CN102596219A

CN102596219A - 新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

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Publication number: CN102596219A
Application number: CN2010800427331A
Authority: CN
Inventors: 申秀安; 朴敏兑; 崔香; 赵英郁; 姜寅惠; 崔秀真
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2009-09-03
Filing date: 2010-09-03
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2030-09-03
Also published as: EP2475377A2; US20110052544A1; WO2011028059A3; ES2562640T3; WO2011028059A2; BR112012004945B8; JP5613767B2; BR112012004945B1; EP2475377A4; CN102596219B; JP2013503628A; BR112012004945A2; US8329442B2; EP2475377B1

Abstract

本发明公开了一种对选自以下的一种或多种沙门氏(Salmonella)细菌具有特异杀菌活性而不影响益生菌的新型噬菌体：肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)。还公开了用于预防和治疗由肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌所引起的传染病或用于控制沙门氏菌的组合物、动物饲料或饮用水、清洁剂以及消毒剂，所述传染病包括沙门氏菌病、沙门氏菌食物中毒、禽伤寒以及鸡白痢。

Description

新型噬菌体和包含所述噬菌体的抗菌组合物

技术领域

本发明涉及新型噬菌体。

发明背景

沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的一个属，其特征为革兰氏阴性、兼性厌氧、无芽孢形成、杆状细菌且大多数菌株均通过鞭毛活动。沙门氏菌基因组的平均GC含量为50-52％，这与大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌(Shigella)相似。沙门氏菌属是在家畜和人中引起传染的病原微生物。血清学分类指出，作为沙门氏菌的一种，肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)具有多个血清型，包括鸡血清型、鸡白痢血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型、伤寒血清型、猪霍乱血清型和德尔卑血清型(Bopp CA，Brenner FW，Wells JG，Strokebine NA.Escherichia，Shigella，Salmonella.In Murry PR，Baron EJ，et al.，eds Manual of ClinicalMicrobiology(临床微生物手册).7th ed.Washington DC American SocietyforMicrobiology 1999；467-74；Ryan KJ.Ray CG(editors)(2004)。SherrisMedical Microbiology(微生物)(4th ed).McGraw Hill.ISBN0-8385-8529-9.)。其中，鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)是特异于禽的病原体，伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)是特异于人的病原体，猪霍乱沙门氏菌(SalmonellaCholeraesuis)和德尔卑沙门氏菌(Salmonella derby)是特异于猪的病原体，肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritis)和鼠伤寒沙门氏菌(SalmonellaTyphimurium)是人和动物二者的病原体，鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌是特异于禽的病原体。各种血清型在相应的物种中引起疾病，对农民或消费者产生严重影响。

由沙门氏菌引起的家禽疾病为禽伤寒(FT)，其由鸡沙门氏菌(下文称为“SG”)病原体引起。禽伤寒(FT)是家禽(如鸡和鸭)的败血症，其病程可能为急性或慢性的，并伴有高死亡率。最近报道禽伤寒常常发生在欧洲、南美洲、非洲和东南亚，并且其破坏性逐年增加。韩国自1992年开始有FT爆发的报道，FT在褐色蛋鸡中引起的经济损失非常严重(KwonYong-Kook.2000 annual report on avian diseases.information publication byNaional Veterinary Research& Quarantine Service.March，2001；Kim Ae-Ranet al.，The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stockand parent stock in Korea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4)：347～353)。

鸡白痢也是由一种沙门氏菌菌株，鸡白痢沙门氏菌(下文称为“SP”)引起的。鸡白痢发生在任何年龄或季节，但雏鸡特别容易感染此病。上世纪，鸡白痢是在1-2周龄或更年幼雏鸡中传播的严重疾病。从二十世纪八十年代，其发病率急剧降低。然而，在二十世纪九十年代中期其发病率又开始增加。(Kwon Yong-Kook.2000 annual report on avian diseases.Information publication by National Veterinary Research & QuarantineService.March，2001；Kim Ae-Ran et al.，The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea，2003，Korean JVet Res(2006)46(4)：347-353)。

在韩国，禽伤寒和鸡白痢的爆发从二十世纪九十年代开始增加，给农民造成了经济损失。为此，已经从2004年开始在肉用仔鸡(broiler)中使用减毒活SG疫苗以预防禽伤寒(Kim Ae-Ran et al.，Theprevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parentstock inKorea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4)：347～353)。尽管其功效尚不确定，然而由于存在由鸡蛋传播传染病的风险，不允许将活疫苗用于蛋鸡。遗憾的是，与禽伤寒不同，对于鸡白痢仍没有在商业上可行的预防策略。因此，迫切需要预防禽伤寒和鸡白痢的新方法。

同时，肠炎沙门氏菌(下文称为“SE”)和鼠伤寒沙门氏菌(下文称为“ST”)是动物源性病原体，与SG或SP不同，它们没有表现出宿主特异性(Zoobises Report；United Kingdom 2003)。

SE和ST是家禽、猪和牛的沙门氏菌病的致因。由沙门氏细菌引起的沙门氏菌病是家畜消化道的急性或慢性感染，并且主要表现出发烧、肠炎和败血症的症状，偶尔会表现出肺炎、关节炎、流产和乳腺炎。沙门氏菌病发生于世界范围内，并且在夏季最频繁(T.R.Callaway et al.Gastrointestinal microbial ecology and the safety of the food supply as relatedto Salmonella.J Anim Sci 2008.86：E163-E172)。在牛中，典型的症状包括食欲不振、发烧、暗褐色腹泻或粪便中有带血的粘液。牛犊中的急性感染会导致快速死亡，并且妊娠期间的感染会导致由败血症引起的胎儿死亡，导致早产(www.livestock.co.kr)。在猪中，沙门氏菌病的临床特征主要为三种症状：急性败血症、急性肠炎以及慢性肠炎。急性败血症发生于2-4月龄的小猪中，并且通常在症状出现后2-4天内发生死亡。急性肠炎发生于育肥期，并伴随腹泻、高烧、肺炎和神经性症状。在某些严重的情况下可能会发生皮肤褪色。慢性肠炎伴随有持续性的腹泻(www.livestock.co.kr)。

一旦由SE和ST引起的沙门氏菌病在家禽、猪和牛中爆发，仅利用治疗剂是很难治愈的。原因是一旦出现临床症状，沙门氏菌就能对多种药物表现出强烈的抗性，并且能在抗生素无法透过的细胞中存活。时至今日，仍然没有可有效治疗由SE和ST所引起的沙门氏菌病的方法，包括抗生素(www.lhca.or.kr)。

如同在家畜中一样，SE和ST能通过家畜及其制品在人中引起感染，导致沙门氏菌食物中毒。摄入被感染的未煮熟的家畜制品(例如肉制品、禽制品、蛋类及副产品)能使人感染。人类的沙门氏菌食物中毒通常涉及迅速发生头痛、发烧、腹痛、腹泻、反胃和呕吐。通常在摄取生物后6-72小时内出现这些症状，并可以持续长达4-7天甚至更久(NSW+HEALTH.2008.01.14.)。

