ES2612916T3 - Nuevo bacteriófago activo contra Salmonella y composición antibacteriana que comprende el mismo - Google Patents

Abstract

Un bacteriófago aislado que tiene una actividad bactericida específica contra Salmonella choleraesuis, el cual se identifica por el número de registro KCCM11208P.

Description

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DESCRIPCION

Nuevo bacteriofago activo contra Salmonella y composicion antibacteriana que comprende el mismo Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un nuevo bacteriofago y a una composicion antibacteriana que comprende el mismo.

Antecedentes de la tecnica

Salmonella tiene un contenido de GC genomico promedio del 50 al 52 %, que es similar al de Escherichia coli y Shigella. El genero Salmonella es un microorganismo patogeno que causa infecciones en el ganado, asf como en los seres humanos. La division serologica contempla que Salmonella enterica, una especie de bacteria Salmonella, tiene una variedad de serovares incluyendo Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium (ST), Salmonella enteritidis (SE), Salmonella typhi, Salmonella choleraesuis (SC), Salmonella derby (SD). De ellos, choleraesuis y derby son patogenos adaptados al ganado porcino, gallinarum y pullorum son patogenos adaptados a las aves de corral, typhimurium y enteritis son patogenos para los seres humanos y los animales y typhi es un patogeno adaptado a los seres humanos, todos los cuales causan la enfermedad en sus respectivas especies, produciendo un dano enorme a los agricultores y consumidores (Informe Zoobises; Reino Unido 2003).

Recientemente, la aplicacion del sistema HACCP (analisis de riesgos y puntos cnticos de control) se ha convertido en un requisito obligatorio para todos los mataderos de Corea a partir del 1 de julio de 2003, debido al alto riesgo de contaminacion durante el curso de la fabricacion de productos de origen animal con Salmonella, que causa dano directo a los cerdos y a la higiene de la carne y la cual se encuentra en el tracto digestivo de los cerdos (Jae-gil Yeh. Characterization and Counterplan of Salmonellosis in Pigs. Monthly Magazine of Pig Husbandry. 2004).

La fiebre paratifoidea, la enfermedad infecciosa aguda o cronica del tracto digestivo de los cerdos estan causadas por la infeccion por Salmonella, se caracteriza por gastroenteritis y septicemia y principalmente se produce durante el penodo de engorde. En particular, algunas de las bacterias patogenas que causan esta enfermedad pueden causar intoxicacion alimentaria en los seres humanos debido a la ingestion de carne, y por lo tanto, es una enfermedad que tiene gran importancia para la salud publica. Una variedad de tipos de bacteria Salmonella pueden ser patogenos. Entre ellas, Salmonella choleraesuis y Salmonella typhisuis conocidas por causar colera del cerdo son las principales causas de septicemia aguda por Salmonella. La enteritis aguda se produce durante el penodo de engorde, y se acompana de apetito irregular, diarrea acuosa grave, fiebre alta, perdida de vitalidad, neumorna y signos nerviosos. La decoloracion de la piel puede ocurrir en algunos casos graves. Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis y Salmonella derby son las principales causas de enteritis cronica.

La salmonelosis se contrae por via oral a traves de los alimentos o agua contaminados con Salmonella y por lo tanto se deben evitar estas rutas. Los piensos, las materias primas o el agua contaminada o los cerdos adultos portadores de agentes patogenos pueden ser fuentes importantes de infeccion. Durante el penodo agudo de la infeccion, los cerdos expulsan hasta 106 Salmonella choleraesuis o 107 Salmonella typhimurium por gramo de heces. Sin embargo, en muchas infecciones experimentales se ha descrito la reproduccion de la enfermedad con exito con una dosis de 108 a 1011 de Salmonella. En un experimento de inyeccion de 103 Salmonella en cerdos, los cerdos inyectados no mostraron smtomas de la enfermedad, pero otros cerdos criados en el mismo corral mostraron smtomas clmicos tfpicos. Estos resultados indican que una gran cantidad de Salmonella crece en cerdos infectados de forma natural, dando como resultado la infeccion de otros cerdos (Jung-Bok Lee. Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and Proliferative Enteropathy. Korea Swine Association. 2009).

En la actualidad, las infecciones virales graves tales como el smdrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) y la infeccion por circovirus porcino (PCV2) han estado causando enormes perdidas economicas a la industria porcina en Corea y, por lo tanto, el control de la enfermedad se ha centrado en estas enfermedades. Dado que estas enfermedades bacterianas pueden causar mucho dano, comparable al causado por enfermedades virales, debena realizarse con antelacion la prohibicion del uso de antibioticos en el pienso y la investigacion de la aparicion de la enfermedad o el control de la misma (Jung-Bok Lee. Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and Proliferative Enteropathy, Infectious Disease Laboratory, College of Veterinary Medicine, Konkuk University, Livestock Product Safety, 2010) (Robert W. Wills, Veterinary Microbiology, 1999). Por otro lado, los bacteriofagos, tambien llamados fagos, son un tipo especializado de virus que infecta solo a bacterias particulares y controla el crecimiento de las bacterias y puede auto-replicarse solo dentro de la bacteria hospedadora. Despues del descubrimiento de los bacteriofagos, se pusieron inicialmente grandes esperanzas en su uso para la terapia de enfermedades infecciosas. Sin embargo, cuando se generalizo el uso de los antibioticos de amplio espectro, los bacteriofagos fueron vistos como innecesarios debido a un espectro objetivo espedfico. Los antibioticos o agentes antimicrobianos se han usado ampliamente para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por una infeccion bacteriana. Sin embargo, el mal uso y abuso de los antibioticos tuvo como resultado un aumento de la preocupacion por la resistencia a los antibioticos y los efectos perjudiciales de los antibioticos residuales en los alimentos. Sin embargo, la eliminacion de los actuales antibioticos en los piensos podna aumentar la aparicion de enfermedades bacterianas incluyendo la salmonelosis que estaba controlada por los antibioticos, como se espera de

los datos experimental de otros pa^ses. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de establecer una gma practica detallada para la gestion de la Salmonella (Jung-Bok Lee. Control of the Recent Outbreaks of Porcine Salmonella and Proliferative Enteropathy, Infectious Disease Laboratory, College of Veterinary Medicine, Konkuk University, Livestock Product Safety. 2010).

5 Esta creciente preocupacion ha llevado a un resurgimiento del interes en los bacteriofagos. Siete bacteriofagos para el control de E. coli O157:H7 se desvelan en la Patente US-6.485.902 (2002) y dos bacteriofagos para el control de varios microorganismos se desvelan en la Patente US-6.942.858 (otorgada a Nymox en 2005). Muchas compares han estado intentando activamente desarrollar diversos productos utilizando bacteriofagos. El sistema alimentario EBI (Europa) desarrollo un aditivo alimentario para la prevencion de la intoxicacion alimentaria causada por Listeria 10 monocytogenes, denominado Listerix-P100, que es el primer producto bacteriofago aprobado por la FDA de los

EE.UU. Un producto a base de fagos, LMP-102 tambien fue desarrollado como un aditivo alimentario contra Listeria monocytogenes, aprobado como GRAS (generalmente considerado como seguro). En 2007, un lavado a base de fagos producido por OmniLytics fue desarrollado para prevenir la contaminacion por E. coli 0157 de la carne durante la matanza, aprobado por el Servicio de Inspeccion y Seguridad de los Alimentos (FSIS) de la FDA de los EE.UU. En 15 Europa, el fago de Clostridium sporogenes NCIMB 30008 y el fago de Clostridium tyrobutiricum NCIMB 30008 se registraron como conservantes de piensos contra la contaminacion por Clostridium de los alimentos en 2003 y 2005, respectivamente. Tales estudios muestran que actualmente se estan llevando a cabo investigaciones de bacteriofagos para el control de las bacterias no susceptibles a antibioticos y la contaminacion de los productos animales por patogenos zoonoticos.

20 Sin embargo, la mayor parte de los estudios de control biologico con fagos se han centrado en el control de E. coli, Listeria y Clostridium. Salmonella tambien es un patogeno zoonotico y los danos debidos a este patogeno no se reducen. Como se ha mencionado anteriormente, puesto que Salmonella presenta resistencia a multiples farmacos, se ha llevado a cabo en Corea la vigilancia de la resistencia antimicrobiana a nivel nacional bajo el decreto de aplicacion de la Ley de prevencion de enfermedades contagiosas (Orden Ejecutiva 16961), Orden de aplicacion de 25 la Ley de prevencion de enfermedades contagiosas (Orden del Ministerio de Salud y Bienestar Social 179) y la Organizacion del Instituto Nacional de Salud (orden Ejecutiva 17164). En consecuencia, hay una necesidad de desarrollo de bacteriofagos para controlar la Salmonella.

