ES2562640T3 - Nuevo bacteriófago y composición antibacteriana que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un bacteriófago aislado que tiene una actividad bactericida específica frente a una o más bacterias de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum, que está depositado con el número de acceso KCCM11030P.

Description

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DESCRIPCION

Nuevo bacteriofago y composicion antibacteriana que comprende el mismo Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un nuevo bacteriofago.

Antecedentes de la tecnica

Salmonella es un genera de la familia Enterobacteriaceae, caracterizado como bacterias Gram-negativas, facultativamente anaerobias, no formadoras de esporas, con forma de baston, y la mayona de las cepas se mueven con flagelos. Salmonella tiene un contenido medio de GC genomico de un 50-52 %, que es similar al de Escherichia coli y Shigella. El genero Salmonella es un microorganismo patogeno que causa infecciones en ganado asf como en seres humanos. La division serologica contiene a Salmonella enterica, una especie de Salmonella bacterium, que tiene una diversidad de serotipos que incluyen Gallinarum, Pullorum, Typhimurium, Enteritidis, Typhi, Choleraesuis, y derby (Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, shigella, Salmonella. En Murry PR, Baron EJ, y col., eds. Manual of Clinical Microbiology. 7a ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999; 467-74; Ryan KJ. Ray CG (editores) (2004). Sherris Medical Microbiology (4a ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.). De ellos, Salmonella, Gallinarum y Pullorum son agentes patogenos adaptados en aves de corral, Salmonella Typhi es un agente patogeno adaptado en seres humanos, Salmonella Choleraesuis y Salmonella derby son agentes patogenos adaptados en porcino, y Salmonella Enteritis y Salmonella Typhimurium son agentes patogenos para seres humanos y animales. Cada serotipo causa enfermedad en las respectivas especies, dando como resultado un dano enorme a granjeros o consumidores.

Una enfermedad de aves domesticas causada por Salmonella bacterium es la Tifosis Aviar (FT), que esta causada por un agente patogeno, Salmonella Gallinarum (denominado "SG" en lo sucesivo en el presente documento). La Tifosis Aviar (FT) es una enfermedad septicemica de aves domesticas tales como pollo y pavo, y el curso puede ser agudo o cronico con mortalidad elevada. Un informe reciente ha propuesto que la Tifosis Aviar se produce frecuentemente Europa, America del Sur, Africa, y en el sudeste asiatico, con danos que aumentan cada ano. Los brotes de FT en Corea del Sur se han informado de este 1992 y las perdidas economicas causadas por la FT en gallinas ponedoras de color marron son muy graves (Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Publicacion de informacion del Servicio Nacional de Investigacion y Cuarentena Veterinaria. Marzo de 2001; Kim Ae- Ran y col., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347~353).

La pullorosis tambien esta causada por una cepa de la bacteria Salmonella, Salmonella Pullorum (denominada "SP" en lo sucesivo en el presente documento). La pullorosis se produce en cualquier edad o estacion, pero los pollos jovenes son particularmente susceptibles a la enfermedad. Durante el ultimo siglo, ha sido una enfermedad grave entre pollos jovenes de 1-2 semanas de edad o mas jovenes. Desde la decada de 1980, la aparicion ha disminuido en gran medida. Sin embargo, ha vuelto a aumentar desde mediados de 1990 (Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on avian diseases. Publicacion de informacion del Servicio Nacional de Investigacion y Cuarentena Veterinaria. March, 2001; Kim Ae-Ran y col., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347~353).

En Corea del Sur, los brotes de Tifosis Aviar y Pullorosis han aumentado desde la decada de 1990, provocando danos economicos a los granjeros. Por esta razon, se ha usado una vacuna de SG viva atenuada en pollos para consumo para prevenir la Tifosis Aviar desde 2004 (Kim Ae-Ran y col., The prevalence of pullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock in Korea, 2003, Korean J Vet Res (2006) 46 (4): 347~353). Su eficacia es dudosa, y el uso de la vacuna viva no se permite en aves ponedoras debido al riesgo de infecciones transmitidas por el huevo. Desafortunadamente, aun no hay estrategias preventivas disponibles en el mercado frente a la Pullorosis, similar a la Tifosis Aviar. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de nuevos maneras de evitar la Tifosis Aviar y la Pullorosis.

Mientras tanto, Salmonella Enteritidis (denominada "SE" en lo sucesivo en el presente documento) y Salmonella Typhimurium (denominada "ST" en lo sucesivo en el presente documento) son agentes patogenos zoonoticos, que no muestran especificidad hacia el hospedador, al igual que SG o SP (Informe de Zoobises; Reino Unido 2003).

SE y ST son agentes causales de la salmonelosis en aves de corral, cerdos y ganado. La salmonelosis, causada por bacterias de Salmonella, es una infeccion aguda o cronica del tracto digestivo en el ganado, y muestra los srntomas principales de fiebre, enteritis, y septicemia, en ocasiones neumorna, artritis, aborto, y mastitis. La salmonelosis se produce en todo el mundo, y de forma mas frecuente durante los meses de verano (T.R. Callaway y col., Gastrointestinal microbial ecology and the safety of the food supply as related to Salmonella. J Anim Sci 2008.86:E163-E172). En el ganado, algunos srntomas habituales incluyen perdida de apetito, fiebre, diarrea de color marron oscuro o moco sanguinolento en las heces. La infeccion aguda en los terneros conduce a una muerte rapida, y la infeccion durante el embarazo conduce a muerte del feto debida a septicemia, dando como resultado un aborto prematuro (
www.livestock.co.kr). En cerdos, la salmonelosis se caracteriza clmicamente por tres smdromes principales: septicemia aguda, enteritis aguda, y enteritis cronica. La septicemia aguda se produce en lechones de

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2~4 meses de edad, y la muerte normalmente se produce a los 2~4 dfas despues del inicio de los smtomas. La enteritis aguda se produce durante el periodo de engorde, y va acompanada por diarrea, fiebre elevada, neumoma, signos nerviosos. En algunos casos graves se puede producir decoloracion de la piel. La enteritis cronica va acompanada de diarrea continua (
www.livestock.co.kr).

Una vez que se produce un brote de salmonelosis por SE y ST en aves de corral, cerdos, y ganado, es diffcil curar solamente con agentes terapeuticos. Las razones son que la bacteria Salmonella presenta una fuerte resistencia a diversos farmacos y vive en celulas que son impermeables a los antibioticos desde la aparicion de los smtomas clmicos. Hasta ahora, no ha habido procedimientos para tratar de forma eficaz la salmonelosis causada por SE y ST, incluyendo antibioticos (
www.lhca.or.kr).

Al igual que en el ganado, SE y ST causan infecciones en seres humanos a traves del ganado y sus productos, lo que conduce a intoxicacion alimentaria por Salmonella. La ingesta de productos de ganado porcino cocinados de forma inapropiada, infectados (por ejemplo, productos de carne, productos de ave, huevos y productos secundarios) infecta a los seres humanos. La intoxicacion alimentaria por Salmonella en seres humanos normalmente implica el inicio rapido de dolor de cabeza, fiebre, dolor abdominal, diarrea, nauseas y vomitos. Los smtomas normalmente aparecen a las 6-72 horas despues de la ingesta del organismo, y pueden persistir durante un periodo tan largo como 4-7 dfas o incluso mas largo (NSW+HEALTH. 2008.01.14.).

De acuerdo con un informe de CDC (The Centers for Disease Control and Prevention, USA), un 16 % de apariciones de intoxicacion alimentaria en seres humanos entre 2005 y 2008 se atribuyeron a bacterias de Salmonella, con SE y ST siendo responsables de un 20 % y un 18 % de las mismas, respectivamente. Con respecto a la intoxicacion alimentaria por Salmonella en seres humanos entre 1973 y 1984, los vehmulos de transmision alimentarios implicados fueron supuestamente pollo (5 %), carne de res (19 %), cerdo (7 %), productos lacteos (6 %), y pavo (9 %). En 1974~1984, el ensayo de contaminacion bacteriana en pollos para consumo durante el procedimiento de matanza mostraba un 35 % o mas de incidencia de Salmonella. En 1983, la Salmonella se aislo en un 50,6 % de pollos, un 68,8% de pavo, un 60 % de ganso, un 11,6 % de cerdo, y un 1,5 % de carne de res. Ademas, una encuesta realizada en 2007 informaba que la Salmonella se encontraba en un 5,5 % de carne de aves de corral sin procesary un 1,1 % de cerdo sin procesar. En particular, se revelo que SE normalmente originada a partir de huevos o carne de aves de corral, y St de carne de cerdo, carne de aves de corral, carne de res contaminadas (
www.cdc.gov) (Centers for Disease Control and Prevention (CDC)). Por ejemplo, la intoxicacion alimentaria causada por SE ha aumentado rapidamente en Estados Unidos, Canada y Europa desde 1988, y algunos estudios epidemiologicos demostraron que esto se atribrna a huevos o alimentos que conteman huevo (Agre-Food Safety Information Service (AGROS). Domestic and foreign food poisoning occurrence and management trend. 2008. 02). Una evaluacion de riesgo dirigida por FAO y OMS en 2002 indicaba que la incidencia de salmonelosis en seres humanos transmitida a traves de huevos y carne de ave de corral parecfa tener una relacion lineal con el predominio de Salmonella observada en aves de corral. Esto significa que, cuando se reduce el predominio de Salmonella en aves de corral, la incidencia de salmonelosis de seres humanos disminuira (Salmonella control at the source; Organizacion Mundial de la Salud. International Food Safety Authorities Network (INFOSAN) Information Note No. 03/2007). Recientemente, las preocupaciones con respecto a la seguridad alimentaria se han visto impulsadas por brotes de Salmonella de productos tan variados como cacahuates, espinacas, tomates, pistachos, pimientos y, mas recientemente, masa para galletas (Jane Black y Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009).

Por estas razones, las infecciones por Salmonella se deben informar en Alemania (6 y 7 de la ley alemana sobre prevencion de enfermedades infecciosas, Infektionsschutzgesetz). Entre 1990 y 2005 el numero de casos oficialmente registrados disminuyo de aproximadamente 200.000 casos a aproximadamente 50.000. Se calcula que cada cinco personas en Alemania es portadora de Salmonella. En Estados Unidos, cada ano se informan aproximadamente 40.000 casos de infeccion por Salmonella (en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2).

Por lo tanto, existe una necesidad urgente del control de SE y ST, que causa salmonelosis en ganado y seres humanos. Los esfuerzos colaboradores de USDA y FDA han desarrollado una serie de estrategias eficaces para prevenir la salmonelosis que causa aproximadamente 1 millon de casos de enfermedades transmitidas por alimentos en Estados Unidos. Entre ellas una regla final, expedida por la FDA, es reducir la contaminacion en huevos. La FDA ahora requiere que los productores de huevos sometan a ensayo en forma regular la Salmonella letal durante la produccion, almacenamiento y transporte de huevos. Como resultado, se calcula que cada ano se evitaran 79.000 enfermedades y 30 muertes debidas a huevos contaminados (Jane Black y Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules en the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009). En Dinamarca, algunos calculos conservadores de un analisis de beneficio de costes que compara los costos control de la Salmonella en el sector de produccion con los costes globales de salud publica por salmonelosis sugieren que las medidas de control de Salmonella ahorraron a la sociedad danesa 14,1 millones de dolares americanos en el ano 2001 (Salmonella control at the source. Organizacion Mundial de la Salud. International Food Safety Authorities Network (INFOSAN) Information Note No. 03/2007).

