tggtgaatgc tgatggctga atatcataaa 29280

ctacttattc aacagtacgc tgataagcca aaagctgttg caactattaa gggcttcgat 29340

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aataacttcg ttataactga caacgaagat atgacaatga ctctggagat atacagtact 29760

ctgacaccac ttaagcaagt gctgattcag aactacgata tacttccgcg ccccacaggg 29820

gtaaagattg aacttaacac gagcgttgac gttacggata gtctgtatcg ttatgctact 29880

gtaaacttac cagcacaggt gaatgtatat ggctgatgta caaacaagac ccgataacga 29940

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ctggggtgca acccttggct actctgaagg tattcctccg atggagtggt ttaactttat 30060

cggtaaccgt actgacaaag gtatccacta catccttcag cagggtgttg atgtatgggt 30120

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cggcgttgag actgagattc tgcatatcaa ctgggatgag aaaaacgctt cacagtgggg 30480

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atggtcatac tcttacgggc ctgataataa acctactgca tctgagctgg gcattaacca 30600

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ccgagtaact accacaaata gctttatttt atgtgagaat ggtgttagag tatattcacc 31020

taacaacccg cagcctatcg atacttcagc cggtaacgtt cggggtattc gactcggcgc 31080

tcgtattgct gctggtgtat ccgagtcaac gttctaccct gggcatgtaa tgactggctg 31140

gcgcttcggc aataagaaag agctgcgtgg tggtacatac tggtcagcgc cgttacagta 31200

ttatatcaac ggcacttgga ttaacgtaag caacgtatcg taaaggttta ttatgactaa 31260

gcataaggtg ttccgtaact ttaccatgta ccatcctgag gtaacagaag agaacgagaa 31320

cattgtaaat gctggtgcaa tcttcctcaa ggatgaggaa ggtcgcgact ggtataatct 31380

cgcaaaagag ttcgctgtca aatacgaagg tgcaacgttc ttgcaggtag ataagaacgg 31440

agttgtaatt gctgcacata ccgacccaac tatgttccat cctgtgggtt gcgatatggt 31500

tgtaacgtac gacccgcctt tcaacatctt cgagactgtt ggcgaatggc tgttcgacgg 31560

taaagagttt acgcttaacg caccaatgat gaaggagatt gctcgtgagc gtaaagaaca 31620

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tgctaccgat gaagaaaaag agctatttgc taaatggcgt gattacagga ttgctgtcaa 31740

tcgtcttgac attaaccttg gttccgctat ggttgttcca cctatgccgg agtaaaccat 31800

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gctgattaag caaggcgttg tattcatcaa ggataacaat ggtaatgact ggcgcaagct 31920

ggctaaagag ctggctaaga ataaagagct ggttcattat attgttgtgg acaagtacaa 31980

tgctgttgcc gcgtatgcta acgatcctac actactgttt cctgttaatt gcgatttgca 32040

tattgttgag tctgtccctg ctgctaagtt tgcggattgc tattacgaat ggtcgtacgt 32100

taatggcaag tttgttaagc actctgaact gcagaaggtg attgcagaag aacgcctgca 32160

ggaagaacag gcttgggttg aaggacaact cgacactgaa gaagatgagg aacgtattat 32220

cgctctccat aaattccgtg ccgatttgtt gctgcttgtt atgtcagatg cgccgcatat 32280

cgactggcct gtacgaccgt aactaattgc taccagcaag cttgtgcagt tgctggtagt 32340

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aataacagta agtactttat cactaagtga ttggggtact cttatcggta tactaagttc 32520

cttggtgatg ctgattgttg ttacgtataa ccaaacacgg cgaaccaaaa ttatgtcgga 32580

ttattacaat cgtaagaagc cgatagagga tgaagtcgca tcgaaagaag aggtgttgcg 32640

tgagtctgaa atcagcagcg actaaaggag gttgtagcgt gctcgctatc atcgggcttg 32700

tattgtcgat gacaagtacg catgtacgta ctaataaaga aggtcttgaa ataatcggta 32760

atgcagaagg ttgtatgcgc aacccgtatg tatgccctac tggttattta acagttggca 32820

ttggtagccg catctacagc gatgagcccg ctgtacggcg cgaaggcctg acagaccagg 32880

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tccacggtaa agatatgaac acgaaccagt tcagcgccat gacctctatg gtatttaacc 33000

atggttgcac tagactccgt aagaacaagg atggttcacc taccaaaata tatactgctg 33060

ctcgtaaaca aaactggact gaaatgtgta accgcataac tgactgggat atgggtggta 33120

agtacagggg cttgacaata cgtaagcaaa aggaaaaagc gctatgtcta aaaccggtgc 33180

aataattgca gttattctcg gcctcgccat tgtgttcctg tctttgtggg tacgtgagct 33240

gaaaggtgat attatcgacc gcgacggtat aatcaaacag cttaacaaga ctaatggcga 33300

gttgtctgct gctaatcaaa cgctgattaa ttctgtaaag gatgaacgtg aggcctcagc 33360

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ctggtgcgta cctggttaaa tgccataagc ctgaattaac aggtaacacc tggaaggcaa 33600