Divulgacion de la invencion

Problema tecnico

30 Con el fin de superar los problemas que se producen por el mal uso o el uso excesivo de antibioticos de amplio espectro, como las bacterias resistentes a los medicamentos y los residuos de medicamentos en los alimentos, los presentes inventores aislaron un bacteriofago de fuentes naturales, bacteriofago que tiene una actividad bactericida espedfica contra la Salmonella que causa enfermedades graves en el ganado. En consecuencia, encontraron que el bacteriofago tiene una actividad bactericida espedfica contra Salmonella choleraesuis (SC), Salmonella typhimurium 35 (ST), Salmonella derby (SD), Salmonella infantis (SI) y Salmonella newport (SN) sin afectar a las bacterias

beneficiosas, ademas de mostrar una excelente resistencia al acido y al calor, como se identifica por las propiedades morfologicas, bioqmmicas y geneticas de las mismas. Ademas, encontraron que el bacteriofago se puede aplicar a composiciones para la prevencion o el tratamiento de enfermedades mediadas por Salmonella typhimurium, como la salmonelosis del ganado y la intoxicacion alimentaria por Salmonella y a diversos productos para la prevencion y 40 control efectivo de la proliferacion de bacterias Salmonella, incluyendo aditivos alimentarios para el ganado, agua potable para el ganado, desinfectantes del granero y productos de limpieza para productos carnicos, completando asf la presente invencion.

Solucion al problema

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un nuevo bacteriofago que tiene una actividad bactericida contra 45 Salmonella choleraesuis.

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar una composicion para la prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o Salmonella newport, que comprende el bacteriofago como un principio activo.

Otro objeto mas de la presente invencion es proporcionar un antibiotico, que comprende el bacteriofago como un 50 principio activo.

Otro objeto mas de la presente invencion es proporcionar un pienso para animales o agua potable, que comprende el bacteriofago como un principio activo.

Otro objeto mas de la presente invencion es proporcionar un desinfectante o limpiador, que comprende el bacteriofago como un principio activo.

55 Otro objeto mas de la presente invencion es proporcionar un procedimiento para prevenir o tratar las enfermedades infecciosas causadas por Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o

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Salmonella newport, utilizando el bacteriofago o la composicion.

Efectos ventajosos de la invencion

El nuevo bacteriofago de la presente invencion tiene una actividad bactericida espedfica contra Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o Salmonella newport sin afectar a las bacterias beneficiosas y una excelente resistencia al acido y al calor y tolerancia a la desecacion. Por lo tanto, el nuevo bacteriofago se puede utilizar para la prevencion o tratamiento de la salmonelosis o la intoxicacion alimentaria por Salmonella, la cual es una enfermedad infecciosa causada por Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o Salmonella newport y que tambien puede ser ampliamente utilizado en los piensos animales, el agua potable para el ganado, desinfectantes y limpiadores.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 es una fotograffa de microscopfa electronica de OCJ11, que pertenece a la familia Siphoviridae de morfotipo B 1, caracterizado por una capside isometrica y una cola larga no contractil;

La FIG. 2 es una fotograffa que muestra la formacion de placas de OCJ11 en un cesped de bacterias Salmonella, en el cual (A,B;SC, C;SG, D;ST, E;SI, F,G;SD, H;SN), se observo la formacion de placas en los cespedes de SC, ST, SI, SD y SN, pero no en el cesped de SG;

La FIG. 3 es el resultado de la SDS-PAGE del bacteriofago OCJ11aislado, en el cual se detectaron las principales protemas en 33 kDa, 55 kDa y 69,5 kDa, usando como marcador el patron de protemas Precision plus (BIO-RAD);

La FIG. 4 es el resultado de la PFGE del bacteriofago OCJ11 aislado, en el que un tamano total del genoma de OCJ11 era de aproximadamente 140 kpb, utilizandose como marcador del tamano de ADN, CHEF DNA Size Standard Lambda Ladder (Bio-Rad);

La FIG. 5 es el resultado de la PCR, realizada usando cada conjunto de cebadores para el ADN genomico de OCJ11, en el que A; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 5 y 6, B; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 7 y 8, C; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 9 y 10 y D; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 11 y 12, donde todos los carriles A, B, C y D teman productos de PCR de aproximadamente 1 kpb o mas de 2 kpb o menos;

La FIG. 6 es el resultado del ensayo de resistencia a los acidos en el bacteriofago OCJ11, que muestra el numero de bacteriofagos supervivientes a un pH de 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,0, 9,0, 9,8 y 11,0, en el cual el bacteriofago OCJ11 no perdio su actividad hasta pH 5,5, aunque el bacteriofago OCJ11 mostro actividad reducida a pH 4 y pH 3,5 y perdio por completo su actividad a pH 3,0 o inferior, en comparacion con un control;

La FIG. 7 es el resultado del ensayo de resistencia al calor en el bacteriofago OCJ11, que muestra el numero bacteriofagos supervivientes a 37, 45, 53, 60 y 70 °C durante 0, 10, 30, 60 y 120 minutos, en el cual el bacteriofago OCJ11 mantuvo su actividad, incluso expuesto a 60 °C durante un maximo de 2 horas;

La FIG. 8 es el resultado del ensayo de tolerancia a la desecacion en el bacteriofago OCJ11 secado con la ayuda de un concentrador SpeedVac, en el cual cuando se median los cambios de fftulo en condiciones secas en comparacion con los tffulos pre-secado, la actividad se mantuvo a 60 °C durante hasta 1 hora; y La FIG. 9 es el resultado de los cambios en el peso corporal debido a la toxicidad despues de la administracion oral unica de ratas Sprague-Dawley con OCJ11, en el cual la observacion de los cambios de peso corporal antes y 1, 3, 7, 10 y 14 dfas despues de la administracion con OCJ11 no mostro cambios significativos en comparacion con el grupo control (■; machos control, □; machos OCJ11, •; hembras control, o; hembras OCJ11).

Mejor modo de llevar a cabo la invencion

En un aspecto de conseguir los objetos anteriores, la presente invencion proporciona un nuevo bacteriofago que tiene una actividad bactericida espedfica contra Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o Salmonella Newport.

Los presentes inventores recogieron muestras fecales y de aguas residuales de pocilga y se aislaron de las mismas bacteriofagos que pueden lisar la celula hospedadora SC. Tambien se encontro que estos bacteriofagos pueden lisar ST, SD, Si y SN (FIG. 2 y Tabla 1). Un examen morfologico al microscopio electronico confirmo que el bacteriofago (OCJ11) pertenece a la familia Siphoviridae de morfotipo B1 (FIG. 1). Ademas, se encontro que el bacteriofago OCJ11 tiene protemas estructurales principales de aproximadamente 69,5 kDa, 55 kDa y 33 kDa, segun se mide por un analisis de patrones de protemas (FIG. 3) y un analisis del genoma mostro que oCJ11 tiene un tamano total del genoma de aproximadamente 97-145,5 kpb (FlG. 4). Ademas, los resultados del analisis de sus caractensticas geneticas mostraron que el bacteriofago incluye moleculas de acido nucleico representadas por las SEC ID NOs. 1-4 dentro del genoma total (Ejemplo 6). Basandose en las SEQ ID NOs. 1 a 4, se comparo la similitud genetica con otras especies. Se encontro que el bacteriofago mostraba una similitud genetica muy pequena con los bacteriofagos conocidos, lo que indica que el bacteriofago es un bacteriofago nuevo (Tabla 2). Para un analisis mas detallado de las caractensticas geneticas, se utilizaron los conjuntos de cebadores espedficos de OCJ11, concretamente, la SEQ ID NO. 5 y 6, SEQ ID NOs. 7 y 8, SEQ ID NOs. 9 y 10 y SEQ ID NOs. 11 y 12 para llevar a cabo la PCR. Se determino que cada producto de pCr tema un tamano de 1,4 kpb, 1,2 kpb, 1,25 kpb y 1,5 kpb (FIG. 5).

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Por otra parte, cuando SC, ST, SD, SI y SN se infectaron con OCJ11, se observaron las placas de fagos (zona clara en el agar blando creada por la lisis celular en una celula hospedadora por un bacteriofago) (FIG. 2). La estabilidad de OCJ11 fue examinada en diversas condiciones de temperatura y pH, lo que tiene como resultado que OCJ11 se mantiene de forma estable en una amplia gama de entornos de pH desde pH 3,5 a pH 11,0 (FIG. 6) y en entornos de alta temperatura de 37 °C a 70 °C (FIG. 7), e incluso despues de la desecacion (FIG. 8). Ademas, tambien se encontro que las cepas SC, ST, SD, SI y SN de tipo silvestre entran dentro del rango de la celula hospedadora de OCJ11 (Tabla 3).

Por ultimo, los resultados de las pruebas de irritacion cutanea y ocular en OCJ11 en conejos New Zealand White libres de patogenos espedficos (SPF) mostraron que el mdice de irritacion primaria (PII) fue de 0,33, lo que indica que no es irritante y el mdice de irritacion ocular aguda (IAOI) fue 0 en grupos de lavado y no lavado durante todo el penodo experimental, lo que indica que no es irritante. Los resultados de la administracion oral de OCJ11 no mostraron cambios en el aumento de peso (FIG. 9). Ademas, no se observo mortalidad, smtomas generales (Tabla 4) ni anomalfa en los organos (Tabla 5), lo que indica que no hay toxicidad.

En consecuencia, los presentes inventores designaron el bacteriofago como “bacteriofago OCJ11”, en el que el bacteriofago fue aislado a partir de muestras fecales y aguas residuales de pocilga, el cual tiene una actividad bactericida espedfica contra SC, ST, SD, SI y SN y las caractensticas anteriores y depositado en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (361-221, Honje 1, Seodaemun, Seul) el 9 de septiembre, 2011, con el numero de registro KCCM11208P.

En otro aspecto para conseguir los objetos anteriores, la presente invencion proporciona una composicion para la prevencion o tratamiento de la enfermedad infecciosa causada por una o mas bacterias Salmonella seleccionadas del grupo que consiste en Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis y Salmonella newport, que comprende el bacteriofago como un principio activo.