Mientras tanto, el bacteriofago es un tipo de virus especializado que infecta y destruye solamente bacterias, y se puede autorreplicar solamente dentro de las bacterias hospedadoras. El bacteriofago consta de material genetico en forma de ADN o ARN mono o bicatenario rodeado por una cobertura proteica. Los bacteriofagos se clasifican en tres

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formas estructurales basicas: una cabeza con forma de icosaedro (veinte lados) con una cola; una cabeza con forma de icosaedro sin una cola; y una forma filamentos. Basandose en la estructura de su cola, la forma de bacteriofagos mas abundante, que tienen una cabeza con forma de icosaedro con una cola, se dividen adicionalmente en: Myoviridae, Siphoviridae, y Podoviridae, que se caracterizan por colas contractiles, no contractiles largas, y no contractiles cortas, respectivamente. Los bacteriofagos que tienen una cabeza con forma de icosaedro sin una cola se dividen basandose en la forma de su cabeza componentes, y la presencia de una cobertura. Los bacteriofagos filamentosos que tienen ADN como su material genetico se dividen basandose en su tamano, forma, cobertura, y componentes del filamento (H.W. Ackermann. Frequency of morfological phage descriptions in the year 2000; Arch Virol (2001) 146: 843-857; Elizabeth Kutter y col. Bacteriophages biology and application; CRC press).

Durante la infeccion, un bacteriofago ataca a una bacteria e inserta su material genetico en la celula. Despues de esto, un bacteriofago sigue uno de dos ciclos de vida, lttico o lisogenico. Los bacteriofagos lfticos se encargan de la maquinaria de la celula para preparar componentes de fago. A continuacion destruyen o alisan la celula, liberandolo las partfculas de fago. Los bacteriofagos lisogenicos incorporan su acido nucleico en el cromosoma de la celula hospedadora y se replican con la misma en forma de una unidad sin destruir la celula. En ciertas condiciones, algunos fagos lisogenicos se pueden inducir para que sigan un ciclo lttico (Elizabeth Kutter y col. Bacteriophages biology and application. CRC Press).

Despues del descubrimiento de bacteriofagos, inicialmente se deposito mucldsima confianza en su uso para terapia en enfermedades infecciosas. Sin embargo, cuando los antibioticos de amplio espectro comenzaron a usarse de forma habitual, se observo que algunos bacteriofagos eran innecesarios debido a un espectro diana espedfico. No obstante, el uso incorrecto y el abuso de antibioticos dio como resultado el aumento de las preocupaciones con respecto a la resistencia a antibioticos y efectos nocivos de antibioticos residuales en los alimentos (Cislo, M y col. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. Arch Immunol. Ther. Exp. 1987.2: 175-183; Kim sung-hun y col., Bacteriophage; New Alternative Antibiotics. Biological research information center (BRIC)). En particular, se sabe que el promotor del crecimiento antimicrobiano (AGP), anadido a alimentos de animales para aumentar el crecimiento, induce resistencia a antibioticos, y por lo tanto, se ha introducido recientemente la prohibicion del uso de promotor de crecimiento antimicrobiano (AGP). En la Union Europea, el uso de todos los promotores de crecimiento antimicrobiano (AGP) se prohibio a partir de 2006. Corea del Sur ha prohibido el uso de algunos AGP a partir de 2009, y esta considerando restricciones sobre el uso de todos los AGP en el futuro.

Estas preocupaciones crecientes con respecto al uso de antibioticos han conducido a una reaparicion del interes en los bacteriofagos como una alternativa a los antibioticos. En el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.485.902 se desvelan siete bacteriofagos para control de 0157:H de E.coli (Uso de bacteriofagos para control de O157 de Escherichia coli, expedida en 2002). En el documento de Patente de Estados Unidos N° 6.942.858 se desvelan dos bacteriofagos para control de diversos microorganismos (expedida por Nymox en 2005). Muchas compares han intentado desarrollar de forma activa diversos productos usando bacteriofagos. El sistema alimentario de EBI (Europa) desarrollo un aditivo alimentario para prevenir la intoxicacion alimentaria causada por Listeria monocytogenes, denominada Listex-P100, que es el primer producto de bacteriofago aprobado por la de US FDA. Tambien se desarrollo un producto basado en fagos, LMP-102 como un aditivo alimentario frente a Listeria monocytogenes, aprobado como GRAS (Generalmente Reconocido Como Seguro). En 2007, se desarrollo un lavado basado en fagos producido por OmniLytics para prevenir la contaminacion por 0157 de E.coli de carne de res durante la matanza, aprobado por el Food Safety and Inspection Service (FSIS) de USDA. En Europa, el fago NCIMB 30008 de Clostridium sporogenes y el fago NCIMB 30008 de Clostridium tyrobutiricum se registraron como conservantes de alimentos frente a contaminacion de alimentos por Clostridium en 2003 y 2005, respectivamente. Tales estudios muestran que en la actualidad se esta desarrollando investigacion en bacteriofagos para uso como antibioticos frente a patogenos zoonoticos en productos de ganado.

Sin embargo, la mayona de los estudios de biocontrol de fagos se han centrado en el control de E.coli, Listeria, y Clostridium. La Salmonella tambien es un agente patogeno zoonotico, y algunos danos debidos a este agente patogeno no se reducen. Como se ha mencionado anteriormente, dado que SE y ST presentan resistencia a multiples farmacos, en Corea del Sur se ha realizado vigilancia de resistencia antimicrobiana a nivel nacional bajo el Decreto de Aplicacion de la Ley para la Prevencion de Enfermedades Contagiosas (Orden Ejecutiva 16961), Ordenanza de aplicacion de la Ley para la Prevencion de Enfermedades Contagiosas (Orden 179 del Ministerio de Salud y Bienestar Social), y Organizacion del Instituto Nacional de la Salud (Orden Ejecutiva 17164). Por consiguiente, existe una necesidad de desarrollo de bacteriofagos para controlar Salmonella.

Divulgacion de la invencion

Problema Tecnico

Como parte mas destacada de la presente invencion, la investigacion intensa y exhaustiva en bacteriofagos, aislados a partir de fuentes naturales, que infectan las aves de corral con el agente patogeno Salmonella, realizados por los presentes inventores, con el objetivo de superar los problemas que se producen despues del uso incorrecto o uso excesivo de antibioticos de amplio espectro, tal como la aparicion de bacterias resistentes a farmaco o a multiples farmacos, etc., dio como resultado el hallazgo de que algunos de los bacteriofagos aislados tienen una actividad bactericida espedfica frente a Salmonella Enteritidis (SE), Salmonella Typhimurium (ST), Salmonella

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Gallinarum (SG) y Salmonella Pullorum (SP) sin influencias en bacterias beneficiosas, ademas de mostrar resistencia a acidos y al calor excelentes y tolerancia a la desecacion, como se identifica para las propiedades morfologicas, bioqmmicas y geneticas de los mismos, y por lo tanto que los bacteriofagos se pueden usar como principios activos de composiciones para la prevencion y tratamiento de enfermedades mediadas por Salmonella Enteritidis o Salmonella Typhimurium, tales como salmonelosis de ganado e intoxicacion alimentaria por Salmonella, y enfermedades mediadas por Salmonella Gallinarum o Salmonella Pullorum, en particular, Tifosis Aviar y Pullorosis. Ademas, el bacteriofago de acuerdo con la presente invencion se puede aplicar a diversos productos para el control de bacterias de Salmonella, incluyendo aditivos alimentarios para ganado, agua potable para ganado, desinfectantes de granero, y productos de limpieza para productos carnicos.

Solucion al Problema

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un nuevo bacteriofago que tiene una actividad espedfica frente a una o mas bacterias de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum, que esta depositado con el numero de referencia KCCM11030P.

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion para la prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por una o mas bacterias de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum, que comprenden el bacteriofago que esta depositado con el numero de referencia KCCM11030P como un principio activo.

Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un aditivo alimentario para ganado y agua potable para ganado, que comprende el bacteriofago que esta depositado con el numero de referencia KCCM11030P.

Ademas un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un producto de limpieza o un desinfectante, que comprende el bacteriofago que esta depositado con el numero de referencia KCCM11030P como un principio activo.

En el presente documento se describe adicionalmente un procedimiento para prevenir o tratar la salmonelosis o en intoxicacion alimentaria por Salmonella causada por Salmonella Enteritidis o Salmonella Typhimurium usando la composicion que comprende el bacteriofago que esta depositado con el numero de referencia KCCM11030P como un principio activo. Ademas, en el presente documento se describe un procedimiento para prevenir o tratar la tifosis aviar y la pullorosis causadas por Salmonella Gallinarum o Salmonella Pullorum.

Efectos Ventajosos de la Invencion

El nuevo bacteriofago de la presente invencion tiene una actividad bactericida espedfica frente a una o mas cepas de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella. Tiphimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum, ademas de mostrar resistencia a acidos y al calor excelentes y tolerancia a la desecacion. Por lo tanto, el nuevo bacteriofago de la presente invencion se puede usar para el control de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum asf como para prevenir o tratar enfermedades infecciosas causadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum, incluyendo salmonelosis, intoxicacion alimentaria por Salmonella, Tifosis Aviar y Pullorosis.

