KR20090030532A

KR20090030532A - 시포비리대에 속하는 박테리오파지 및 이를 포함하는 세균사멸용 조성물

Info

Publication number: KR20090030532A
Application number: KR1020070095899A
Authority: KR
Inventors: 유상렬; 홍준우
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-09-20
Filing date: 2007-09-20
Publication date: 2009-03-25
Also published as: KR100943041B1

Abstract

본 발명은 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지, 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물 및 세균사멸용 미생물 제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균 및 살모넬라균에 감염능력이 있어 이들을 사멸시킬 수 있는 신규한 시포비리대에 속하는 박테리오파지를 하수로부터 분리함으로써 이 미생물을 이용하여 대장균 또는 살모넬라균 감염으로 인한 질병 치료에 사용할 수 있고, 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수 있으며, 이에 따라 항생제 사용 절감을 유도할 수 있는, 시포비리대에 속하는 박테리오파지, 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물 및 세균사멸용 미생물 제제에 관한 것이다.

박테리오파지, 대장균, 살모넬라균, 생물학적 조절제

Description

시포비리대에 속하는 박테리오파지 및 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물{Bacteriophage belonging to Siphoviridae and bacteriocidal composition comprising the same}

식물바이러스와 동물바이러스 발견 후, 1915년 트워트가 포도상구균의 용균현상을 관찰하였고, 1917년 파스퇴르 연구소의 헤렐르가 적리균에서도 같은 현상을 관찰하게 되면서 이것이 세균에 감염하는 바이러스 (세균바이러스)에 의한 것임을 알아내었다. 이후, 세균에 감염하는 바이러스는 "세균(Bacteria)"을 "먹는다(Phage)"의 의미에서 박테리오파지 (bacteriophage)로 명명하였으며 간단히는 "파지"로 불리고 있다.

파지는 크게 용균파지와 용원성파지로 분류하며, 용균 사이클만 반복하는 것을 용균(virulent) 파지, 용원 사이클만 반복하는 것을 약독성(temperate) 파지로 정의한다. 약독성 파지는 숙주세균의 유전자에 파지의 유전자정보를 넣어 파지의 모양은 사라지지만 숙주세균이 파괴되지도 않으며, 이런 상태는 숙주세균이 좋은 환경조건에 있는 한 지속되는데, 숙주세균의 환경이 악화되면 숙주세균의 유전자에 있던 일부의 파지 유전자는 용균 사이클로 바뀌어 새로운 파지를 만들어 숙주세균을 용균시켜 숙주세포 밖으로 방출된다.

용균 사이클에 있는 파지의 경우, 세균 감염 약 30분 후에 100∼200개의 새로운 파지를 만들어 세균의 막을 파괴하며 밖으로 나와 용균 시키는데 세균의 증식속도보다 파지의 증식속도가 훨씬 높으므로 따라서 세균의 증식을 제한하는 중요한 요인이 될 수 있다.

이러한 파지는 발견된 1910년부터 1930년대에 걸쳐서 파지의 숙주특이성 문제 및 파지의 치료목적으로의 제조에 있어 숙주세균의 내독소, 외독소 문제 등 그 당시 과학적으로 풀지 못하는 문제가 있어 이용에 제한이 있었다.

이즈음 1929년 플래밍이 발견한 페니실린 및 1943년 워크스만이 발견한 스트렙토마이신은 파지와 대조적으로 항균범위가 넓어 하나의 약으로 복수의 감염증에 효과를 나타냈으며 처음에는 내성균 문제도 없었기 때문에 이 항생제를 이용한 화 학요법제가 널리 사용되게 되었다.

이에 반해 효과가 불확실한 파지요법은 점점 사라지게 되었으며, (1)파지의 숙주에 대한 감수성으로 임상에 감염성이 다른 다양한 파지주가 필요한 점, (2) 동물의 생체 내에서는 파지의 용균작용이 일어나기 어려운 점, 및 (3) 파지내성균이 동일 세균집단에 존재한다는 이유로 1950년대에 WHO에 의해 파지요법이 무효 선언되어 동구권과 구소련연방에서만이 명맥이 유지되어 왔다.