taggtcagtt agctattgaa cgtggaacag ctcttgatga ttgtgcagac aagatggaca 33660

gcataattaa ctggagtaac aaaggggccg agtgatggcc cctttattta ttagcgtttt 33720

cctttcagct cgttatactg cgcacatgca gcacacagca ctgtaccggg taaaagctga 33780

cgtcgttttt cttcaatgtc ttccccacac tggtagcacg tcagcgggct tactccggtg 33840

tatcttactc ggttcgatag tgctgcgtcc cgggcaactt gttcagcttc agaagccata 33900

tcagtaatgt ccgatgtgcg catagtctca atcattattt tccctcttct tcacaataca 33960

gggtttctaa ttcatcgcat agctgttgcg tccagtaatc atcctcgcca cgtatctgga 34020

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cttctggttc ttcctggaat atcttcataa accagtccag gcctgacgta cagcctgagg 34140

cgtctagtat ctccttcgcc cttaatttaa gcgtttcatc tacctcatac tctaaaccta 34200

tattagacat attatagacc tttaattagt gtgcctctgc ccagttactt tctatcttag 34260

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taatgttaaa gccaatctgg tctttaatct gctggtgcat tttccttatt tcagcgctaa 35400

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catactttcg tccaagtcct tcaagtgcaa cacgcgcgcc tgggtcaagt aatgcttccg 35760

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cattttgagc gcctgactac ccaggcctat tctttccatg cctttagcca gtttactcat 36300

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ggctgctagt accggagcat ccatctgtac accatccgca aagccgaaga acatctggcc 36600

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tctggcaaag gtcaacacat cgcaatccct ttaccatgga ctgcagcaac atctaaagag 50160

aaagacgacc agctggacat caaaatccag aaggctgaga tgttcctggt aatgacaggc 50220

aatgtattga gtgagttcaa tgctaatcct gtttcagccc gtgaatggca tgcagcaatt 50280

gagaagttct ttcttgaatc aagcgcacct gacattgatg ttgagtttga gcaagacgaa 50340

gactgtggcg aagagtacga caaagagctg tacgaacagt tagccgacaa tactcgctgg 50400

gcgcttgaac attatcttag cgactatgca cctgacggtg ttggtgttag taacgacggt 50460

tccgaacgtt taagccgcat actcaaagac ttgcttcgtg taacccgtaa ctacgaagtt 50520

acacaacgca tcttcatggc cagcaaagct gcagcatatg aaggtcgcag accaagccga 50580

cacaacttgt ctgttgacaa gtaccatcag tggttcagcc gtgtaggtaa gactgtgctg 50640

aaagagatgc aacgtgacgg cttattcgtt aagaccaagt ttgctcttga catcaacaaa 50700

gagttagcca agaattcagg tgtctccctg gctgagaacg ttgagttcaa ggtcaacgac 50760

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gctgagatac aggataacat atctcctgct aacagggtta acgactatgc catcggcaca 50880

gctcttaaca tcctgagcaa ctgcgccggt cgcaagtatg tttgtccagt aggcggtcat 50940

gctaacttcc tggtaaccaa catcattctt gtgggtggtt catctatcgg taaatcgctg 51000

tataccgagt tgttcccaca aatccaggca agcgtaccag acacatcgcc tatcagcctt 51060

aaccgtatcc caagggaaca gacttttgca accaggacgt ttgctgaact gatgtccaac 51120

ccgtcatacc attcagtcca gttgttctat cctgaatttg gtctggcttt aggttcaggc 51180

ttacgcatga atcctaacaa cccggacaac tttcagaaag ctctgatgga cgcttcaacc 51240

aagcgtaagg ttggcggtat tctgacaggt atcaaacgtg ctaatgctga taatgatgtc 51300

aagacagtaa gcgaaccatg ttactctatc ctgggcgact ccactcaaga gcttatcctt 51360

gacaacaccc gtaagcaaga cttctcaagt ggctttttgc cccgcttcct gttcatcccg 51420

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cgtactcaat tctccaaaga actgattgag aagctggaag caatcgctta tgtgaatgct 51540

