WO2024091038A1 - 신규한 박테리오파지 lbc1, lbc2, lec1, lec2, 또는 lse1 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 박테리오파지 lbc1, lbc2, lec1, lec2, 또는 lse1 및 이의 용도 Download PDF

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WO2024091038A1
WO2024091038A1 PCT/KR2023/016794 KR2023016794W WO2024091038A1 WO 2024091038 A1 WO2024091038 A1 WO 2024091038A1 KR 2023016794 W KR2023016794 W KR 2023016794W WO 2024091038 A1 WO2024091038 A1 WO 2024091038A1
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WO
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bacteriophage
hypothetical protein
lbc1
lbc2
lec1
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PCT/KR2023/016794
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English (en)
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임정아
임민철
우민아
김어진
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한국식품연구원
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
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    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
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    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/48—Medical, disinfecting agents, disinfecting, antibacterial, germicidal or antimicrobial compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Definitions

  • the present invention relates to novel bacteriophages LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, or LSE1, and specifically to the bacteriophages LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, or LSE1 and uses thereof.
  • Bacteriophage is a bacteria-specific virus that infects only specific bacteria and controls the growth of bacteria. It cannot self-proliferate without a bacterial host and is often called a phage. Bacteriophage is a simple structure in which single or double strands of DNA or RNA constitute nucleic acid as genetic material, and this nucleic acid is wrapped in a protein envelope. It has an icosahedral head with a tail, an icosahedral head with no tail, etc. It is divided into three basic filament-type structures.
  • icosahedral head-and-tail bacteriophages are classified according to their tail characteristics: Myoviridae with a contractile tail, Siphoviridae with a long, non-contractile tail, and Podoviridae with a short tail. (Podoviridae), bacteriophages with an icosahedral head and no tail are subdivided according to the shape of the head, the components of the head, and the presence or absence of an envelope.
  • the bacteriophage When infecting a bacterium, the bacteriophage attaches to the surface of the bacterium, injects its genetic material into the cell, and then becomes lytic or lysogenic. In the lytic case, the bacteriophage uses cellular machinery to create its own structures and then destroys or lyses the cell by releasing new bacteriophage particles. In the case of lysogeny, the nucleic acid is incorporated into the chromosome of the bacterial host cell and replicates with the cell without destroying the bacterium, but under certain conditions, it converts to lytic.
  • bacteriophages After the discovery of bacteriophages, research was conducted to use them as a treatment for infectious diseases, but compared to the characteristics of antibiotics with a broad target spectrum, bacteriophages with a specific target spectrum were outcompeted and did not receive attention.
  • Antibiotics or antibacterial agents are widely used to treat infections caused by bacterial infections, but the problem of antibiotic-resistant bacteria is becoming more serious due to misuse of antibiotics, and as concerns about the impact of antibiotic residues in food on the human body are increasing, they have higher host specificity than antibiotics. Interest in bacteriophages is increasing.
  • Bacillus is a Gram-positive bacillus that forms spores and has flagella.
  • Bacillus cereus is an aerobic bacterium that proliferates well under oxygen conditions and grows at 7 to 49°C, with an optimal temperature of 28 to 35°C. Characteristics that distinguish it from other Bacillus genera include ⁇ -hemolysis and the production of lecithinase, which gives the colony a milky white appearance during the egg-yolk reaction.
  • Bacillus cereus is widely distributed in the natural world, including soil and water, and contaminates food by forming heat-resistant spores. In particular, detection is frequent in food raw materials such as rice, dairy products, meat, and spices, or in foods processed thereof.
  • Food poisoning caused by Bacillus cereus can be divided into two types: a diarrheal type caused by enterotoxin and an emetic type caused by an emetic toxin.
  • the diarrheal form is caused by Bacillus cereus proliferating in the human intestinal tract and producing enterotoxins.
  • the toxin activity is highly heat-resistant and is not destroyed even when heated at 120°C for 20 minutes.
  • the vomiting type In the case of the vomiting type, it is caused by vomiting toxin, a vomiting type toxin, when bacteria proliferate after eating contaminated food, causing vomiting, nausea, and abdominal pain.
  • the toxin is not destroyed even when heated at 126°C for 90 minutes and is resistant to acids, alkalis, and proteolytic enzymes.
  • food poisoning caused by Bacillus cereus occurs when there are 10 5 to 10 8 /g of Bacillus cereus growth cells or spores present in food.
  • the spores of Bacillus cereus have strong adhesive properties and adhere well to any surface, making cleaning and disinfection difficult. Additionally, it forms a biofilm after attaching to the surface of an object, making it a difficult problem to control in agriculture, livestock farming, and the food industry.
  • Bacillus cereus have strong adhesive properties is because the spores have relatively high hydrophobicity, the surface of the spores has a low charge, and the long appendages surround the spores. As such, Bacillus cereus is widely distributed in nature, and due to its characteristics, it is difficult to prevent contamination in food, so it is killed using physical and chemical control methods such as heating, sodium chloride, organic acids, ethanol, and electron beam irradiation. or inhibit proliferation.
  • physical and chemical control methods such as heating, sodium chloride, organic acids, ethanol, and electron beam irradiation. or inhibit proliferation.
  • consumers want the inclusion of the above-mentioned substances in food and minimal processing there is a need for a new method of food preservation and disinfectant that is harmless to beneficial microorganisms and can selectively kill only harmful microorganisms.
  • E. coli is an enteric bacterium belonging to the bacillus genus and belongs to Gram-negative bacteria. Most E. coli are common bacteria and are not pathogens, but E. coli O157:H7 and enterotoxigenic E. coli (ETEC) are pathogenic E. coli that can be harmful to humans. It causes food poisoning or diarrhea in various animals such as cows, pigs, and goats. Pathogenic E. coli can produce heat-labile enterotoxin (LT), which loses its activity when heated at 60°C for 10 minutes, or heat-stable enterotoxin (ST), which is resistant even when heated at 100°C for 30 minutes. .
  • LT heat-labile enterotoxin
  • ST heat-stable enterotoxin
  • Salmonella is a Gram-negative, facultative anaerobic bacterium belonging to the Enterobacteriaceae family, a non-spore-forming bacillus, and is a pathogenic microorganism widely distributed not only in the intestines of humans, animals, and birds, but also in the natural world. Because Salmonella is a zoonotic infectious agent, it can infect not only humans but also various livestock, including pigs, cows, and chickens, and cause disease. When infected in humans, it causes food poisoning, causing chronic diseases such as diarrhea, vomiting, abdominal pain, fever, and even arthritis, and in livestock such as pigs, cows, and chickens, it causes salmonellosis, causing acute and chronic infections. It is infected by factors such as feed, water, etc.
  • Salmonella (Salmonella spp.) is broadly classified into two species, Salmonella enterica (S. enterica) or Salmonella bongori (S. bongori), most of which are Salmonella enterica, which is characterized by biochemical characteristics. Accordingly, it is classified into 6 subspecies. After Salmonella species are identified through biochemical tests, the serovar is confirmed according to the Kauffmann-White antigen table, and the strain name is finally written. To date, about 2,659 serotypes have been reported.
  • Salmonella infection patterns according to serotype in the past, outbreaks were concentrated in major serotypes such as Salmonella Enteritidis (S. Enteritidis), Salmonella S. Typhimurium, and Salmonella Typhi, but recently The frequency of infections with new serotypes of Salmonella is increasing, showing a diversification trend.
  • antibiotics are mainly used to prevent and treat Salmonella infections.
  • Salmonella infects animals, it often penetrates into cells, proliferates, and infects, making it difficult for antibiotics, drugs, or other probiotics to penetrate and act.
  • the problem of antibiotic resistance is occurring, the cause of this has been identified as misuse of antibiotics, which has led to insufficient use of antibiotics.
  • antibiotics used as growth promoters in mixed feed for industrial animals began to be banned, and the European Union began regulating antibiotic use in 2006 and Korea began regulating antibiotic use in the second half of 2011.
  • the use of antibiotics is gradually decreasing.
  • the use of antibiotics to control bacteria decreases, the occurrence of bacterial diseases is increasing, and the demand for methods to control bacterial diseases without using antibiotics is increasing.
  • the present inventors have developed a new bacteriophage having lytic activity against Bacillus bacteria, E. coli or Salmonella bacteria, and used an antibacterial composition containing the same to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus bacteria, E. coli or Salmonella bacteria.
  • the present invention was completed by confirming that it can be used as an antibiotic, disinfectant, etc.
  • the present invention aims to solve the above-described problems and other problems associated therewith.
  • An exemplary object of the present invention is to provide a bacteriophage having a specific killing ability against Bacillus, E. coli, or Salmonella.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide an antibiotic containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a disinfectant containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a detergent containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a food additive composition containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a food composition containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a feed additive composition containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a feed composition containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella, containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a bacterial sterilization method including the step of treating the subject with the bacteriophage.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a method for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella, comprising administering to an individual a composition containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • Another exemplary object of the present invention is to provide a use of the bacteriophage or a composition containing the same for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella.
  • LBC1 accession number KCTC 15078BP
  • LBC2 accession number 15089BP
  • LEC1 accession number KCTC 15076BP
  • LEC2 accession number KCTC 15079BP
  • LSE1 accession number KCTC 15077BP
  • the present invention provides a bacteriophage having a specific killing ability against Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella.
  • bacteria refers to a bacteria-specific virus that infects a specific bacterium and inhibits and inhibits the growth of that bacterium, meaning a virus containing single or double stranded DNA or RNA as genetic material. do.
  • Bacillus refers to Gram-positive bacteria belonging to the genus Bacillus, including Bacillus cereus, Bacillus mycoides , Bacillus paramycoides , or Bacillus. It may be Bacillus thuringiensis , but is not limited thereto.
  • E. coli refers to enteric bacteria belonging to the bacillus group and belonging to Gram-negative bacteria. Most E. coli are common bacteria and are not pathogens, but E. coli O157:H7 and enterotoxigenic E. coli (ETEC) are pathogenic E. coli and cause food poisoning in humans or various animals such as cattle, pigs, and goats. It is known to cause diarrhea in the fields.
  • ETEC enterotoxigenic E. coli
  • pathogenic E. coli refers to E. coli with virulence factors that live in the large intestine of humans or animals, including Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enterohemorrhagic E. coli (EHEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteroaggregative E. coli (EAEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC), or Diffusely adherent E. coli (DAEC) It may be, but is not limited to this.
  • EPEC Enteropathogenic E. coli
  • EHEC Enterohemorrhagic E. coli
  • ETEC Enterotoxigenic E. coli
  • EAEC Enteroaggregative E. coli
  • EIEC Enteroinvasive E. coli
  • DAEC Diffusely adherent E. coli
  • Salmonella used in this specification refers to Gram-negative facultative anaerobic bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family, including Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, and S. Typhi. ) or Salmonella Paratyphi ( S. Paratyphi), but is not limited thereto.
  • the bacteriophage may include the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5 as all or part of the entire gene.
  • the bacteriophage of the present invention may be composed of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5, and a functional equivalent of the base sequence.
  • the functional equivalent refers to a base sequence that is at least 70%, specifically 80%, of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5, as a result of modification or substitution of the base sequence.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, or SEQ ID NO: 5 has a sequence homology of at least 90%, and even more specifically at least 95%. refers to a sequence that exhibits the same physiological activity.
  • the bacteriophage may be a bacteriophage deposited as KCTC 15078BP, a bacteriophage deposited as KCTC 15089BP, a bacteriophage deposited as KCTC 15076BP, a bacteriophage deposited as KCTC 15079BP, or a bacteriophage deposited as KCTC 15077BP.
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15078BP may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a functional equivalent of the base sequence
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15089BP may consist of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the base sequence.