按照CDC(The Centers for Disease Control and Prevention，USA)的报道，2005至2008年间爆发的人食物中毒中的16％归因于沙门氏菌，其中SE和ST各占其20％和18％。关于1973至1984年间的人沙门氏菌食物中毒，据报道，所涉及的食品传播媒介为鸡肉(5％)、牛肉(19％)、猪肉(7％)、乳制品(6％)以及火鸡肉(9％)。在1974-1984年间，在屠宰过程中，对肉用仔鸡进行的细菌污染测试表明，35％或更多出现沙门氏菌。在1983年，在50.6％的鸡肉、68.8％的火鸡肉、60％的鹅肉、11.6％的猪肉以及1.5％的牛肉中分离出沙门氏菌。此外，在2007年进行的一项调查报道，在5.5％的生禽肉和1.1％的生猪肉中发现沙门氏菌。特别揭示，SE通常来源于受污染的蛋类或禽肉，而ST来源于受污染的猪肉、禽肉以及牛肉(www.cdc.gov)(Centers for Disease Control and Prevention(CDC))。例如，由SE引起的食物中毒自从1988在美国、加拿大和欧洲迅速增加，流行病学研究表明，这归因于蛋类或含蛋的食品(Agre-Food Safety InformationService(AGROS).Domestic and foreign food poisoning occurrence andmanagement trend.2008.02)。由FAO和WHO在2002进行的风险评估指出，通过蛋类或禽肉在人类传播沙门氏菌病的发生率似乎与在家禽中所观察到的沙门氏菌流行病存在线性关系。这意味着，当家禽中沙门氏菌流行病下降时，人类的沙门氏菌病的发生率也随之下降(Salmonellacontrol at the source；World Health Organization.International Food SafetyAuthorities Network(INFOSAN)Information Note No.03/2007)。最近，来自产品(如花生、菠菜、番茄、阿月浑子、胡椒粉以及最近的曲奇饼)的沙门氏菌的爆发已激起对食品安全的担忧(Jane Black and Ed O′Keefe.Overhaul of Food Safety Rules in the Works.Washington Post Staff WritersWednesday，July 8，2009)。

由于这些原因，沙门氏菌感染在德国必须报道(6 and 7 of the Germanlaw on infectious disease prevention，Infektionsschutzgesetz)。在1990至2005年间，官方记载的病历数从大约200,000例下降到大约50,000例。据估计，在德国平均每五个人当中就有一个沙门氏菌携带者。在美国，每年报道大约有40,000例沙门氏菌感染(en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2)。

因此，迫切需要控制能在家畜和人中引起沙门氏菌病的SE和ST。USDA与FDA的协作已开发出了多种能有效预防沙门氏菌病的策略，所述沙门氏菌病在美国引起超过一百万例食物源性疾病。其中，由FDA发行的决定性条例是降低蛋类的污染。FDA目前需要蛋类生产商在蛋类生产、储存和运输过程中定期测试致病性沙门氏菌。因此，据估计每年将避免由污染的蛋类所导致的79,000例病例和30例死亡(Jane Black and EdO′Keefe.Overhaul of Food Safety Rules in the Works.Washington Post StaffWriters Wednesday，July 8，2009)。在丹麦，从比较生产部门的沙门氏菌控制成本和沙门氏菌病的总体公共健康成本的成本收益分析得到的保守估计表明，在2001年，沙门氏菌控制措施为丹麦社会节省了1410万美元(Salmonella control at the source.World Health Organization.InternationalFood Safety Authorities Network(INFOSAN)Information Note No.03/2007)。

同时，噬菌体是仅感染并破坏细菌，并且仅能在宿主细菌内进行自我复制的一种特殊类型的病毒。噬菌体由被蛋白质外壳包围的核酸遗传物质(单链或双链DNA或RNA形式)构成。噬菌体被分成三种基本的结构类型：有尾部的二十面体(二十面)头部、无尾部的二十面体头部和丝状体。根据其尾部结构，最丰富的具有有尾部的二十面体头部的噬菌体形式被进一步分成：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)和短尾噬菌体科(Podoviridae)，其特征分别在于收缩性尾部、非收缩性的长尾和非收缩性的短尾。可以根据其头部形状和成分以及外壳的存在将具有无尾部的二十面体头部的噬菌体进行分组。根据其大小、形状、外壳和细丝(filament)成分对以DNA为其遗传物质的丝状噬菌体进行分组(H.W.Ackermann.Frequency of morphological phage descriptions in the year2000；Arch Virol(2001)146：843-857；Elizabeth Kutter et al.Bacteriophagesbiology and application；CRC press)。

在感染过程中，噬菌体附着在细菌上，并将其遗传物质注入到所述细胞中。之后，噬菌体进入裂解性或溶源性周期这两个生命周期之一。裂解性噬菌体接管所述细胞的运转以制备噬菌体组分。然后使细胞破裂或裂解，以释放新的噬菌体颗粒。溶源性噬菌体将其核酸并入到宿主细胞的染色体中，将其作为一个单元进行复制，而不破坏所述细胞。在某种情况下，溶源性噬菌体可以被诱导进入裂解周期(Elizabeth Kutter et al.Bacteriophages biology and application；CRC Press)。

在发现噬菌体后，人们最初对于其在传染病治疗中的应用给予了极大地信心。然而，在广谱抗生素得到广泛使用后，噬菌体因由于特异靶标谱而被认为是不必要的。但是，抗生素的误用和滥用使得人们对抗生素耐性和食品中残留抗生素的不良影响的担忧增加(Cislo，M et al.Bacteriophage treatmentof suppurative skin infections.ArchImmunol.Ther.Exp.1987.2：175-183；Kimsung-hun et al.，Bacteriophage；New Alternative Antibiotics.Biological research information center，(BRIC))。特别地，已知加入到动物饲料以促进生长的抗生素类生长促进剂(AGP)诱导抗生素耐性，因此最近提出禁止使用抗生素类生长促进剂(AGP)的禁令。欧盟从2006年开始禁止使用所有抗生素类促生长剂(AGP)。韩国从2009年已经禁止使用一些AGP，并且正在考虑将来限制使用所有的AGP。

这些逐渐增加的对抗生素使用的担忧已经使人们对作为抗生素替代物的噬菌体的兴趣再次兴起。在美国专利第6485902号中公开了控制大肠杆菌O157:H的7种噬菌体(2002年申请-噬菌体在控制大肠杆菌O157中的用途(Use of bacteriophages for control of Escherichia coli O157))。在美国专利第6,942,858号中公开了用于控制多种微生物的两种噬菌体(2005年由Nymox申请)。许多公司已经积极尝试利用噬菌体开发各种产品。BI food system(欧洲)开发了用于预防由单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)引起的食物中毒的食品添加剂，命名为Listex-P100，这是得到美国FDA批准的首个噬菌体产品。研发的产品LMP-102也是基于噬菌体的抗单核细胞增生李斯特氏菌的食品添加剂，并被批准GRAS(公认安全)级。在2007年，OmniLytics生产的基于噬菌体的洗剂被开发用于预防屠宰过程中牛肉的大肠杆菌O157污染，并得到美国农业部(USDA)的食品安全监督服务局(FSIS)的批准。在欧洲，产胞梭菌(Clostridium sporogenes)噬菌体NCIMB 30008和Clostridiumtyrobutiricum噬菌体NCIMB 30008分别在2003年和2005年被注册为抗梭菌污染的饲料防腐剂。这些研究表明，目前正在对将噬菌体作为在家畜产品中抗动物源性病原体的抗生素进行深入的研究。