Al tener actividad bactericida espedfica contra Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis y Salmonella newport, el bacteriofago de la presente invencion se puede utilizar con el proposito de prevenir o tratar las enfermedades causadas por estas bacterias. Preferentemente, los ejemplos de las enfermedades infecciosas incluyen la salmonelosis porcina y la intoxicacion alimentaria causada por Salmonella por Salmonella choleraesuis o Salmonella typhimurium y la enteritis porcina aguda o cronica causada por Salmonella derby, Salmonella infantis, Salmonella newport, pero sin limitarse a las mismas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “salmonelosis” se refiere a los smtomas despues de la infeccion por Salmonella, como fiebre, dolor de cabeza, diarrea y vomitos. Es decir, la salmonelosis es una infeccion con bacterias del genero Salmonella, que se define con dos formas clmicas: una forma septicemica aguda que se asemeja a la fiebre tifoidea y una gastroenteritis aguda, incluyendo la enteritis, intoxicacion alimentaria y septicemia aguda.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “prevencion” significa todas las acciones en las que esta restringido o retardado por la administracion de la composicion progreso de la enfermedad.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “tratamiento” significa todas las acciones en las que la afeccion ha tomado un giro hacia mejor o se ha restringido o modificado favorablemente por la administracion de la composicion.

La composicion de la presente invencion incluye OCJ11 en una cantidad de 1 x 102 a 1 x 1012 UFP/ml y preferentemente en una cantidad de 1 x 106 a 1 x 1010 UFP/ml.

Por otra parte, la composicion de la presente invencion puede incluir ademas un vedculo farmaceuticamente aceptable.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “vedculo farmaceuticamente aceptable” se refiere a un vedculo o diluyente que no causa irritacion significativa a un organismo y no anula la actividad biologica ni las propiedades del compuesto administrado. Para la formulacion de la composicion en una preparacion lfquida, se puede usar un vedculo farmaceuticamente aceptable que sea esteril y biocompatible, tal como solucion salina, agua esteril, solucion de Ringer, solucion salina tamponada, solucion de infusion de albumina, solucion de dextrosa, solucion de maltodextrina, glicerol, etanol y mezclas de uno o mas de los mismos. Si es necesario, se pueden anadir otros aditivos convencionales tales como antioxidantes, tampones y agentes bacteriostaticos. Ademas, pueden anadirse adicionalmente a la composicion diluyentes, dispersantes, tensioactivos, aglutinantes y lubricantes para preparar formulaciones inyectables tales como soluciones acuosas, suspensiones, y emulsiones, o formulaciones orales tales como pastillas, capsulas, granulos o comprimidos.

Las composiciones profilacticas o terapeuticas de la presente invencion pueden aplicarse o pulverizarse a la zona afectada, o administrarse por via oral o parenteral. La administracion parenteral puede incluir la administracion intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutanea o topica.

La dosificacion adecuada para la aplicacion, pulverizacion o administracion de la composicion de la presente

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invencion dependera de una variedad de factores que incluyen procedimiento de formulacion, el modo de administracion, la edad, peso, sexo, afeccion y dieta del paciente o animal que esta siendo tratado, el tiempo de administracion, la v^a de administracion, la tasa de excrecion y la sensibilidad de reaccion. Un medico o veterinario que tiene experiencia ordinaria en la tecnica puede determinar facilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composicion requerida.

Ejemplos de las formas de dosificacion oral que incluyen la composicion de la presente invencion como un principio activo incluyen comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas o emulsivas, polvo o granulos, emulsiones, capsulas de gelatina dura o blanda, jarabes o elixires. Para la formulacion tal como comprimidos y capsulas, los siguientes son utiles: un aglutinante tal como lactosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidon, amilopectina, celulosa o gelatina; un excipiente tal como fosfato dicalcico; un disgregante tal como almidon de mafz o almidon de batata; y un lubricante tal como estearato de magnesio, estearato de calcio, estearilfumarato de sodio o cera de polietilenglicol. Para las capsulas, ademas de los compuestos anteriormente mencionados se puede utilizar un vehnculo lfquido tal como lfpido.

Las formas de dosificacion parenteral que incluyen la composicion de la presente invencion como principio activo se pueden formular en inyecciones por via subcutanea, intravenosa, o intramuscular, supositorios, o aerosoles inhalables a traves de las vfas respiratorias, tales como aerosoles. Las formas inyectables se pueden preparar disolviendo o suspendiendo la composicion de la presente invencion, junto con un estabilizante o un tampon, en agua y cargando la solucion o suspension en ampollas o formas unitarias de viales. Para las pulverizaciones, tales como aerosoles, se puede usar un propelente para la pulverizacion de un concentrado dispersado en agua o humectante en polvo en combinacion con un aditivo.

En otro aspecto mas de lograr los objetos anteriores, la presente invencion proporciona un antibiotico que comprende el bacteriofago como un principio activo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino “antibiotico” significa cualquier farmaco que se aplica a los animales para destruir los agentes patogenos y se utiliza en el presente documento como un termino general para antisepticos, agentes bactericidas y agentes antibacterianos. Los animales son mairnferos, incluyendo humanos. El bacteriofago de la presente invencion, a diferencia de los antibioticos convencionales, tiene una alta especificidad por Salmonella con el fin de destruir a los patogenos espedficos sin afectar a las bacterias beneficiosas y no induce la resistencia a los medicamentos de modo que pueda proporcionarse como un nuevo antibiotico con un ciclo de vida relativamente largo.

En otro aspecto mas de lograr los objetos anteriores, la presente invencion proporciona un pienso para animales o agua potable que comprende el bacteriofago como un principio activo.

Los antibioticos incluidos en los alimentos utilizados en las industrias ganaderas y pesqueras estan destinados a prevenir infecciones. Sin embargo, la mayona de los antibioticos incluidos en los alimentos disponibles actualmente son problematicos, ya que son propensos a inducir la aparicion de cepas resistentes y pueden ser transferidos a los seres humanos, debido a que permanecen en los productos animales. La absorcion de tales antibioticos residuales puede convertir a los patogenos humanos en resistentes a los antibioticos, dando como resultado la propagacion de enfermedades. Ademas, puesto que hay una gran variedad de antibioticos incluidos en los alimentos, la creciente aparicion global de cepas multirresistentes es una gran preocupacion. Por lo tanto, el bacteriofago de la presente invencion se puede utilizar como un antibiotico incluido en los alimentos que es mas respetuoso del medio ambiente y capaz de resolver los problemas anteriores.

El pienso para animales de la presente invencion se puede preparar anadiendo el bacteriofago directamente o en forma de aditivo para piensos separado a un pienso para animales. El bacteriofago de la presente invencion puede estar contenido en el pienso para animales en forma lfquida o en forma solida, preferentemente en forma de polvo seco. El procedimiento de secado puede realizarse mediante secado por aire, secado natural, secado por pulverizacion y liofilizacion, pero no se limita a estos. El bacteriofago de la presente invencion se puede anadir como una forma de polvo en una cantidad de 0,05 a 10 % en peso, preferentemente de 0,1 a 2 % en peso, basado en el peso del pienso para animales. El pienso para animales puede incluir otros aditivos convencionales para la conservacion a largo plazo, ademas del bacteriofago de la presente invencion.

El aditivo para piensos de la presente invencion puede incluir adicionalmente otros microorganismos no patogenos. El microorganismo adicional disponible se puede seleccionar del grupo que consiste en Bacillus subtilis que puede producir proteasa, lipasa e invertasa, cepas de Lactobacillus sp. que pueden ejercer actividad fisiologica y una funcion de descomposicion en condiciones anaerobias, tales como en el estomago del ganado, incluyendo hongos filamentosos Aspergillus oryzae (J Animal Sci 43: 910-926, 1976) que aumenta el peso de los animales domesticos, aumenta la produccion de leche y ayuda a la digestion y la capacidad de absorcion de los alimentos y la levadura incluyendo Saccharomyces cerevisiae (J Anim Sci 56: 735-739, 1983).

El pienso que incluye OCJ11 de la presente invencion puede incluir piensos de origen vegetal, tales como cereales, nuez, subproductos de alimentos, algas, fibra, subproductos de medicamentos, aceite, almidon, harina y subproductos de cereales y piensos de origen animal tales como protema, materia inorganica, grasas, minerales,

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protemas monocelulares, zooplancton y residuos de alimentos, pero sin limitarse a estos.

El aditivo para piensos que incluye OCJ11 de la presente invencion puede incluir aglutinantes, emulsionantes y conservantes para la prevencion del deterioro de la calidad, aminoacidos, vitaminas, enzimas, probioticos, aromatizantes, nitrogeno no proteico, silicatos, agentes de tamponamiento, agentes colorantes, extractos y oligosacaridos para mejora de la eficiencia y otras premezclas de piensos, pero sin limitarse a estos.

Ademas, el suministro de agua potable mezclada con el bacteriofago de la presente invencion puede reducir el numero de bacterias Salmonella en el intestino del ganado, obteniendo de ese modo ganado exento de Salmonella.

En otro aspecto mas para conseguir los objetos anteriores, la presente invencion proporciona un desinfectante o limpiador que comprende el bacteriofago como un principio activo.

En otro aspecto mas para conseguir los objetos anteriores, la presente invencion proporciona el uso del bacteriofago o la composicion en un procedimiento para el tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o Salmonella newport.