Breve Descripcion de las Figuras

La FIG. 1 es una fotograffa de microscopfa electronica de OCJ7, que muestra que OCJ7 pertenece al grupo morfotfpico de la familia Siphoviridae, caracterizado por una capside isometrica y una cola contractil larga; la FIG. 2 es una fotograffa que muestra la formacion de placas de OCJ7 en un cultivo de bacterias de Salmonella: A: en un cultivo de SE; B: en un cultivo de ST; C: en un cultivo de SG; D: en un cultivo de SP; E: en un cultivo de SA; F: en un cultivo de SB; G: en un cultivo de SC; H: en un cultivo de SD. Las placas se forman en los cultivos de SE, ST, SG y SP, pero no en los cultivos de SA, SB, SC y SD.

la FIG. 3 es el resultado de SDS-PAGE del bacteriofago OCJ7 aislado, en el que se muestran patrones de protema del bacteriofago, con la aparicion de protemas principales a 38 kDa, 63 kDa, 52 kDa y 12 kDa (See-blue mas 2 patron tenido previamente (Invitrogen) usado como marcador);

la FIG. 4 es el resultado de PFGE del bacteriofago OCJ7 aislado, que muestra el tamano del genoma total de aproximadamente 39,2 a 44,1 kpb, con un patron de tamano de ADN de 5 kpb (Bio-rad) que sirve como un marcador de tamano;

la FIG. 5 es el resultado de PCR, realizada usando cada cebador expuesto para el ADN genomico de OCJ7: A: un conjunto de cebador de las SEC ID N°s: 5 y 6; B: un conjunto de cebador de las SEC ID N°s: 7 y 8; C: un conjunto de cebador de las SEC ID N°s: 9 y 10; y D: un conjunto de cebador de las SEC ID N°s: 11 y 12. Todos los productos de PCR teman una longitud de 500 pb ~ 3 kpb;

la FIG. 6 es el resultado de ensayo de resistencia a acidos en el bacteriofago OCJ7, que muestra el numero de bacteriofagos que sobreviven a pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,0, 9,0, 9,8 y 11,0. El bacteriofago OCJ7 no perdfa su actividad hasta pH 3,0, pero perdfa completamente su actividad a pH 2,5 o inferior, en

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comparacion con el control;

la FIG. 7 es el resultado de ensayo de resistencia al calor en el bacteriofago OCJ7, que muestra el numero de bacteriofago que sobreviven a 37, 45, 53, 60, 70 y 80 °C durante 0, 10, 30, 60 y 120 min. El bacteriofago OCJ7 mantema su actividad a 70 °C hasta 2 horas, pe^a su actividad un poco cuando se expoma a 80 °C durante 10 mins, perdfa totalmente su actividad cuando se expoma a mas tiempo;

la FIG. 8 es el resultado de ensayo de resistencia a desecacion en el bacteriofago OCJ7 con la ayuda de una secadora de velocidad (Lab Plant), en que cuando los cambios de titulacion en la condicion seca se median en comparacion con titulaciones previas al secado, la actividad se mantema en un 100 %;

la FIG. 9 es un grafico en el que los pesos corporales de ratas se representan frente al tiempo a los 1, 3, 7, 10 y 14 dfas despues de la administracion y antes de la administracion con el bacteriofago 0CJ7, mostrando que no se encontraban cambios significativos en el peso corporal en comparacion con el control (■; control de machos, □ ; grupo de ensayo con machos administrados con OCJ7, •; control de hembras, o; grupo de ensayo con hembras administradas con OCJ7); y

la FIG. 10 es un grafico que muestra el efecto desinfectante de OCJ7. Se observo que OCJ7 era eficaz en todas las condiciones de agua ligera, dilucion organica, y agua ligera + leche al 20 %. En particular, el efecto mas elevado se obtuvo 2,5 horas despues del tratamiento con OCJ7. El producto Harasol (Yuhan Corporation, Corea) disponible en el mercado, como un control positivo, presentaba efectos excelentes en la condicion de agua ligera, pero sin efectos en la dilucion organica, y efecto reducido en gran medida en la condicion de agua ligera + leche al 20 % (■; agua ligera de control, □; dilucion organica de control, ; agua ligera de control + leche al 20 %, • ; agua ligera con OCJ7, o; dilucion organica con OCJ7, ; agua ligera con OCJ7 + leche al 20 %, ▲; agua ligera con Harasol, A; dilucion organica con Harasol; agua ligera con Harasol + leche al 20 %).

Mejor Modo para Realizar la Invencion

De acuerdo con un aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a un nuevo bacteriofago aislado, OCJ7, depositado con el numero de referencia KCCM11010P, que tiene una actividad bactericida espedfica frente a Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum.

El bacteriofago de la presente invencion pertenece a la familia Siphoviridae de morfotipo B 1 con la estructura morfologica que consiste en una capside isometrica y una cola larga, no contractil, caracterizado por un tamano del genoma total de 38-45 kpb y protemas estructurales principales que un tamano que vana de 37 a 40 kDa, de 62 a 65 kDa, de 51 a 54 kDa y de 10 a 13 kDa.

En una realizacion preferente, el bacteriofago de la presente invencion muestra la especificidad de especies de infeccion espedficamente solo de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum.

En una realizacion preferente, el bacteriofago de la presente invencion tienen un tamano del genoma total de aproximadamente 38-45 kpb, y de forma preferente aproximadamente 39,2-44,1 kpb. Ademas, el bacteriofago puede contener, como partes del genoma del mismo, una o mas moleculas de acido nucleico seleccionadas entre el grupo que consiste en las SEC ID N°s: 1 a 4. Preferentemente, el bacteriofago contiene, como partes del genoma del mismo, moleculas de acido nucleico que consisten en las SEC ID N°s: 1 a 4.

Cuando se realiza PCR en presencia de un conjunto de cebador seleccionado entre las SEC ID N°s: 5 y 6, SEC ID N°s: 7 y 8, SEC ID N°s: 9 y 10 y SEC ID N°s: 11 y 12, con el genoma del bacteriofago de la presente invencion sirviendo como un molde, cada producto de PCR tiene una longitud de 500 pb ~ 3 kpb. Preferentemente, cuando se realiza PCR en presencia del conjunto de cebador mencionado anteriormente, respectivamente, cada producto de PCR tiene una longitud de 500 pb ~ 3 kpb.

La expresion "molecula de acido nucleico", como se usa en el presente documento, pretende incluir moleculas de ADN (ADNg y ADNc) y ARN. El termino "nucleotidos", que cuando se unen entre sf, forman las unidades estructurales de moleculas de acido nucleico, incluye los analogos de los mismos naturales y los modificados con azucar o con base.

El bacteriofago de la presente invencion tiene protemas estructurales principales con un tamano que vana de 37 a 40 kDa, de 62 a 65 kDa, de 51 a 54 kDa y de 10 a 13 kDa, y que corresponden preferentemente a tamanos respectivos de aproximadamente 38 kDa, 63 kDa, 52 kDa y 12 kDa.

Ademas, el bacteriofago de la presente invencion muestra propiedades bioqmmicas de resistencia a acidos, calor y desecacion.

Con mayor detalle, el bacteriofago de la presente invencion tiene resistencia excelente a acidos y calor de modo que puede sobrevivir en un amplio intervalo de pH de 3,0 a 11,0 y un intervalo de calor de 37 °C a 70 °C. Con respecto a la tolerancia a la desecacion del mismo, el bacteriofago puede permanecer viable incluso a una temperatura elevada y condicion seca de 120 °C/70 °C. Gracias a la superioridad del mismo en resistencia a acidos, calor y desecacion, el bacteriofago de la presente invencion se puede usar en un amplio intervalo de temperaturas y pH, encontrando aplicaciones en composiciones y productos para la prevencion y tratamiento de enfermedades del ganado y enfermedades humanas mediadas por ganado.

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El bacteriofago de la presente invencion que se aislo de muestras de aguas residuales de mataderos de polios y se identifico como en posesion de una actividad bactericida espedfica frente a SG, SP, ST y SE y las caractensticas mencionadas anteriormente, se denomino OCJ7 y se deposito en el Korean Culture Center of Microorganisms (361221, Honje 1, Seodaemun, Seul) el 14 de agosto de 2009 con el numero de referencia KCCM11030P.

De acuerdo con un ejemplo de la presente invencion, las muestras de aguas residuales se recogieron de mataderos de pollos y se usaron para aislar de las mismas bacteriofagos que pueden lisar el SE de la celula hospedadora. Tambien se encontro que lisaban SG, SP y ST (FIG. 2 y Tabla 1). Un examen morfologico con un microscopio electronico confirmo que el bacteriofago (OCJ7) pertenece a la familia Siphoviridae del morfotipo B1 (FIG. 1).

Se encontro que el bacteriofago OCJ7 de la presente invencion tema protemas estructurales de aproximadamente 38 kDa, 63 kDa, 52 kDa y 12 kDa, como se mide con un analisis de patron de protemas (FIG. 3).

Ademas, un analisis genomico mostraba que OCJ7 tiene un tamano del genoma total de aproximadamente 44,139,1 kpb (FIG. 4), con las moleculas de acido nucleico de SEC ID N°s: 1 a 4 incorporadas en el mismo (Ejemplo 6). Ademas, se encontro que el bacteriofago de la presente invencion tema una similitud genetica muy baja con bacteriofagos conocidos como se mide mediante la comparacion de similitud genetica con otras especies, lo que indica que el bacteriofago de la presente invencion es uno nuevo (Tabla 2). Mas particularmente, cuando se realizo PCR usando los conjuntos de cebador de las SEC ID N°s: 5 y 6, SEC ID N°s: 7 y 8, SEC ID N°s: 9 y 10, y SEC ID N°s: 11 y 12, que se disenaron para OCJ7, los productos de PCR resultantes teman un tamano de 500 pb ~ 3 kpb (FIG. 5).

Ademas, se observo que las placas de fagos (formas claras formadas en un cultivo de cells en agar blando debido a lisis con fago) que resultan de la infeccion de OCJ7 en SE, ST, SG y SP teman el mismo tamano y turbidez (FIG. 2).

El OCJ7 se examino para estabilidad en un amplio espectro de pH, temperatura y desecacion. Se observo que el bacteriofago sobrevrna en un intervalo de pH de 3,0 a 11,0 (FIG. 6) y un intervalo de temperatura de 37 °C a 70 °C (FIG. 7) ademas de permanecer viable de forma estable incluso despues de desecacion a temperatura elevada (120 °C/70 °C) (FIG. 8).

Ademas, tambien se encontro que las cepas SE, ST, SG y SP de tipo silvestre entraban dentro del intervalo de celula hospedadora de OCJ7 (Tabla 3).

Cuando se administran por via oral con OCJ7, se observo que algunas ratas permanedan sin cambio de peso (FIG. 9), mortalidad, smtomas generales (Tabla 4) y anomalfa en organos (Tabla 5).

Ademas, un ensayo de limpieza muestra que, cuando se usa en granjas de ganado, se encuentra que el bacteriofago OCJ7 controlar la Salmonella de forma eficaz (Tabla 7) y tiene actividad bactericida excelente y coherente frente a cepas de Salmonella en diversas condiciones, en comparacion con agentes de limpieza convencionales como controles positivos (Tabla 7).

Estos datos implican que el bacteriofago OCJ7 de la presente invencion se puede aplicar a diversos productos para el control de bacterias de Salmonella.

De acuerdo con otro aspecto de la misma, la presente invencion se refiere a una composicion para la prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por una o mas bacterias de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum, que comprenden el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.

En una realizacion preferente, la composicion puede contener un antibiotico.

Al tener actividad bactericida espedfica frente a Salmonella enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, y Salmonella Pullorum, el bacteriofago de la presente invencion se puede usar con el fin de prevenir o tratar las enfermedades causadas por las bacterias. Preferentemente, algunos ejemplos de las enfermedades infecciosas incluyen salmonelosis e intoxicacion alimentaria por Salmonella con Salmonella enteritidis o Salmonella Typhimurium, Tifosis Aviar con Salmonella Gallinarum y Pullorosis con Salmonella Pullorum incluyen, pero no se limitan a los mismos.

Como se usa en el presente documento, el termino "samonelosis" se refiere a smtomas despues de la infeccion con Salmonella, tales como fiebre, dolor de cabeza, diarrea y vomitos. Es decir, la salmonelosis es una infeccion con bacterias del genero Salmonella, que va acompanada con dos smtomas representativos: septicemia tal como fiebre tifoidea; y gastroenteritis aguda tal como intoxicacion alimentaria, enteritis, y bacteriemia aguda.