然而，大多数噬菌体生物控制研究集中在大肠杆菌、李斯特氏菌和梭菌的控制上。沙门氏菌也是动物源性病原体，并且由这种病原体引起的损害无法被降低。如上文所提到的，由于SE和ST表现出多种药物抗性，因此已在韩国根据传染病预防法执行法令(行政命令16961)(Enforcement Decree of the Act on the Prevention of Contagious Disease(Executive Order 16961))、传染病预防法执行条例(健康福利部规章179)(Enforcement ordinance of the Act on the Prevention of Contagious Disease(Ministry of Health and Welfare′s Order 179))以及国家健康协会机构(行政命令17164)(Organization of the National Institute of Health(ExecutiveOrder 17164))进行全国范围内的抗微生物抗性监视。因此，存在对用于控制沙门氏菌的噬菌体开发的需求。

发明概述

技术问题

由本发明人进行的对从天然来源分离的噬菌体(其感染家禽的病原体——沙门氏菌)的广泛且深入的研究旨在克服由广谱抗生素的误用和滥用而产生的问题，如药物或多种药物抗性细菌的出现、药物残留等的研究，导致发现下述结果：一些分离的噬菌体除了表现出通过其形态学、生物化学和遗传学特征所鉴定的良好的耐酸性、耐热性和耐干燥性之外，还对肠炎沙门氏菌(SE)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)、鸡沙门氏菌(SG)和鸡白痢沙门氏菌(SP)具有杀菌活性而不影响益生菌，因此，所述噬菌体可用作用于预防和治疗由肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌介导的疾病(如家畜沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒)以及由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌介导的疾病(特别是禽伤寒或鸡白痢)的组合物的活性成分，从而导致本发明。此外，本发明的噬菌体还可以应用于各种控制沙门氏细菌的产品中，包括用于家畜的家畜饲料添加剂、饮用水、消毒剂以及用于肉制品的清洁剂。

技术方案

本发明的一个目的是提供对选自以下的一种或多种沙门氏细菌具有特异杀菌活性的新型噬菌体：肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。

本发明的另一个目的是提供用于预防和治疗由选自以下的一种或多种沙门氏细菌引起的传染病的包含噬菌体作为活性成分的组合物：肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。

本发明的另一个目的是为家畜提供家畜饲料添加剂和饮用水。

本发明的另一个目的是提供包含噬菌体作为活性成分的清洁剂或消毒剂。

本发明的另一个目的是提供利用包含噬菌体作为活性成分的组合物来预防或治疗由肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病或沙门氏菌食物中毒的方法。本发明还提供了用于预防或治疗由鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的禽伤寒和鸡白痢的方法。

有益效果

本发明的新型噬菌体除了具有良好的耐酸性、耐热性和耐干燥性之外，还对选自以下的一种或多种沙门氏菌菌株具有特异杀菌活性：肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。因此，本发明的新型噬菌体可用于控制肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌，还可用于预防或治疗由肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病，包括沙门氏菌病、沙门氏菌食物中毒、禽伤寒和鸡白痢。

附图说明

图1为ΦCJ7的电子显微镜照片，其中ΦCJ7属于长尾噬菌体科的形态型，特征为等轴衣壳(isometric capsid)和非收缩性长尾；

图2是展示沙门氏菌菌苔中形成ΦCJ7噬菌斑的图片：A：SE菌苔；B：ST菌苔；C：SG菌苔；D：SP菌苔；E：SA菌苔；F：SB菌苔；G：SC菌苔；H：SD菌苔。在SE、ST、SG和SP菌苔中形成了噬菌斑，但在SA、SB、SC和SD菌苔中没有形成噬菌斑；

图3为所分离的噬菌体ΦCJ7的SDS-PAGE结果，其中显示了所述噬菌体的蛋白图谱，包括38kDa、63kDa、52kDa和12kDa的主要蛋白(参见作为标志物的蓝色plus 2预染标准物(Invitrogen))；

图4为为所分离的噬菌体ΦCJ7的PFGE结果，其显示全基因组大小约为39.2至44.1kbp(使用5kbp DNA大小标准物(Bio-rad)作为大小标志物)；

图5是利用ΦCJ7基因组DNA的每个引物集所进行的PCR的结果：A：引物集SEQ ID NO.5和6；B：引物集SEQ ID NO.7和8；C：引物集SEQ ID NO.9和10；以及D：引物集SEQ ID NO.11和12。所有PCR产物的长度均为500bp-3kbp；

图6为噬菌体ΦCJ7的耐酸性测定结果，显示噬菌体在pH 2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.0、9.0、9.8和11.0时存活噬菌体的数量。与对照相比，噬菌体ΦCJ7直到pH 3.0时都没有丧失其活性，但在pH 2.5时完全丧失其活性；

图7为噬菌体ΦCJ7的耐热性测定结果，表明在37、45、53、60、70和80℃持续0、10、30、60、120分钟时存活噬菌体的数量。即便在70℃长达2小时后噬菌体ΦCJ7依然保持其活性，当在80℃暴露10分钟后其活性略有下降，当暴露更长时间时，其活性完全丧失；

图8为在加速干燥器(Lab Plant)的帮助下，噬菌体ΦCJ7的耐干燥性测定的结果，其中，当测量干燥条件下滴度的变化并与干燥前的滴度相比时，活性100％维持；

图9是用噬菌体ΦCJ7给药后1、3、7、10和14天和给药前，所绘制的大鼠体重与时间的图像，表明与对照相比，没有发现体重有显著的改变(■；雄性对照、□；给予ΦCJ7的雄性试验组、●；雌性对照、○；给予ΦCJ7的雌性试验组)；以及

图10展示了ΦCJ7的消毒效应。观察到ΦCJ7在普通水、有机稀释液和普通水+20％乳中的所有条件下都是有效的。特别地，在用ΦCJ7处理后2.5小时获得最高效应。商购产品Harasol(Yuhan Corporation，Korea)作为阳性对照，在普通水条件下展现了良好的效应，但是对有机稀释液没有效应，并且在普通水+20％乳的条件下，效应大幅降低(■；对照普通水、□；对照有机稀释液、；对照普通水+乳20％、●；ΦCJ7普通水、○；ΦCJ7有机稀释液、；ΦCJ7普通水+乳20％、▲；Harasol普通水、△；Harasol有机稀释液、；Harasol普通水+乳20％)。

本发明的最佳实施方式

一方面，本发明涉及对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性的新型噬菌体。

本发明的噬菌体属于长尾噬菌体科的B1形态型，其具有由等轴衣壳和非收缩性长尾组成的形态结构，并且特征为全基因组大小为38-45kbp，主要结构蛋白的大小范围为37-40kDa、62-65kDa、51-54kDa和10-13kDa。

在优选的实施方案中，本发明的噬菌体表现出仅特异地感染肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌的种特异性。