  • KCTC 15076BP may be composed of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 and the functional equivalent of the base sequence
  • bacteriophage deposited as KCTC 15079BP may have the base sequence shown in SEQ ID NO: 4. and a functional equivalent of the base sequence
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15077BP may consist of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and a functional equivalent of the base sequence.
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15078BP may have a specific killing ability against Bacillus, E. coli, or Salmonella
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15089BP may have a specific killing ability against Bacillus cereus
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15076BP or the bacteriophage deposited as KCTC 15079BP may have a specific killing ability against E. coli
  • the bacteriophage deposited as KCTC 15077BP may have a specific killing ability against Salmonella.
  • the present invention provides an antibiotic containing bacteriophage as an active ingredient.
  • the term bacteriophage is as described above.
  • antibiotic refers to an agent that can kill bacteria or inhibit the growth of bacteria, and may be a general term for preservatives, disinfectants, and antibacterial agents.
  • active ingredient refers to an ingredient that exhibits the desired activity alone or can exhibit activity in combination with a carrier that is not active on its own.
  • antibiotics containing the bacteriophage as an active ingredient can kill only specific pathogens without killing beneficial bacteria, and do not induce drug resistance, which can have the effect of extending product lifespan compared to conventional antibiotics.
  • the antibiotic can be manufactured by a manufacturing method commonly used in the art.
  • the antibiotic may contain an effective amount of an additive sufficient to reduce quality degradation of the antibiotic, and the additive may be a preservative, stabilizer, excipient, or cryoprotectant.
  • the antibiotic may allow the bacteriophage to survive or maintain activity for a longer period of time within the antibiotic, unlike bacteriophages that exist in nature.
  • the preservatives, stabilizers, excipients, or cryoprotectants may be those commonly used in the art without limitation as long as they can reduce the quality degradation of antibiotics.
  • the present invention provides a disinfectant containing bacteriophage as an active ingredient.
  • Another aspect provides a detergent containing the bacteriophage as an active ingredient.
  • the terms bacteriophage and active ingredients are as described above.
  • the formulation of the disinfectant or cleaner is not particularly limited, and formulations commonly known in the art can be prepared and used.
  • the disinfectant or cleaner can be manufactured by a manufacturing method commonly used in the art.
  • the disinfectant may be sprayed to remove Bacillus bacteria, E. coli, or Salmonella bacteria, and may be sprayed on animal activity areas, slaughterhouses, death areas, cooking areas, or cooking equipment, but is not limited thereto.
  • the detergent may be used to clean the skin surface or body parts of animals that have been or may be exposed to Bacillus, E. coli, or Salmonella, but is not limited to this.
  • the disinfectant or cleaner may contain an effective amount of an additive sufficient to reduce quality degradation, and the additive may be a preservative, stabilizer, excipient, or cryoprotectant.
  • the disinfectant or cleaner may allow the bacteriophage to survive or remain active for a longer period of time in the disinfectant or cleaner, unlike bacteriophages that exist in nature.
  • the preservatives, stabilizers, excipients or cryoprotectants can be those commonly used in the art without limitation, as long as they can reduce the quality deterioration of the disinfectant or cleaning agent.
  • the present invention provides a food additive composition or food composition containing bacteriophage as an active ingredient.
  • bacteriophage as an active ingredient.
  • active ingredients are as described above.
  • the bacteriophage included in the food composition of the present invention specifically kills Bacillus, E. coli, or Salmonella, and therefore shows an improving effect on infections caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella, as long as it has this effect. , can be included in various amounts.
  • improvement refers to any action that reduces or improves the condition of an infection caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella by administering the composition of the present invention, or makes it beneficial.
  • infection caused by Bacillus bacteria, E. coli, or Salmonella bacteria refers to Bacillus infection, acute gastroenteritis, food poisoning, E. coli infection, hemorrhagic colitis, uremic syndrome, thrombocytopenic purpura, salmonella infection, or typhoid fever. It may be possible, but it is not limited to this.
  • the food composition of the present invention may further include any compound or natural extract whose safety has already been verified in the art and known to have the corresponding activity in order to improve the convenience of taking or ingesting.
  • These compounds or extracts include compounds, extracts, and medicinal products listed in compendiums such as the Pharmacopoeia of each country ('Korean Pharmacopoeia' in Korea) and the Code of Health Functional Foods of each country ('Standards and Specifications for Health Functional Foods' notified by the Ministry of Food and Drug Safety in Korea).
  • the laws of each country governing the manufacture and sale of compounds, extracts, and health functional foods that have received product approval in accordance with the laws of each country that govern the manufacture and sale ('Pharmaceutical Affairs Act' in Korea) (the 'Act on Health Functional Foods' in Korea) Accordingly, compounds or extracts with recognized functionality may be included.
  • the term "food” in the present invention refers to meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, There are vitamin complexes, nutritional supplements, functional foods, food additives, health functional foods, and health foods, and include all foods in the conventional sense.
  • the term "health functional food” in the present invention is the same term as food for special health use (FoSHU), and refers to food with high medical and medical effects that has been processed to efficiently exhibit bioregulatory functions in addition to nutritional supply. it means.
  • “function” means adjusting nutrients to the structure and function of the human body or obtaining useful effects for health purposes, such as physiological effects.
  • the food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the industry, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the industry. Additionally, the food formulation can be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present invention can be manufactured in a variety of dosage forms, and unlike general drugs, it has the advantage of being made from food as a raw material and has no side effects that may occur when taking the drug for a long period of time, is excellent in portability, and Food can be consumed as a supplement to improve infections caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella.
  • the health functional foods are foods made by adding bacteriophages to food materials such as beverages, teas, spices, gum, and confectionery, or manufactured into pills, tablets, capsules, powders, suspensions, etc., and consuming them may cause certain health problems. It means bringing about an effect, but unlike regular drugs, it has the advantage of not having any side effects that may occur when taking the drug for a long time since it is made from food.
  • the food composition of the present invention can be consumed on a daily basis, it can be expected to have an improvement effect on infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella, which is very useful.
  • the food composition of the present invention can be manufactured in any form, for example, beverages such as tea, juice, carbonated beverages, and electrolyte drinks, processed oils such as milk and yogurt, gums, rice cakes, Korean snacks, bread, It can be manufactured into foods such as snacks and noodles, and preparations such as tablets, capsules, pills, granules, liquids, powders, flakes, pastes, syrups, gels, jellies, bars, etc.
  • the food composition of the present invention may have any product classification in terms of legal and functional classification as long as it complies with the enforcement laws and regulations at the time of manufacture and distribution.
  • it is a health functional food according to Korea's 'Act on Health Functional Foods', or confectionery, tea, beverages, and special food according to each food type according to the food code of Korea's 'Food Sanitation Act' (Ministry of Food and Drug Safety Notification 'Food Standards and Specifications'). It may be food for use, etc.
  • the food composition of the present invention may contain food additives in addition to the active ingredients.
  • Food additives can generally be understood as substances that are added to, mixed with, or infiltrated into food when manufacturing, processing, or preserving food. Since they are consumed daily and for a long period of time with food, their safety must be guaranteed. In terms of use, these food additives are divided into sweeteners, flavor enhancers, preservatives, emulsifiers, and flavorings.
  • the sweetener is used to impart an appropriate sweetness to food, and can be either natural or synthetic.
  • sweeteners such as neotame, lactitol, D-ribose, mannitol, D-maltitol, and sodium saccharin can be used.
  • flavor enhancer is a food additive that enhances the taste or aroma of food, and both natural and synthetic agents can be used.
  • flavor enhancers may include disodium 5'-guanylate, L-glutamic acid, glycine, betaine, etc.
  • sodium metabisulfite sodium metabisulfite, sulfurous anhydride, sorbic acid, benzoic acid, grapefruit seed extract, etc. may be used.
  • the emulsifier is a food additive that homogeneously mixes or maintains two or more immiscible phases such as water and oil, and may include sodium gluconate, glycerin fatty acid ester, lecithin, magnesium stearate, alginic acid, etc.
  • the flavoring agent is a food additive that gives a unique flavor to food or reinforces the original flavor of food lost during the manufacturing process.
  • Ethyl vanillin, ethyl octanoate, linalyl acetate, allyl caproate, paramethylacetophenone, etc. may be used. .
  • the food composition of the present invention may contain bioactive substances or minerals known in the art and whose safety is guaranteed as food additives for the purpose of supplementing and reinforcing functionality and nutrition.
  • the bioactive substances include catechins contained in green tea, vitamins such as vitamin B1, vitamin C, vitamin E, and vitamin B12, tocopherol, and dibenzoylthiamine.
  • Minerals include calcium preparations such as calcium citrate and stearic acid. Magnesium preparations such as magnesium, iron preparations such as iron citrate, chromium chloride, potassium iodide, selenium, germanium, vanadium, zinc, etc. are included.
  • the food composition of the present invention may contain the above-described food additives in an appropriate amount to achieve the purpose depending on the product type, and with respect to other food additives that may be included in the food composition of the present invention, each country's food code or You can refer to the Food Additives Code.
  • the present invention provides a feed additive composition or feed composition containing bacteriophage as an active ingredient.
  • bacteriophage as an active ingredient.
  • active ingredient etc. are as described above.
  • the bacteriophage contained in the feed composition of the present invention specifically kills Bacillus, E. coli, or Salmonella, and therefore has an improving effect on infections caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella, and as long as it has this effect, , can be included in various amounts.
  • the feed additive may be prepared in the form of a composition containing bacteriophage and mixed into feed, or may be used by directly adding the bacteriophage during feed production.
  • the bacteriophage contained in the feed additive may be in a liquid state or a dried solid state, and specifically, may be in the form of a dried powder.
  • the drying method of the bacteriophage may be ventilation drying, natural drying, spray drying, or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the feed additive containing the bacteriophage as an active ingredient may additionally include other additives as needed.
  • the additives that can be used include binders, emulsifiers, and preservatives added to prevent deterioration of feed quality; Amino acids, vitamins, enzymes, probiotics, flavoring agents, non-protein nitrogen compounds (NPN), silicate agents, buffers, colorants, extractants, or oligosaccharides added to increase the utility of feed include these. It may be added singly or two or more types may be added together.
  • Raw materials other than bacteriophages included in the feed are those commonly used in the industry and can be used without limitation.
  • Non-limiting examples of the feed include plant feeds such as grains, roots and fruits, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, cucurbits or grain by-products;
  • Examples include animal feeds such as proteins, inorganic substances, fats and oils, minerals, fats and oils, single-cell proteins, zooplanktons or food. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • the feed additives and feeds can be manufactured by manufacturing methods commonly used in the industry.
  • the feed additive or feed may contain an effective amount of additive sufficient to reduce quality degradation, and the additive may be a preservative, stabilizer, excipient, or cryoprotectant.
  • the feed additive or feed may allow the bacteriophage to survive or remain active for a longer period of time in the feed additive or feed, unlike bacteriophages that exist in nature.
  • the preservatives, stabilizers, excipients or cryoprotectants are feed additives and those commonly used in the art can be used without limitation as long as they can reduce the quality deterioration of the feed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella, containing bacteriophage as an active ingredient.
  • the terms bacteriophage, active ingredient, infection caused by Bacillus, E. coli or Salmonella, etc. are as described above.
  • prevention refers to any action that improves, alleviates, or improves the degree of symptoms of infection caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella by administering the composition of the present invention.
  • treatment refers to any action that improves or improves the condition of an infection caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella by administering the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and is formulated with the carrier to be used as a food, medicine, feed additive, or feed, etc. can be provided.
  • the term “pharmaceutically acceptable carrier” may mean a carrier or diluent that does not irritate living organisms and does not inhibit the biological activity and properties of the administered compound.