Como se usa en el presente documento, el termino "prevencion" pretende incluir todas las acciones para contener o retrasar la evolucion de la enfermedad a traves de la administracion de la composicion. El termino "tratamiento", en este contexto, incluye todas las acciones para mejorar o cambiar de forma beneficiosa la condicion del paciente a traves de la administracion de la composicion.

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La composicion de la presente invencion comprende OCJ7 en una cantidad de 5x102 a 5x1012 pfu/ml, y preferentemente en una cantidad de 1 x 106 a 1 x 1010 pfu/ml.

La composicion de la presente invencion puede comprender adicionalmente un vehnculo farmaceuticamente aceptable, y se puede formular junto con el vehfculo en alimentos, medicamentos y aditivos alimentarios.

Como se usa en el presente documento, la expresion "vehnculo farmaceuticamente aceptable" se refiere a un vehnculo o diluyente que ni causa irritacion significativa a un organismo ni degrada la actividad biologica ni las propiedades del principio activo administrado. Para uso en la formulacion de la composicion en una preparacion ifquida, un vehfculo farmaceuticamente aceptable debe ser adecuado para estilizacion y biocompatibilidad. Algunos ejemplos incluyen solucion salina, agua esteril, solucion de Ringer, solucion salina fisiologica tamponada, solucion de infusion de albumina, solucion de dextrosa, solucion de maltodextrina, glicerol, y etanol. Se pueden usar solos o en cualquier combinacion de los mismos. Si fuera necesario, otro aditivo convencional, tal como antioxidantes, tampones, agentes bacteriostaticos, etc., se pueden anadir a la composicion. Cuando se combinan adicionalmente con diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y/o lubricantes, la composicion de la presente invencion se puede formular en inyecciones tales como soluciones acuosas, suspensiones y emulsiones, o pfldoras, capsulas, granulos, o comprimidos.

Las composiciones profilacticas o terapeuticas de la presente invencion se pueden aplicar por via local a las zonas afectadas mediante revestimiento o pulverizacion.

Como alternativa, la composicion de la presente invencion se puede administrar a traves de vfas orales o parenterales. Las vfas parenterales estan disponibles para administracion intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea o topica.

Dependiendo de una diversidad de factores que incluyen formulaciones, el modo de administracion, la edad, peso, sexo, condicion y dieta del paciente o animal que se esta tratando, el tiempo de administracion, la via de administracion, la tasa de excrecion, y sensibilidad de la reaccion, la dosificacion adecuada de la composicion de la presente invencion variara cuando se aplica, pulveriza o administra. Para los expertos en la materia sera evidente que cuando la composicion farmaceutica se administra a pacientes, la dosis diaria total adecuada la puede determinar un medico o veterinario que tratan a los pacientes dentro del alcance del criterio medico sensato.

Las preparaciones de dosificacion oral de la composicion de la presente invencion pueden tomar la forma de comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosa o de emulsion, polvos o granulos, emulsiones, capsulas duras o blandas, jarabes o elixires. Las formas de dosificacion oral tales como comprimidos y capsulas pueden comprender un aglutinante tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidon, amilopectina, celulosa o gelatina, un excipiente tal como fosfato dicalcico, un agente disgregante tal como almidon de mafz o almidon de patata dulce, un lubricante tal como estearato de magnesio, estearato calcico, estearilfumarato sodico, o cera de polietilenglicol. Para capsulas, se puede usar adicionalmente un vehfculo lfquido tal como lfpido.

Para administracion no oral, la composicion de la presente invencion se puede formular inyecciones a traves de vfas subcutanea, intravenosa, o intramuscular, supositorios, o pulverizaciones inhalables a traves del tracto respiratorio, tales como aerosoles. Algunas formas de inyeccion se pueden preparar por disolucion o suspension de la composicion de la presente invencion, junto con un estabilizante o un tampon, en agua y cargando la solucion suspension en formas unitarias de ampollas o vial. Para pulverizaciones, tales como aerosoles, un agente propulsor para pulverizacion de un concentrado dispersado en agua o polvo de humectacion se puede usar en combinacion con un aditivo.

El " antibiotico", como se usa en el presente documento, se refiere una sustancia o compuesto que se pueden administrar a animales para eliminar bacterias o inhibir su crecimiento y pretende incluir agentes antisepticos, bactericidas y antibacterianos. Los animales son mairnferos incluyendo seres humanos. Gracias a la ventaja de presentar una especificidad mas elevada para Salmonella con respecto a otros antibioticos convencionales, el bacteriofago de la presente invencion puede eliminar los agentes patogenos espedficos sin afectar a las bacterias beneficiosas. Ademas, el bacteriofago de la presente invencion no induce resistencia a farmacos de modo que se puede proporcionar como un nuevo antibiotico con un ciclo de vida largo.

De acuerdo con un aspecto adicional de la misma, la presente invencion se refiere a un alimento o agua potable para animales, que comprende el bacteriofago como un principio activo.

Algunos antibioticos de aditivos alimentarios usados en la industria de pesca y ganadena estan destinados a prevenir infecciones. Sin embargo, la mayona de los antibioticos de aditivos alimentarios disponibles en la actualidad son problematicos porque son aptos para inducir la aparicion de cepas resistentes y se pueden transferir a seres humanos ya que permanecen en productos de ganado. La absorcion de tales antibioticos residuales puede hacer que algunos patogenos humanos se conviertan en resistentes a antibioticos, dando como resultado la propagacion de enfermedades. Ademas, muchos tipos de antibioticos de aditivos alimentarios, usados normalmente en combinacion en alimentos para animales, puede causar la aparicion de cepas resistentes a multiples farmacos. Por lo tanto, el bacteriofago de la presente invencion se puede usar como un antibiotico de aditivo alimentario que es lo suficientemente ecologico como para ser una solucion a los problemas.

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El alimento para animales de acuerdo con la presente invencion se puede preparar mediante la adicion del bacteriofago directamente o en una forma de aditivo alimentario separada a un alimento para animales. En un alimento para animales, el bacteriofago de la presente invencion puede adquirir una forma lfquida o una forma seca, y existe preferentemente en forma de un polvo seco. En este sentido, el bacteriofago de la presente invencion se puede secar mediante secado con aire, secado natural, secado por pulverizacion o liofilizacion, pero estos procedimientos de secado no limitan la presente invencion. El bacteriofago de la presente invencion se puede anadir en forma de polvo en una cantidad de un 0,05 % a un 10 % en peso, preferentemente en una cantidad de un 0,1 % a un numero 2 % en peso, basandose en el peso total del alimento para animales. El alimento para animales puede comprender otros aditivos convencionales utiles para la conservacion del mismo a largo plazo, ademas del bacteriofago de la presente invencion.

Al aditivo alimentario de la presente invencion se le puede anadir otro microorganismo no patogeno. El microorganismo adicional disponible se puede seleccionar entre el grupo que consiste en Bacillus subtilis que puede producir proteasa, lipasa e invertasa, cepa de Lactobacillus sp. que puede ejercer actividad fisiologica y una funcion de descomposicion en condiciones anaerobias, tales como en el estomago de ganado, hongos filamentosos que incluyen Aspergillus oryzae (J Animal Sci 43: 910-926, 1976) que aumenta el peso de los animales domesticos, aumenta la produccion de leche y ayuda a la digestion y capacidad de absorcion de alimentos, y levadura que incluye Saccharomyce scerevisiae (J Anim Sci 56: 735-739, 1983).

El alimento para animales que comprende OCJ7 de acuerdo con la presente invencion puede incluir alimentos basados en plantas, tales como granos, nueces, productos secundarios alimenticios, algas, fibra, productos secundarios farmacologicos, aceite, almidones, harina, productos secundarios de grano, y alimentos de origen animal tales como protemas, minerales, grasa, protemas de celulas individuales, zooplancton, y desechos de alimentos, pero no se limita a los mismos.

El aditivo alimentario que comprende OCJ7 de acuerdo con la presente invencion puede incluir aditivos para prevenir el deterioro de la calidad, tales como aglutinantes, emulgentes y conservantes, y aditivos para aumentar la utilidad, tales como aminoacidos, vitaminas, enzimas, probioticos, aromatizantes, nitrogeno no proteico, silicatos, agentes de tamponamiento, agentes colorantes, extractos, y oligosacaridos, pero no se limita a los mismos.

Cuando se proporciona con agua potable que contiene el bacteriofago de la presente invencion, la poblacion de bacterias de Salmonella en el intestino del ganado se puede reducir continuamente en el mismo ganado. Como resultado, se puede producir ganado sin Salmonella.

De acuerdo con otro un aspecto adicional de la misma, la presente invencion se refiere a un agente de limpieza o un desinfectante, que comprende el bacteriofago como un principio activo.

El agente desinfectante que comprende el bacteriofago como un principio activo es muy util para higiene de alimentos frente a, por ejemplo, intoxicacion alimentaria. Con detalle, el agente desinfectante se puede usar, no solamente como un agente o un aditivo alimentario para prevenir la contaminacion con Salmonella, sino tambien en la produccion de ganado sin Salmonella. Para eliminar la Salmonella, el agente desinfectante tambien se puede pulverizar sobre aguas residuales domesticas y se puede aplicar a granjas avmolas, mataderos, lugares en los que murio el ganado, espacios de cocina e instalaciones de cocina, y cualquier zona en la que actuen las aves.

Ademas, el agente de limpieza que comprende el bacteriofago como un principio activo se puede usar en una zona corporal de animales vivos, tales como piel, Lomas y similares, ya esta contaminada o potencialmente contaminada con bacterias de Salmonella.

Ademas, en el presente documento se describe un procedimiento para la prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas mediadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum, que comprende la administracion de un bacteriofago, a un animal con necesidad del mismo, que tiene una actividad bactericida espedfica frente a Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum.

Ademas, en el presente documento se describe un procedimiento para la prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas mediadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum, que comprende la administracion de una composicion, a un animal con necesidad de la misma, para la prevencion o tratamiento de enfermedades mediadas por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum, o Salmonella Pullorum.

La composicion de la presente invencion se puede administrar en forma de una formulacion farmaceutica en animales o se puede ingerir en forma de una mezcla con alimentos o agua potable para animales y preferentemente en forma de una mezcla con alimentos para animales. En la presente invencion, los animales incluyen ganado, cerdos, pollo, aves de corral y seres humanos, pero no se limitan a los mismos.

Siempre y cuando alcance los tejidos diana, se puede tomar cualquier via, ya sea oral o parenteral, para la administracion de la composicion de la presente invencion. Con detalle, la composicion de la presente invencion se puede administrar a traves de las vfas oral, rectal, topica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial,

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transdermica, intranasal, e inhalacion.

El procedimiento para el tratamiento de enfermedades comprende la administracion de la composicion de la presente invencion en una cantidad terapeuticamente eficaz. Para los expertos en la materia es evidente que la dosis diaria total la debena determinar un medico veterinario que tratan a los pacientes dentro del alcance del criterio medico sensato. La cantidad terapeuticamente eficaz para un paciente dado puede variar dependiendo de diversos factores bien conocidos en la tecnica medica, que incluyen el tipo y grado de la respuesta a conseguir, la edad, peso corporal, estado de salud, sexo y dieta del paciente, tiempo y via de administracion, la tasa de secrecion de la composicion, el penodo de tiempo de la terapia, composiciones en concreto de acuerdo a si se usan otros agentes con las mismas o no, etc.