1980년대에 들어 파지요법에 대한 생각이 바뀌게 되는데, 1982년 영국의 연구자그룹인 스미스와 휴긴스는 뇌막염 치료 모델실험으로 마우스를 이용하여 다음과 같이 실험하였다 (Smith HW, Huggins MB, J.Gen.Microbiol, 1982 , Feb;128(2); 307-18).

즉, 마우스의 피하 근육 내에 균을 주사하고 반대쪽의 피하에는 균의 특이적인 용균파지를 주사한 결과, 파지를 주사하지 않은 대조군은 100% 폐사한 것에 비해 파지를 주사한 실험군의 경우 100% 생존하였으며, 항생제 (스트렙토마이신 등)의 효과보다도 우월한 결과를 나타내었다. 특히, 놀라운 것은 균을 직접 뇌 내에 주사한 경우와 파지를 근육주사 하는 경우 모두에서 파지가 뇌에서 회수가 됨으로써, 근육 주사한 파지가 혈류를 통해 뇌 조직으로 이동하여 혈액뇌관문 (blood-brain barrier)을 통과한다는 사실을 확인할 수 있었다.

그 후 용균성 파지를 이용하여 송아지의 대장균성 설사증, 어류의 다양한 질병, 반코마이신 내성 장구균 패혈증, 결핵균, 닭의 파라티푸스 및 대장균 O157:H7 등 다양한 질병에 대해 성공적인 예방 및 치료사례가 보고되었으며, 파지를 직접 사용하는 방법 뿐 아니라 파지가 숙주세균의 세포벽을 특이적으로 파괴하는데 작용하는 리신 (lysin)을 이용하여 탄저, 폐렴구균 등에 특이적인 항생제 개발도 이루어지고 있는 실정이다.

또한, 최근 들어 항생제의 남용과 불필요한 처방으로 인해 기존 항생제로는 잘 죽지 않는 내성을 갖는 '슈퍼박테리아'가 발생하고 있으나 항생제 개발은 내성균의 출현 속도를 따라 잡지 못하고 있다는 점에서 항생제 내성균의 심각성이 큰 문제로 대두되고 있다.

따라서 기존 항생제를 대체할 수 있는 물질 또는 항생제 내성 세균 제어 방법의 개발이 요구되고 있으며 이에 대한 국내 연구가 시급하다.

이에 본 발명자는 이러한 종래의 문제점을 해결하기 위하여 연구, 노력한 결과, 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 새로운 박테리오파지를 하수로부터 분리하였고 이 박테리오파지가 대장균 및 살모넬라균 모두에 대하여 숙주 특이성을 나타내어 감염가능하고 사멸효과를 나타냄을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지를 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지를 포함하는 세균 사멸용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지를 포함하는 세균 사멸용 미생물 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 EPS7 (수탁번호 : KCTC 11121BP)를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 박테리오파지 EPS7을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 EPS7을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 박테리오파지는 대장균 및 살모넬라균에 대하여 감염능을 나타냄으로써 기존 박테리오파지의 숙주 특이성으로 인한 단점인 제한적인 사용범위를 넓혀, 좀 더 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 박테리오파지, 이를 포함한 세균 사멸용 조성물 및 세균 사멸용 미생물 제제는 기존 항생제에 대한 내성여부와 상관없이 대장균 및 살모넬라균을 사멸시킬 수 있으므로, 대장균 및 살모넬라균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 항생제 내성을 가진 대장균 및 살모넬라균으로 인한 의료 문제 의 해결에 이용될 수 있고, 새로운 개념의 항생제 내성균 제어방안 개발을 통해 의료안전을 향상시킬 수 있다. 또한 축산업 및 어업에서 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로서 제공될 수 있다. 더 나아가서는 항생제 사용 절감 유도할 수 있으며, 이에 따라 새로운 항생제 내성균의 출현 가능성을 낮출 수 있고 환경 안전성을 높이는데 기여할 수 있다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 및 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균 및 살모넬라균에 감염능력이 있어 이들을 사멸시킬 수 있는 신규한 시포비리대에 속하는 박테리오파지를 하수로부터 분리함으로써 이 미생물을 이용하여 대장균 또는 살모넬라균 감염으로 인한 질병 치료에 사용할 수 있고, 항생제 내성 세균을 제어할 수 있는 생물학적 조절제로 사용할 수 있으며, 이에 따라 항생제 사용 절감을 유도할 수 있는, 시포비리대에 속하는 박테리오파지, 이를 포함하는 세균 사멸용 조성물 및 세균사멸용 미생물 제제에 관한 것이다.