  • the type of carrier that can be included in the composition is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable can be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline solution, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, etc. They can be used alone or in a mixture of two or more types, and other common additives such as antioxidants, buffers, and bacteriostatic agents can be added as needed.
  • diluents such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella can be administered through oral or parenteral administration, and can also be applied or sprayed to the diseased area.
  • parenteral administration it may be administered using intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, or local administration.
  • Suitable application, spraying, and dosage of the composition are determined by factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, degree of disease symptoms, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity of the subject animal and patient. It varies depending on factors, and usually a skilled doctor or veterinarian can easily determine and prescribe an effective dosage for the desired treatment.
  • Formulations for oral administration of the pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella include, for example, tablets, troches, lozenges, water-soluble or oily suspensions, prepared powders, or granules. , can be formulated as an emulsion, hard or soft capsule, syrup, or elixir.
  • binders such as lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, starch, amylopectin, cellulose or gelatin, excipients such as dicalcium phosphate, disintegrants such as corn starch or sweet potato starch, and magnesium stearate.
  • a lubricant such as calcium stearate, sodium stearyl fumarate, or polyethylene glycol wax
  • a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned substances.
  • Formulations for parenteral administration of the pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella include injectable forms such as subcutaneous injection, intravenous injection, or intramuscular injection, suppository injection, or through the respiratory tract. It can be formulated as a spray, such as an aerosol that allows inhalation.
  • the composition of the present invention can be mixed in water with a stabilizer or buffer to prepare a solution or suspension, and the composition can be formulated for unit administration in ampoules or vials.
  • formulating for spraying such as an aerosol, a propellant, etc. may be mixed with additives to disperse the water-dispersed concentrate or wet powder.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating infections caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella may include a preservative, stabilizer, wetting agent, emulsifier, cryoprotectant, or excipient.
  • the preservative, stabilizer, or excipient may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce deterioration of the composition.
  • deterioration in quality may include a decrease in the number of bacteriophages included in a composition, a decrease in activity, or a combination thereof.
  • the composition may contain an effective amount of a preservative, stabilizer, or excipient sufficient to reduce degradation of the composition, thereby allowing bacteriophage LBC1 to survive or maintain activity for a longer period of time in the composition, unlike bacteriophages that exist in nature. It could be.
  • the preservatives, stabilizers or excipients may be those commonly used in the art without limitation, as long as they can reduce quality degradation of the composition.
  • the stabilizer includes alginate, sodium alginate, casein, sodium caseinate, cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, pectin, gelatin, It may be any one or more selected from the group consisting of gum arabic, xanthan gum, dextran, cyclodextrin, and starch.
  • the cryoprotectant may be included in the composition in an effective amount sufficient to reduce quality degradation of the composition when the composition is freeze-dried.
  • the composition is frozen by containing an effective amount of a cryoprotectant sufficient to reduce degradation of the composition in the lyophilized state. Even in the dried composition, bacteriophage activity may be maintained or bacteriophages may be able to survive.
  • cryoprotectant is intended to reduce quality degradation of the freeze-dried composition
  • those commonly used in the art may be used without limitation.
  • the cryoprotectant may be one or more selected from the group consisting of glycerol, ethylene glycol, propylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO), glucose, trehalose, maltodextrin, dextrin, skim milk, and starch. .
  • the present invention provides a method of bacterial sterilization, comprising the step of treating the subject with the bacteriophage.
  • the method of sterilizing bacteria may include treating the bacteria with an effective amount of a disinfectant or detergent containing the bacteriophage of the present invention as an active ingredient, but is not limited thereto.
  • the term “sterilization” refers to killing bacteria using bacteriophages, and the bacteria refers to Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella, but is not limited thereto.
  • the term "subject” refers to food, the skin surface of animals, each body part, as well as the animal's activity area, slaughterhouse, death area, cooking area, or Cooking equipment may be the target, but it is not limited to this.
  • the present invention provides a method for preventing or treating infections caused by Bacillus, Escherichia coli, or Salmonella, comprising administering to an individual a composition containing the bacteriophage as an active ingredient. do.
  • the object refers to all living organisms, such as rats, mice, and livestock, including humans, that can develop infections caused by Bacillus bacteria, E. coli, or Salmonella bacteria. As a specific example, it may be a mammal, including humans.
  • the present invention provides the use of a bacteriophage or a composition containing the same for the prevention or treatment of infections caused by Bacillus bacteria, E. coli, or Salmonella bacteria.
  • the present invention provides the use of a bacteriophage or a composition containing the same for the production of a drug for preventing or treating infections caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella.
  • bacteriophage active ingredient
  • Bacillus E. coli
  • salmonella infectious disease, etc. are as described above.
  • the new bacteriophage of the present invention has the ability to inhibit or kill the growth of Bacillus, E. coli, or Salmonella, so it can be used as an antibiotic, disinfectant, detergent, food additive, food, feed additive, feed, or to prevent or treat infections caused by Bacillus, E. coli, or Salmonella. It can be widely used in pharmaceutical compositions, etc.
  • Figure 1 is a photograph showing a plaque formed by bacteriophage LBC1 isolated in the present invention.
  • Figure 2 is a photograph showing a plaque formed by bacteriophage LBC2 isolated in the present invention.
  • Figure 3 is a photograph showing a plaque formed by bacteriophage LEC1 isolated in the present invention.
  • Figure 4 is a photograph showing a plaque formed by bacteriophage LEC2 isolated in the present invention.
  • Figure 5 is a photograph showing a plaque formed by bacteriophage LSE1 isolated in the present invention.
  • Figure 6 is a photograph showing the results of microscopic observation of the bacteriophage LBC2 isolated in the present invention.
  • Figure 7 is a photograph showing the results of microscopic observation of the bacteriophage LEC1 isolated in the present invention.
  • Figure 8 is a photograph showing the results of microscopic observation of the bacteriophage LEC2 isolated in the present invention.
  • Figure 9 is a photograph showing the results of microscopic observation of bacteriophage LSE1 isolated in the present invention.
  • Figure 10 is a diagram showing the results of nucleotide sequence similarity analysis of bacteriophage LBC2 isolated in the present invention.
  • Figure 11 is a graph showing the host lytic activity of bacteriophage LBC1 isolated in the present invention over time (total 20 hours).
  • Figure 12 is a graph showing the host lytic activity of bacteriophage LBC1 isolated in the present invention over time (total 84 hours).
  • Figure 13 is a graph showing the host lytic activity over time of the bacteriophage LBC2 isolated in the present invention.
  • Figure 14 is a graph showing the host lytic activity over time (total 12 hours) of the bacteriophage LEC1 isolated in the present invention.
  • Figure 15 is a graph showing the host lytic activity of the bacteriophage LEC1 isolated in the present invention over time (total 84 hours).
  • Figure 16 is a graph showing the host lytic activity over time of the bacteriophage LEC2 isolated in the present invention.
  • Figure 17 is a graph showing the host lytic activity over time of bacteriophage LSE1 isolated in the present invention.
  • Example 1 Isolation of bacteriophage
  • a sewage sample was collected from a public sewage treatment facility in Gimje-si, Jeollabuk-do, and 20 ml of sewage sample, 20 ml of twice-concentrated TSB medium, 2 mM CaCl 2 , and host Bacillus cereus strain ( B. cereus ATCC 11778) were placed in a 50 mL tube. The culture medium was added and cultured at 30°C for 16 hours.
  • the grown culture was centrifuged and filtered (0.45 ⁇ m) to remove foreign substances and bacteria from the sample.
  • Bacillus bacteria cultured for more than 12 hours were mixed with Top Agar (0.4%) and poured into 1.5% Agar medium to harden. 10 ⁇ l of the growth sample was added and cultured at 30°C for 16 hours.
  • the culture medium was centrifuged, and only the supernatant was taken to recover a filtrate containing only bacteriophages. Pure bacteriophages were obtained from the bacteriophage filtrate recovered through ultra-high-speed centrifugation using cesium chloride (CsCl) density difference.
  • CsCl cesium chloride
  • the bacteriophage obtained in this way has an excellent killing effect against Bacillus cereus, and in particular, the rate of resistant bacteria appearing even after a long period of time is low, so the killing effect is excellent. It was named LBC1 and deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, with accession number Received KCTC 15078BP.
  • a sewage sample was collected from a public sewage treatment facility in Iksan, Jeollabuk-do, and 20 ml of sewage sample, 20 ml of twice-concentrated TSB medium, 2 mM CaCl 2 , and the host Bacillus cereus B. cereus NCCP 14796 culture were added to a 50 mL tube. Cultured for 16 hours at 30°C.
  • the grown culture was centrifuged and filtered (0.45 ⁇ m) to remove foreign substances and bacteria from the sample.
  • Bacillus bacteria cultured for more than 12 hours were mixed with Top Agar (0.4%) and poured into 1.5% Agar medium to harden. 10 ⁇ l of the growth sample was added and cultured at 30°C for 16 hours.
  • the culture medium was centrifuged, and only the supernatant was taken to recover a filtrate containing only bacteriophages. Pure bacteriophages were obtained from the bacteriophage filtrate recovered through ultra-high-speed centrifugation using cesium chloride (CsCl) density difference.
  • CsCl cesium chloride
  • the bacteriophage obtained in this way had an excellent killing effect against Bacillus cereus, so it was named LBC2, deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, and given the deposit number KCTC 15089BP.
  • a sewage sample was collected from Gongdeok-myeon, Gimje-si, Jeollabuk-do, and 20 ml of sewage sample, 20 ml of twice-concentrated TSB medium, 2 mM CaCl 2 , and E. coli NCTC 12079 culture medium as the host were added to a 50 mL tube and incubated at 37°C for 16 hours. Cultured. The grown culture was centrifuged and filtered (0.45 ⁇ m) to remove foreign substances and bacteria from the sample. E. coli cultured for more than 12 hours was mixed with Top Agar (0.4%) and poured into 1.5% Agar medium to solidify. Then, 10 ⁇ l of the growth sample was added and cultured at 37°C for 8 hours.
  • the culture medium was centrifuged, and only the supernatant was taken to recover a filtrate containing only bacteriophages. Pure bacteriophages were obtained from the bacteriophage filtrate recovered through ultra-high-speed centrifugation using cesium chloride (CsCl) density difference.
  • CsCl cesium chloride
  • the bacteriophage obtained in this way has an excellent killing effect on E. coli, and in particular, the rate of resistant bacteria appearing even after a long period of time is low, so the killing effect is excellent, so it was named LEC1 and deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, accession number KCTC 15076BP. was granted.
  • Samples of livestock waste (pig manure) were collected from the livestock waste common resource recycling facility in Jeongeup-si, Jeollabuk-do, and 20 ml of sewage sample, 20 ml of twice-concentrated TSB medium, 2 mM CaCl 2 , and host E. coli NCCP 15961 were placed in a 50 mL tube. The culture medium was added and cultured at 37°C for 16 hours.
  • the grown culture was centrifuged and filtered (0.45 ⁇ m) to remove foreign substances and bacteria from the sample.
  • E. coli cultured for more than 12 hours was mixed with Top Agar (0.4%) and poured into 1.5% Agar medium to solidify. Then, 10 ⁇ l of the growth sample was added and cultured at 37°C for 8 hours.
  • the culture medium was centrifuged, and only the supernatant was taken to recover a filtrate containing only bacteriophages. Pure bacteriophages were obtained from the bacteriophage filtrate recovered through ultra-high-speed centrifugation using cesium chloride (CsCl) density difference.
  • CsCl cesium chloride
  • the bacteriophage obtained in this way has an excellent killing effect on E. coli, and in particular, the rate of resistant bacteria appearing even after a long period of time is low, so it has an excellent killing effect. It was named LEC2 and deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, accession number KCTC 15079BP. was granted.