atcccgccta acggtaaact aaggcacgac ccgattccta tttacgacga gtcggacgat 51600

gatgacttcc tgtacgagta ccagtgcaat attaatgaca tgcgccagta ttacagggac 51660

aacgaagtag catctgcctt tgtgggccga atgggtgagt atgttttcaa tatagcagca 51720

ctgatcgggt tactcgacaa ctgggatgct cctgtaatga ccagggacaa catcgaatgg 51780

gcttacaaat acgttcttcg ttgtataacc gcctgggtca ataacacaag cagaatagtc 51840

gcacctccga ctactaacgc cgaagtagtg gacggcttcc tcaaagtcta cagggatatt 51900

ttggcccttt acgccaaaag cggatggaac ggtattgtta agcattatcc tgaaggtgtt 51960

gtgagaagta tccgagaaga acacctccag atgaatggtt taagcatata tgctattcgt 52020

caatctttaa gctggtttaa atcaaattat ggttttaata tcacagctaa taataaagtc 52080

attgacggaa tgctacagga catgattgac caggactatt tagcggttca aatatataag 52140

cccacaagag gccgaactgc taacatttac tgcctgacag agcgaggata tgacactgct 52200

aagaaactaa aataagtaag taaatcaagg gcttgggtaa ttgtaaaaat cctaagccct 52260

tattttttaa gcttatttta caaactgatt aatatttaaa ctataattaa atatatgggc 52320

tataagagta tgattttatt actcttttac taaccataat atatgggctc cttataaaag 52380

attaaggggg taaaaaaggg ggtacaagta ccggataaaa gggggtatat atttatt 52437

<210> 3

<211> 60606

<212> DNA

<213> 长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp. BP-12)

<400> 3

gctctgcgca cccccgggcc aaccgatcgc cgggtaagta cctttttaaa atcgtgaccg 60

gaattcttcg ccagccgccc gccacgccac gcgcgatcga tcgtaatagg tagtcatacc 120

ttacaccacg atcgccccgt ctagccccca tagcggccga aataagggca tacaataacg 180

ccccgtcaca ccatatagca gggaatacca taaaaagggg aatagatagc catatacagc 240

cgcacaccaa cgcacgccgc gtatatcatg cagcaccata gcgggccgcc atacggcata 300

gcgcacacat aaggccgcat tgatgcacgt cgtgtatatc aggaaggaag aaagcaggac 360

gggccgccat acgcacgccg cgtatatcat cgcacacggc acaccatagg cccgctacac 420

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gcctttgata catggggaat atgtcaaaac aggttaaaag ggatcgtgcg gcgttccccg 540

aaaatccggt tttagataaa cgcttttaac agcacgttaa gcatcgcatt cgcgcgtaca 600

gtggcaacgg caagacgtgc ggccccgtcc attttgtaca gcgtcacacg gaaagcgcgc 660

gcccggtcat cccatgttag atccgcatcg gcccgcgtaa aagtcacgcc atccgcatga 720

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cttgtccagt gtatatccgg gcgcgcgttc aggatctccg cgtcgtcaag atctaacatc 2220

cagaaaccgc gctttaaata cacatattcc ccggccggat tggttgagcg taaaacatga 2280

tcggcggcgt caaacgttgc cgcgtcggcg tcggcgcttg ccgcgtttaa ttctgcattc 2340

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ttcatcacag catacgcctg tatacgggca atcgtcggac gcgttgaaca ccccgctaac 4080

ccatttaacg aaagatgcct tttgtttaaa accgtggtta ttcacttcac ggtattcacg 4140

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gctttctttg tattctgaaa agtcgaattg atcgccgctc ttatattcgc ggtaattttc 4380

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Claims (9)

1.噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)，其中长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)保藏编号为CCTCC NO：M 2015141。

2.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)的全基因组核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

3.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不含表6所记载的毒力基因或不良基因。

4.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不识别表9中长尾噬菌体BP-12所不识别的57株非致病性细菌。

5.根据权利要求1或2所述的噬菌体，其特征在于，所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)不识别表10中长尾噬菌体BP-12所不识别的184株非宿主性致病性细菌。

6.权利要求1-5任一所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)在制备裂解沙门氏菌的产品中的应用，其特征在于，所述的沙门氏菌是指表7中22株能够被长尾噬菌体BP-12裂解的沙门氏菌或表8中24株能够被长尾噬菌体BP-12裂解的沙门氏菌。

7.权利要求1所述长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的发酵方法：

2-1)取长尾噬菌体BP-12(Chilikevirus sp.BP-12)的宿主菌落，接种到LB培养液中振荡得到宿主菌悬液；

2-2)将菌悬液稀释转接到LB培养液，振荡培养；

2-3)调节LB培养液的初始pH值使得长尾噬菌体BP-12的发酵初始pH值为6；

2-4)采用火焰接种法接种，向初始pH值为6的LB培养液中分别接入噬菌体和对数期宿主菌悬液并发酵，发酵过程中通入无菌空气，并加入消泡剂；

2-5)发酵结束后，将噬菌体与宿主菌的全部混合液取出并离心，上清液经真空抽气泵抽滤至无菌过滤器装置内，得到噬菌体发酵液并于4℃下保存，即得。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB培养液的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml，pH 7.0。

9.一种噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物包括长尾噬菌体BP-12(Chilikevirussp.BP-12)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015141和肌尾噬菌体BP-63(Myoviridae sp.BP-63)、保藏编号为CCTCC NO：M 2015145的组合。

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