본 발명의 시포비리대(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 EPS7은 하기와 같은 방법으로 분리 동정되었다.

먼저, 박테리아는 여과하지만 박테리오파지는 통과시킬 수 있는 구멍크기를 가진 필터로 채취한 하수를 여과한 후 액체 배지와 혼합한다. 이 배지와의 혼합액에 대장균, 살모넬라균 등의 박테리아를 접종하여 37 ℃에서 배양하고, 배양액을 원심분리한 후 수득한 상등액을 다시 위와 동일한 필터로 여과하여 여과액을 취한다. 이 여과액을 박테리아 배양액과 혼합한 다음 아가 농도가 낮은 액체 아가 배지와 함께 섞어 고형 아가 배지 플레이트에 붓는다. 이 플레이트를 37 ℃에서 하룻밤동안 배양한 후 플레이트 상에 나타난 투명한 플라그(plaque)를 개별로 분리하고 박테리아 배양액에 넣어 배양하여 배양액이 맑아지는 것을 확인한다. 맑아진 배양액을 원심분리하고 상등액 만을 위의 필터로 여과시켜, 박테리아는 제거되고 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 취한다. 이렇게 얻은 여과액을 상기와 같이 아가 배지를 이용한 플라그의 재분리를 2회 이상 반복수행하여 각각의 순수한 박테리오파지를 분리한다. 상기 분리한 박테리오파지 중 여러 숙주 균주에 감염능을 나타내는 파지를 선별하고, 전자현미경을 통한 형태관찰 및 볼티모어 분류법에 의해분류, 동정한다.

본 발명의 박테리오파지로서 대장균 및 살모넬라 타이피뮤리움을 모두 감염시키는 박테리오파지 EPS7을 선별하고, 형태 관찰 결과 파지가 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖는 복합형의 시포비리대(siphoviridae)에 속하는 것으로 동정하였고, 볼티모어 분류법에 의해 이중 나선 DNA (double-stranded DNA)를 갖는 것으로 확인되어 제1형 바이러스로 분류한다.

본 발명자는 상기 박테리오파지 EPS7을 미생물기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 2007년 4월 17일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 11121BP를 부여받았다.

본 발명의 시포비리대에 속하는 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)는 사람 및 가축 등에 식중독, 장티푸스, 살모넬라증 등 질병을 일으키는 대표적인 박테리아인 대장균 (Escherichia coli) 및 살모넬라(Salmonella) 균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)이 숙주 감수성을 갖는 상기 살모넬라균은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 또는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)인 것을 특징으로 한다.

상기 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)은 유전체 내에 서열번호 1의 염기서열을 포함한다. 이 염기서열에서 발현되는 단백질은 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)가 대장균 또는 살모넬라균을 포함하는 숙주세포의 BtuB 세포막 단백질에 결합하여 숙주세포 내로 박테리오파지가 들어갈 수 있게 하고, 감염되도록 하므로, 숙주세포에 감수성을 나타내게 하는 단백질이라 할 수 있다.

따라서, 상기 본 발명의 박테리오파지는 대장균 또는 살모넬라균이 감염된 부분에 직접 투여하거나 적절한 형태의 미생물 조성물로 제조되어 투여됨으로써 대장균 또는 살모넬라균의 사멸을 위한 용도로 사용할 수 있다.

본 발명은 시포비리대에 속하는 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)을 유효성분으로 포함하는 세균 사멸용 조성물을 제공한다.