Una mejor comprension de la presente invencion se puede obtener a traves de los siguientes ejemplos que establecen para ilustracion, pero que no se deben interpretar como limitantes de la presente invencion.

Modo para la Invencion

EJEMPLO 1: Aislamiento de Bacteriofago de Salmonella

1-1. Identificacion sistematica de bacteriofago y aislamiento de bacteriofago individual

De un matadero de pollos y una planta de eliminacion de aguas residuales cercana se transfirieron 50 ml de cada muestra a un tubo de centnfuga, y se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 min, seguido de filtracion del sobrenadante a traves de un filtro de 0,45 pm. Se mezclaron 18 ml del filtrado de muestra con 150 pl de un medio de cultivo en agitacion de Salmonella Enteritidis (denominada "SE" en lo sucesivo en el presente documento) (DO600 = 2) y 2 ml de 10x de medio de Luria-Bertani (denominado "medio de LB" en lo sucesivo en el presente documento), 10 g de triptona; 5 g de extracto de levadura; 10 g de NaCl; en un volumen final de 1 l). La mezcla se cultivo a 37 °C durante 18 horas y a continuacion se centrifugo a 4000 rpm durante 10 min tras lo cual el sobrenadante se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm. Por separado, una mezcla de 3 ml de agar al 0,7 % (p/v) y 150 pl de del medio de cultivo en agitacion de SE (DO600 = 2) se vertio a traves de una placa de LB y se permitio que solidificara. Sobre esta placa se extendieron 10 pl del filtrado de cultivo, seguido de incubacion durante 18 horas a 37 °C (como "agar de cobertura" se uso agar al 0,7 % y la valoracion del lisado de fago se realizo en la cobertura de agar, denominada tecnica de superposicion de agar blando).

Una dilucion del medio de cultivo de muestra que contema el lisados de fago se mezclo con 150 pl de un medio de cultivo en agitacion de SE (DO600 = 2) y se sometio a ensayo de superposicion de agar blando para producir placas individuales. Dado que una placa individual consistfa en el mismo bacteriofago, se tomo una placa y se disolvio en 400 pl de una solucion de SM (NaCl, 5,8 g; 0,2 g de MgSO47H2; Tris-Cl 1 M (pH 7,5), 50 ml; H2O, en un volumen final de 1 l), y se dejo durante 4 horas a temperatura ambiente para aislar bacteriofagos individuales. Para amplificar el bacteriofago aislado, se tomaron 100 pl del sobrenadante de la solucion de bacteriofago individual, mezclados con 12 ml de agar al 0,7 % y 500 pl de un medio de cultivo en agitacion de SE, y se sometio a un ensayo de superposicion de agar blando en una placa de LB (150 mm de diametro). Se vertieron 15 ml de una solucion de SM en una placa en la que se habfa completado la lisis, tras lo cual la placa se agito cuidadosamente durante 4 horas a temperatura ambiente para eluir los bacteriofagos del agar de cobertura. La solucion de SM que contema los bacteriofago eluidos se recupero, y se anadio cloroformo en una cantidad que corresponde a un 1 % del volumen final, y se mezcla bien durante 10 min. Despues de centrifugacion a 4000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante resultante se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm, y se almaceno en el refrigerador hasta su uso.

1-2. Lotes de bacteriofago a gran escala

El bacteriofago seleccionados el cultivo a gran escala usando SE. La SE se cultivo con agitacion. Despues de centrifugar una alfcuota de 1,5 x1010 cfu (unidades formadoras de colonias) a 4000 rpm durante 10 min, el sedimento se volvio a suspender en 4 ml de una solucion de SM. En la suspension se inocularon 7,5 x 107 pfu (unidades formadoras de placas) del bacteriofago a una MOI (multiplicidad de infeccion) de 0,005), seguido de incubacion a 37 °C durante 20 min. Esta solucion se inoculo en 150 ml de un medio de LB en un matraz, y se cultivo a 37 °C durante 5 h. Se anadio cloroformo en una cantidad correspondiente a 1 % del volumen final antes de agitar la solucion de cultivo durante 20 min. Se anadieron DNasa I y RNasa A hasta una concentracion final de 1 pg/ml, cada una. La solucion se dejo a 37 °C durante 30 min. Se anadieron NaCl y PEG (polietilenglicol) hasta una concentracion final de 1 M y un 10 % (p/v), respectivamente y se dejo a 4 °C durante un periodo adicional de 3 h. La solucion se centrifugo a 4 °C y 12.000 rpm durante 20 min para descartar el sobrenadante. Una suspension del sedimento en 5 ml de una solucion de SM se dejo a temperatura ambiente durante 20 minutos y se mezcla bien con 4 ml de cloroformo. Despues de centrifugacion a 4 °C y 4000 rpm durante 20 min, el sobrenadante se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm y a continuacion se sometio a ultracentrifugacion usando un gradiente de densidad de glicerol para purificar OCJ7 (densidad: 40 %, glicerol al 5 % a 35.000 rpm y 4 °C durante 1 h). El OCJ7 purificado se volvio a suspender en 300 pl de una solucion de SM, seguido de valoracion. El OCJ7 se deposito en el Centro de Cultivos de Microorganismos Coreano (361-221, Honje 1, Seodaemun, Seul) el 14 de agosto de 2009 con el numero de referencia KCCM11030P.

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EJEMPLO 2: Examen sobre Infeccion de OCJ7 de Salmonella

Para analizar el bacteriofago seleccionado para actividad lttica en especies de Salmonella distintas de SE, se realizaron intentos de infeccion cruzada con otras especies de Salmonella. Como resultado, OCJ7 no infectaba a SC (Salmonella Choleraesuis), SD (Salmonella Derby), SA (Salmonella arizonae), ni SB (Salmonella bongori), pero infectaba a SE (Salmonella Enteritidis), ST (Salmonella Typhimurium), SG (Salmonella Gallinarum) y SP (Salmonella Pullorum) (vease el Ejemplo 11). Los resultados en resumen en la Tabla 1, que sigue a continuacion y se muestran en la FIG. 2.

Tabla 1

[Tabla 1] [Tabla] Infeccion de OCJ7 de Salmonella

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de placa Serotipo Nombre de la cepa Formacion de placa

SE

SGSC 2282 O SA ATCC 13314 X

ST

ATCC 14028 O SB ATCC 43975 X

SG

SGSC 2293 O SC ATCC 10708 X

SP

SGSC 2295 O SD ATCC 6960 X

* ATCC : El Centro de Biorrecursos Globales

* SGSC : Centro de Reserva Genetica de Salmonella

EJEMPLO 3: Morfologia del Bacteriofago OCJ7

El OCJ7 purificado se diluyo en una solucion de gelatina al 0,01 %, y a continuacion se fijo en una solucion de glutaraldehndo al 2,5 %. La muestra se deposito otra gota en una placa de mica revestida con carbono (aprox. 2,5 X 2,5 mm), se adapto durante 10 min, y se lavo con agua destilada esteril. Una pelmula de carbono se monto en una rejilla de cobre, se tino con acetato de uranilo al 4 % durante 30-60 segundos, y se seco. El examen con un microscopio electronico de transmision JEM-1011 (a 80 kV, aumento de X 120.000 ~ X 200.000), como se muestra en la FIG. 1, observo que el purificado OCJ7 consistfa morfologicamente en una capside isometrica y una cola no contractil larga, lo que indica que pertenece a la familia Siphoviridae del morfotipo B 1.

EJEMPLO 4: Analisis de Patron de Protema de OCJ7

Se mezclaron 15 pl de una solucion purificada de OCJ7 a una titulacion de 1012 pfu/ml con 3 pl de una solucion de muestra de SDS 5x, y se calento durante 5 min. La protema total de OCJ7 se desarrollo en un gel Bis-Tris NuPAGE al 4 ~ 12 % (Invitrogen). A continuacion, el gel se tino con azul de Coomassie durante 1 h a temperatura ambiente. Las bandas principales se detectaron a aproximadamente 38 kDa, 63 kDa, 52 kDa y 12 kDa, como se muestra en la FIG. 3.

EJEMPLO 5: Tamano Total del ADN Genomico de OCJ7

El ADN genomico de OCJ7 se aislo usando ultracentrifugacion. En este sentido, a un cultivo de OCJ7 purificado se anadieron EDTA (acido etilendiamintetraacetico (pH 8,0)), proteinasa K, y SDS (dodecil sulfato sodico) a una concentracion final de 20 mM, 50 ug/ml, y un 0,5 % (p/v), respectivamente, seguido de incubacion a 50 °C durante 1 h. Un volumen igual de fenol (pH 8,0) se anadio y se mezclo bien. Despues de centrifugacion a 12.000 rpm y temperatura ambiente durante 10 min, el sobrenadante se mezclo bien con un volumen igual de PCI (fenol:cloroformo:alcohol isoairnlico = 25:24:1). Otra centrifugacion a 12.000 rpm y temperatura ambiente durante 10 min produjo un sobrenadante que se mezclo a continuacion con un volumen a 1/10 de acetato sodico 3 M y dos volumenes de etanol frio al 95 %, y se dejo a -20 °C durante 1 h. Despues de centrifugacion a 0 °C y 12.000 rpm durante 10 min, el sobrenadante se retiro completamente, y el sedimento de ADN se disolvio en 50 pl de TE (Tris- EDTA (pH 8,0)). El ADN extrafdo se diluyo 10 veces y la absorbancia se midio a DO260 para determinar su concentracion. Se cargo 1 pg del ADN genomico total sobre gel de agarosa PFGE al 1 % (electroforesis en gel de campo pulsado) y se sometio a electroforesis a temperatura ambiente durante 20 horas con la ayuda de un programa 7 de sistema de PFGE de BIO RAD (intervalo de tamano de 25-100 kpb; amp del dispositivo de temporizacion 0,4-2,0 segundos, forma lineal; tension directa 180 V; tension inversa 120 V). Como se muestra en la FIG. 4, el ADN genomico de OCJ7 tema una longitud de aproximadamente 39,2 44,1 kb.

EJEMPLO 6: Analisis Genetico de 0CJ7

El analisis genetico del OCJ7 purificado comenzo con doble digestion de 5 pg del ADN genomico de OCJ7 con las enzimas de restriccion StuI y NrnI, AfeI y HinCII, y SnaBI y PvuII. El vector pCL1920 (Promega) se digirio con Sma I, y se trato con CIP (fosfatasa alcalina de intestino de ternero). Tambien se uso un vector romo en forma de T (Sogent). El ADN genomico digerido se mezclo a una proporcion de 3:1 con el vector, y se ligo a 16 °C durante 2 h.

El vector recombinante resultante se transformo en DH5a de E.coli que a continuacion se sembro en una placa de LB que contema especinomicina o kanamicina y X-gal (5-bromo-4-doro-3-indolil-beta-D-galactopiranosido) a la seleccion de color azul/ blanco. Las colonias seleccionadas se cultivaron durante 16 horas en un medio de cultivo que contema el antibiotico con agitacion. A continuacion, los plasmidos se extrajeron usando un kit de purificacion de 5 plasmido (Promega).