  • a sewage sample was collected from a public sewage treatment facility in Gimje-si, Jeollabuk-do, and 20 ml of sewage sample, 20 ml of twice-concentrated TSB medium, 2 mM CaCl 2 , and the host Salmonella ( Salmonella Enteritidis NCCP 14547) culture medium were added to a 50 mL tube. Cultured for 16 hours at 37°C.
  • the grown culture was centrifuged and filtered (0.45 ⁇ m) to remove foreign substances and bacteria from the sample. Salmonella cultured for more than 12 hours was mixed with Top Agar (0.4%) and poured into 1.5% Agar medium to solidify. Then, 10 ⁇ l of the growth sample was added and cultured at 37°C for 8 hours.
  • the culture medium was centrifuged, and only the supernatant was taken to recover a filtrate containing only bacteriophages. Pure bacteriophages were obtained from the bacteriophage filtrate recovered through ultra-high-speed centrifugation using cesium chloride (CsCl) density difference.
  • CsCl cesium chloride
  • the bacteriophage obtained in this way has an excellent killing effect on Salmonella bacteria, and in particular, the killing effect is excellent as the rate of resistant bacteria appearing is small even after a long period of time, so it was named LSE1 and deposited at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, with accession number KCTC. Received 15077 BP.
  • Electron micrographs of bacteriophage LBC2 obtained in Example 1 were analyzed ( Figure 6).
  • the electron microscope used was a transmission electron microscope.
  • the bacteriophage sample to be observed was placed on a carbon-coated copper grid and negatively stained with 2% liquid uranyl acetate.
  • the stained sample was observed using a transmission electron microscope (Hitach 7650) at a voltage of 100 kV.
  • the bacteriophage LBC2 observed in this way was confirmed to have a head of about 90 nm, a tail of about 200 nm, and a baseplate of 40-50 nm when viewed as a standard for classification by shape.
  • Electron micrographs of bacteriophage LEC1 obtained in Example 1 were analyzed ( Figure 7).
  • the electron microscope used was a transmission electron microscope.
  • the bacteriophage sample to be observed was placed on a carbon-coated copper grid and negatively stained with 2% liquid uranyl acetate.
  • the stained sample was observed using a transmission electron microscope (Hitach 7650) with a voltage of 100 kV.
  • the bacteriophage LEC1 observed in this way has the morphological characteristics of Myoviridae, consisting of a head of about 90 nm and a constricted tail of about 140 nm, when viewed as a standard for classification by shape.
  • Electron micrographs of bacteriophage LEC2 obtained in Example 1 were analyzed ( Figure 8).
  • the electron microscope used was a transmission electron microscope.
  • the bacteriophage sample to be observed was placed on a carbon-coated copper grid and negatively stained with 2% liquid uranyl acetate.
  • the stained sample was observed using a transmission electron microscope (Hitach 7650) at a voltage of 100 kV.
  • the bacteriophage LEC2 observed in this way has the morphological characteristics of Myoviridae, consisting of a head of about 80 nm and a constricted tail of about 120 nm, when viewed as a standard for classification by shape.
  • Electron micrographs of bacteriophage LSE1 obtained in Example 1 were analyzed ( Figure 9).
  • the electron microscope used was a transmission electron microscope.
  • the bacteriophage sample to be observed was placed on a carbon-coated copper grid and negatively stained with 2% liquid uranyl acetate.
  • the stained sample was observed using a transmission electron microscope (Hitach 7650) at a voltage of 100 kV.
  • the bacteriophage LSE1 observed in this way has the form of a siphovirus consisting of a head of about 80 nm and a non-contractile tail of about 200 nm, based on the standard for classification by shape.
  • Example 3 Base sequence analysis of the obtained phage
  • the phage gene was isolated. 0.5 M EDTA (pH 8.0), proteinase K, and SDS were added to 1 mL of pure isolated bacteriophage, and the concentrations after addition of the reagents were 20 mM, 50 ⁇ g/mL, and 0.5%, respectively. .
  • the mixed solution was kept at 56°C for 2 hours and then cooled to room temperature. The same amount of phenol was added and centrifuged at 3000 g for 5 minutes. Only the supernatant was obtained, treated again with PCI (phenol-chloroform-isoamylalcohol), and centrifuged under the same conditions.
  • PCI phenol-chloroform-isoamylalcohol
  • the nucleotide sequence of the total pure isolated gene was determined, and the nucleotide sequence of bacteriophage LBC1 has a total size of 155,058 bp (SEQ ID NO: 1), and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the determined base sequence was analyzed using the 'RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)' program. As a result of the analysis, 219 open reading frames (ORFs) and 20 tRNAs were predicted in the LBC1 genome, of which 180 ORFs were hypothetical proteins whose functions have not yet been discovered. It is judged.
  • the 39 ORFs can be broadly divided into four groups: metabolism, packaging, structure, and lysis. Since the integrase or repressor that maintains the bacteriophage in a lysogenic state was not predicted, it was confirmed again that LBC1 is a lytic phage. The putative functions of the LBC1 gene are shown in Table 1 below.
  • the phage gene was isolated. 0.5 M EDTA (pH 8.0), proteinase K, and SDS were added to 1 mL of pure isolated bacteriophage, and the concentrations after addition of the reagents were 20 mM, 50 ⁇ g/mL, and 0.5%, respectively. .
  • the mixed solution was kept at 56°C for 2 hours and then cooled to room temperature. The same amount of phenol was added and centrifuged at 3000 g for 5 minutes. Only the supernatant was obtained, treated again with PCI (phenol-chloroform-isoamylalcohol), and centrifuged under the same conditions.
  • PCI phenol-chloroform-isoamylalcohol
  • the nucleotide sequence of the total pure isolated gene was determined, and the nucleotide sequence of bacteriophage LBC2 has a total size of 157,546 bp (SEQ ID NO. 2), and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO. 2.
  • the determined base sequence was analyzed using the 'RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)' program. As a result of the analysis, 229 open reading frames (ORFs) were predicted in the LBC2 genome, and the gene functions of 47 of them could be predicted.
  • LBC2 is a lytic phage.
  • the putative functions of the LBC2 gene are shown in Table 2 below.
  • the phage gene was isolated. 0.5 M EDTA (pH 8.0), proteinase K, and SDS were added to 1 mL of pure isolated bacteriophage, so that the concentrations after adding the reagents were 20 mM, 50 ⁇ g/mL, and 0.5%, respectively. .
  • the mixed solution was kept at 56°C for 2 hours and then cooled to room temperature. The same amount of phenol was added and centrifuged at 3000 g for 5 minutes. Only the supernatant was obtained, treated again with PCI (phenol-chloroform-isoamylalcohol), and centrifuged under the same conditions.
  • PCI phenol-chloroform-isoamylalcohol
  • the nucleotide sequence of all pure isolated genes was determined, and the nucleotide sequence of bacteriophage LEC1 was 168,610 bp (SEQ ID NO: 3) in total, and the nucleotide sequence was shown in SEQ ID NO: 3.
  • the determined base sequence was analyzed using the 'RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)' program. As a result of the analysis, 267 open reading frames (ORFs) and 2 tRNAs were predicted in the LEC1 genome, of which 123 ORFs were hypothetical proteins whose functions have not yet been discovered. It is judged.
  • the 144 ORFs can be broadly divided into four groups: metabolism, packaging, structure, and lysis.
  • the tail fiber protein which determines host specificity, shows very low homology to other known proteins, which may support the strong host specificity of LEC1, and the integrase or repressor protein that maintains the bacteriophage in a lysogenic state may support the strong host specificity of LEC1. Since repressor, etc. were not predicted, it was reconfirmed that LEC1 is a lytic phage.
  • the putative functions of the LEC1 genes are shown in Table 3 below.
  • the phage gene was isolated. 0.5 M EDTA (pH 8.0), proteinase K, and SDS were added to 1 mL of pure isolated bacteriophage, and the concentrations after addition of the reagents were 20 mM, 50 ⁇ g/mL, and 0.5%, respectively. The mixed solution was kept at 56°C for 2 hours and then cooled to room temperature. The same amount of phenol was added and centrifuged at 3000 g for 5 minutes. Only the supernatant was obtained, treated again with PCI (phenol-chloroform-isoamylalcohol), and centrifuged under the same conditions.
  • PCI phenol-chloroform-isoamylalcohol
  • the nucleotide sequence of the total pure isolated gene was determined, and the nucleotide sequence of bacteriophage LEC2 has a total size of 167,756 bp (SEQ ID NO: 4), and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the determined base sequence was analyzed using the 'RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)' program. As a result of the analysis, 269 open reading frames (ORFs) and 11 tRNAs were predicted in the LEC2 genome, of which 113 ORFs were hypothetical proteins whose functions have not yet been discovered. It is judged.
  • the 156 ORFs can be broadly divided into four groups: metabolism, packaging, structure, and lysis. Since the integrase or repressor that maintains the bacteriophage in a lysogenic state was not predicted, it was confirmed that LEC2 was a lytic phage. The putative functions of the LEC2 gene are shown in Table 4 below.
  • Locus tag start closing function LEC2_1 1156 539 Phage-associated homing endonuclease LEC2_2 1206 1886 Inh inhibitor of gp21 prohead protease LEC2_3 1896 3026 Phage capsid and scaffold LEC2_4 3146 3331 Hypothetical protein LEC2_5 3318 3596 Hypothetical proteins LEC2_6 3606 4610 RNA ligase, phage-associated LEC2_7 5923 4640 Phage capsid vertex LEC2_8 7572 6007 Phage major capsid protein LEC2_9 8400 7591 Phage prohead assembly (scaffolding) protein LEC2_10 9069 8431 Phage prohead assembly (scaffolding) protein LEC2_11 9494 9069 Phage capsid and scaffold LEC2_12 9730 9494 Phage prohead core protein LEC2_13 11304 9730 Phage portal vertex of the head LEC2_14 11879
  • the phage gene was isolated. 0.5 M EDTA (pH 8.0), proteinase K, and SDS were added to 1 mL of pure isolated bacteriophage, and the concentrations after addition of the reagents were 20 mM, 50 ⁇ g/mL, and 0.5%, respectively. .
  • the mixed solution was kept at 56°C for 2 hours and then cooled to room temperature. The same amount of phenol was added and centrifuged at 3000 g for 5 minutes. Only the supernatant was obtained, treated again with PCI (phenol-chloroform-isoamylalcohol), and centrifuged under the same conditions.
  • PCI phenol-chloroform-isoamylalcohol
  • the nucleotide sequence of the total pure isolated gene was determined, and the nucleotide sequence of bacteriophage LSE1 has a total size of 112,766 bp (SEQ ID NO: 5), and the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the determined base sequence was analyzed using the 'RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology)' program. As a result of the analysis, 146 open reading frames (ORFs) and 26 tRNAs were predicted in the LSE1 genome, of which 94 ORFs were hypothetical proteins whose functions have not yet been discovered. It is judged.
  • the 52 ORFs can be broadly divided into four groups: metabolism, packaging, structure, and lysis. Since the integrase or repressor that maintains the bacteriophage in a lysogenic state was not predicted, it was confirmed again that LSE1 is a lytic phage. The putative functions of the LSE1 gene are shown in Table 5 below.
  • Host B. cereus ATCC 11778 The host lytic ability of LBC1 was confirmed by mixing a certain concentration of bacteriophage LBC1 into the culture medium and measuring the absorbance at regular intervals and comparing it with the control group.
  • Host B. cereus NCCP 14796 The host lytic ability of LBC2 was confirmed by mixing a certain concentration of bacteriophage LBC2 into the culture medium and measuring the absorbance at regular intervals and comparing it with the control group.
  • the host lytic ability of LEC1 was confirmed by mixing a certain concentration of bacteriophage LEC1 into the host E. coli NCTC 12079 culture medium and measuring the absorbance at regular intervals and comparing it with the control group.