상기 세균으로는 대장균 (Escherichia coli) 및 살모넬라 균인 것을 특징으로 하며, 상기 살모넬라균은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 또 는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 시포비리대에 속하는 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명에 의한 세균 사멸용 제제는 통상적인 미생물 제제 제조방법으로 제제화할 수 있다. 특별히 한정되지 않으나, 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위 내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.

상기 본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제는 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 EPS7 외에 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 상기 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지(예, Luria broth 등) 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제는 액상, 반 고체상 또는 고체상으로 제제 형태는 분말제, 과립제, 정제 등의 고체상 제제, 현탁제 또는 주사액제 등의 액상 제제 및 크림, 로션, 젤, 페이스트 등의 반 고체상 제제 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제는 경구, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 경피, 비측내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 세균 사멸용 미생물 제제의 투여량은 투여대상에서 대장균 또는 살모넬라균을 사멸시키는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 종류 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

이와 같이 본 발명의 박테리오파지는 대장균 및 살모넬라균에 대하여 감염능을 나타냄으로써 기존 박테리오파지의 숙주 특이성으로 인한 단점인 제한적인 사용범위를 넓혀, 좀 더 넓은 범위의 숙주를 효과적으로 억제할 수 있는 생물학적 조절제로서 활용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 박테리오파지 또는 이를 포함한 세균 사멸용 조성물은 기존 항생제에 대한 내성여부와 상관없이 대장균 및 살모넬라균을 사멸시킬 수 있으므로, 대장균 및 살모넬라균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 특히 항생제 내성을 갖는 대장균 및 살모넬라균에 사용시 기존 항생제로 제거할 수 없었던 항생제 내성균을 사멸시킬 수 있으므로, 기존 항생제 대체물로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 항생제 내성을 가진 대장균 및 살모넬라균으로 인한 의료 문제의 해결에 이용될 수 있고, 새로운 개념의 항생제 내성균 제어 방법 개발을 통해 의료안전을 향상시킬 수 있다.

또한 축산업 및 어업에서 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로서 제공될 수 있다. 특히, 축산 분야에서 문제가 되는 각종 세균성 질병을 제어할 수 있는 파지 제제를 개발하여 항생제를 대체 하게 되면 항생제 내성균 문제의 해결과 더불어 국내 소비자에게 우리 축산물의 안전성에 대한 신뢰를 보장할 수 있을 뿐만 아니라 우리 축산물의 수출을 증대시킴으로써 국내 축산물의 부가가치를 향상시키고 국내 축산업 전반을 활성화시킬 수 있을 것이다. 또한 새로운 축산 식품 안전 소재의 개발도 가능할 것이다.

더 나아가서는 항생제 사용 절감 유도할 수 있으며, 이에 따라 새로운 항생제 내성균의 출현 가능성을 낮출 수 있고 환경 안전성을 높이는데 기여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 본 발명의 박테리오파지 EPS7 분리 및 동정

(1) 박테리오파지의 분리

살모넬라 및 대장균에 대한 박테리오파지를 분리하기 위해, 서울시 청계천 물을 취하여 이로부터 박테리오파지 분리실험을 수행하였다.

상기 청계천 물을 여과하되, 박테리아는 잡아내지만 박테리오파지는 통과시킬 수 있는 구멍 크기인 0.45 μm 막필터로 여과시켰다. 생성된 여과액과, 10배 농축된 액체 배지(LB broth; NaCl 1%, Yeast Extract 0.5%, Tryptone 1%, Micro Agar 1.5%)를 첨가하였고, 박테리아(살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 대장균(Escherichia coli)) 배양액과 혼합하였다.

상기 박테리아와의 혼합액을 12시간 동안 37 ℃에서 배양하였고, 그 다음 8000rpm의 속도로 원심 분리하여 상등액을 다시 0.45μm 막필터로 여과시켰다. 그 여과액 0.1 mL과 12시간 이상 배양한 박테리아(살모넬라 또는 대장균) 0.1 mL의 현탁액을 피펫으로 추출한 후에 섞어주었다. 이 혼합액을 아가농도가 낮은 아가(0.7%) 배지와 함께 섞어서 1.5% 아가 배지를 포함하는 플레이트에 부었다. 상기 플레이트는 37 ℃에서 하룻밤동안 배양하였다.