En detalle, el uso terapeutico de la presente invencion comprende la etapa de administrar una cantidad farmaceuticamente eficaz del bacteriofago o la composicion a un individuo que tiene enfermedades infecciosas causadas por Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis o Salmonella Newport.

El bacteriofago o la composicion de la presente invencion se puede administrar en la forma de una formulacion farmaceutica en animales o puede ser ingerido como una mezcla con el pienso para animales o el agua de bebida por los animales y, preferentemente, como una mezcla con el pienso para animales.

Siempre y cuando llegue a los tejidos diana, se puede usar cualquier ruta, ya sea oral o parenteral, para administrar el bacteriofago o la composicion de la presente invencion. En detalle, la composicion de la presente invencion se puede administrar de una manera tfpica a traves de cualquier via tal como oral, rectal, topica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial, transdermica, intranasal e inhalacion.

Sera obvio para los expertos en la tecnica que la dosis diaria total del bacteriofago o la composicion de la presente invencion a ser administrada por el procedimiento terapeutico debe ser determinada mediante un juicio medico apropiado por un medico. Preferentemente, la cantidad terapeuticamente eficaz para los pacientes dados puede variar dependiendo de varios factores bien conocidos en la tecnica medica, incluyendo el tipo y grado de la respuesta que debe lograrse, el estado del paciente, tales como la edad, peso corporal, estado de salud, sexo y dieta, tiempo y via de administracion, la tasa de secrecion de la composicion, el penodo de tiempo de terapia, composiciones concretas en funcion de la utilizacion de otros agentes con la misma o no, etc.

Modo de la invencion

En lo sucesivo, la presente invencion se describira en mas detalle con referencia a los Ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y la invencion no pretende estar limitada por estos Ejemplos.

Ejemplo 1: Aislamiento del bacteriofago de Salmonella

Ejemplo 1-1: Seleccion del bacteriofago y aislamiento de bacteriofagos individuals

Se transfirieron 50 ml de muestra de pocilga y aguas residuales del efluente a un tubo de centnfuga y se centrifugaron a 4.000 rpm durante 10 minutos. A continuacion, el sobrenadante se filtro utilizando un filtro de 0,45 pm. Se mezclaron 18 ml de filtrado de la muestra con 150 pl de medio de cultivo en agitacion de Salmonella choleraesuis (“SC”) (DO600= 2) y 2 ml de 10x medio Luria-Bertani (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l y NaCl 10 g/l: medio LB). La mezcla se cultivo a 37 °C durante 18 horas, y el medio de cultivo se centrifugo a 4.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se filtro utilizando un filtro de 0,2 pm. Se mezclo 3 ml de agar 0,7 % (p/v) y 150 pl de medio de cultivo en agitacion de SC (DO600= 2) y se sembraron en una placa LB (“agar superior”) y se dejo solidificar. Se extendio 10 pl del filtrado del cultivo sobre la misma y se cultivaron durante 18 horas a 37 °C y se llevo a cabo la titulacion del lisado del fago en el agar de la parte superior, denominado procedimiento de superposiciones de agar blando.

El medio de cultivo de la muestra que contiene el lisado de fagos se diluyo adecuadamente y se mezclo con 150 pl de medio de cultivo con agitacion de SC (DO600= 2), seguido por el procedimiento de superposiciones de agar blando, de modo que se obtuvieron placas individuales. Una unica placa representa un bacteriofago y, por tanto, para el aislamiento de bacteriofagos individuales, se anadio una placa de fago a 400 pl de solucion de SM (NaCl, 5,8 g/l, MgSO47H2O, g/l, Tris-Cl 1 M (pH 7,5) 50 ml/l) y se dejo durante 4 horas a temperatura ambiente para aislar bacteriofagos individuales. Para purificar el bacteriofago en grandes cantidades, se tomaron 100 pl de sobrenadante de la solucion de bacteriofago individual y se mezclaron con 12 ml de agar 0,7 % y 500 pl de medio de cultivo en agitacion de SC, seguido por el procedimiento de superposiciones de agar blando en una placa LB que tiene un diametro de 150 mm. Cuando se completo la lisis, se anadieron 15 ml de solucion SM a la placa. La placa se agito

suavemente durante 4 horas a temperatura ambiente para eluir los bacteriofagos del agar de la parte superior. Se recupero la solucion SM que contiene los bacteriofagos eluidos, se anadio cloroformo hasta un volumen final de 1 % y se mezclo bien durante 10 minutos. La solucion se centrifugo a 4.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido se filtro utilizando un filtro de 0,45 pm y se guardo en la nevera.

5 Ejemplo 1-2: Lotes de bacteriofago a gran escala

Los bacteriofagos seleccionados se cultivaron en grandes cantidades utilizando SC. SC se cultivo en agitacion y una alfcuota de 1,5 * 1010 ufc (unidades formadoras de colonias) se centrifugo a 4.000 rpm durante 10 minutos y el sedimento se resuspendio en 4 ml de solucion SM. El bacteriofago de 9,0 * 108 UFP (unidades formadoras de placas) se inoculo a la misma (MOI: multiplicidad de infeccion = 0,001) y se dejo a 37 °C durante 20 minutos. La 10 solucion se inoculo en 150 ml de medio Lb y se cultivo a 37 °C durante 5 horas. Se anadio cloroformo hasta un volumen final de 1 % y la solucion del cultivo se agito durante 20 minutos. Se anadio DNasa I y RNasa A a una concentracion final de 1 pg/ml, respectivamente. La solucion se dejo a 37 °C durante 30 minutos. Se anadio NaCl y PEG (polietilenglicol) a una concentracion final de 1 M y 10 % (p/v), respectivamente y se dejo a 4 °C durante 3 horas adicionales. La solucion se centrifugo a 4 °Cy 12.000 rpm durante 20 minutos para descartar el sobrenadante. 15 El sedimento se resuspendio en 5 ml de solucion SM y se dejo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se anadieron 4 ml de cloroformo a la misma y se mezclaron bien, seguido de centrifugacion a 4 °C y 4.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se filtro utilizando un filtro de 0,2 pm y el bacteriofago se purifico por ultracentrifugacion en gradiente de densidad de glicerol (densidad: 40 %, glicerol 5 % a 35.000 rpm y 4 °C durante 1 hora). El bacteriofago purificado fue designado como “Bacteriofago OCJ11” y se resuspendio en 300 pl de solucion SM, 20 seguido por valoracion. El bacteriofago OCJ11 se deposito en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (361-221, Honje 1, Seodaemun, Seul) el 9 de septiembre de2011 con el numero de registro KCCM11208P.

Ejemplo 2: Examen de la infeccion con 0CJ11 de Salmonella

Para analizar el bacteriofago seleccionado por su actividad lttica en especies de Salmonella distintas de SC, se hicieron intentos de infeccion cruzada con otras especies de Salmonella. Se observo que OCJ11 infectaba SC 25 (Salmonella choleraesuis), ST (Salmonella typhimurium), SD (Salmonella derby), SN (Salmonella newport), SI

(Salmonella infantis), SA (Salmonella arizonae) y SB (Salmonella bongori), pero no infectaba a SE (Salmonella enteritidis), SG (Salmonella gallinarum) y SP (Salmonella pullorum) (Tabla 1 y FIG. 2).

Tabla 1

[Tabla 1]

Infeccion con OCJ11 de Salmonella

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de placas de fagos Serotipo Nombre de la cepa Formacion de placas de fagos

SC

ATCC 10708 O SA ATCC 12398 O

SN

SL 317 O SB ATCC 12397 O

SD

ATCC 2468 O ST 13 O

SE

SGSC 2282 X SI SARB 26 O

SG

SGSC 2293 X SP SGSC 2295 X

* ATCC: Coleccion Americana de Cultivos Tipo * SGSC: Centro de Stocks Geneticos de Salmonella

30

Por otra parte, la FIG. 2 es una fotograffa que muestra la formacion de placas de OCJ11 en un cesped de bacterias Salmonella. Como se muestra en la FIG. 2 (A,B;SC, C;SG, D;ST, E;SI, F,G;SD, H;SN), se observo la formacion de placas en los cespedes de SC, ST, SI y SD y SN, no, pero en el cesped de SG.

Ejemplo 3: Morfologia de 0CJ11

35 El OCJ11 purificado se diluyo en la solucion tampon SM y a continuacion se monto sobre una rejilla de cobre, se tino con acetato de uranilo 2 % durante 3 a 5 segundos y se seco. Se realizo un examen en un microscopio electronico de transmision (LIBRA 120, Carl Zeiss transmission electron Microscope, 80 kV, aumento de * 120.000 ~ 200.000) (FIG. 1). La FIG. 1 es una fotograffa de microscopfa electronica de OCJ11. Como se muestra en la FIG. 1, se observo que el OCJ11 purificado pertenece a la familia Siphoviridae de morfotipo B1, que se caracteriza por una 40 capside isometrica y una cola larga no contractil.

Ejemplo 4: Analisis del patron de protemas de QCJ11

Se mezclaron 15 pl de una solucion de OPCJ11 purificado a un tttulo de 1011 UPF/ml con 3 pl de una solucion de muestra 5xSDS y se calento durante 5 minutos. Se llevo a cabo una SDS-PAGE 12 % y a continuacion, el gel se tino

5

10

15

20

25

30

35

40

con azul de Coomassie durante 1 hora a temperatura ambiente (FIG. 3). La FIG. 3 es el resultado de la SDS-PAGE del bacteriofago OCJ11 aislado, en la que se utilizo el patron de protemas Precision Plus (Bio-Rad) como marcador. Como se muestra en la FIG. 3, se detectaron las principales protemas a 33 kDa, 55 kDa y 69,5 kDa.