  • the host lytic ability of LEC2 was confirmed by mixing a certain concentration of bacteriophage LEC2 into the host E. coli NCCP 15961 culture medium, measuring the absorbance at regular intervals, and comparing it with the control group.
  • the host specificity of bacteriophage LBC1 was determined through the dropping method. After mixing the bacterial culture cultured for 16 hours with 0.4% agar medium, it was poured into 1.5% agar medium and dried at room temperature for 15 minutes. The phage culture medium was dropped on top of it and incubated for 16 hours at 30°C. If the strain is susceptible to phage, a transparent area, that is, a plaque, appears on the plate, which proves that it is the result of complete lysis of the bacterial cells. If sensitivity is weak, hazy areas may appear or independent bold spots may appear.
  • the bacteriophage LBC1 of the present invention belongs to the genus Bacillus ( Bacillus sp .), such as Bacillus mycoides, Bacillus paramycoides , and Bacillus thuringiensis, in addition to Bacillus cereus. It showed lytic activity on strains, etc. In particular, when the lytic activity was measured for 31 strains of Bacillus cereus isolates with relatively high antibiotic resistance, it showed a killing effect on 21 strains, showing about 68% lytic activity against antibiotic-resistant strains.
  • Bacillus sp . Bacillus mycoides
  • Bacillus paramycoides Bacillus paramycoides
  • Bacillus thuringiensis in addition to Bacillus cereus. It showed lytic activity on strains, etc. In particular, when the lytic activity was measured for 31 strains of Bacillus cereus isolates with relatively high antibiotic resistance, it showed a killing effect on 21 strains, showing about 68% lytic activity against antibiotic-resistant strains.
  • the lytic activity of bacteriophage LBC1 was divided into three stages according to the transparency of the plaque, and the lytic activity of bacteriophage LBC1 is shown in Table 6 [+++: clear lysis, ++: slightly turbid, +: very turbid. turbid), -: nasal bacteria (no lysis)].
  • Bacteriophage LBC1 Bacillus cereus ATCC 10876 - cereus ATCC 11778 ++ cereus ATCC 14579 + cereus ATCC 10702 + cereus ATCC 21768 - cereus KCTC 1094 + cereus KFDA 164 - cereus KFDA 229 - cereus KFDA 250 - cereus NCCP 14043 - cereus NCCP 14796 + cereus NCCP 15910 - mycoides ATCC 6462 + mycoides ATCC 21929 + mycoides ATCC 6462 + paramycoides KCTC 33709 + subtilis KCTC 13429 - subtilis ATCC 6633 - subtilis ATCC 6051 - thuringiensis ATCC 35646 + thuringiensis ATCC 35866 + thuringiensis ATCC 13367 + thuringiensis ATCC 33679 + thuringiensis KCTC 1510 + thuringiensis ATCC10792 + cereus isolate 21/31 Cronobacter sakaz
  • the host specificity of bacteriophage LBC2 was determined through the dropping method. After mixing the bacterial culture cultured for 16 hours with 0.4% agar medium, it was poured into 1.5% agar medium and dried at room temperature for 15 minutes. The phage suspension was dropped on it and incubated for 16 hours at 30°C. If the strain is susceptible to phage, a transparent area, that is, a plaque, appears on the plate, which proves that it is the result of complete lysis of the bacterial cells. If sensitivity is weak, hazy areas may appear or independent bold spots may appear.
  • the bacteriophage LBC2 of the present invention showed lytic activity against 6 out of 10 Bacillus cereus strains and 8 against 11 Bacillus cereus strains with relatively high antibiotic resistance among the Bacillus cereus strains isolated from soybean paste, sunsik, etc. It showed a killing effect on the strain.
  • the bacteriophage LBC2 of the present invention is Bacillus mycoides , Bacillus paramycoides , Bacillus pseudomycoides , Bacillus subtilis , and Bacillus thuringiensis.
  • Representative food poisoning bacteria include ( Bacillus thuringiensis ), Escherichia coli , Listeria monocytogenes, Salmonella , Staphylococcus aureus , Cronobacter sakazakii , and Vibrio . It did not show lytic activity and only showed lytic activity specifically for Bacillus cereus.
  • the lytic activity was divided into three levels according to the transparency of the plaque, and the lytic activity of LBC2 against Bacillus cereus is shown in Table 7 [+++: clear lysis, ++: slightly turbid, +: very turbid, -: no lysis].
  • Bacteriophage LBC2 Bacillus cereus ATCC 14579 - cereus ATCC 10702 + cereus ATCC 21768 + cereus KCTC 1094 - cereus KFDA 164 + cereus KFDA 229 + cereus KFDA 250 + cereus NCCP 14043 - cereus NCCP 14796 + cereus NCCP 15910 - cereus isolate 8/11 mycoides ATCC 6462 - mycoides ATCC 21929 - mycoides ATCC 6462 - paramycoides KCTC 33709 - pseudomycoides KCTC 3862 - subtilis KCTC 13429 - subtilis ATCC 6633 - subtilis ATCC 6051 - thuringiensis ATCC 35646 - thuringiensis ATCC 35866 - thuringiensis ATCC 13367 - thuringiensis ATCC 33679 - thuringiensis KCTC 1510 - thuringiensis ATCC10792 - Escherichia coli NC
  • bacteriophage LEC1 To confirm the host specificity of bacteriophage LEC1, the lytic activity against 56 strains, including E. coli isolate, Bacillus cereus, Cronobacter sakazakii, Listeria monocytogenes, Salmonella, and Staphylococcus aureus, was analyzed.
  • the host specificity of bacteriophage LEC1 was determined through the dropping method. After mixing the bacterial culture cultured for 16 hours with 0.4% Agar medium, it was poured into 1.5% Agar medium and dried at room temperature for 15 minutes. The phage culture medium was dropped on top of it and incubated for 8 hours at 37°C. If the strain is susceptible to phage, a transparent area, that is, a plaque, appears on the plate, which proves that it is the result of complete lysis of the bacterial cells. If sensitivity is weak, hazy areas may appear or independent bold spots may appear.
  • the bacteriophage LEC1 of the present invention could not infect food poisoning bacteria used in the experiment other than E. coli, and showed lytic activity against most E. coli strains, showing high lytic activity specific to E. coli.
  • the lytic activity was divided into three levels according to the transparency of the plaque, and the lytic activity of LEC1 against E. coli is shown in Table 8 [+++: clear lysis, ++: slightly turbid, +: very turbid. (very turbid), -: nasal bacteria (no lysis)].
  • Bacteriophage LEC1 Bacillus cereus ATCC 10876 - ATCC 11778 - ATCC 14579 - Bacillus mycoides ATCC 6462 - KCCM 40260 - Cronobacter sakazakii ATCC 29004 - KCTC 2949 - Listeria monocytogenes ATCC 19113 - ATCC 19114 - ATCC 19115 - ATCC 19116 - KCTC 3569 - Salmonella Enteritidis ATCC 13076 - KCCM 12021 - Salmonella Typhimurium ATCC 14028 - ATCC 6994 - DT104 - Staphylococcus aureus ATCC 33593 - ATCC 6538 - KCCM 12103 - KCCM 40050 - KCTC 1621 - E.
  • the host specificity of bacteriophage LEC2 was determined through the dropping method. After mixing the bacterial culture cultured for 16 hours with 0.4% agar medium, it was poured into 1.5% agar medium and dried at room temperature for 15 minutes. The phage culture medium was dropped on top of it and incubated for 8 hours at 37°C. If the strain is susceptible to the phage, a transparent area, that is, a plaque, appears on the plate, which proves that it is the result of complete lysis of the bacterial cells. If sensitivity is weak, hazy areas may appear or independent bold spots may appear.
  • the bacteriophage LEC2 of the present invention showed lytic activity against 30 out of 34 E. coli strains and could infect a wide range of hosts.
  • the lytic activity was divided into three levels according to the transparency of the plaque, and the lytic activity of LEC2 against E. coli is shown in Table 9 [+++: clear lysis, ++: slightly turbid, +: very turbid. (very turbid), -: nasal bacteria (no lysis)].
  • Bacteriophage LEC2 E. coli DH5 ⁇ + OE50 + NCTC 12079 + NCCP 13937 + DH10B + BL21(DE3) + ER2738 + ATCC 47000 + ATCC 10536 + ATCC 9637 + ATCC 11775 + ATCC 43890 + ATCC 43889 + ATCC 43894 + ATCC 35150 + NCCP 11091 + ATCC 43895 + NCCP 14540 - NCCP 12537 + NCCP 12551 + NCCP 13581 - NCCP 13667 + NCCP 13721 - NCCP 14010 + NCCP 14020 + NCCP 14538 + NCCP 15647 + NCCP 15656 - NCCP 15739 + NCCP 15954 + NCCP 15956 + NCCP 15961 + ATCC 25922 + ATCC 8739 +
  • the host specificity of bacteriophage LSE1 was determined through the dropping method. After mixing the bacterial culture cultured for 16 hours with 0.4% agar medium, it was poured into 1.5% agar medium and dried at room temperature for 15 minutes. The phage culture medium was dropped on top of it and incubated for 8 hours at 37°C. If the strain is susceptible to phage, a transparent area, that is, a plaque, appears on the plate, which proves that it is the result of complete lysis of the bacterial cells. If sensitivity is weak, hazy areas may appear or independent bold spots may appear.
  • the bacteriophage LSE1 of the present invention was isolated from S. In addition to Enteritidis, it showed lytic activity on other serotypes such as Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhi, and Salmonella Typhimurium, confirming its broad lytic activity within Salmonella bacteria.
  • the lytic activity was divided into three levels according to the transparency of the plaque, and the lytic activity of LSE1 against Salmonella is shown in Table 10 [+++: clear lysis, ++: slightly turbid, +: very very turbid, -: no lysis].
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Abstract

본 발명은 신규한 박테리오파지 LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, 또는 LSE1에 관한 것으로, 구체적으로 상기 박테리오파지 LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, 또는 LSE1 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규 박테리오파지는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균 생육 억제 또는 사멸능이 있으므로, 이를 항생제, 소독제, 세척제, 식품 첨가제, 식품, 사료 첨가제, 사료, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균으로 인한 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 널리 활용할 수 있다.

Description

신규한 박테리오파지 LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, 또는 LSE1 및 이의 용도
본 발명은 신규한 박테리오파지 LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, 또는 LSE1에 관한 것으로, 구체적으로 상기 박테리오파지 LBC1, LBC2, LEC1, LEC2, 또는 LSE1 및 이의 용도에 관한 것이다.
박테리오파지(bacteriophage)는 특정 세균에만 감염하여 세균의 성장을 통제하는 세균특이적 바이러스로 세균 숙주 없이는 자가 증식이 불가능하며 보통 파지라고 부르기도 한다. 박테리오파지는 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA가 유전물질로써 핵산을 구성하고 있으며, 이 핵산을 단백질 외피가 싸고 있는 단순한 구조로 20면체의 머리에 꼬리가 있는 형태, 20면체 머리에 꼬리가 없는 형태, 그리고 필라멘트형의 3가지 기본형 구조로 나뉜다. 가장 흔한 형태인 20면체의 머리에 꼬리가 있는 형태의 박테리오파지는 꼬리 특성에 따라 수축성 꼬리를 가지는 마이오비리대(Myoviridae), 길고 수축성이 없는 꼬리의 시포비리대(Siphoviridae) 그리고 짧은 꼬리의 포도비리대(Podoviridae) 로 세분화될 수 있으며, 20면체의 머리에 꼬리가 없는 박테리오파지는 머리의 형태, 머리의 구성성분 및 외피의 유무에 따라 세분화된다.