그 결과, 목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우에 독립되고 투명한 플라그(plaque)가 관찰되었다. 이 플라그 영역을 백금 루프를 이용하여 분리해낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣어 37 ℃에서 배양하였을 때 배양액이 맑아짐을 관찰하였다.

그 후에 배양액을 원심분리한 후 상등액만을 0.45 μm 막필터로 통해 여과시켜 용해물에 남아있는 모든 박테리아를 제거한 후에, 여과액만을 취하였다. 상기 여과액은 박테리오파지만을 포함한다.

이렇게 얻은 박테리오파지 용액을 가지고 아가 배지 상에서 다르게 희석하고 주입하여 플라그의 재분리를 3회 수행하였고, 이로써 순수한 박테리오파지 20 개 얻을 수 있었다.

(2) 박테리오파지 EPS7의 형태 관찰 및 분류

상기 (1)에서 획득한 박테리오파지들 중에서 살모넬라와 대장균 모두를 감염시켰던 파지를 선별해냈고, 그 중에서 박테리오파지 EPS7이라고 명명한 파지를 가 지고 전자현미경 사진을 분석하였다.

전자현미경은 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy-Filtering Transmission Electron Microscope)을 사용하였다.

관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드(grid)에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 80kV의 전압으로 에너지 여과 투과 전자현미경(LIBRA 120, Carl Zeiss)을 이용하여 관찰하였고, 도 1에 그 결과를 나타내었다.

도 1에 관찰된 박테리오파지를 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 파지가 수축성이 없는 긴 꼬리(a long non-contractile tail)를 갖고, 시스(sheath)가 없으므로 이 박테리오파지는 복합형의 시포비리데 (Siphoviridae)에 속하는 것으로 분류하였다.

또한, 볼티모어 분류법(Baltimore classification)에 따라, 박테리오파지의 유전정보가 이중가닥 DNA로 되어 있어 제한효소처리로 유전자가 잘려지는 경우 박테리오파지는 이중가닥 DNA 유전체를 가진 제1형 바이러스로 분류한다.

상기 본 발명의 박테리오파지 EPS7의 유전자를 EcoRI 제한효소로 처리하였을 때 유전자가 잘려진 것을 아가로스 겔 상에서 확인할 수 있었다(도 2, M: 1kb plus DNA size marker, uncut: 유전자를 제한효소로 자르지 않은 것, EcoRI: 제한효소로 자른 것). 따라서, 본 발명의 박테리오파지 EPS7는 제1형 바이러스로 분류할 수 있다.

본 발명자들은 위와 같은 방법으로 얻어진 시포비리데 속 박테리오파지 EPS7 를 2007년 4월 17일자로 한국생명공학연구원의 생물자원센터 (KCTC)에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 11121BP).

실시예 2. 박테리오파지 EPS7의 숙주별 감수성 (susceptibility) 확인

숙주별 감수성은 연속 희석 적하법(serial dilution dropping method)을 사용하여 확인하였다(Adams, M.H. 1959. Bacteriophage, pp27-34. Interscience Publishers Inc., New York).

2시간 배양한 박테리아 배양액과 0.7%의 아가 배지를 섞어 아가 플래이트 상에 부어서 37 ℃에서 15분간 건조하였고, 그 위에 희석배수별로 희석된 박테리오파지 EPS7를 떨어뜨리고 상온에서 말린 후 37 ℃에서 10시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우 플레이트 상에 투명한 영역, 플라그(plaque)가 보이게 되며, 이는 박테리아 세포가 완전하게 용해(lysis)되어 사멸된 결과이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌옇게 영역이 생기거나 독립적인 볼드 스팟이 나타나는 것으로 증명된다.

표 1에서는 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)을 사용하여 대장균과 살모넬라를 대상으로 숙주 감수성을 실험한 결과를 나타내었다.

그 결과, 박테리오파지 EPS7이 대장균 및 살모넬라 균주를 폭넓게 용해시킴으로서 세균사멸능을 확인할 수 있었고, 특히, 인간 장내에서 분리해낸 살모넬라 엔테리티디스(S.E 1~10)와 동물에서 분리해낸 살모넬라 타이피뮤리움(S.T 1~10) 또한 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)에 대해 감수성을 가짐을 확인하였다.