La clonacion de los plasmidos se confirmo por PCR usando conjuntos de cebador de FRT135 y FRT136 (SEC ID N°s: 13 y 14) y M13 directo y M13 inverso (SEC ID N°s: 15 y 16), y solamente se realizo seleccion de fragmentos de inserto con un tamano de 1 kb o superior. Sus secuencias de bases se analizaron usando los conjuntos de cebador. Las secuencias de bases obtenidas de este modo se proporcionaban en las SEC ID N°s: 1 a 4, respectivamente, 10 cada una teniendo una longitud de 500 bp ~ 3 kpb, y se analizaron para similitud de secuencias con la ayuda de un programa blastx de NCBI, y los resultados se resumen en la Tabla 2, a continuacion.

Tabla 2

___________________________________________[Tabla 21

[Tabla]

Similitud de Secuencias entre OCJ7 y Otros bacteriofagos

N°

Organismo Protema Blastx

Busqueda Sujeto Identidad valor de e

1

Fago KS7 de Salmonella protema hipotetica 118-567 17-166 146/150 (97 %) 6e-84

Fago SETP3 de Salmonella protema de tipo enolasa 567-103 1 1-155 145/155 (93 %) 5e-76

Bacteriofago MB78 protema hipotetica 659-297 1-120 113/121 (93 %) 2e-60

2

Fago SETP3 de Salmonella protema hipotetica 618-472 75-123 40/49 (81 %) 8e-31

Fago T1 de Enterobacteria supuesta endonucleasa 108-479 00 CO CD CM ^ 123/124 (99 %) 5e-60

Fago Era 103 de Erwinia protema hipotetica 498-119 1-119 69/119 (57 %) 1e-31

3

Escherichia coli hipoxantina fosforribosiltransferasa 489-268 109-18 2 73/74 (98 %) 1e-33

Shigella flexneri hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa 285-506 126-19 9 73/74 (98 %) 1e-65

4

Fago de Salmonella KS7 protema hipotetica 103-113 1 3-346 349/371 (94 %) 0e-00

1128-25 212-58 1 161/166 (96 %) 3e-93

EJEMPLO 7: Diseno de Secuencias de Cebador Especficas de OCJ7

15 Para identificar a OCJ7, se disenaron cebadores espedficos de OCJ7 basandose en las SEC ID N°s: 1 a 4. La PCR

se realizo usando cada conjunto de cebador de las SEC ID N°s: 5 y 6, SEC ID N°s: 7 y 8, SEC ID N°s: 9 y 10, y SEC ID N°s: 11 y 12. Se anadieron 0,1 |jg del ADN genomico de bacteriofago y 0,5 pmol de cada cebador a una mezcla previa (Bioneer), y el volumen final se ajusto a 20 jl. La PCR se realizo con 30 ciclos de desnaturalizacion; 94 °C 30 segundos, hibridacion; 60 °C 30 segundos, y polimerizacion; 72 °C, 1,5 min. Los productos de PCR obtenidos de 20 este modo teman una longitud de aproximadamente 500 bp ~ 3 kpb, con los conjuntos de cebador de las SEC ID

N°s: 5 y 6, SEC ID N°s: 7 y 8, SEC ID N°s: 9 y 10, y SEC ID N°s: 11 y 12. Los resultados se muestran en la FIG. 5.

EJEMPLO 8: Estabilidad del pH del Bacteriofago

Para determinar si OCJ7 sobrevive al entorno de pH bajo el estomago de pollo, el OCJ7 se sometio a ensayo a la

5

10

15

20

25

30

35

40

45

estabilidad en un intervalo de pH amplio (pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,2, 9,0, 9,8, y 11,0). Se prepararon varias soluciones de (tampon de acetato sodico (pH 4,0, pH 5,5, y pH 6,4), tampon de citrato sodico (pH 2,5, pH 3,0, y pH 3,5), tampon de fosfato sodico (pH 6,9 y pH 7,4) y Tris-HCl (pH 8,2, pH 9,0, pH 10,0 y pH 11,0)) para que tuvieran una concentracion de 0,2 M. Se mezclaron 180 jl de cada solucion de pH con 20 jl de una solucion de bacteriofago (1,0 X 1011 pfu/ml) para dar cada solucion de pH a una concentracion de 1 M, seguido de incubacion a temperatura ambiente durante 2 h. La solucion de reaccion se diluyo en serie, y se cultivaron 10 jl de cada dilucion a 37 °C durante 18 horas con un procedimiento de superposicion de agar blando para determinar las titulaciones de los lisados de fago. Los cambios de la titulacion con el pH se midieron para determinar la estabilidad del bacteriofago con respecto al pH en comparacion con las titulaciones de OCJ7 a 0 h. Los resultados mostraban que el bacteriofago no perdfa su actividad y permaneda estable a pH inferior a 3,0. Sin embargo, perdfa su actividad a pH 2,5 o inferior. Los resultados se muestran en la FIG. 6.

EJEMPLO 9: Estabilidad al Calor del Bacteriofago

Para uso como un aditivo alimentario, el bacteriofago se sometio ensayo para estabilidad al calor generado durante un procedimiento de formulacion. En este sentido, se incubaron 200 jl de una solucion de OCJ7 con una titulacion de 1,0 X 1011 pfu/ml a 37 °C, 45 °C, 53 °C, 60 °C, 70 °C, o 80 °C durante 0 min, 10 min, 30 min, 60 min y 120 min. La solucion se diluyo en serie, y 10 jl de cada dilucion se cultivaron a 37 °C durante 18 horas con un procedimiento de superposicion de agar blando para determinar las titulaciones de los lisados de fago. Los cambios en la titulacion con la temperatura y el tiempo de exposicion se midieron para determinar la estabilidad del bacteriofago al calor en comparacion con las titulaciones a 0 h y 37 °C. Los resultados mostraban que el bacteriofago no perdfa su actividad a 70 °C hasta 2 horas, perdfa su actividad en menor medida cuando se expoma a 80 °C durante 10 min, pero perdfa su actividad completamente cuando se expoma a 80 °C durante mas de 10 min. Los resultados se muestran en la FIG. 7.

EJEMPLO 10: Tolerancia a la Desecacion del Bacteriofago

Para uso como un aditivo alimentario, el bacteriofago se sometio a ensayo para tolerancia a la condicion seca establecida para un procedimiento de formulacion. Basandose en los resultados obtenidos a partir del ensayo de estabilidad al calor, se realizo un ensayo de desecacion usando una secadora por pulverizacion (Lab Plant).

Se anadieron dextrina y azucar, sirviendo ambas como agentes estabilizantes, en una cantidad de un 40 % y un 2 % (p/v), respectivamente, a 50 ml de una solucion de OCJ7 con una titulacion de 1,0 X 10" pfu/ml. La solucion resultante se pulverizo dentro de una secadora por pulverizacion en la que la entrada y la salida se mantuvieron a 120 °C y 70 °C, respectivamente. 0,3 g del polvo obtenido de este modo se volvieron a suspender en 2 ml de una solucion de SM y se midio para valores de titulacion. Despues de desecacion, la actividad del bacteriofago no disminuyo en absoluto, en comparacion con las titulaciones de secado previo. Los resultados se muestran en la FIG. 8.

EJEMPLO 11: Espectro de Cepas de Celulas Hospedadoras de Tipo Silvestre a las Que Infecta el Bacteriofago

Se evaluo la actividad lttica de OCJ7 frente a Salmonella Enteritidis (36 cepas), Salmonella Typhimurium (22 cepas), Salmonella Gallinarum (56 cepas), Salmonella Pullorum (19 cepas), Salmonella Choleraesuis (2 cepas), Salmonella Derby (4 cepas) y Salmonella Arizona (1 cepa), y Salmonella Bongori (1 cepa) de tipo silvestre de Corea, obtenidas en el Laboratorio de Enfermedades Aviares, Colegio de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de Seul, y Servicio Nacional Veterinario de Investigacion y Cuarentena y los Centros de Corea para Control y Prevencion de Enfermedades, ademas de las cepas usadas en la presente invencion, SE (SGSC SE2282), ST (ATCC ST14028), SG (SGSC SG2293), y SP (SGsC SP2295). Se mezclaron 150 ul de cada medio de cultivo en agitacion de cepa (DO600 = 2), y se cultivaron 10 jl de solucion de OCJ7 (1010 pfu/ml) a 37 °C durante 18 horas usando un procedimiento de superposicion de agar blando para controlar la formacion de placas. Se observo que el bacteriofago OCJ7 presentaba una actividad lttica de un 94 % frente a todas las cepas de SE, ST, SG y SP. Los resultados en resumen en la Tabla 3, a continuacion.

Tabla 3

_______________________________[Tabla 31_______________________________

Actividad Lftica de OCJ7 frente a Cepas SE, ST, SG, y SP de Tipo Silvestre de Corea

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de Placas de OCJ7 Serotipo Nombre de la cepa Formacion de Placas de OCJ7

SNU SG1 O SNU ST1 O

SNU SG2

O SNU ST2 O

SNU SG3

O SNU ST3 O

Actividad Lttica de OCJ7 frente a Cepas SE, ST, SG, y SP de Tipo Silvestre de Corea

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de Placas de OCJ7 Serotipo Nombre de la cepa Formacion de Placas de OCJ7

SNU SG4 O SNU ST4 O

SNU SG5 O SNU ST7 O

SNU SG6 O SNU ST8 O

SNU SG7 O SNU ST11 O

SNU SG8 O SNU ST12 O

SNU SG9 O SNU ST13 X

SG

SNU SG10 O ST SNU ST14 O

SNU SG11

O SNU ST17 O

SNU SG12 O SNU ST18 O

SNU SG13 O SNU ST19 X

SNU SG14 O SNU ST20 O

SNU SG15 O SNU ST25 O

SNU SG16 O SNU ST26 O

SNU SG17 O SNU ST37 O

SNU SG18 O SNU ST38 O

SNU SG19 O SNU ST41 O

SNU SG20 O SNU ST42 O

SNU SG21 O ATCC UK1 O

SNU SG22 O ATCC 14028S O

SNU SG23 O SGSC STM1412 O

SNU SG24 O SGSC STM260 O

SNU SG25 O SGSC STM SA2197 O

SNU SG26 O SGSC SE2282 O

SNU SG27 O SGSC SE2377 O

SNU SG28 O PT4 S1400194 O

SNU SG30 O PT4 LA52 O

SNU SG31 O NVRQS SE004 O

SNU SG32 O NVRQS SE00S O

SNU SG33 O KCDC SE00 O

SNU SG34 O KCDC SE00 O

SNU SG36 O KCDC SE01 O

SNU SG37 O KCDC SE01 O

Actividad Lttica de OCJ7 frente a Cepas SE, ST, SG, y SP de Tipo Silvestre de Corea

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de Placas de OCJ7 Serotipo Nombre de la cepa Formacion de Placas de OCJ7