Ejemplo 5: Analisis del tamano del ADN genomico total de OCJ11

Se aislo el ADN genomico del OCJ11 purificado usando ultracentrifugacion. En detalle, al medio de cultivo de OCJ11 purificado se anadieron EDTA (acido etilendiaminotetraacetico (pH 8,0)), proteinasa K y SDS (dodecil sulfato de sodio) a una concentracion final de 20 mM, 50 pg/ml y 0,5 % (p/v), respectivamente, seguido de incubacion a 50 °C durante 1 hora. Se anadio un volumen igual de fenol (pH 8,0) y se mezclo bien. Despues de la centrifugacion a temperatura ambiente y 12.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se mezclo bien con un volumen igual de PC (fenol:cloroformo = 1:1). Se llevo a cabo otra centrifugacion a temperatura ambiente y 12.000 rpm durante 10 minutos. A continuacion, se obtuvo un sobrenadante y se mezclo con un volumen igual de cloroformo, seguido de centrifugacion a temperatura ambiente y 12.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante obtenido se mezclo con 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M y dos volumenes de etanol fno 95 % y se dejo a -20 °C durante 1 hora. Despues de centrifugacion a 0 °C y 12.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se elimino completamente y el sedimento de ADN se disolvio en 50 pl de tE (Tris-EDTA (pH 8,0)). El ADN extrafdo se diluyo 10 veces y se midio la absorbancia a una DO 260 para determinar su concentracion. Se cargo 1 pg del ADN genomico total en gel de agarosa para PFGE (electroforesis en gel de pulso de campo) 1 % y se realizo la electroforesis a 14 °C durante 22 horas en un sistema de PFGE CHEF DR II de BIORAD en las condiciones de cambio de tiempo de rampa de 50-90 segundos, 6 V/cm (200V). Se utilizo como un marcador de tamano de ADN la escalera lambda de patron de tamano de ADN, CHEF DNA Size Standard Lambda Ladder (Bio-Rad) (FIG. 4). La FIG. 4 es el resultado de la PFGE del bacteriofago OCJ11 aislado. Como se muestra en la FIG. 4, no se observo ADN de aproximadamente 140 kpb presente entre 48,5 a 1.000 kpb.

Ejemplo 6: Analisis genetico de QCJ11

Para el analisis genetico del OCJ11 purificado, se hizo una digestion doble de 5 pg de ADN genomico de OCJ11 con las enzimas de restriccion PstI, Xbal y BamHI, EcoRI y Sail. El vector pCL1920 (Promega) fue digerido con las enzimas de restriccion PstI, Xbal y BamHI, EcoRI y Sail y despues se trato con CIP (fosfatasa alcalina de intestino de ternera). El ADN genomico digerido se mezclo en una proporcion de 3:1 con el vector y se ligo a 16 °C durante 2 horas. El vector recombinante resultante se transformo en E. coli DH5a y se sembro despues en una placa LB que contiene especinomicina y X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosido) para la seleccion de colonias azules/blancas. Las colonias seleccionadas se cultivaron durante 16 horas en un medio de cultivo que contiene el antibiotico con agitacion. A continuacion, los plasmidos se extrajeron usando un kit de purificacion de plasmido (Promega).

La clonacion de los plasmidos fue confirmada por PCR utilizando conjuntos de cebadores de FTR135 y FTR136 (SEQ ID NOs. 13 y 14) y la seleccion se hizo solo de los fragmentos de inserto que tienen un tamano de 1 kb o mas. Sus secuencias de nucleotidos fueron analizadas utilizando los conjuntos de cebadores. Las secuencias de nucleotidos asf obtenidas se dan en las SEQ ID NOs. 1 a 4, respectivamente, teniendo cada una un tamano de 1-2 kpb o menos y se analizaron para determinar la similitud de secuencia con la ayuda del programa NCBI blastx y blastn y los resultados se resumen en la siguiente Tabla 2.

Tabla 2

[Tabla 2]

Comparacion de la similitud de secuencia entre OCJ11 y otros bacteriofagos

Organismo Protema Blastx

Consulta Sujeto Identidad Valor e

1

Fago de enterobacterias T5 protema hipotetica 436-627 1-64 63/64(98 %) 7e-32

Fago de enterobacterias SPC35

protema hipotetica 10-423 1-139 127/1 39(91 %) 3e-31

Fago de enterobacterias SPC35

protema hipotetica 3-863 30-315 264/2 91(91 %) 2e-116

Fago de enterobacterias T5

protema hipotetica 3-863 30-315 255/2 91(88 %) 1e-113

Fago de enterobacterias EPS7

protema hipotetica 3-761 29-281 235/2 53(93 %) 7e-107

Fago de Klebsiella KP15

protema hipotetica 9-761 22-276 217/2 55(85 %) 4e-100

(continuacion)

Comparacion de la similitud de secuencia entre OCJ11 y otros bacteriofagos

Organismo Protema Blastx

Consulta Sujeto Identidad Valor e

Fago de enterobacterias RB43 protema que contiene el dominio putativo SPFH 9-839 18-257 223/2 81 (79 %) 7e-99

Fago de enterobacterias RB16 protema hipotetica 9-761 18-272 219/2 55(86 %) 2e-98

2

Fago de enterobacterias EPS7 protema hipotetica 412-771 1-120 109/1 20(91 %) 7e-57

Fago de enterobacterias T5 protema hipotetica 490-771 1-94 94/94( 100 % ) 3e-46

Fago de enterobacterias T5 protema D11 532-2 1-177 175/1 77(99 %) 5e-96

Fago de enterobacterias SPC35 protema D11 532-2 1-177 174/1 77(98 %) 2e-95

Fago de enterobacterias EPS7 protema D11 532-8 1-175 163/1 75(93 %) 4e-90

Fago de enterobacterias EPS7 protema hipotetica 872-528 5-120 96/11 6(83 %) 2e-46

3

Fago de enterobacterias SPC35 protema de la cola Pb4 777-4 1-258 221/2 58(86 %) 4e-128

Fago de enterobacterias T5 protema de la cola Pb4 777-4 1-258 197/2 58(76 %) 6e-115

Fago de enterobacterias SPC35 protema de la cola Pb3 1322-780 769-949 178/1 81(98 %) 2e-96

Fago de enterobacterias EPS7 protema de la cola Pb3 1322-780 769-949 160/1 81(88 %) 9e-88

Fago de enterobacterias T5 protema estructural de la cola Pb3 1322-780 769-949 156/1 81(86 %) 8e-84

Fago de enterobacterias EPS7 protema de la cola Pb4 423-4 1-140 112/1 40(80 %) 2e-62

4

Fago de enterobacterias SPC35 endonucleasa flap 980-564 153-291 138/1 39(99 %) 1e-73

Fago de enterobacterias T5 endonucleasa flap 980-564 153-291 138/1 39(99 %) 1e-73

Fago de enterobacterias EPS7 endonucleasa flap 980-564 153-291 135/1 39(97 %) 4e-72

Fago de enterobacterias SPC35 desoxiUTP pirofosfatasa putativa 564-157 1-136 130/1 36(96 %) 3e-70

Fago de enterobacterias T5 desoxiUTP pirofosfatasa putativa 564-160 1-135 130/1 35(96 %) 2e-69

Fago de enterobacterias EPS7 desoxiUTP pirofosfatasa putativa 564-157 1-136 128/1 36(94 %) 2e-67

Ejemplo 7: Diseno de las secuencias del cebador especifico de OCJ11

Con el fin de identificar OCJ11, se disenaron cebadores espedficos de OCJ11 sobre la base de las SEQ ID NOS. 15 4. Se realizo una PCR usando cada conjunto de cebadores de las SEQ ID NOS. 5 y 6, SEQ ID NOs. 7 y 8, SEQ ID

NOs. 9 y 10 y SEQ ID NOs. 11 y 12. Se anadio 0,1 |jg de ADN genomico del bacteriofago y 0,5 pmol de cada cebador a una pre-mezcla (Bioneer) y el volumen final se ajusto a 20 jl. La PCR se realizo con 30 ciclos de desnaturalizacion; 94 °C 30 segundos, hibridacion; 55 °C 30 segundos y polimerizacion; 72 °C, 1,5 minutos (FIG. 5). La FIG. 5 es el resultado de la PCR, realizada usando cada conjunto de cebadores para el ADN genomico de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

OCJ11. A; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 5 y 6, B; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 7 y 8, C; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 9 y 10 y D; un conjunto de cebadores de SEQ ID NOs. 11 y 12. Todos los carriles A, B, C y D teman productos de PCR de aproximadamente 1 a 2 kpb. Como se muestra en la FIG. 5, los productos de PCR obtenidos de este modo teman un tamano de aproximadamente 1 kpb o mas de 2 kpb o menos, con los conjuntos de cebadores de SEQ ID NOs. 5 y 6, SEQ ID NOs. 7 y 8, SEQ ID NOs. 9 y 10 y SEQ ID NOs. 11 y 12.