숙주	파지	숙주	파지	숙주	파지
LT2	++	S.E 1	++	S.T 1	-
SL1344	++	S.E 2	++	S.T 2	++
14028s	++	S.E 3	++	S.T 3	++
S.Dublin	++	S.E 4	++	S.T 4	++
UK1	++	S.E 5	++	S.T 5	++
KCTC 1925	+++	S.E 6	++	S.T 6	++
NCTC 12023	++	S.E 7	++	S.T 7	++
ST 4/74	++	S.E 8	++	S.T 8	-
Senteritidis	++	S.E 9	++	S.T 9	++
DH5α	+++	S.E 10	+++	S.T 10	++
MC4100	+++
JM109	+++
JM109(DE3)	+++
MC1655	+++
BL21(DE3)	-

실시예 3. 박테리오파지 ESP7의 살모넬라와 대장균에 대한 숙주 감수성 확인

박테리오파지 ESP7 (KCTC 11121BP)의 부분적인 서열 분석으로 이 파지의 숙주세포에 결합하는 단백질을 찾을 수 있었다.

서열번호 1 및 도 3에 그 단백질의 염기서열을 나타내었다.

이 단백질은 NCBI에서 유사성을 비교해 본 결과, 박테리아의 BtuB 단백질에 결합할 수 있는 단백질임을 확인할 수 있었다.

상기 BtuB 단백질은 대장균 및 살모넬라 타이피뮤리움에서 비타민 B12, 박테리오파지 BF23 또는 E 콜리신과 결합하여 이들을 세포 내로 흡수(uptake)시키는 막 수용체로 알려져 있다(Agusta Gudmundsdottir et al., 1988, J. Biol. Chem., 263(28), pp14224-14230, Roth, J.R., et al. 1993, J. Bacteriol.,175, pp3303-3316)

본 발명의 박테리오파지가 서열번호1에서 발현되는 단백질을 이용하여 숙주세포의 BtuB에 결합한다는 사실을 이용하여, 숙주세포에서 BtuB 단백질을 돌연변이시켜서 단백질이 발현되지 못하게 한 후에 파지의 숙주 감수성 실험을 하였다.

btuB 유전자가 돌연변이된 균주를 제작하기 위해 λ-RED recombination system을 이용하였다 (Datsenko and wanner, 2000, PNAS, 97(12), pp6640-4445).

pKD3 나 pKd13 플라스미드를 이용하여 항생제 내성 유전자를 포함하면서 말단에 목적 유전자의 일부 염기서열을 가지도록 유전자 증폭을 하였다. 얻어진 증폭된 유전자를 pKD46 플라스미드 (β,γ, exo)를 가진 살모넬라 내로 주입하여 형질전환이 일어날 수 있게 하였다. 형질전환으로 생긴 btuB 돌연변이는 중합효소 연쇄반응과 염기서열 분석으로 확인하였다. 그 다음, 대조군인 야생형 살모넬라 및 btuB가 돌연변이된 살모넬라에 본 발명의 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)를 감염시켜 시간별로 세포의 수를 측정하였다.

도 4는 그 결과를 보여주는데 돌연변이된 숙주세포는 대조군(야생형)과 비교하여 같은 세포밀도에서 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)를 감염시키더라도 세포의 수가 감소하지 않고 증가하는 것으로 보아 감수성이 현저히 떨어짐을 알 수 있었다.

따라서, btuB 유전자가 발현하는 BtuB 단백질이 박테리아 또는 살모넬라와 같은 숙주세포에 박테리오파지가 결합할 수 있게 하여 숙주세포의 용해(lysis)를 일으키는 감수성을 가지게 하는 요인임을 확인할 수 있었다.