SNU SG38 O KCDC SE01 O

SNU SG39 O KCDC SE01 O

SNU SG40 O KCDC SE01 O

SNU SG41 KCDC SE01 O

SNU SG42 O KCDC SE01 O

SNU SG43 O KCDC SE01 O

SNU SG44 O SE KCDC SE01 O

SNU SG45 O KCDC SE01 O

SNU SG46 O KCDC SE02 O

SNU SG47 O KCDC SE02 O

SNU SG48 O KCDC SE02 O

SNU SG49 O KCDC SE02 O

SNU SG50 O KCDC SE02 O

SGSC SG9184 O KCDC SE02 O

SGSC SG2292 O KCDC SE02 O

SGSC SG2293 O KCDC SE02 O

SGSC SG2744 O KCDC SE02 O

SGS SG2796 O KCDC SE02 O

SNU SP1 O KCDC SE03 O

SNU SP4 O KCDC SE03 O

SNU SP5 O KCDC SE03 O

SNU SP8 O KCDC SE03 O

SNU SP11 O KCDC SE03 O

SGSC SP2294 O KCDC SE03 O

SGSC SP2295 O KCDC SE03 O

SGSC SP2737 O KCDC SE03 O

SGSC SP2739 O SC ATCC SC10708 X

SP

SGSC SP2742 O ATCC SC2929 X

SGSC SP2743 O ATCC SD6960 X

SGSC SP2745 O SD ATCC SD2466 O

SGSC SP2751 O ATCC SD2467 O

5

10

15

20

25

Actividad Lttica de OCJ7 frente a Cepas SE, ST, SG, y SP de Tipo Silvestre de Corea

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de Placas de 0CJ7 Serotipo Nombre de la cepa Formacion de Placas de 0CJ7

SGSC SP4663 O ATCC SD2468 X

SGSC SP4664

O SA ATCC SA13314 X

SGSC SP4665

O SB ATCC SB43975 X

SGSC SP4666

O

SGSC SP4667

O

SGSC SA1684

O

* SNU : Laboratorio de Enfermedades Aviares, Colegio de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional de Seul

* SGSC : Centro de reserva genetica de Salmonella

* NVRQS : Servicio Nacional Veterinario de Investigacion y Cuarentena

* KCDC : Centros Coreanos para Control y Prevencion de Enfermedades

EJEMPLO 12: Ensayo de Toxicidad de Bacteriofago

Para uso seguro en la prevencion de la salmonelosis, intoxicacion alimentaria por Salmonella, tifosis aviar y pullorosis, el bacteriofago se sometio a ensayo in vivo para toxicidad. El ensayo de toxicidad se realizo con dosificaciones orales individuales. En este ensayo, las ratas se administraron por via oral con una sola dosis de OCJ7 y se controlaron para toxicidad aguda para determinar concentraciones letales aproximadas de OCJ7. En este sentido, en primer lugar, cada una de 10 ratas macho y hembra (SD) sin patogeno espedfico (SPF) de 7 semanas de edad, se mantuvieron en ayunas durante 24 horas antes de la administracion de OCJ7. El dfa de la administracion, cinco machos y cinco hembras se administraron por via oral a una dosis de 10 ml/kg con OCJ7 con una titulacion de 1 X 1012 pfu/ml usando una sonda oral a la vez que cinco controles se administran por via oral con una mezcla de Tris-HCl 20 mM y MgCh 2 mM. Cuatro horas despues de la administracion oral, se proporcionaron alimentos a las ratas. El control se realizo cada hora durante 4 horas, partiendo de 30 min despues de la administracion del dfa de la administracion. A partir de ese momento, se controlaron una vez al dfa durante 14 dfas para smtomas generales. Ninguna de ellas murio. No se generaron y smtomas toxicos ni smtomas clmicos observables con OCJ7. Los resultados se resumen en las Tablas 4 y 5, que siguen a continuacion. Los pesos corporales se registraron antes de la administracion y a los 1 3, 7, 10 y 14 dfas despues de la administracion. No se observaron cambios significativos en el peso corporal, lo que indica que OCJ7 no causa una reaccion toxica suficiente para reducir el apetito ni para cambiar el peso corporal. Estos resultados se muestran en la FIG. 9. No se encontraron anomalfas observables en ningun organo examinado con la autopsia ni a simple vista. Por lo tanto, el nuevo bacteriofago OCJ7 no es toxico.

Tabla 4

_______________________________[Tabla 41______________________________

[Tabla]

Ensayo de Toxicidad Oral de OCJ7 en Terminos de Mortalidad y Smtomas Generales

Sexo

Pfu/kg Dado Mortalidad Final Signos Clmicos

Macho

Hembra Macho Hembra

Macho

Control 0/5 0/5 0/5 0/5

1013

0/5 0/5 0/5 0/5

Hembra

Control 0/5 0/5 0/5 0/5

1013

0/5 0/5 0/5 0/5

__________________________[Tabla 51__________________________

[Tabla]

Ensayo de Toxicidad Oral de OCJ7 en Terminos de AnomaUa en Organos

Sexo

Pfu/kg Dado Hallazgo global Frecuencia

N.A.Da

5/5

Macho

Control N.A.D 5/5

1013

N.A.D 5/5

Hembra

Control N.A.D 5/5

1013

N.A.D 5/5

a: no se detectan anomaKas.

EJEMPLO 13: Eficacia del Bacteriofago

Para evaluar la eficacia de OCJ7 para uso en la prevencion y tratamiento de enfermedades mediadas por Salmonella, el bacteriofago se evaluo para su capacidad para controlar Salmonella en una granja de los pollos en la 5 que 20.000 aves ponedoras se reprodujeron con una condicion estricta frente a infeccion por Salmonella.

Se proporciono agua potable que contema OCJ7 a una concentracion de 106 pfu/l durante un periodo de tiempo total de 25 dfas. En primer lugar, se proporciono durante 17 dfas. A continuacion, el agua potable sin OCJ7 se proporciono durante 10 dfas antes de volver a comenzar con el suministro de agua potable que contema OCJ7 durante 8 dfas. Antes y despues del suministro de OCJ7, el control de Salmonella se realizo para entornos de lechos 10 de paja y polvo y para muestras de desarrollo de polluelos, plumas y cascaras de huevo. Antes del suministro de OCJ7, la Salmonella se detecto en las plumas de las incubadoras y los polluelos, lo que indica que es diffcil controlar la Salmonella en una granja grande aunque las instalaciones para control de Salmonella se hagan funcionar en el mismo sitio. Por el contrario, despues del suministro de OCJ7, no se detecto ninguna bacteria de Salmonella en los entornos y en las muestras de desarrollo. Por lo tanto, el suministro de OCJ7 en forma de agua potable era eficaz 15 para la prevencion de descarga de Salmonella y el control de Salmonella. Los resultados se resumen en la Tabla 6, a continuacion.

Tabla 6

[Tabla 61

[Tabla] Efecto de Desinfeccion de OCJ7 en Salmonella

dfa Entorno Muestra de desarrollo

Antes del suministro

Lecho de paja Polvo Polluelo Pluma Cascara de huevo

-30

- - - + -

-21

+ + - + -

-16

- - + - -

-13

- - - + -

Suministro primario de OCJ7

0 - - - - -

2

- - - - -

4

- - - - -

6

- - - - -

8

- - - - -

10

- - - - -

12

- - - - -

5

10

15

20

25

30

[Tabla] Efecto de Desinfeccion de OCJ7 en Salmonella

dfa Entorno Muestra de desarrollo

14 - - - - -

16

- - - - -

Interrupcion del Suministro

-10 - - - - -

-7

- - - - -

-4

- - - - -

-1

- - - - -

Suministro secundario de OCJ7

0 - - - - -

2

- - - - -

4

- - - - -

6

- - - - -

8

- - - - -

9

- - - - -

EJEMPLO 14: Eficacia del Bacteriofago como un Agente de Desinfeccion

Para evaluar la eficacia del bacteriofago como un agente de limpieza frente a Salmonella. Para comparacion, se uso Harasol (Yuhan Corporation, hipoclorito sodico al 4,6 %, un agente de desinfeccion para granjas de aves de corral, bancos y agua potable) como un control en la condicion de agua ligera, materiales organicos, y leche.

Se prepararon OCJ7 con una titulacion de 109 pfu/ml, Harasol (hipoclorito sodico al 4,6 %), y cepa de SE s. Despues de su crecimiento a D.O. = 0,5, la SE se diluyo 5 veces en agua ligera para dar D.O. = 0,1. Se prepararon dos matraces de 250 ml, cada uno con 50 ml de agua ligera, una dilucion de material organico, o una dilucion de leche al 20 % en agua ligera. El bacteriofago se anadio en una cantidad de 107 pfu a un matraz a la vez que se anadfa al otro una dilucion del Harasol a 1/240. A cada matraz se le anadieron 2 ml del cultivo bacteriano con D.O. = 0,1, seguido de incubacion a 37 °C y 200 rpm con toma de muestras a las 0,5 h, 2,5 h, 6 h, y 10 h. Las muestras se diluyeron en serie se extendieron sobre las placas de LB. Despues de incubacion a 37 °C durante 18 horas, se hizo recuento de las celulas para determinar la actividad bactericida. Cuando se usaba agua ligera, la actividad antibacterianos del agente de desinfeccion convencional fluctuaba en gran medida de acuerdo con las condiciones. Por el contrario, el bacteriofago ejercfa actividad antibacteriana uniforme incluso en diversas condiciones. Los resultados se muestran en la FIG. 10.

EJEMPLO 15: Eficacia del Bacteriofago como un Agente de Limpieza

Para uso como un agente de limpieza para productos carnicos, el bacteriofago se sometio a ensayo para capacidad para controlar bacterias de Salmonella en comparacion con un agente de limpieza convencional (Hipoclorito sodico al 4~6 %). En este sentido, se adquirieron 50 g de cortes de pechuga de pollo en una tienda. Un cultivo con agitacion de SE (D.O. = 2) se ajusto a una concentracion de 108 cfu/ml y se extendio de forma uniforme en una cantidad de 200 |jl sobre los cortes de pechuga de pollo que a continuacion se secaron a temperatura ambiente durante 12 min. El bacteriofago OCJ7 cargado estaba contenido en los respectivos pulverizadores a una concentracion de 109 pfu/l, 1010 pfu/l, y 1011 pfu/l y 50 ppm y el cloro como agente de limpieza estaba contenido en un pulverizador a una concentracion de 50 ppm. Se pulverizaron a una tasa de una pulsacion/segundo durante 10 segundos. Los cortes de pechuga de pollo tratados se colocaron en sus respectivos envases higienicos a los que se anadieron a continuacion 30 ml de un tampon de SM. Los envases se agitaron con un patron semicircular. El WCR (aclarado de toda la carcasa) obtenido de este modo se diluyo en serie y las diluciones se extendieron sobre medios de LB, seguido de incubacion a 37 °C durante 18 horas para determinar el numero de SE. Inmediatamente despues del tratamiento con el mismo, se encontro que el agente de limpieza dejaba bacterias de Salmonella. Sin embargo, se identifico que el bacteriofago OCJ7 era muy eficaz. Ademas, con el lapso de tiempo, el bacteriofago mostraba una actividad de

limpieza coherente, en comparacion con el agente qmmico. Los resultados en resumen en la Tabla 7, a continuacion.