Ejemplo 8: Estabilidad del bacteriofago frente al pH

Con el fin de determinar si OCJ11 sobrevive de manera estable en un entorno de pH bajo en el estomago del cerdo, el OCJ11 se ensayo para determinar su estabilidad en una amplia gama de pH (pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,2, 9,0, 9,8 y 11,0). Se prepararon varias soluciones de pH (tampon de acetato de sodio (pH 2,1, pH 4,0, pH 5,5 y pH 6,4), tampon de citrato sodico (pH 2,5, pH 3,0 y pH 3,5), tampon de fosfato de sodio (pH 6,9 y pH 7,4) y Tris-HCl (pH 8,2, pH 9,0, pH 9,8 y pH 11,0)) a una concentracion de 0,2 M. Se mezclo 180 pl de cada solucion de pH con 20 pl de una solucion de bacteriofago (1,0 * 1011 UFP/ml) para dar cada solucion de pH una concentracion de 1 M, seguido de incubacion a temperatura ambiente durante 2 horas. La solucion de reaccion se diluyo en serie y 10 pl de cada dilucion se cultivo a 37 °C durante 18 horas por un procedimiento de superposiciones de agar blando para determinar los tftulos de los lisados de fagos (FIG. 6). La FIG. 6 es el resultado del ensayo de resistencia a los acidos en el bacteriofago OCJ11, que muestra el numero de bacteriofagos supervivientes a pH 2,1, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,5, 6,4, 6,9, 7,4, 8,0, 9,0, 9,8 y 11,0. El bacteriofago OCJ11 no perdio su actividad hasta un pH de 5,5. Sin embargo, el bacteriofago OCJ11 mostro actividad reducida a pH 4 y pH 3,5 y perdio por completo su actividad a pH 3,0 o inferior, en comparacion con un control. Como se muestra en la FIG. 6, el bacteriofago no perdio su actividad y se mantuvo estable por debajo de pH 5,5, mientras que perdio su actividad a pH 3,0 o inferior.

Ejemplo 9: Estabilidad del bacteriofago frente al calor

Para su uso como aditivo alimentario, el bacteriofago se ensayo para determinar su estabilidad al calor generado durante un procedimiento de formulacion. A este respecto, se incubo 200 pl de una solucion de OCJ11 con un tftulo de 1,0 x 1011 UFP/ml a 37 °C, 45 °C, 53 °C, 60 °C y 70 °C durante 0 minutos, 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. La solucion se diluyo en serie y 10 pl de cada dilucion se cultivo a 37 °C durante 18 horas por un procedimiento de superposiciones en agar blando para determinar los tftulos de los lisados de fagos (FIG. 7). La FIG. 7 es el resultado del ensayo de resistencia al calor en el bacteriofago OCJ11, que muestra el numero de bacteriofagos supervivientes a 37 °C, 45 °C, 53 °C, 60 °C y 70 °C durante 0, 10, 30, 60 y 120 minutos. Como se muestra en la FIG. 7, el bacteriofago OCJ11 mantuvo su actividad a pesar de su exposicion a 60 °C hasta 2 horas.

Ejemplo 10: Tolerancia a la desecacion del bacteriofago

Para su uso como aditivo alimentario, el bacteriofago OCJ11 se ensayo para determinar la tolerancia a las condiciones de sequedad establecidas para un procedimiento de formulacion. Tomando como base los resultados obtenidos en el ensayo de estabilidad frente al calor, se llevo a cabo un ensayo de desecacion utilizando un concentrador SpeedVac. Se seco 200 pl de una solucion de OCJ11 que tiene un tftulo de 1,0 x 1011 de UPF/ml a vacfo a 60 °C durante 2 horas y el sedimento obtenido se resuspendio completamente en 200 pl de la solucion SM a 4 °C durante un dfa y se midio para determinar los valores del tftulo (FIG. 8). La FIG. 8 es el resultado del ensayo de tolerancia a la desecacion en el bacteriofago OCJ11 desecado con la ayuda de un concentrador SpeedVac. Como se muestra en la FIG. 8, cuando se midieron los cambios de tftulo en las condiciones de sequedad en comparacion con los tftulos pre-secado, la actividad se mantuvo a 60 °C hasta 1 hora.

Ejemplo 11: Espectro de infeccion del bacteriofago

Se ensayo la actividad lftica de OCJ11 frente al tipo silvestre (2 cepas), Salmonella choleraesuis (5 cepas), Salmonella typhimurium (17 cepas), Salmonella infantis (4 cepas), Salmonella newport (6 cepas), Salmonella derby (2 cepas) y Salmonella dublin (3 cepas), obtenidas del Laboratorio de enfermedades aviares, de la Facultad de Veterinaria de la Universidad Nacional de Seul, ademas de SC (ATCC SC10708) utilizada en el experimento. Se mezclo 150 pl de medio de cultivo en agitacion (DO600= 2) de cada cepa y 10 pl de solucion de OCJ11 con un tftulo de 1010 UPF/ml se cultivo a 37 °C durante 18 horas utilizando un procedimiento de superposiciones de agar blando para controlar la formacion de placas (Tabla 3). Se observo la formacion de placas del fago en 8 cepas de SC.

Tabla 3

[Tabla 3]

Cepas de tipo silvestre SC, ST, SD, SI, SN infectadas por OCJ11

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de placas de fagos Serotipo Nombre de la cepa Formacion de placas de fagos

SC

S. choleraesuis ATCC 2929 O SI S. infantis SARB 26 O

S. choleraesuis

ATCC 2930 O S. infants SARB 27 O

(continuacion)

Cepas de tipo silvestre SC, ST, SD, SI, SN infectadas por OCJ11

Serotipo

Nombre de la cepa Formacion de placas de fagos Serotipo Nombre de la cepa Formacion de placas de fagos

S. choleraesuis ATCC 2932 O S. infantis S1326/28 O

S. choleraesuis

ATCC 2933 O S. infantis B09-106 O

S. choleraesuis

ATCC 2425 O SN S. newport SARB 36 O

S. choleraesuis

ATCC 10708 O S. newport SARB 37 O

S. choleraesuis

SNU#1 O S. newport SARB 38 O

S. choleraesuis

SNU#2 O S. newport 7257 O

ST

S. typhimurium SNU ST1 O S. newport SL 317 O

S. typhimurium

SNU ST2 O S. newport SL 254 O

S. typhimurium

SNU ST4 O SD S. derby ATCC 2466 O

S. typhimurium

SNU ST7 O S. derby ATCC 2468 O

S. typhimurium

SNU ST8 O SD S. dublin SA 4405 O

S. typhimurium

SNU ST11 O S. dublin RKS 4699 O

S. typhimurium

SNU ST12 O S. dublin 88/6 O

S. typhimurium

SNU ST13 O SA S. arizonae ATCC 12398 O

S. typhimurium

SNU ST14 O SB S. hongori ATCC 12397 O

S. typhimurium

SNU STJ7 O SH S. heidelberg SARA 33 O

S. typhimurium

SNU ST18 O S. heidelberg SARA 23 O

S. typhimurium

SNU ST 19 O SM S. maimi SARB 28 n

S. typhimurium

SNU ST20 O S. maimi SARB 29 O

S. typhimurium

SNU ST26 O SP S. panama SARB 39 O

S. typhimurium

SNU ST38 O S. panama SARB 40 O

S. typhimurium

SNU ST41 O S. panama SARB 41 O

S. typhimurium

SNU ST42 O S. panama 7261 O

* SGSC: Centro de stocks geneticos de Salmonella

* ATCC: Coleccion Americana de Cultivos Tipo

* SNU: Laboratorio de enfermedades aviares, Facultad de Veterinaria, Universidad Nacional de Seul

Ejemplo 12: Ensayo de toxicidad del bacteriofago

Se realizaron pruebas de irritacion cutanea y ocular en conejos New Zealand White libres de patogenos espedficos 5 (SPF) que son frecuentemente utilizados en el ensayo de toxicidad del bacteriofago OCJ11 para la prevencion de la salmonelosis y la intoxicacion alimentaria por Salmonella y de los cuales existen datos experimentales acumulados que permiten un analisis sencillo de los resultados experimentales. La piel normal abdominal (piel no lesionada) y la piel abdominal lesionada de conejos heridos se cubrieron y se pusieron en contacto con 2,5 cm x 2,5 cm de gasa aplicada con la sustancia de ensayo, aplicandose 0,5 ml/sitio. No se observaron cambios en los smtomas generales 10 y se observo una ligera perdida de peso 1 dfa despues de la aplicacion de la sustancia de ensayo, lo cual probablemente se puede atribuir al estres debido a la aplicacion oclusiva de la sustancia de ensayo. En el ensayo de irritacion cutanea, el mdice de irritacion primaria (PII) fue de 0,33, lo que indica que no es irritante. Para el ensayo de irritacion ocular, se aplico la sustancia de ensayo al ojo izquierdo de un conejo y despues se comparo con el ojo derecho, al que no se aplico la sustancia de ensayo. Durante el penodo experimental, no se observaron smtomas 15 generales ni cambios anormales en el peso corporal en relacion con la aplicacion de la sustancia de ensayo. Despues de la aplicacion de la sustancia de ensayo, el examen ocular mostro que el mdice de irritacion ocular aguda (IAOI) era “0”, lo que indica que no es irritante. Por lo tanto, estos resultados indican que el nuevo bacteriofago

5

10

15

20

25

OCJ11 no tiene toxicidad.