제제예. 박테리오파지 EPS7을 포함하는 세균사멸용 미생물 제제의 제조

1) 액상 제제 1

실시예 1-2)의 박테리오파지 EPS7을 대장균 배양액에 감염시켜 수득한 상등액을 여과하여 여과액을 준비하였다. 박테리오파지의 pfu (plaque forming unit; 파지가 플라그를 형성하는 것을 수치화한 단위, 박테리아의 경우 cfu (colony forming unit)와 유사한 개념이다)를 계산하고, LB 배지에 5.0x10⁹pfu/ml 의 양으로 준비하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.

2) 액상제제 2

상기 제제예 1)의 여과액을 생리식염수 100 ml당 박테리오파지 EPS7가 5.0x10¹¹pfu 이 되도록 혼합하여 세균사멸용 액상 제제를 제조하였다.

3) 반고체상 제제

상기 제제예 1)의 여과액을 가축 경피투여용 크림 g 당 박테리오파지 EPS7가 5.0x10⁹pfu 이 되도록 혼합하여 세균사멸용 반고체상 제제를 제조하였다.

4) 분말형 제제

사료 g 당 박테리오파지 EPS7가 5.0x10⁹pfu이 되도록 제제예 1-1)의 여과액을 첨가, 혼합, 건조 및 분말화하여 세균사멸용 분말형 제제를 제조하였다.

도 1은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 EPS7의 전자현미경 사진이고,

도 2는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 EPS7의 유전자 제한효소 처리사진이고,

도 3은 본 발명의 박테리오파지 EPS7가 포함하는 숙주 감수성과 관련된 단백질의 염기서열이며,

도 4는 돌연변이된 BtuB를 갖는 숙주세포를 이용한 박테리오파지 EPS7의 숙주 감수성을 분석한 도면이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Bacteriophage belonging to Siphoviridae and bacteriocidal composition comprising the same <130> 07p-229 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 714 <212> DNA <213> bacteriophage (Siphoviridae) <220> <221> gene <222> (1)..(714) <223> cDNA sequence expressing BtuB-binding protein <400> 1 ctaccttttt ttaccggcaa agccacgaat attggaacta caaacgtaaa accaatcatg 60 acctctacca gcagacccga taggcgcttg ccagttaggc tcccaatagt ctgcattacc 120 accatctata ggaactgtag atacacccgt tggaaagccc attaatcccc aggctctaga 180 aatagcttca ccagcagaaa caccaccagg tctaaagatc tggaaaccgg aagattgtag 240 caaagtaccg ccagttcctt gtctagcaat agattcctca tgacctaggc taccattata 300 aatataggta ccatgagcta aactatcacc gattgcaaag gcagatgtta ttgccaattc 360 agcaccagca cgtggttggt cttcaaagaa tgttaaaaac tggccaacct gagattgtgt 420 accattaagg aaacccctat gagtaccgtt tatctcaata gcagttaata taactctacc 480 aggatcattg gatttaatgt ttataatatc ccaaggcatc tgagtaacaa aatacccatt 540 acctgcatca cctagagcag cctcgtaagt cccatcaact aggacaaatg gcatatctga 600 gtggaagata ctattagtat ttggagagta gtgctgattt atatcaccac cattagcagc 660 gtttagagat aatacagttt taccatcact aaattttcct gcgaaaaaac tcat 714

Claims

시포비리데(Siphoviridae)에 속하는 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP).
제1항에 있어서, 상기 박테리오파지는 대장균 및 살모넬라 균에 숙주 감수성을 나타내는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 EPS7.
제2항에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 또는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 EPS7.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)를 유효성분으로 포함하는 세균 사멸용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 세균은 대장균 또는 살모넬라균인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 또는 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 박테리오파지 EPS7 (KCTC 11121BP)를 유효성분으로 포함하는 세균 사멸용 미생물 제제.
제7항에 있어서, 상기 세균은 대장균 또는 살모넬라 균인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제.
제8항에 있어서, 상기 살모넬라균은 살모넬라 타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella Enteritidis)인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제.
제8항에 있어서, 상기 제제는 액상, 반고체상 또는 분말상인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제.
제9항에 있어서, 상기 제제는 액상, 반고체상 또는 분말상인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제.
제10항에 있어서, 상기 제제는 액상, 반고체상 또는 분말상인 것을 특징으로 하는 세균 사멸용 미생물 제제.