在优选的实施方案中，本发明的噬菌体的全基因组大小为大约38-45kbp，且优选大约39.2-44.1kbp。此外，所述噬菌体可以含有作为其基因组一部分的选自SEQ ID NO.1至4的一种或多种核酸分子。优选地，所述噬菌体含有作为其基因组一部分的由SEQ ID NO.1至4组成的核酸分子。

当在存在选自SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8、SEQ ID NO.9和10以及SEQ ID NO.11和12的引物集集的条件下，利用本发明噬菌体的基因组作为模板进行PCR时，每种PCR产物的长度为500bp-3kbp。优选地，当在分别存在上述引物集的条件下进行PCR时，每种PCR产物的长度为500bp-3kbp。

本文所使用的术语“核酸分子”意图包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子。当与作为核酸的结构单元结合起来时，术语“核苷酸”包括天然核苷酸及其糖或碱基被修饰的类似物。

本发明噬菌体的结构蛋白的大小范围为37-40kDa、62-65kDa、51-54kDa和10-13kDa。且优选与各自大约38kDa、63kDa、52kDa和12kDa的大小相对应。

此外，本发明的噬菌体具有耐酸、耐热和耐干燥的生化特性。

具体而言，本发明的噬菌体具有良好的耐酸性和耐热性，使得其可以在3.0-11.0的宽范围pH和37℃-70℃的热范围中存活。就其耐干燥性而言，所述噬菌体即使在120℃/70℃的高温和干燥条件下仍能保持活性。归因于其耐酸性、耐热性和耐干燥性的优越性，本发明的噬菌体可以在宽范围的温度和pH下使用，发现在用于预防和治疗家畜疾病和家畜介导的人类疾病的组合物和产品中的应用。

将从鸡屠宰场的污水样品分离的，并鉴定为具有对SG、SP、ST和SE的特异杀菌活性和上述性质的本发明噬菌体，命名为噬菌体ΦCJ7，并于2009年8月14日保藏在韩国微生物培养中心(361-221，Honje 1，Seodaemun，Seoul)，保藏号为KCCM11030P。

根据本发明的实施例，从鸡屠宰场收集污水样品，并用以从其分离能裂解宿主细胞SE的噬菌体。还发现它们能裂解SG、SP和ST(图2和表1)。在电子显微镜下的形态观察证实，所述噬菌体(ΦCJ7)属于长尾噬菌体科的B1形态型(图1)。

通过蛋白图谱分析测量，发现本发明的噬菌体ΦCJ7的结构蛋白为约38kDa、63kDa、52kDa和12kDa(图3)。

此外，基因组分析显示，ΦCJ7的全基因组大小约为44.1-39.1kbp(图4)，并且其中并入了SEQ ID NO.1至4的核酸分子(实施例6)。此外，通过与其它种类的遗传相似性比较测量，发现本发明的噬菌体与已知噬菌体的遗传相似性非常低，这表明本发明的噬菌体是新型噬菌体(表2)。更具体而言，当利用为ΦCJ7设计的引物集SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8、SEQ ID NO.9和10以及SEQ ID NO.11和12进行PCR时，所得到的PCR产物的大小为500bp-3kbp(图5)。

此外，观察到由ΦCJ7感染SE、ST、SG和SP所得到的噬菌斑(一个噬菌体对宿主细胞裂解而在软琼脂上产生的清澈区域)具有相同的大小和浊度(图2)。

检测ΦCJ7在宽范围的pH、温度和干燥下的稳定性。观察到所述噬菌体能在3.0至11.0的pH范围(图6)以及37℃至70℃的温度范围下(图7)存活，并且甚至在高温干燥后仍能稳定存活(120℃/70℃)(图8)。

此外，还发现野生型菌株SE、ST、SG和SP也落入ΦCJ7的宿主范围内(表3)。

当用ΦCJ7进行口服给药时，观察到大鼠在体重(图9)、死亡率、全身症状(表4)和器官异常(表5)上保持不变。

此外，清洁测定表明，当用于畜牧场时，发现噬菌体ΦCJ7可有效控制沙门氏菌(表7)，并且与作为阳性对照的传统清洁剂相比，在多种条件下对沙门氏菌菌株具有良好且一致的杀菌活性(表7)。

这些数据表明，可以将本发明的噬菌体ΦCJ7应用于各种用于控制沙门氏细菌的产品中。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗由选自以下的一种或多种沙门氏细菌引起的传染病的包含噬菌体作为活性成分的组合物：肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。

在优选的实施方案中，所述组合物可以含有抗生素。

本发明的噬菌体对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性，因此可以用于预防或治疗由这些细菌引起的疾病的目的。优选地，所述传染病的实例包括由肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒、由鸡沙门氏菌引起的禽伤寒以及由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢，但并非受限于此。

本文使用的术语“沙门氏菌病”指沙门氏菌感染后的症状，如发烧、头痛、腹泻和呕吐。也就是说，沙门氏菌病是感染了沙门氏菌属的细菌，并伴随两种代表性的症状：败血症如伤寒发烧；以及急性肠胃炎，如食物中毒、肠炎和急性bactereria。

本文所使用的术语“预防”是指包括通过给予所述组合物来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文所使用的术语“治疗”是指包括通过给予所述组合物而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。

本发明的组合物包含5x10²-5x10¹²pfu/ml的ΦCJ7，优选为1x10⁶-1x10¹⁰pfu/ml。

本发明的组合物还可以进一步包含药学上可接受的载体，并可以与所述载体一起配制进食品、药物和饲料添加剂。

本文所使用的术语“药学上可接受的载体”指不对生物体造成显著刺激且不消除所给予的活性组分的生物活性和特性的载体或稀释剂。为了将所述组合物配制成液体制剂，药学上可接受的载体必须适于无菌和生物相容性。实例包括盐水、无菌水、Ringer’s溶液、缓冲生理盐水、白蛋白输注液、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油和乙醇。它们可以单独使用或以其任意组合使用。如果需要，可以加入其它常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂等。当还与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和/或润滑剂组合时，还可以将本发明的组合物制备成注射剂(例如水性溶液、悬浮液和乳液)，或者丸剂、胶囊、粒剂或片剂。

可以通过包被或喷射将本发明的预防性或治疗性组合物局部施用于受影响的区域。

可选择地，可以通过口服或肠胃外途径给予本发明的组合物。可用的肠胃外途径为静脉内给药、腹膜内给药、肌内给药、皮下给药或外用给药。

根据包括剂型，给药方式，待治疗的患者或动物的年龄、体重、性别、状态和饮食，给药时间，给药途径，排泄速率以及应答敏感度的多种因素，当施用、喷射或给予时，本发明组合物的合适剂量可以不同。本领域技术人员显而易见的是，当给予患者药物组合物时，主治医生或兽医通过适当的医学判断可以确定合适的单日总剂量。

本发明组合物的口服剂型可以采用片剂、锭剂(troches)、糖锭(lozenges)、水悬液或乳悬液、散剂或粒剂、乳剂、硬胶囊或软胶囊、糖浆或酏剂的形式。诸如片剂和胶囊的口服剂量形式可以包含粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰延胡索酸钠或聚乙二醇蜡。对于胶囊，还可以进一步使用诸如脂质的液体载体。