Ademas, el ensayo de toxicidad se llevo a cabo mediante la administracion oral unica de ratas Sprague-Dawley con OCJ11. Un grupo al que se administro la sustancia de ensayo fue tratado con 1 x 1011 UFP/kg de OCJ11 y un grupo de control tratado con excipiente fue tratado con un vehmulo [Tris-HCl 20 mM (pH 7,0) + MgCh 2 mM] como un excipiente y a 10 ratas de cada grupo (5 hembras y 5 machos) se administro por via oral una sola dosis. La mortalidad, los smtomas generales, los cambios en el peso corporal y los hallazgos de la autopsia fueron controlados durante 2 semanas y se compararon entre st El control se llevo a cabo cada 6 horas, a partir de los 30 minutos hasta 1 hora despues de la administracion en el dfa de la administracion. A continuacion, los smtomas generales fueron controlados una vez al dfa durante 14 dfas y se registraron los mismos (Tablas 4 y 5).

Tabla 4

[Tabla 4]

Mortalidad y smtomas generales tras la administracion oral de OCJ11

Sexo

Hecho (UFP) Dfa despues del tratamiento Mortalidad

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Machos

Control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1011

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Hembras

Control 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1011

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla 5

[Tabla 5]

Hallazgos de la autopsia tras la administracion oral de $CJ11

Sexo

Fin (UFP) Hallazgo macroscopico FrecuenciaA

Machos

Control Ningun hallazgo macroscopico 5/5

1011

Ningun hallazgo macroscopico 5/5

Hembras

Control Ningun hallazgo macroscopico 5/5

1011

Ningun hallazgo macroscopico 5/5

A Numero de animales con el signo/numero de animales examinados.

Como se muestra en las Tablas 4 y 5, ninguno de ellos murio y OCJ11 no provoco smtomas toxicos ni smtomas clmicos notables. Los resultados se resumen en las Tablas 4 y 5. Los pesos corporales se registraron antes de la administracion y 1, 3, 7, 10 y 14 dfas despues de la administracion. No se observaron cambios significativos en el peso corporal en comparacion con el grupo control.

Por otro lado, los resultados de los cambios en el peso corporal indican que OCJ11 no causa una reaccion toxica suficiente para reducir el apetito o para cambiar el peso corporal. Estos resultados se muestran en la FIG. 9. La FIG. 9 es el resultado de los cambios en el peso corporal debido a la toxicidad despues de la administracion oral unica de ratas Sprague-Dawley con OCJ11. Como se muestra en la FIG. 9, la observacion de cambios en el peso corporal antes de la administracion y 1, 3, 7, 10 y 14 dfas despues de la administracion con OCJ11 mostro que no hay cambios significativos en el peso corporal en comparacion con el grupo control (■; machos control, □; machos OCJ11, •; hembras control, o; hembras OCJ11).

Por lo tanto, se encontro que el ADL del nuevo bacteriofago OCR11 era superior a 1 X 1011 UFP/kg en ratas de ambos sexos, y por lo tanto, no es toxico.

imagen1

TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPOSITO DE 5 MICROORGANISMOS A LOS FINES DEL PROCEDIMIENTO EN MATERIA DE PATENTES

FORMULARIO INTERNACIONAL

Para

CJ'Mefons ;c^or6tbd GOO 5-GA NAMDAEMUN-RO, CHUNG-KU, SEOUL REPUBLIC OF KOREA

RECEPCION EN EL CASO DE UN DEPOSITO ORIGINAL emitido segun la Regla 7.1 de la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL identificada en la parte inferior de esta pagina

10

I. IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO

Referencia identificativa dada por el DEPOSITANTE:

Bacteriofago 0-CJ11

Numero de registro dado por la

AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL:

KCCM11208P

II. DESCRIPCION CIENTIFICA Y/O DESIGNACION TAXOMOMICA PROPUESTA

El microorganismo identificado en I anteriormente se acompano por:

□ una descripcion cientifica

□ una designacion taxonomica propuesta (Marcar con una cruz lo aplicable)

III. RECEPCION Y ACEPTACION

Esta Autoridad Depositaria Internacional acepta el microorganismo identificado en I anteriormente, que recibio el 9 de septiembre de 2011 (fecha del deposito original)1

IV. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL

Nombre:

Direccion:

Korean Culture Center of Microorganisms

361-2SL, Virfifn. TVT) Hong jc-Wong S Bo<teidrritifi "ji I)

SEOUL 120-091 Republic of. Korea

Firma(s) de la(s) persona(s) que tiene(n) poder para representar a la Autoridad Depositaria Internacional u oficial(es) autorizado(s):

Fecha: 9 de septiembre de 2011

Cuando se aplica la regla 6.4 (d), tal fecha es la fecha en la que se adquirio el estado de autoridad depositaria internacional; cuando un deposito hecho fuera del Tratado de Budapest despues de la adquisicion del estado de autoridad depositaria internacional se convierte en un deposito segun el Tratado de Budapest, dicha fecha es la fecha en la que el microorganismo se recibio en la autoridad depositaria internacional.

Formulario BP/4 Pagina unica

15 <110> CJ CheilJedang Corporation

<120> Nuevo bacteriofago y composicion antibacteriana que comprende el mismo <130> OPA12111PCT