세균을 감염시킬때 박테리오파지는 세균의 표면에 달라붙어 자신의 유전물질을 세포 내로 주입한 후 용균성 (lytic) 또는 용원성(lysogenic)을 띠게 된다. 용균성인 경우 박테리오파지가 세포 기구들을 이용하여 자신의 구조물들을 만든 후 새로운 박테리오파지 입자들을 방출시킴으로써 세포를 파괴하거나 용해한다. 용원성인 경우 자신의 핵산을 세균 숙주세포의 염색체에 편입시켜 세균을 파괴하지 않고 세포와 함께 복제되지만 일정 조건이 되면 용균성으로 전환된다.
박테리오파지의 발견 이후 이를 감염질병 치료제로 이용하기 위한 연구가 진행되었지만 광범위한 숙주범위(broad target spectrum)를 갖는 항생제의 특성에 비해 숙주특이성(specific target spectrum)을 갖는 박테리오파지가 경쟁에서 밀려나 관심을 받지 못했다. 항생제 혹은 항균제는 세균 감염에 의한 감염증의 치료에 널리 사용되고 있지만 항생제의 오남용으로 항생제 내성균의 문제가 심각해지고, 식품내의 항생제 잔류가 인체에 미칠 영향에 대한 우려가 높아짐에 따라 항생제에 비하여 숙주 특이성이 높은 박테리오파지에 대한 관심이 높아지고 있다.
한편, 바실러스(Bacillus)는 그람 양성의 간균으로 아포를 형성하고 편모를 갖는 세균이다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 산소 조건에서 잘 증식하는 호기성 세균으로 7~49℃에서 발육하며, 최적온도는 28~35℃이다. 다른 바실러스 속과 구별되는 특징으로는 β-용혈 현상을 가지고 있고, 레시틴 분해효소(lecithinase)를 생성하여 난황반응(egg-yolk reaction)에서 집락 주변이 유백색을 띄는 양상을 나타낸다. 바실러스 세레우스는 토양이나 물 등 자연계에 널리 분포하고, 열에 강한 포자를 형성하여 식품 등을 오염시킨다. 특히 쌀, 유제품, 육류, 향신료 등의 식품 원료나, 이를 가공한 식품에서 검출이 빈번하다. 1955년, 노르웨이에서 식중독 원인균으로 처음 보고가 되었으며 이후 영국 등 유럽에서의 발병사례가 많아 주목을 받아왔다. 최근 우리나라에서도 각종 식품에서 검출되어 주요 식중독 원인 균주로 규제 대상이 되고 있다. 바실러스 세레우스에 의한 식중독은 두 가지로 나뉠 수 있는데, 장 독소(enterotoxin)를 원인 독소로 하는 설사형과 구토 독소(emetic toxin)를 원인 독소로 하는 구토형으로 두 가지 형태가 있다. 설사형인 경우 바실러스 세레우스가 인체 장관 내에서 증식하면서 장독소를 생산하여 발생되며, 독소 활성은 내열성이 높아서 120℃, 20분 가열하여도 파괴되지 않는다. 구토형인 경우 오염된 식품 섭취 후 균이 증식하면서 구토형 독소인 구토 독소에 의해 발생하며 구토, 오심, 복통을 유발한다. 독소는 126℃, 90분간 가열하여도 파괴되지 않으며 산, 알칼리 및 단백질 가수분해 효소에도 저항성을 갖는다. 바실러스 세레우스에 의한 식중독은 대부분의 경우 식품 중에 존재하는 바실러스 세레우스 생장세포나 포자가 105~108/g 존재할 경우 발생한다. 바실러스 세레우스의 포자는 강한 접착성을 지녔으며 어느 표면이든 잘 부착하여 세척과 소독에 어려움이 있다. 그리고 물체 표면에 부착 후 바이오필름을 형성하여 농업, 축산업, 식품산업 등에서 제어하기 어려운 문제가 되고 있다. 바실러스 세레우스의 포자가 강한 접착성을 지니는 것은 포자가 상대적으로 높은 소수성을 지녔고 포자의 표면이 낮은 전하를 띄고 긴 부속사(appendage)가 포자를 싸고 있는 형태 때문이다. 이렇듯 바실러스 세레우스는 자연에 널리 분포되어 있고 그 특성으로 인하여 식품 중 오염을 방지하기는 어려우므로 가열, 염화나트륨, 유기산, 에탄올, 전자선 조사(electron beam irradiation) 등의 물리적, 화학적 제어법을 이용하여 사멸시키거나 증식을 억제한다. 하지만, 소비자들은 식품 내에 상기 물질의 함유 및 최소한의 가공 처리를 원하기 때문에 인체 유익한 미생물에는 무해하며 유해 미생물만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 방법의 식품 보존 및 살균제가 요구되는 상황이다.
대장균은 간균에 속하는 장내세균으로 그람 음성균에 속하며, 대부분의 대장균은 상재균으로 병원균이 아니나, E. coli O157:H7이나 장내독소형 대장균 (ETEC, enterotoxigenic E. coli) 등은 병원성 대장균으로서 사람에게 식중독을 유발하거나, 소, 돼지, 염소 등의 여러 동물들에서 설사를 일으킨다. 병원성 대장균은 60℃에서 10분간 가열했을 때 활성을 잃는 이열성독소 (heat-labile enterotoxin, LT)나 100℃에서 30분간 가열해도 저항성을 나타내는 내열성독소 (heat-stable enterotoxin, ST)를 생산할 수 있다.
이러한 병원성 대장균의 폐해로 감염을 방지하거나 효과적으로 치료할 수 있는 방법의 개발이 절실하다. 이러한 병원성 대장균의 감염 방지나 치료 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 항생제 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 효과적 방안의 확보가 시급한 실정이다.
살모넬라(Salmonella)는 장내세균과에 속하는 그람음성의 통성혐기성 세균이며 아포를 형성하지 않는 간균으로 사람, 동물 및 조류의 장내뿐만 아니라 자연계에 널리 분포하는 병원성 미생물이다. 살모넬라는 인수공통 감염원을 포함하기 때문에 사람뿐만 아니라 돼지, 소, 닭 등을 비롯한 다양한 가축에 감염되어 질병을 발병시킬 수 있다. 사람에게 감염 시 식중독을 발병시켜 설사, 구토, 복통, 발열 심하게는 관절염 등의 만성질환을 유발하고 돼지, 소, 닭 등 가축에는 살모넬라증(Salmonellosis)을 유발하여 급성 및 만성 감염증을 발병시키는데 주로 오염된 사료, 물 등과 같은 요인에 의해 감염된다.
살모넬라균(Salmonella spp.)은 크게 2가지의 종(species)인 살모넬라 엔테리카(S. enterica) 또는 살모넬라 봉고리(S. bongori)로 분류되며, 그 중 대부분 속은 살모넬라 엔테리카로 생화학적 특성에 따라 6종류의 아종 (subspecies)으로 분류된다. 살모넬라균은 생화학 시험을 통해 살모넬라 종을 동정한 후, Kauffmann-White의 항 원표에 따라 혈청형(serovar)을 확인하여 최종적으로 균주명을 표기하며, 현재까지 약 2,659 여종의 혈청형이 보고되었다.
혈청형에 따른 살모넬라 감염 양상을 보면 과거에는 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis), 살모넬라 티피뮤 리움(S. Typhimurium), 살모넬라 타이피(S. Typhi) 등 주요 혈청형에 편중되어 발병되었으나, 최근에는 새로운 혈청형을 가진 살모넬라균의 감염 빈도가 증가하고 있어 다양화 추세를 보이고 있다.
현재 살모넬라 감염증을 예방 및 치료하기 위해 항생제를 주로 사용하고 있으나 살모넬라는 동물에 감염 시 세포 내에 침투하여 증식하고 감염하는 경우가 많아 항생제나 약제, 기타 생균제가 침투하여 작용하기는 어려우며, 최근 많은 분야에서 항생제 내성에 대한 문제가 발생하고 있어 이에 대한 원인을 항생제 오남용으로 규명하고 항생제를 충분히 사용하지 못하게 되었다. 이에 따라 산업동물의 배합 사료 내에 성장촉진제로 사용하는 항생제를 금지하기 시작하였고, 유럽연합에서는 2006년부터, 우리나라에서는 2011년 하반기부터 항생제 사용을 규제하기 시작하였다. 또한, 안전한 먹거리와 식품의 안전에 대한 소비자의 요구가 증대되고 있어 점차 항생제 사용이 줄어들고 있다. 세균을 제어하는 항생제의 사용이 줄어듦에 따라 세균성 질병의 발생이 증가하고 있어 항생제를 사용하지 않고 세균성 질병을 제어하는 방법에 대한 요구가 늘어나고 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 용균 활성을 갖는 신규 박테리오파지를 개발함으로써 이를 포함하는 항균 조성물을 이용하여 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균으로 인한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 항생제, 소독제 등에 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 대상에 처리하는 단계를 포함하는 세균 살균 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 예시적 목적은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 상기 박테리오파지 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 신규 박테리오파지 LBC1(수탁번호 KCTC 15078BP), LBC2(수탁번호 15089BP), LEC1(수탁번호 KCTC 15076BP), LEC2(수탁번호 KCTC 15079BP) 및 LSE1(수탁번호 KCTC 15077BP)을 자연계에서 분리하였으며, 신규 박테리오파지 LBC1, LBC2, LEC1, LEC2 및 LSE1의 형태적, 생화학적 및 유전적 특성을 확인한 결과, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 대한 생육 억제 또는 사멸능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "박테리오파지(bacteriophage)"는 특정 세균에 감염하여 당해 세균의 성장을 억제하고 저해하는 세균 특이적 바이러스로, 단일 혹은 이중 사슬의 DNA 또는 RNA를 유전 물질로 포함하는 바이러스를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바실러스균"은 간균속(바실러스속)에 속하는 그람 양성균으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 파라마이코이데스(Bacillus paramycoides) 또는 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대장균"은 간균에 속하는 장내세균으로 그람 음성균에 속하는 균을 의미한다. 대부분의 대장균은 상재균으로 병원균이 아니나 E. coli O157:H7이나 장내독소형 대장균 (ETEC, enterotoxigenic E. coli) 등은 병원성 대장균으로서 사람에게서 식중독을 유발하거나, 소, 돼지, 염소 등의 여러 동물들에서 설사를 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "병원성 대장균"은 사람이나 동물의 대장에 서식하는 병독인자를 지닌 대장균으로, 장병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli, EPEC), 장출혈성 대장균(Enterohemorrhagic E. coli, EHEC), 장독소형 대장균(Enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장관응집성 대장균(Enteroaggregative E. coli, EAEC), 장침입성대장균(Enteroinvasive E. coli, EIEC) 또는 장관확산부착성 대장균(Diffusely adherent E. coli, DAEC) 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “살모넬라균”은 장내세균과에 속하는 그람음성의 통성혐기성 세균으로 살모넬라 엔테리티디스(S. Enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(S. Typhimurium), 살모넬라 타이피(S. Typhi) 또는 살모넬라 파라티피(S. Paratyphi)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 박테리오파지는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 전체 유전자의 전체 또는 일부로서 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 박테리오파지는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열, 및 상기 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 염기서열의 변형, 치환의 결과, 상기 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열과 적어도 70%이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상, 더더욱 구체적으로는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 서열을 의미한다.