对于非口服给药，可以将本发明的组合物配制成用于经皮下、静脉内或肌内途径施用的注射剂，配制成栓剂，或经呼吸道施用的喷雾吸入剂，例如气雾剂。可以通过将本发明的组合物与稳定剂或缓冲剂一起溶解或悬浮在水中，并将所述溶液或悬浮液分装在安瓿或单位小瓶中来制备注射剂形式。对于喷剂，例如气雾剂，可以将用于喷射水分散浓缩物或湿粉末的推进剂与添加剂组合使用。

本文所使用的术语“抗生素”是指可给予动物以杀灭细菌或抑制细菌生长的物质或化合物，并且意图包括防腐剂、杀菌剂和抗菌剂。所述动物是包括人在内的哺乳动物。归因于比传统抗生素具有更高的沙门氏菌特异性，本发明的噬菌体可以杀灭特定病原体而不影响益生菌。此外，本发明的噬菌体不诱导药物抗性，使其作为具有长生命周期的新型抗生素来提供。

根据另一方面，本发明涉及包含噬菌体作为活性成分的动物饲料或饮用水。

用于渔业和家畜产业的饲料添加剂抗生素意图预防感染。然而，当前大多数可用的饲料添加剂抗生素都是有问题的，原因在于它们都倾向于诱导抗性菌株的出现，并且由于它们保留在家畜产品中而可以转移至人。摄取这种残余的抗生素可能使得人类病原体对抗生素产生抗性，并导致疾病的传播。此外，常与动物饲料组合使用的多种饲料添加剂抗生素可能会导致出现抗多种药物的菌株。因此，本发明的噬菌体可用作饲料添加剂抗生素，其是足够环境友好的而成为对该问题的解决方案。

可以通过向动物饲料直接添加噬菌体或以单独的饲料添加剂的形式来制备本发明的动物饲料。在动物饲料中，本发明的噬菌体可以采用液体或干燥形式，优选以干粉形式存在。为此，本发明的噬菌体可以通过风干、自然干燥、喷雾干燥或冻干而进行干燥，但这些干燥方法并非限制本发明。基于动物饲料的总重量，可以以粉末的形式添加0.05-10重量％，优选0.1-2重量％的本发明噬菌体。除了本发明的噬菌体之外，所述动物饲料还可以包含用于使其长期保存的其它传统添加剂。

可以向本发明的饲料添加剂添加另一种非病原性微生物。可利用的其它微生物可以选自：能够产生蛋白酶、脂肪酶和转化酶的枯草杆菌(Bacillus subtilis)；能够在厌氧条件下如牛胃中发挥生理活性和分解功能的乳酸杆菌(Lactobacillus sp.)菌株；丝状真菌，包括能增加驯养动物的体重、提高乳产量并帮助饲料消化和吸收的米曲霉(Aspergillus oryzae)(JAnimal Sci 43：910-926，1976)；以及酵母，包括啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(JAnimSci56：735-739，1983)。

本发明的包含ΦCJ7的动物饲料可以包括基于植物的饲料，例如谷物、坚果、食品副产物、海草、纤维、药物副产物、油、淀粉、粗粉和谷物副产物；基于动物的饲料，例如蛋白质、矿物质、脂肪、单细胞蛋白质、浮游动物和食品废料，但并不限于此。

本发明的包含ΦCJ7的饲料添加剂可以包含用于防止质量退化的添加剂，例如粘合剂、乳化剂、防腐剂；以及用于提高功效的添加剂，例如氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白氮、硅酸盐(酯)、缓冲剂、着色剂、提取物和寡糖，但并不限于此。

当提供含有本发明噬菌体的饮用水时，家畜肠内的沙门氏细菌群可被持续减少。由此可以产生不含沙门氏菌的家畜。

根据另一方面，本发明涉及包含噬菌体作为活性成分的清洁剂或消毒剂。

包含噬菌体作为活性成分的消毒剂对于食品卫生学，例如针对食物中毒是非常有用的。具体而言，所述消毒剂不仅可以用作用来预防沙门氏菌污染的试剂或食品添加剂，而且还可以用来产生不含沙门氏菌的家畜。为了除去沙门氏菌，还可以将所述消毒剂喷射到生活污物上以及施用到家畜舍、屠宰场、污染区域(家畜死掉、制备饲料的地方和制备饲料的设施)以及家禽活动的任何区域上。

此外，包含噬菌体作为活性成分的清洁剂可以用在活家禽的已经受沙门氏菌污染的身体部分，如皮肤、羽毛等。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌介导的传染病的方法，所述方法包括将噬菌体给予有需要的动物，所述噬菌体对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌具有特异杀菌活性。

另一方面，本发明涉及用于预防或治疗肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌介导的传染病的方法，所述方法包括将组合物给予有需要的动物，所述组合物用于预防或治疗肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌介导的疾病。

可以将本发明的组合物以药物制剂的形式给予动物或者可以作为与动物饲料或饮用水的混合物被动物摄取，且优选作为与动物饲料的混合物来给予。在本发明中，所述动物包括牛、猪、鸡、家禽和人，但并不限于此。

只要能到达靶组织，本发明组合物的给药可以采用任何途径，口服或肠胃外，具体而言，可以经由口服、经直肠、外用、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、透皮、鼻内和吸入途径来给予本发明的组合物。

本发明的治疗疾病的方法包括给予治疗有效量的本发明组合物。对于本领域技术人员显而易见的是，主治医生或兽医通过适当的医学判断可以确定单日总剂量。对于指定患者来说，治疗有效量可能根据医学领域熟知的各种因素而变化，包括要获得的应答的种类和程度，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食，给药时间和途径，组合物的分泌率，治疗时间周期，根据是否使用其它试剂的具体组合物等。

通过以下实施例可以更好地理解本发明，以下所示的实施例是用于说明，而不应当被解释为限制本发明。

发明的实施方式

实施例1：沙门氏菌噬菌体的分离

1-1.噬菌体的筛选和单噬菌体的分离

将来自鸡屠宰场和附近的污水处理场的50ml的每种样品转移到离心管中，并以4000rpm离心10分钟。随后，利用0.45μm滤器过滤上清。将18ml样品滤液与150μl肠炎沙门氏菌(下文称为“SE”)振荡培养基(OD₆₀₀＝2)和2ml的10×Luria-Bertani培养基(下文称为LB培养基)，蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，终体积为1L)混合。将混合物在37℃培养18小时，并将培养液以4000rpm离心10分钟，之后利用0.2μm滤器过滤上清。另外，将3ml 0.7％琼脂(w/v)和150μl SE振荡培养基(OD₆₀₀＝2)的混合物倒在LB平板上，并允许其凝固。在该平板上涂布10μl培养物滤液，并在37℃培养18小时(将0.7％的琼脂用作“上层琼脂”，并在所述上层琼脂上进行噬菌体裂解物的滴定，称为软琼脂覆层法)。