<150> 10-2011-0094648 <151>

<160> 14

<170> KopatentIn 2.0 5

<210> 1 <211>1643 <212>ADN

<213> bacteriofago CJ11

10

<400> 1

taaactgccg

gcttaatatt aaggggagga gcccattatg agtaaatatg gttttgtaaa 60

taacggactt

aatcaaagta tgggctccca gcagcccatg ccgggtctgg ataaccccta 120

cttacaacag

ttgcaacagc gtttagcaga agcgcaacag atgcagcaac aactccagca 180

aaatcctgga

agtgttagtc ctatgcaaat gatgcagcaa atgaatgggc agtcgcaaat 240

gccccaacaa

atgcagcaac agatgccgca gcagcaagtt cagcaacaaa cccaacaacc 300

gcaggtttct

gcggaaggac aggcagtact agcccttttc gaagacttcg caaagacaga 360

ggatgggaag

cagcttgtat cacttatggg taagtttaat agcttctgcc aaagccaagt 420

tgcaaaagct

caaaatggtg gtaataactc ctaaggagga attatgtgtt gcagaaaatc 480

tgtttcgtgc

tgcccaatgc ctgtagcacg ttgttgctct tcagcaatgt ttacacaaat 540

accggcgttc

aatccgtttg cctttaagco tactcttatc ctgcccccta gagtagattt 600

tcagtcaagg

ttggcctccc gtatgggtgg ttgctgtaat aagagtatat ggttctaaag 660

aaccaaacaa

taaagcccct agtcgaaaga cttaggggct tttcttttat cttaaataca 720

gaaaagccct

gcgctctcca gggaacgcag ggettacttc agatgttacg tgcggatatt 780

atttattacg

catatccatg atcatttggo catcatagcc agtgccaacc acagtetgcg 840

gtacaocaec

tttggtattt ctgagcacga atcatttcaa ctttccagtt gcttccagcg 900

aatcatctca

ggagtaatgg tacgttgcaa tgcggegtta gettcagctt ctttcttagc 960

tgegtacagt

ttggcatctg cgtcacgttc gttagcaata gcttggttat taegagcttc 1020

gcgatctgct

tctgcttgtt taaccttetg ctgtgcttot tgttcaacac gagccagttc 1080

agctttcgca

gcattaacct gttcttcacg aactttggta ttctgtacct gttccatgat 1140

taccgghggc

aaagtaatat cctgaagaaa taectgctta actgtgtaac catatgggcg 1200

tgcatactct

tcaacttcct gttgaattgc agtttgcaat tgagcctgaa ttttagcatc 1260

aaacaaatct

tgtgctttag gtacagactt accaaactca cgaatagtag acagtaattt 1320

ttcagttaca

i tatttgtcta acgcttgatc ctgagtacct gcattaatac ggttaatcgg 1380

tgccttagaa ccafccaaact

gcaacataac agtcaggtca acagtggatt taaacttate 1440

ctgactagga acctgaagtt

tatctaattt tagagcaata tctttagtac taaaagtatc 1500

gaaagaagca aaaggattta

caatatgaaa gccgggtaat actgggctag ggtcaaettt 1560

acccaggaaa gtctgggttt

taacagtacc gtcttgaaca acagtatagg agttaagggc 1620

cagaactaaa cctaccaaac

caa 1643

<210> 2

<211> 1464 <212>ADN

<213> bacteriofago CJ11 5 <400>2

taggtataca

ctgggatact aactcttcta aatggaaggt agaaataact aactgtatag 60

gtgttaaaat

atatggtggg ttattccctt atgaagaatt agagttagct ataaataaag 120

ctaacgaact

tagagcacag catctaggta tggattccag gcaagaacta ttcaaaggat 180

atatttgccg

acgtgaggac ttagataagt aaaattgcat ttggcaatag ctcataaatg 240

atgtataata

tatacataaa tttgagagag aaagtttcgg attgataaga aagtccgaag 300

cagaaaaata

aaaattttag fctgctaaatt ctctcgaaat ctagtataat atatacataa 360

attcgaggag

aaaacaaaaa ttaaattctt cgattatgaa aagctatact tactagctag 420

aggaaattcc

gacctaatta ttaagttatt caaaagaatg cttacagagc ctgatgctca 480

ccaattattg

gtcggttcct cattcatttt gaatgaatca acaatagttg ataatccaaa 540

taaattgtct

aatagacaac tggcagaata tctaggaatt ttaagtctac gaaattatgc 600

cgaatacaag

tttacaaacg atcctagttt ggacatacaa tatgttccag tatggatacc 660

acgtttagta

atcgacacta acccactaat cgcaattaac aaatcgaaat taatctttaa 720

agaggaaata

aaatatggct aagtcttggg gcgaaactac tggcggttct aacgataaaa 780

tcgaattcct

gaagttcaac aacggtatca ctcgtgttcg tatcgtttct ggtgttcttc 840

cacgttatgt

ctattggctg actaataaag agggtagcgt agctcctttc gaatgtctcc 900

gttttaaccg

tgacaaagag agctttgttc gtggtaaagc tgatccggtt catgagatgg 960

gcttcttcga

gaaagaactg gataaagatg gbaatcgEgt tccgctgaaa ccgaagaaaa 1020

actatatcgc

ttttgttatc gaccgttctg ataacaaact gaaagtaatg gaagtcaagg 1080

ctactattct

gaaaggcatc cagtctatca tgaagcagtt gagtctggca actccgtttg 1140

atattgatat

ttctatcgag aaaaaaggta aaggtttcga tactgagtat gatgtacagc 1200

agattgctgc

tatgcagttc cagattaagc tgcaagatcc taacagtgca gagtctaagc 1260

aatatgctgc

aggcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa 1320

ttgttatccg

ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg 1380

gggtgcctaa

tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca 1440

gtcgggaaac

ctgtcgtgcc agct 1464

<210> 3

10 <211> 1324

<212> ADN

<213> bacteriofago CJ11

<400> 3 15

tactgaatct

atataagaaa caacaaattc gcgaacgtta gcgccagctc ctctatccca 60

ttcceattgt

acacggagat catatctttc tttaccatca gcaatccttg cagctttgaa 120

agtaatgttg

ttaggagcag taggaggtac aaagttatac tctacagtaa gaactttgga 180

aaattcaaag

tatecagaag agtctacagt tacaccatct ggcatggtaa cttgcccaga 240

tatgcgtact

ttgtaatccc caacaggaac accaccaaat ctaatagtgg gagatagtgg 300

acctatataa

tactttaccc acgggctatt tgaaggttga gtaottttta actcaatagt 360

acaataacta

gcttctcctg tagtctctat aactactata ggggcaccta cacccacatc 420

tactggatca

gcctctgatc tagcggcagt aatagtaggt tttctcttag tactaaaggt 480

agttttattg

gataagttta tgccaatttt agcctctaat agctcagagt ctataataga 540

gtcatagaaa

gccecttgaa cctcataaga agttgaaggg gttagattat taatcattac 600

aaagaaagta

tctataccgg tatagtcacg tctatcaata ctttctccta aotttaacca 660

aaaggatcta

ccaataacgt cataatcagt atatatagag tgctggacat atgccattgt 720

atatccagte

attatactat ttaagaccat tttggctggt gcattattcg aaatcattaa 780

atggatgccc

actccacaga ctgttcccca tcatotectt etgctctaat acgaaaatat 840

agttttctat

tgatccctag agcatcactg ttatggagag caaaatctgc cttattatac 900

attaataaat

agtcataagt atactgattt tcaatacgta cacttcttag cattctattc 960

tgggaatcat

agatetccag agtatagaat atactttcta ttatatcttc ttctggtatc 1020

ctatcccaag

ctagttttac gtetgggccg acaaactcag ttacatctcc agaagccgta 1080

ttagttacoc

taaaattaga tactacgctt aggtttttag cagagttaag ttctatagat 1140

aatgttactg

gagaacttct tctaccgttt atatccacag cccttatttc aaatattgct 1200

aaacctgcag

gttctccaac tatctcttgg atcatgcgtt cattgggatt tgtttctagt 1260

tgctgcacaa

tatacggctc agcatggcct gaatgtacga tagaatagta aactacgtta 1320

ttag

1324

<210>4 <211>1666 5 <212> ADN

<213> bacteriofago CJ11

<400> 4

cagaaaataa

cattaccttc tttatctgtt tttagtacaa ccgtttctgg tttagtagtt 60

ttaatetgat

aagttgatgt actagtatca atacctacca tattaggatc ggtaaaatta 120

tttgcttcct

gaacttccaa atccgccttc cecacgatct gtctccccta gttcgtcaac 180

gatttcaaaa

ttatgagttg agtagtgtgg tactactact agctgacaaa gtctttcaaa 240

attttccaga

gtttgaattt cagaaccata gttataaagg ttcatcttaa tagttccacg 300

atagtctgag

tcaateaetc ctgeggtgtt tgcaatcatc agatgacgct tacctaagga 360

gctacgagga

actaccaaac cgaaccaacc tcgcggaatt tctaccgcga caccyyLg Lc 420

aatcattaag

gatttgcctg gtgcaatagc acgtaaatct gcagcagggt tagtaccaaa 480

gaacgctcgc

agatccatac ctgcggcatc ttcggaacca atcttaggcg tacaatctgg 540

atgagttaat

ttaattttaa tcattgttct gcaatctcca aaatatcttt tgtaaattta 600

tctaatacat

cttgacctac agcagcaata gcatccacac agtaggtagg taaatcaacc 660

agaattaggt

ttcgataaag caattcttcc gaageattta aattctgtat atatttctgt 720

tttccaggca

gtggaagctg atcaataata tccagaacgt taccaaattc acgaataata 780

ttatacccac

gctttgeecc aataccctca acacctcgga tattateeec taaatcaccc 840

ataattgctt

tcagggagat aaaetgetet acatcgtcaa cattatgatg ctcatacata 900

tcacgaagat

gatattcacg acgtgttgtg aaagagaagc gagatacttt atcagttaat 960

aaagtatccc

agtcaecatc ggtagaaatt agccaaacat gatcatatag atgcccaatc ' 1020

agcttaacaa

tataagctgc catatcatct gcttctaccc cacgaatagt gaaagttggg 1080

aatgtagttt

cacataattc gaaagcatct ttcaagtact cgaagaattg ttcatctaat 1140

gctttetect

ettcegtacg ctgcgagtat ttctcatctc gattcccttt atactcaggg 1200

agatgctcta

ggcggaatgc agacttccct ttatctccta aaactattgt agttctagca 1260

gagtaagatt

ttgcaagaga ctgaatagtg gaaacataac ttgaggcaaa tggtttttta 1320

ctattgttat

gcttgaagcg aaagcctaag ttagttccat cgacaatcat taggttacga 1380

cgggaagcca

tttcggcttc ctcttcctca ataaattttc cccaggattt aeteattatt 1440

taattaagtc

ctcaacagat gcatgatgta gccacggctc aaataaacca attacgattt 1500

ccatgtcttt

cttatttaac accatatggg tacgactcat taagttgtca accatcgggt 1560

ctgagetatc

caaagctatt aaccactgtc ctctgtcttt tttgaatatt aatgcaggtt 1620

tggagttcat

ctgctcacct tcaegtgagc actgctgcca ccactt 1666

<210>5 <211> 20

5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

10

<400>5

cccattatga tgaaataggg 20

<210>6

15 <211> 19

<212> ADN

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 6

ctatactgtt gttcaagac

<210>7 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 7

gatactaact cttctaaatg

<210>8 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 8

cttagactct gaactgttag

<210>9 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 9

ctgaatctat ataagaaaca ac

<210> 10 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 10

cgaagtttac tattctatcg

<210> 11 <211> 20 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 11

gtttttagta caaccgtttc

<210> 12 <211> 19 <212> ADN

19

20

20

22

20

20

5

10

15

20

25

30

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 12

cagatgaact ccaaacctg

<210> 13 <211> 20 <212>ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 13

cgggcctctt cgctattacg

<210> 14 <211> 22 <212> ADN

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador <400> 14

aggcttaccc gtcttactgt cg

19

20

22

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un bacteriofago aislado que tiene una actividad bactericida espedfica contra Salmonella choleraesuis, el cual se identifica por el numero de registro KCCM11208P.
2. 2. Una composicion para su uso en la prevencion o tratamiento de enfermedades infecciosas causadas por bacterias 5 Salmonella seleccionadas del grupo que consiste en Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella

   derby, Salmonella infantis, Salmonella newport y combinaciones de las mismas, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.
3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en la que la enfermedad infecciosa causada por Salmonella choleraesuis o Salmonella typhimurium es la salmonelosis o intoxicacion alimentaria por Salmonella y la

   10 enfermedad infecciosa causada por Salmonella derby, Salmonella infantis y Salmonella newport es la intoxicacion alimentaria por Salmonella de tipo infeccion bacteriana.
4. 4. Una composicion para su uso como un antibiotico, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.
5. 5. Un pienso o agua potable para animales , que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio 15 activo.
6. 6. Un desinfectante o limpiador, que comprende el bacteriofago de la reivindicacion 1 como un principio activo.
7. 7. El bacteriofago de la reivindicacion 1, o la composicion de la reivindicacion 2 para su uso en un procedimiento para prevenir o tratar enfermedades infecciosas causadas por una o mas bacterias Salmonella seleccionadas del grupo que consiste en Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Salmonella derby, Salmonella infantis,

   20 Salmonella newport y combinaciones de las mismas en los animales que lo necesitan.