상기 박테리오파지는 KCTC 15078BP로 기탁된 박테리오파지, KCTC 15089BP로 기탁된 박테리오파지, KCTC 15076BP로 기탁된 박테리오파지, KCTC 15079BP로 기탁된 박테리오파지, 또는 KCTC 15077BP로 기탁된 박테리오파지일 수 있다. 구체적으로, 상기 KCTC 15078BP로 기탁된 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 및 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있고, KCTC 15089BP로 기탁된 박테리오파지는 서열번호 2로 표시되는 염기서열 및 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있으며, KCTC 15076BP로 기탁된 박테리오파지는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 및 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있고, KCTC 15079BP로 기탁된 박테리오파지는 서열번호 4로 표시되는 염기서열 및 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있으며, KCTC 15077BP로 기탁된 박테리오파지는 서열번호 5로 표시되는 염기서열 및 염기서열의 기능적 동등물로 이루어질 수 있다.
또한, KCTC 15078BP로 기탁된 박테리오파지는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 것일 수 있으며, KCTC 15089BP로 기탁된 박테리오파지는 바실러스 세레우스에 대한 특이적 사멸능을 갖는 것일 수 있고, KCTC 15076BP로 기탁된 박테리오파지 또는 KCTC 15079BP로 기탁된 박테리오파지는 대장균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 것일 수 있으며, KCTC 15077BP로 기탁된 박테리오파지는 살모넬라균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제를 제공한다. 상기 용어 박테리오파지는 전술한 바와 같다.
본 명세서 사용되는 용어 "항생제"는 균을 죽이거나 균의 성장을 억제할 수 있는 제제를 의미하며, 방부제, 살균제 및 항균제를 총칭하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제는 종래 항생제에 비하여 익균은 죽이지 않고 특정 병원균만을 사멸시킬 수 있으며, 약물 내성을 유도하지 않아 종래의 항생제에 비하여 제품 수명이 연장되는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 항생제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 항생제는 항생제의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있고, 상기 첨가제는 보존제, 안정화제, 부형제 또는 동결보호제 등일 수 있다. 상기 항생제는 상기 첨가제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 항생제 내에서 박테리오파지가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다. 상기 보존제, 안정화제, 부형제 또는 동결보호제는 항생제의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제를 제공한다. 또 다른 양상은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제를 제공한다. 상기 용어 박테리오파지 및 유효성분은 전술한 바와 같다.
상기 소독제 또는 세척제의 제형은 특별히 제한되지 아니하며 당업계에서 통상적으로 알려진 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 소독제 또는 세척제는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 소독제는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균을 제거하기 위하여 살포될 수 있으며 동물의 활동 영역, 도축장, 폐사 지역, 조리 장소 또는 조리 설비 등에 살포될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세척제는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 동물의 피부 표면 또는 신체 각 부위 등을 세척하는 용도로 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 소독제 또는 세척제는 이들의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있고, 상기 첨가제는 보존제, 안정화제, 부형제, 또는 동결보호제 등일 수 있다. 상기 소독제 또는 세척제는 상기 첨가제를 포함함으로써, 자연상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 소독제 또는 세척제 내에서 박테리오 파지가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다. 상기 보존제, 안정화제, 부형제 또는 동결보호제는 소독제 또는 세척제의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물 또는 식품 조성물을 제공한다. 상기 용어 박테리오파지 및 유효성분은 전술한 바와 같다.
본 발명의 식품 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균을 특이적으로 사멸시키므로, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증에 개선 효과를 나타내며, 이러한 효과를 가지는 한, 다양한 함량으로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "개선"은 본 발명의 조성물을 투여함으로써 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의해 유발된 감염증의 상태가 경감 또는 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증"은 바실러스균 감염증, 급성위장관염, 식중독, 대장균 감염증, 출혈성 대장염, 요독증후군, 혈소판 감소성 자반증, 살모넬라균 감염증, 또는 장티푸스 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 박테리오파지 이외에, 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 '대한민국약전'), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 '건강기능식품 기준 및 규격') 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 '약사법')에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 '건강기능식품에 관한 법률')에 따라 기능성이 인정된 화합물 또는 추출물이 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 비타민 복합제, 영양 보조제(nutritional supplement), 기능성 식품, 식품 첨가제(food additive), 건강 기능　식품　및 건강　식품　등이 있으며, 통상적인 의미의　식품을 모두 포함한다.
본 발명의 용어 "건강 기능 식품"이란, 특정보건용　식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은　식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의　식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기　식품의 제형 또한　식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의　식품　조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리　식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나며, 본 발명의　식품은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증 개선을 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
구체적으로, 상기 건강 기능　식품은 박테리오파지를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의　식품소재에 첨가하거나, 환, 정제, 캡슐, 분말, 현탁액 등으로 제조한　식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리　식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.
본 발명의　식품　조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.
본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 제제류 등으로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 '건강기능식품에 관한 법률'에 따른 건강기능식품이거나, 한국 '식품위생법'의 식품공전(식약처 고시 '식품의 기준 및 규격')상 각 식품유형에 따른 과자류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 이러한 식품첨가물은 용도면에 있어서는 감미료, 향미증진제, 보존료, 유화제, 향료 등으로 구분된다.
상기 감미료는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 네오탐, 락티톨, D-리보오스, 만니톨, D-말티톨, 사카린나트륨 등의 감미료가 사용될 수 있다.
상기 향미증진제는 식품의 맛이나 향을 증진시키는 식품 첨가물로, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 예를 들어, 향미증진제는 5'-구아닐산이나트륨, L-글루탐산, 글리신, 베타인 등이 사용될 수 있다.
상기 보존료로서는 메타중아황산나트륨, 무수아황산, 소브산, 안식향산, 자몽종자추출물 등이 사용될 수 있다.
상기 유화제는 물과 기름 등 섞이지 않는 두 가지 또는 그 이상의 상(phases)을 균질하게 섞어주거나 유지시키는 식품첨가물로, 글루콘산나트륨, 글리세린지방산에스테르, 레시틴, 스테아린산마그네슘, 알긴산 등이 사용될 수 있다.
상기 향료는 식품에 특유한 향을 부여하거나 제조공정 중 손실된 식품 본래의 향을 보강시키는 식품첨가물로, 에틸바닐린, 옥탄산에틸, 초산리나릴, 카프론산알릴, 파라메틸아세토페논 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 생리활성 물질로는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 목적을 달성할 수 있는 적정량으로 포함될 수 있으며, 본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물 또는 사료 조성물을 제공한다. 상기 용어 박테리오파지, 유효성분 등은 전술한 바와 같다.
본 발명의 사료 조성물에 포함되는 박테리오파지는 상술한 바와 같이, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균을 특이적으로 사멸시키므로, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증에 개선 효과를 나타내며, 이러한 효과를 가지는 한, 다양한 함량으로 포함할 수 있다.
상기 사료 첨가제는 박테리오파지를 포함하는 조성물의 형태로 제조되어 사료에 혼합시키거나, 상기 박테리오파지를 사료 제조시 직접 첨가하는 방식으로 사용하는 것일 수 있다.
상기 사료 첨가제 내에 포함되는 박테리오파지는 액체 상태 또는 건조된 고체 상태일 수 있고, 구체적으로, 건조된 분말 형태일 수 있다. 상기 박테리오파지의 건조 방법은 통풍 건조, 자연 건조, 분무 건조 또는 동결 건조 방법일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제는 필요에 따라 기타 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 사용 가능한 첨가제의 비제한적인 예로는, 사료의 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결합제, 유화제, 보존제; 사료의 효용 증대를 위하여 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 비단백태 질소 화합물(non-protein nitrogen compound: NPN), 규산염제, 완충제, 착색제, 추출제 또는 올리고당 등이 있으며, 이들은 단독으로 첨가되거나 또는 2종 이상이 함께 첨가될 수 있다.
상기 사료에 포함되는 박테리오파지 이외의 원료들은 당업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 제한없이 사용될 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
상기 사료 첨가제, 사료는 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 사료 첨가제, 사료는 이들의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 첨가제를 포함하는 것일 수 있고, 상기 첨가제는 보존제, 안정화제, 부형제 또는 동결보호제 등일 수 있다. 상기 사료 첨가제, 사료는 상기 첨가제를 포함함으로써, 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 사료 첨가제, 사료 내에서 박테리오파지가 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다. 상기 보존제, 안정화제, 부형제 또는 동결보호제는 사료 첨가제, 사료의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 용어 박테리오파지, 유효성분, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증 등은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물을 투여함으로써 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의해 유발된 감염증 증상의 정도가 호전 또는 완화되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물을 투여함으로써 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의해 유발된 감염증의 상태가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
상기 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것일 수 있고, 상기 담체와 함께 제제화되어 식품, 의약품, 사료 첨가제 또는 사료 등으로 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제 등을 의미하는 것일 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용가능한 담체라면 어느 것이든 사용될 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 통해 투여할 수 있으며, 질환 부위에의 도포 또는 분무하는 방법도 이용할 수 있다. 비경구 투여의 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수도 있다. 상기 조성물의 적합한 도포, 분무 및 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 대상이 되는 동물 및 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 민감성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사나 수의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
상기 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.
상기 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정화제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
상기 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 동결보호제(cryoprotectant) 또는 부형제 등을 포함할 수 있다.
상기 보존제, 안정화제 또는 부형제는 상기 조성물의 품질 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "품질 저하"는 조성물 등에 포함되는 박테리오파지의 균 수 감소, 활성 감소, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물은 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 보존제, 안정화제 또는 부형제를 포함함으로써 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게 조성물 내에서 박테리오파지 LBC1이 보다 오랜 기간 동안 생존하거나 활성이 유지되는 것일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제 또는 부형제는 상기 조성물의 품질 저하를 감소시킬 수 있는 것이라면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어 상기 안정화제는 알긴산염(alginate), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 카제인, 카제인 나트륨, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 (carboxymethylcellulose), 카르복시메틸셀룰로스 나트륨(sodium carboxymethylcellulose), 펙틴, 젤라틴, 아라비아검, 잔탄검, 덱스트란, 사이클로덱스트린 및 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 동결보호제는 상기 조성물이 동결건조된 상태일 때, 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 예를 들어 동결건조된 조성물 내에서 활성이 저하되거나 생존할 수 없는 자연 상태에 존재하는 박테리오파지와 다르게, 상기 조성물은 동결건조된 상태에서 조성물의 품질 저하를 감소시키는데 충분한 유효량의 동결보호제를 포함함으로써 동결건조된 조성물 내에서도 박테리오파지 활성이 유지되거나 박테리오파지가 생존할 수 있는 것일 수 있다.
상기 동결보호제는 동결건조된 상태인 조성물의 품질 저하를 감소시키기 위한 것이라면, 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어 상기 동결보호제는 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide: DMSO), 글루코스, 트레할로스, 말토덱스트린, 덱스트린, 스킴밀크 및 전분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 대상에 처리하는 단계를 포함하는, 세균 살균 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 세균을 살균하는 방법은 본 발명의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제 또는 세척제의 유효량을 세균에 처리하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "살균"은 박테리오파지를 이용해 세균을 죽이는 것으로, 상기 세균은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균을 의미하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상"은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 노출되었거나 노출될 가능성이 있는 식품, 동물의 피부 표면, 신체 각 부위뿐만 아니라 동물의 활동 영역, 도축장, 폐사 지역, 조리 장소 또는 조리 설비 등이 대상이 될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 개체는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증이 발병될 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 박테리오파지 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 양태로서, 본 발명은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한, 박테리오파지 또는 이를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 용어 박테리오파지, 유효성분, 바실러스균, 대장균, 살모넬라균, 감염증 등은 전술한 바와 같다.
본 발명의 신규 박테리오파지는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균 생육 억제 또는 사멸능이 있으므로, 이를 항생제, 소독제, 세척제, 식품 첨가제, 식품, 사료 첨가제, 사료, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균으로 인한 감염증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 등에 널리 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC1이 형성하는 플라크(plaque)를 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC2가 형성하는 플라크(plaque)를 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC1이 형성하는 플라크(plaque)를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC2가 형성하는 플라크(plaque)를 나타낸 사진이다.