将包含噬菌体裂解物的样品培养基的稀释液与150μl SE振荡培养基(OD₆₀₀＝2)混合，随后进行软琼脂覆层测定，从而获得单个噬菌斑。由于单个噬菌斑由相同的噬菌体组成，所以取一个噬菌斑，并将其溶解于400μl SM溶液(NaCl，5.8g；MgSO₄·7H₂O，0.2g；1M Tris-Cl(pH7.5)，50ml；H₂O，终体积为1L)中，在室温下静置4小时，以分离单噬菌体。为了扩增分离的噬菌体，从所述单噬菌体溶液中取出100μl上清，并与12ml0.7％琼脂和500μl SE振荡培养基混合，随后在LB平板(直径为150mm)上进行软琼脂覆层测定。当裂解完成后，向平板中倒入15ml SM溶液，之后将平板在室温下温和振荡4小时，以从上层琼脂中洗脱噬菌体。回收包含洗脱的噬菌体的SM溶液，并加入终体积的1％的氯仿，均匀混合10分钟。在4000rpm下离心10分钟后，利用0.2μm滤器过滤所获得的上清，并贮存在冰箱中直到使用。

1-2.噬菌体的大规模培养

利用SE大量培养所选择的噬菌体。振荡培养SE，将1.5×10¹⁰cfu(集落形成单位)的等分试样在4000rpm离心10分钟，随后将沉淀重悬在4mlSM溶液中。在其中接种7.5×10⁷pfu(噬菌斑形成单位)的噬菌体(MOI(感染倍数)为0.005)，在37℃静置20分钟。将所述溶液接种到摇瓶中的150ml LB培养基中，并于37℃孵育5小时。加入终体积的1％的氯仿，并将培养溶液振荡20分钟。加入终浓度分别为1μg/ml的DNase I和RNaseA。将溶液在37℃静置30分钟。加入终浓度分别为1M和10％(w/v)的NaCl和PEG(聚乙二醇)，并在4℃再静置3小时。将所述溶液在4℃以12000rpm离心20分钟，舍弃上清。将沉淀重悬在5ml SM溶液中，在室温下静置20分钟，并与4ml氯仿均匀混合。在4℃以4000rpm离心20分钟之后，利用0.2μm滤器过滤上清，并利用甘油密度梯度进行超离心(密度：40％，5％甘油在4℃以35,000rpm离心1小时)以纯化ΦCJ7。将纯化的ΦCJ7重悬在300μl SM溶液中，随后进行滴定，将ΦCJ7于2009年8月14日保藏在韩国微生物培养中心(361-221，Honje 1，Seodaemun，Seoul)，保藏号为KCCM11030P。

实施例2：检测ΦCJ7对沙门氏菌的感染

为了分析所选噬菌体对SE之外的沙门氏菌种的裂解活性，利用其它沙门氏菌种进行了交叉感染的试验。结果ΦCJ7没有感染SC(猪霍乱沙门氏菌)、SD(德尔卑沙门氏菌)、SA(亚利桑那沙门氏菌(Salmonella arizonae))和SB(邦戈尔沙门氏菌(Salmonella bongori))，但是感染了SE(肠炎沙门氏菌)、ST(鼠伤寒沙门氏菌)、SG(鸡沙门氏菌)和SP(鸡白痢沙门氏菌)(参见实施例11)。所述结果总结于下表1中，并在图2中展示。

表1 ΦCJ7对沙门氏菌的感染

血清型	菌株名称	噬菌斑形成	血清型	菌株名称	噬菌斑形成
						SE	SGSC2282	O	SA	ATCC13314	X
ST	ATCC14028	O	SB	ATCC43975	X
						SG	SGSC2293	O	SC	ATCC10708	X
SP	SGSC2295	O	SD	ATCC6960	X

^*ATCC：全球生物资源中心(The Global Bioresource Center)

^*SGSC：沙门氏菌遗传库中心(salmonella genetic stock center)

实施例3：噬菌体ΦCJ7的形态

利用0.01％明胶溶液稀释经纯化的ΦCJ7，随后在2.5％的戊二醛溶液中固定。将样品滴在碳包被的云母板(ca.2.5×2.5mm)上并使其适应10分钟后，用无菌的蒸馏水洗涤。将碳膜封装在铜栅(copper grid)上，并用4％的乙酸铀酰染色30-60秒，干燥。如图1所示，在JEM-1011透射式电子显微镜(80kV，放大倍数为×120,000-×200,000)下的观察发现，纯化的ΦCJ7在形态上由等轴衣壳和非收缩性长尾组成，这表明其属于长尾噬菌体科的B1形态型。

实施例4：噬菌体ΦCJ7的蛋白谱分析

将15μl纯化的ΦCJ7溶液以10¹²pfu/ml滴度与3μl 5×SDS样品溶液混合，并加热5分钟。将ΦCJ7的总蛋白在4-12％NuPAGE Bis-Tris凝胶(Invitrogen)中进行电泳，随后用考马斯亮蓝将凝胶在室温下染色1小时。如图3所示，在大约38kDa、63kDa、52kDa和12kDa处检测到主要条带。

实施例5：ΦCJ7的全基因组DNA大小

利用超速离心法分离ΦCJ7的基因组DNA。为此，向纯化的ΦCJ7培养液中加入终浓度分别为20mM、50μg/ml和0.5％(w/v)的EDTA(乙二胺四乙酸，pH8.0)、蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)，随后在50℃下孵育1小时。加入等体积的苯酚(pH8.0)并均匀混合。在室温下以12000rpm离心10分钟之后，将上清与等体积的PCI(苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)均匀混合。再次在室温下以12000rpm离心10分钟来得到上清，然后将该上清与1/10体积的3M乙酸钠和2倍体积的95％的冷乙醇混合，并在-20℃静置1小时。在0℃以12000rpm离心10分钟后，彻底除去上清，并将DNA沉淀溶解在50μl TE(Tris-EDTA，pH 8.0)中。将所提取的DNA稀释10倍，并测量其在OD₂₆₀的吸光度，以确定其浓度。将1μg全基因组DNA上样到1％PFGF(脉冲场凝胶电泳)琼脂糖凝胶中，并利用BIORAD PFGE系统程序7(大小范围为25-100kbp；转换时间梯度(switchtime ramp)为0.4-2.0秒，线形；正向电压为180V；反向电压为120V)在室温下电泳20小时。如图4所示，ΦCJ7的基因组长度约为39.2-44.1kb。

实施例6：噬菌体ΦCJ7的遗传分析

利用限制性酶StuI和NruI、AfeI和HinCII以及SnaBI和PvuII对5μgΦCJ7基因组DNA进行双重消化来起始纯化的ΦCJ7的遗传分析。用SmaI消化载体pCL 1920(Promega)，并用CIP(小牛肠碱性磷酸酶)处理。还利用T-blunt载体(Sogent)。将经消化的基因组DNA和载体以3∶1的比例混合，并在16℃连接2小时。将得到的重组载体转化到大肠杆菌DH5α中，然后将该大肠杆菌涂布在含壮观霉素或卡那霉素和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的LB平板上，用于进行蓝/白斑筛选。将所选克隆在含抗生素的培养基中振荡培养16小时。随后，利用质粒提取试剂盒(Promega)提取质粒。

利用引物集FRT135和FRT136(SEQ ID NO.13和14)以及M13正向和M13反向引物(SEQ ID NO.15和16)通过PCR确定质粒克隆，并选择大小为1kb或更长的插入片段。利用所述引物集分析它们的碱基序列。因而获得的碱基序列分别如SEQ ID NO.1-4所示，每个序列的长度都为500bp-3kbp，并利用NCBI blastx程序辅助进行序列相似性分析，结果示于以下的表2中。