Tabla 7

__________________________[Tabla 71________________________

[Tabla]

Comparacion de Eficacia de Limpieza entre OCJ7 y Agente de Limpieza

Tiempo (min)

Sustancia Tasa de Reduccion de Salmonella (%)

0

Tampon de SM

PHI 105 * * * 9 pfu/l

3,70

PHI 101U pfu/l

1,27

PHI 1011 * * * 15 pfu/l

48,09

Cloro 50 ppm

(+14,50)

30

Tampon de SM

PHI 109 pfu/l

21,31

PHI 1010 pfu/l

22,45

PHI 1011 pfu/l

68,71

Cloro 50 ppm

9,52

200

Tampon de SM

PHI 109 pfu/l

36,00

PHI 1010 pfu/l

43,75

PHI 1011 pfu/l

49,63

Cloro 50 ppm

12,59

1440

Tampon de SM

PHI 109 pfu/l

24,39

PHI 1010 pfu/l

60,58

PHI 1011 pfu/l

73,33

Cloro 50 ppm

13,33

5

Aplicabilidad Industrial

Al tener una actividad bactericida espedfica frente a una o mas bacterias de Salmonella seleccionadas entre el

grupo que consiste en Salmonella Enteritidis (SE), Salmonella Typhimurium (ST), Salmonella Gallinarum (SG), y

Salmonella Pullorum (SP) sin afectar a las bacterias beneficiosas, ademas de presentar tolerancia a acido, calor y

10 desecacion excelentes, como se ha descrito hasta el momento, el nuevo bacteriofago de la presente invencion se

puede usar ampliamente como un principio activo para agentes terapeuticos, alimentos animales o agua potable,

agentes de limpieza y desinfectantes para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas causadas por Salmonella

Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum o Salmonella Pullorum que incluyen salmonelosis,

intoxicacion alimentaria por Salmonella, Tifosis Aviar, y Pullorosis.

15 <110> CJ Cheiljedang Corporation

<120> Nuevo bacteriofago y composicion antibacteriana que comprende al mismo

<130> OPA10064/PCT

<150> US61/239.748 <151>

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1 <211>1394 <212> ADN

<213> Bacteriofago KCCM11030P <400> 1

cctatagtat

cgaaaggcta ctcgatgacg cgaggtaaca acgtgtggcg agtagacctg 60

gccggtggcg

gggttcgcca ggggcgtgat acatactttg atatgttccc gattaacgtt 120

accctggtcg

tatcaccgtt ggggcggcaa gcattcctca gtttcatgga gaaggtagac 180

ggaggggctt

ccagtttctg gatgaaacac gacttgggtc agggtatcga ggattaccag 240

gttactctaa

catctacgtg gaacgagtcc accgacgacg ggaagaactg ggtaataact 300

ttcacggcca

cagccgagaa atcaccattc caggaagccg gcagcgcctg tcttaaccag 360

aatctgcccg

acttatatgg atgctacggc gattgtcttg gtgaatttct taaaacttac 420

ggagtgtacc

aaactacatt ccctcgaatc tgggacccaa tgcaatgagt caggaatcag 480

tagaagcggc

ataccggcgt aagctggcgt ccaatcccga tggcgagatg gattttatta 540

ccctggagat

atcccaccct cttctttcga agcgctggtt gcttgtgcgc ggggctaacg 600

acttgaccgc

tactctagag acgggtgagg ttgttacatt cgagggtacg ccgatggagg 660

ccaagaacgc

cgccaacaat aacgatatgg accagaccgc ctctttctct ttgccggatg 720

tgcttaatat

actggacgag gaaatggacc gcatccctta tgataataag gaattgccca 780

aattcatctt

ccggcgttac gtgagcacgg acctgtcata cccatgcgat gggccggtgg 840

tatatgaatt

gcaaacactc acacaagaga aaggagtgtt cacagcggaa acaggtacac 900

ccatgcttaa

ccaacgagct accggaatcc tgatgacgcc ggaggagatt cctttacttc 960

gagggatact

gacatcgtga atattaacga ttacactggc ctgccgtatg acttccgccg 1020

ccgtaattgt

tggcaccacg tccgcaacgt ccgggctgac gcggggttat caactccaat 1080

gttcgatgta

acaagcccaa cggcaataga tgcagctttc gatgacggcc attcagaccc 1140

taaaggtctt

aggcgagtgc ttactccgca gaattttgac gccgttctac tcggtgtgaa 1200

acatcgaggg

cggatagtgt ggcacgctgg ggtatattac gaagggatgg ttagccactg 1260

tgagctggcg

tccagacagg ttagactgga tagtctggaa gaccttaaag atacttattc 1320

ggagattgaa

ttttggcgct agtaattcac tacacacgaa acgaagacgg cacatttgac 1380

gttaaacgtt

atcg 1394

<210> 2 <211> 672 <212> ADN

<213> Bacteriofago KCCM11030P

5

<400>2 aaccgggagg cacgggcatt atgtacgggc aaagagacta tctagtaaag tacggggagg tcaacatact ggcgtcctat gccgggagtt aggtctaggg cacaccaacc gacaacatgg

tgtcgccgta ttatgcgtat gttctaactt tactaaagta agtgtaagtt cacatatgtc atcttctaat tgttgagcaa gcggttatta ttcaggtaga tgtcccgcat aagtatacct aaaatgtagg tgaaaggatg actggaaagt caaatcatgt tgtgtaaaaa cggctattgg tggtgtatga gatgttctca atgatacctg tgacgacaga tt

aagttcgggg attgtatgat gagcagtcta taataggtaa catacgggtc acctacacca caccagacat tagcggctaa agcgcaaatg tgattacata gttgaaatgc tgcgagacat gattggagtg aggtttttag cgccgtaacg atgtgaatgt tatgtcatgt tcggtaaccg ggtaagattc caaaaggatt attgaaaacc tgtcatgcaa

ttcagcacat

60

gtatcgggag

120

ccgggcggtt

180

agatgagtat

240

ccataaacgt

300

aaaccccaaa

360

ctacaaaaac

420

a9999&tgtg

480

taagtttaaa

540

tgtcatagac

600

atccagaagg

660

672

<210>3 <211> 581 <212> ADN

<213> Bacteriofago KCCM11030P <400> 3

gacggatggc

ttgctgcgtg atctggatgt gttctccacg tccggactgg ccttgccctg 60

gcgtaccgtc

acgggatttc caacctcaag ctgaaacacg ccaaccacaa ataaaaatgc 120

catgccggat

gcaacacatc cggcaacttc acacttactc gtccagcaga atcactttgc 180

cgatatacgg

cagatgacgg taacgctgtg cgtaatcaat gccgtaaccc accacaaact 240

catccgggat

cgagaaaccg ataaattcta ccgggacgtt cacttcacga cgggacggtt 300

tatccagcag

cgtacaaatc gccagcgact tcggttcgcg caggcttaag atctcacgca 360

ctttcgacag

tgtatccccg agtcgatgat atcttcaaca atcagcacgt ccttgccacg 420

gatatcttca

tccagatctt tgaggatttt cacatcatgg gtggtggaca tgccgctacc 480

gtagctggag

gcggtcataa agtcgacttc atgagatacc tgaacttcac ggcacaggtc 540

cgccataaac

ataaatgagc cacgcagcaa ggcatcggtc a 581

<210> 4 <211>1008 <212> ADN

<213> Bacteriofago KCCM11030P <400> 4

5

10

15

acaggcaatt

tagcatactc atggtcgcgt cgcaatcgcc gtgaggaacg cgctgacatt 60

aacgtttaca

ccacgacctc cggcacctgg gatgagtttg ttgaacttat gcaaccgctt 120

aaacgttcgc

gccggaaccc caagacagac cccggctaca ttaccgccgc ttgtaccgcc 180

acggtaagct

ctaccggtaa agaagccgcc gaaggtatgt tctatcgctg caatgcgtct 240

gttacgtctt

catccctggc ctatgccgac gtggacagcg cgacgccgga agagttcgca 300

accgactgtg

agatggtgcg cgagtcacgt tacgcaatga tgctctacac cacggcatcc 360

cacaccgaag

aagcgccgcg ctaccgcgtc gttatgcctg tacgcactcc ggtaaccggt 420

ggcgacatca

tccgcatccg gtacggcctg ttggcacact tccttaaagg tcgtgacgtg 480

gatagcgccg

ggttcaccct gtcgcagcct atgtaccgcc cgccggtagg aagccaggtc 540

atcgtgtctg

aaagtagccg catgattacg gcgagcaagc ttatggagga agttcctgaa 600

attaacgtta

ccggtgcttc tgattataaa gttccggagg gtgaacaatc cgaattaacc 660

gacctgtttg

aagagttcgc ttttgaattc ggcggacgta tgaccgaccg cggcctgcaa 720

atgcccgcca

cgccggagca cgccgcccaa tacactaccg gcgaacctaa gcaggacgac 780

ttcctgttct

gttggccgcg cgacggcttc gagcgaccca acgttaccct gtaccacgat 840

accgacctgg

tagctacggg cgggatgaag cctggcggac gggatatgtg ggcttacgct 900

tgtgcggcca

ccggcttacc ttttgaccgt gtggagtgcc gcttgggtgg gcggaggggg 960

tcacttgcga

cgaagaagac ctggacgacg agaccaccag caccacaa 1008

<210>5 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400>5

cctatagtat cgaaaggc 18

<210>6 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 6

cgataacgtt taacgtcaaa tg 22

<210>7 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

<400>7

aaccgggagg tgtcgccg 18

<210>8 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 8

aaccatgttg tcccttctgg 20

<210>9 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 9

gacggatggc ttgctgcg 18

<210> 10 <211> 18 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 10

tgaccgatgc cttgctgc 18

<210> 11 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 11

acaggcaatt tagcatactc 20

<210> 12 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 12

ttgtggtgct ggtggttctt cg 22

<210> 13 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 13

cgggcctctt cgctattacg 20

5

10

15

20

25

<210> 14 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 14

aggcttaccc gtcttactgt 20

<210> 15 <211> 17 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 15

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 16 <211> 16 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> cebador <400> 16

aacagctatg accatg 16

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un bacteriofago aislado que tiene una actividad bactericida espedfica frente a una o mas bacterias de Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum, que esta depositado con el numero de acceso KCCM11030P.

   5 2. Una composicion para prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por una o mas cepas de

   Salmonella seleccionadas entre el grupo que consiste en Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Salmonella Gallinarum y Salmonella Pullorum, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.
2. 3. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que las enfermedades infecciosas son salmonelosis e 10 intoxicacion alimentaria por Salmonella cuando las producen Salmonella enteritidis o Salmonella Typhimurium,

   Tifosis aviar cuando la produce Salmonella Gallinarum y pullorosis cuando la produce Salmonella Pullorum.
3. 4. Una composicion para su uso como un antibiotico, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.
4. 5. Un alimento o agua potable para animales, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio 15 activo.
5. 6. Un agente desinfectante o de limpieza, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.