表2 ΦCJ7和其它噬菌体的序列相似性

实施例7：ΦCJ7-特异性引物序列的设计

为了鉴定ΦCJ7，在SEQ ID NO.1-4的基础上设计ΦCJ7的特异性引物。利用以下各引物集进行PCR：SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8、SEQ ID NO.9和10以及SEQ ID NO.11和12。向预混物(Bioneer)中加入0.1μg基因组DNA和0.5pmol的每种引物，并将终体积调整至20μl。利用30个如下循环进行PCR：94℃变性30秒、60℃退火30秒、72℃聚合1.5分钟。利用引物集SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8、SEQID NO.9和10以及SEQ ID NO.11和12所获得的PCR产物的大小大约为500bp-3kbp。结果如图5所示。

实施例8：噬菌体的pH稳定性

为了测定ΦCJ7在鸡胃的低pH环境下是否能存活，在宽pH范围(pH2.1、2.5、3.0、3.5、4.0、5.5、6.4、6.9、7.4、8.2、9.0、9.8和11.0)内进行了稳定性测定。制备了浓度为0.2M的各种pH溶液(乙酸钠缓冲液(pH2.1、pH 5.5和pH 6.4)、柠檬酸钠缓冲液(pH 2.5、pH 3.0和pH 3.5)、磷酸钠缓冲液(pH 6.9和pH 7.4)以及Tris-HCl(pH 8.2、pH 9.0、pH 10.0和pH11.0))。将180μl的每种pH溶液与20μl噬菌体溶液(1.0X10¹¹pfu/ml)混合，得到浓度为1M的各pH溶液，随后在室温下孵育2小时。对反应溶液进行连续稀释，并通过软琼脂覆层法将10μl的各稀释液在37℃培养18小时，以测定噬菌体裂解物的滴度。测量滴度在不同pH下的变化，并与ΦCJ7在0小时时的滴度相比来测定噬菌体随pH的稳定性。结果显示，所述噬菌体没有丧失其活性，并且低至pH 3.0时都保持稳定。然而，在pH 2.5或更低时，其活性丧失。结果示于图6中。

实施例9：噬菌体的热稳定性

为了用作用作饲料添加剂，测定噬菌体对配制过程中产生的热的稳定性。为此，将200μl的ΦCJ7溶液(滴度为1.0×10¹¹pfu/ml)在37℃、45℃、53℃、60℃、70℃或80℃孵育0分钟、10分钟、30分钟、60分钟和120分钟。对所述溶液进行连续稀释，并通过软琼脂覆层法将10μl的各稀释样品在37℃培养18小时，以测定噬菌体裂解物的滴度。测定滴度随温度和暴露时间的变化，并与0小时和37℃下的滴度相比来测定噬菌体对热的稳定性。结果表明，在70℃下长达2小时，所述噬菌体都没有丧失其活性。当在80℃下暴露10分钟后，所述噬菌体活性略有下降，但是当在80℃下暴露超过10分钟后，其活性完全丧失。结果示于图7中。

实施例10：噬菌体的耐干燥性

为了用作饲料添加剂，测定噬菌体对配制过程中的干燥条件的耐性。基于热稳定性测定的结果，利用喷雾干燥仪(Lab Plant)进行干燥测定。

将葡聚糖和蔗糖(二者均为稳定剂)分别以40％和2％(w/v)的量添加到50mL滴度为1.0X10¹¹pfu/ml的ΦCJ7溶液中。将得到的溶液喷入喷雾干燥仪中，其入口和出口分别维持在120℃和70℃。将因而得到的0.3g粉末重悬于2ml SM溶液中，并测定滴度值。干燥后，所述噬菌体与干燥前的滴度相比，活性根本没有下降。结果示于图8中。

实施例11：噬菌体所感染的野生型宿主细胞菌株的范围

除了在本发明中使用的SE(SGSC SE2282)、ST(ATCC ST14028)、SG(SGSC SG2293)和SP(SGSC SP2295)外，还测定了ΦCJ7对从首尔国立大学兽医药学院鸟类疾病实验室(Laboratory of Avian Disease，College ofVeterinary Medicine，Seoul National University)和国家兽医研究及检疫服务院(National Veterinary Research and Quarantine Service)以及韩国疾病预防控制中心(Korea Centers for Disease Control and Prevention)所获得的韩国野生型肠炎沙门氏菌(菌株36)、鼠伤寒沙门氏菌(菌株22)、鸡沙门氏菌(菌株56)、鸡白痢沙门氏菌(菌株19)、猪霍乱沙门氏菌(菌株2)、德尔卑沙门氏菌(菌株4)和亚利桑那沙门氏菌(菌株1)以及邦戈尔沙门氏菌(菌株1)的裂解活性。将150μl各菌株的振荡培养液(OD₆₀₀＝2)与10μl的ΦCJ7溶液(10¹⁰pfu/ml)混合，并利用软琼脂覆层法在37℃培养18小时，以监测噬菌斑的形成。发现噬菌体ΦCJ7对SE、ST、SG和SP都具有94％的裂解活性。结果总结于以下的表3中。

表3 ΦCJ7对韩国野生型菌株SE、ST、SG和SP的裂解活性

^*SNU：首尔国立大学兽医药学院鸟类疾病实验室

^*SGSC：沙门氏菌遗传库中心

^*NVRQS：国家兽医研究及检疫服务院

^*KCDC：韩国疾病预防控制中心

实施例12：噬菌体的毒性测定

为了安全用于预防沙门氏菌病、沙门氏菌食物中毒、禽伤寒和鸡白痢，对所述噬菌体进行体内毒性测定。利用单一口服剂量进行毒性测定。在该测定中，大鼠被口服给予单一剂量的ΦCJ7，并监测急性中毒，从而测定ΦCJ7的近似致死浓度。为此，首先，在给予ΦCJ7之前，使7周龄的无特定病原体(SPF)的雄性和雌性大鼠(SD)，每种10只，挨饿24小时。在给药当天，利用口腔导管向5只雄性和5只雌性大鼠口服给予剂量为10mL/kg，滴度为1X10¹²pfu/ml的ΦCJ7，而5只对照口服给予20mMTris-HCl和2mM MgCl₂的混合物。给药后4小时，为大鼠提供食物。从给药当天的给药后30分钟开始，每小时进行监测，持续4小时。从这时开始，每隔一天来监测它们的全身症状，持续14天。它们当中没有死掉的。ΦCJ7既没产生毒性症状也没产生可察觉的临床症状。结果总结于以下的表4和5中。在给药前和给药后1、3、7、10和14天，记录体重。没有观察到体重有显著变化，这表明ΦCJ7没有引起足以降低食欲或改变体重的毒性反应。这些结果如图9所示。通过尸检和利用裸眼检查，在任何器官中均未发现可察觉的异常。因此，所述新型噬菌体ΦCJ7是非毒性的。

表4 ΦCJ7在死亡率和全身症状方面的口服毒性测定

表5 ΦCJ7在器官异常方面的口服毒性测定

a：没有检测到异常情况

实施例13：噬菌体的功效

为了评价用于预防和治疗沙门氏菌介导的疾病的ΦCJ7的功效，在鸡场测定所述噬菌体控制沙门氏菌的能力，在所述鸡场中，在抗沙门氏菌感染的严格条件下饲养了20,000只蛋鸡。

提供含有ΦCJ7(浓度为10⁶pfu/L)的饮用水，共25天。首先，提供17天。然后，在重新开始提供8天的含有ΦCJ7的饮用水之前，提供不含ΦCJ7的饮用水10天。在提供ΦCJ7之前和之后，对草垫和灰尘环境以及开发样鸡、羽毛和蛋壳进行沙门氏菌监测。在提供ΦCJ7之前，检测到孵卵处羽毛和鸡的沙门氏菌，表明难以在大鸡场内控制沙门氏菌，尽管在那里运行了控制沙门氏菌的设施。相比之下，在提供ΦCJ7之后，从环境及发育样品检测不到沙门氏菌。因此，以饮用水的形式提供ΦCJ7可有效预防沙门氏菌排放并控制沙门氏菌。结果总结于以下的表6中。

表6 ΦCJ7对沙门氏菌的杀菌效应

实施例14：作为消毒剂的噬菌体的功效

为了评价噬菌体作为清洁剂对沙门氏菌的功效。为了比较，将harasol(Yuhan Corporation，次氯酸钠4.6％，用于家禽舍、容器和饮用水的消毒剂)用作普通水、有机材料和乳条件下的对照。

制备滴度为10⁹pfu/ml的ΦCJ7、harasol(次氯酸钠4.6％)以及SE菌株。在长至O.D.＝0.5之后，将SE在普通水中稀释5倍，以得到O.D.＝0.1。准备两个250mL的烧瓶，每一个含有50mL普通水、有机材料稀释液或普通水中20％的乳稀释液。向一个烧瓶添加10⁷pfu的噬菌体，而向另一个烧瓶添加1/240的parasol稀释液。向每个烧瓶添加2mL O.D.＝0.1的细菌培养物，随后在37℃和200rpm下孵育，并在第0.5小时、2.5小时、6小时和10小时取样。将样品梯度稀释，并涂布于LB平板上。在37℃孵育18小时后，对细胞进行计数，以确定杀菌活性。当使用普通水时，传统消毒剂的抗菌活性会随条件大幅波动。相反，所述噬菌体在多种条件下均表现出一致的抗菌活性。结果如图10所示。

实施例15：作为清洁剂的噬菌体的功效

为了用作肉制品的清洁剂，测定所述噬菌体与传统清洁剂(4-6％次氯酸钠)相比的控制沙门氏菌的能力。为此，从商店购买50g鸡肋排。将SE振荡培养物(O.D.＝2)调整至10⁸cfu/ml的浓度，并以200μL的量均匀涂布于鸡肋排上，然后将该鸡肋排于室温下干燥12分钟。将含有浓度为10⁹pfu/L、10¹⁰pfu/L和10¹¹pfu/L的噬菌体ΦCJ7以50ppm加载到各喷雾器中，并将清洁剂氯气以50ppm被包含在喷雾器中。以1冲程/秒的速率喷射它们，持续10秒。将处理的鸡肋排装入各垃圾袋中，然后向该垃圾袋添加30mL SM缓冲液。以半圆弧模式震荡袋子。将因而获得的WCR(全残骸漂洗液(whole carcass rinse))进行梯度稀释，并将稀释液涂布于LB培养基上，随后于37℃孵育18小时，以测定SE的数量。就在这类处理之后，发现所述清洁剂留下了沙门氏细菌。然而，鉴定出噬菌体ΦCJ7是非常有效的。此外，随着时间的推移，与化学品相比，所述噬菌体表现出一致的清洁活性。结果总结于以下的表7中。

表7 ΦCJ7与清洁剂之间清洁功效的比较

工业应用性

本发明的噬菌体除了具有上文所描述的良好的耐酸性、耐热性和耐干燥性外，还对选自以下的一种或多种沙门氏菌具有特异杀菌活性而不影响有益细菌：肠炎沙门氏菌(SE)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)、鸡沙门氏菌(SG)和鸡白痢沙门氏菌(SP)，并且其可以广泛用作治疗剂、动物饲料或饮用水、清洁剂以及消毒剂的活性成分，所述治疗剂、动物饲料或饮用水、清洁剂以及消毒剂用于预防和治疗由肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的传染病，包括沙门氏菌病、沙门氏菌食物中毒、禽伤寒和鸡白痢。

尽管所公开的本发明的优选实施方案是为了说明的目的，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离所附权利要求书所公开的本发明的范围和实质的条件下，多种修改、添加和替代都是可能的。

布达佩斯条约下国际承认的用于专利程序的微生物保存

国际表

¹如果应用规则6/4(d)，这些数据的日期是国际保藏单位获得该状态的日期；如果在布达佩斯条约之外进行的保藏在获得国际保藏单位的状态之后转化成布达佩斯条约下的保藏，该日期是国际保藏单位收到微生物的日期

表BP/4 单页

Claims

1.分离的噬菌体，其属于长尾噬菌体科的B1形态型，对选自以下的一种或多种沙门氏菌(Salmonella)具有特异杀菌活性：肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，并通过以下特征之一来表征：

1)所述噬菌体全基因组大小为38-45kb；

2)所述噬菌体含有选自SEQ ID NO.1至4中至少一个核酸序列作为其基因组的一部分；以及

3)所述噬菌体的结构蛋白大小范围为37-40kDa、62-65kDa、51-54kDa和10-13kDa。

2.如权利要求1所述的噬菌体，其具有由等轴衣壳和非收缩性长尾组成的形态结构。

3.如权利要求1所述的噬菌体，其中在选自SEQ ID NO.5和6、SEQID NO.7和8、SEQ ID NO.9和10以及SEQ ID NO.11和12的引物集的存在下，利用所述噬菌体的基因组作为模板进行PCR，每种PCR产物的长度为500bp-3kbp。

4.如权利要求1所述的噬菌体，其表现出以下特性中的至少一种：

1)对pH 3.0至pH 11.0的耐性；

2)对37℃至70℃的热范围的耐性；

3)对120℃/70℃条件下干燥的耐性。

5.如权利要求1所述的噬菌体，其由登录号KCCM11030P来识别。

6.用于预防或治疗由选自以下的一种或多种沙门氏菌菌株引起的传染病的组合物：肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，其包含权利要求1至5中任一项所述的噬菌体作为活性成分。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述传染病为由肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)引起的沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒、由鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)引起的禽伤寒以及由鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)引起的鸡白痢。

8.如权利要求6所述的组合物，其被用作抗生素。

9.动物饲料或饮用水，其包含权利要求1-5中任一项所述的噬菌体作为活性成分。

10.消毒剂或清洁剂，其包含权利要求1-5中任一项所述的噬菌体作为活性成分。

11.用于预防或治疗由选自以下的一种或多种沙门氏菌菌株引起的传染病的方法：肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，其包括给予有需要的动物权利要求1-5中任一项所述的噬菌体。

12.用于预防或治疗由选自以下的一种或多种沙门氏菌菌株引起的传染病的方法：肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)，其包括给予有需要的动物权利要求6所述的噬菌体。