도 5는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LSE1이 형성하는 플라크(plaque)를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC2를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC1을 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC2를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LSE1을 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC2의 염기서열 유사도 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC1의 시간 경과(총 20시간)에 따른 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 12는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC1의 시간 경과(총 84시간)에 따른 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LBC2의 시간 경과별 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 14는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC1의 시간 경과(총 12시간)에 따른 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 15는 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC1의 시간 경과(총 84시간)에 따른 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LEC2의 시간 경과별 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
도 17은 본 발명에서 분리한 박테리오파지 LSE1의 시간 경과별 숙주 용균 활성을 나타내는 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 박테리오파지의 분리
(1) 박테리오파지 LBC1
전북 김제시 공공하수처리시설에서 하수 샘플을 채취하고, 50 mL 튜브에 하수 샘플 20 ml과 2배 농축된 TSB 배지 20 ml, 2 mM CaCl2, 숙주가 되는 바실러스 세레우스 균주 (B. cereus ATCC 11778) 배양액을 넣고 30℃에서 16시간 배양하였다.
증식된 배양액은 원심분리 후 여과시켜(0.45 μm) 샘플 중 이물과 세균을 제거하였다. 12시간 이상 배양한 바실러스균을 Top Agar(0.4%)와 섞어 1.5% Agar 배지에 부어 굳힌 후, 상기 증식 샘플 10 μl을 떨어뜨리고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우, 독립되고 투명한 플라크(plaque)가 관찰되었다 (도 1). 이 플라크 영역을 팁을 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.
그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상층액만을 취해 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다. 염화세슘(CsCl) 밀도차를 이용한 초고속 원심분리를 통해 회수된 박테리오파지 여과액으로 부터 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.
이와 같이 얻은 박테리오파지는 바실러스 세레우스에 대한 사멸효과가 우수하고, 특히 오랜 시간이 지난 후에도 저항성 세균이 나타나는 비율이 적어 사멸효과가 우수하며, 이를 LBC1로 명명하고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15078BP를 부여받았다.
(2) 박테리오파지 LBC2
전북 익산시 공공하수처리시설에서 하수 샘플을 채취하고, 50 mL 튜브에 하수 샘플 20 ml과 2배 농축된 TSB 배지 20 ml, 2 mM CaCl2, 숙주가 되는 바실러스 세레우스 B. cereus NCCP 14796 배양액을 넣고 30℃에서 16시간 배양하였다.
증식된 배양액은 원심분리 후 여과시켜(0.45 μm) 샘플 중 이물과 세균을 제거하였다. 12시간 이상 배양한 바실러스균을 Top Agar(0.4%)와 섞어 1.5% Agar 배지에 부어 굳힌 후, 상기 증식 샘플 10 μl을 떨어뜨리고, 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우, 독립되고 투명한 플라그(plaque)가 관찰되었다 (도 2). 이 플라그 영역을 팁을 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.
그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상층액만을 취해 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다. 염화세슘(CsCl) 밀도차를 이용한 초고속 원심분리를 통해 회수된 박테리오파지 여과액으로 부터 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.
이와 같이 얻은 박테리오파지는 바실러스 세레우스에 대한 사멸효과가 우수하여, 이를 LBC2로 명명하고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15089BP를 부여받았다.
(3) 박테리오파지 LEC1
전북 김제시 공덕면의 하수 샘플을 채취하고, 50 mL 튜브에 하수 샘플 20 ml과 2배 농축된 TSB 배지 20 ml, 2 mM CaCl2, 숙주가 되는 대장균 E. coli NCTC 12079 배양액을 넣고 37℃에서 16시간 배양하였다. 증식된 배양액은 원심분리 후 여과시켜(0.45 μm) 샘플 중 이물과 세균을 제거하였다. 12시간 이상 배양한 대장균을 Top Agar(0.4%)와 섞어 1.5% Agar 배지에 부어 굳힌 후, 상기 증식 샘플 10μl을 떨어뜨리고, 37℃에서 8시간 동안 배양하였다.
목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우, 독립되고 투명한 플라크(plaque)가 관찰되었다 (도 3). 이 플라크 영역을 팁을 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.
그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상층액만을 취해 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다. 염화세슘(CsCl) 밀도차를 이용한 초고속 원심분리를 통해 회수된 박테리오파지 여과액으로 부터 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.
이와 같이 얻은 박테리오파지는 대장균에 대한 사멸효과가 우수하고, 특히 오랜 시간이 지난 후에도 저항성 세균이 나타나는 비율이 적어 사멸효과가 우수하여, 이를 LEC1으로 명명하고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15076BP를 부여받았다.
(4) 박테리오파지 LEC2
전북 정읍시 가축분뇨 공동자원화시설에서 가축분뇨(돈분) 샘플을 채취하고, 50 mL 튜브에 하수 샘플 20 ml과 2배 농축된 TSB 배지 20 ml, 2 mM CaCl2, 숙주가 되는 대장균 E. coli NCCP 15961 배양액을 넣고 37℃에서 16시간 배양하였다.
증식된 배양액은 원심분리 후 여과시켜(0.45 μm) 샘플 중 이물과 세균을 제거하였다. 12시간 이상 배양한 대장균을 Top Agar(0.4%)와 섞어 1.5% Agar 배지에 부어 굳힌 후, 상기 증식 샘플 10 μl을 떨어뜨리고, 37℃에서 8시간 동안 배양하였다.
목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우, 독립되고 투명한 플라그(plaque)가 관찰되었다 (도 4). 이 플라그 영역을 팁을 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.
그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상층액만을 취해 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다. 염화세슘(CsCl) 밀도차를 이용한 초고속 원심분리를 통해 회수된 박테리오파지 여과액으로 부터 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.
이와 같이 얻은 박테리오파지는 대장균에 대한 사멸효과가 우수하고, 특히 오랜 시간이 지난 후에도 저항성 세균이 나타나는 비율이 적어 사멸효과가 우수하며, 이를 LEC2로 명명하고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15079BP를 부여받았다.
(5) 박테리오파지 LSE1
전북 김제시 공공하수처리시설에서 하수 샘플을 채취하고, 50 mL 튜브에 하수 샘플 20 ml과 2배 농축된 TSB 배지 20 ml, 2 mM CaCl2, 숙주가 되는 살모넬라균 (Salmonella Enteritidis NCCP 14547) 배양액을 넣고 37℃에서 16시간 배양하였다.
증식된 배양액은 원심분리 후 여과시켜(0.45 μm) 샘플 중 이물과 세균을 제거하였다. 12시간 이상 배양한 살모넬라균을 Top Agar(0.4%)와 섞어 1.5% Agar 배지에 부어 굳힌 후, 상기 증식 샘플 10 μl을 떨어뜨리고, 37℃에서 8시간 동안 배양하였다.
목적하는 박테리오파지가 플레이트 상에 나타난 경우, 독립되고 투명한 플라크(plaque)가 관찰되었다 (도 5). 이 플라크 영역을 팁을 이용하여 분리해 낸 다음, 새로운 박테리아 배양액에 넣었는데, 배양액이 맑아짐을 관찰할 수 있었다.
그 후에 배양액을 원심분리한 후, 상층액만을 취해 박테리오파지만을 포함하는 여과액을 회수할 수 있었다. 염화세슘(CsCl) 밀도차를 이용한 초고속 원심분리를 통해 회수된 박테리오파지 여과액으로 부터 순수한 박테리오파지를 얻을 수 있었다.
이와 같이 얻은 박테리오파지는 살모넬라균에 대한 사멸효과가 우수하고, 특히 오랜 시간이 지난 후에도 저항성 세균이 나타나는 비율이 적어 사멸효과가 우수하여, 이를 LSE1으로 명명하고, 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 15077BP를 부여받았다.
실시예 2: 박테리오파지의 형태학적 특성 분석
(1) 박테리오파지 LBC2
실시예 1에서 획득한 박테리오파지 LBC2의 전자현미경 사진을 분석하였다(도 6). 전자현미경은 투과 전자현미경(Transmission Electron Microscope)을 사용하였다. 관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 100 kV의 전압의 투과 전자현미경 (Hitach 7650)을 이용하여 관찰하였다.
이렇게 관찰된 박테리오파지 LBC2는 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 약 90 nm의 머리와 약 200 nm의 꼬리, 40-50 nm의 baseplate를 가지고 있음을 확인하였다.
(2) 박테리오파지 LEC1
실시예 1에서 획득한 박테리오파지 LEC1의 전자현미경 사진을 분석하였다(도 7). 전자현미경은 투과 전자현미경(Transmission Electron Microscope)을 사용하였다. 관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 100 kV의 전압의 투과 전자현미경 (Hitach 7650)을 이용하여 관찰하였다.
이렇게 관찰된 박테리오파지 LEC1은 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 약 90 nm의 머리와 약 140 nm의 수축형의 꼬리로 구성된 마이오비리대(Myoviridae)의 형태학적 특성을 지닌다.
(3) 박테리오파지 LEC2
실시예 1에서 획득한 박테리오파지 LEC2의 전자현미경 사진을 분석하였다(도 8). 전자현미경은 투과 전자현미경(Transmission Electron Microscope)을 사용하였다. 관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 100 kV의 전압의 투과 전자현미경 (Hitach 7650)을 이용하여 관찰하였다.
이렇게 관찰된 박테리오파지 LEC2는 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 약 80 nm의 머리와 약 120 nm의 수축형의 꼬리로 구성된 마이오비리대(Myoviridae)의 형태학적 특성을 지닌다.
(4) 박테리오파지 LSE1
실시예 1에서 획득한 박테리오파지 LSE1의 전자현미경 사진을 분석하였다(도 9). 전자현미경은 투과 전자현미경(Transmission Electron Microscope)을 사용하였다. 관찰하고자 하는 박테리오파지 샘플을 탄소를 입힌 구리 그리드에 올리고, 2% 액상 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 음성 염색을 하였다. 염색된 시료를 100 kV의 전압의 투과 전자현미경 (Hitach 7650)을 이용하여 관찰하였다.
이렇게 관찰된 박테리오파지 LSE1은 모양으로 분류하는 기준으로 보았을 때 약 80 nm의 머리와 약 200 nm의 비수축형의 꼬리로 구성된 siphovirus의 형태를 지닌다.
실시예 3: 수득한 파지의 염기서열 분석
(1) 박테리오파지 LBC1
분리한 박테리오파지 LBC1의 염기서열 분석을 위하여 파지 유전자를 분리하였다. 순수 분리된 박테리오파지 1 mL에 0.5 M EDTA(pH 8.0), 프로테이나아제(proteinase) K, SDS를 첨가하되, 시약을 첨가한 후의 농도가 각각 20 mM, 50 μg/mL, 0.5%가 되도록 하였다. 혼합된 용액은 2시간 동안 56℃로 온도를 유지하며 이후 상온에서 식혔다. 동량의 페놀을 넣고 3000 g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 상층액만을 얻어 PCI(phenol-chloroform-isoamylalcohol)를 다시 한 번 처리하고, 동일한 조건의 원심분리를 수행하였다. 위에서 획득한 상층액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 원심분리하였다. 이 과정을 반복하고 95% 에탄올 1 mL과 3 M 소디움 아세테이트(Sodium acetate, pH 5.2)를 100 μL 첨가하여 -80℃에서 DNA를 침전시킨 뒤 15분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올을 첨가하여 한번 더 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고 DNA를 건조시킨 후, 증류수에 DNA를 녹였다.
순수 분리된 총 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 박테리오파지 LBC1의 염기서열은 총 155,058 bp (서열번호 1) 크기이며, 상기 염기서열은 서열번호 1에 나타내었다. 결정된 염기서열을 'RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology)' 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분석한 결과, LBC1의 유전체(genome)에서 219개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORFs)과 20개의 tRNA가 예측되었고, 이중 180개의 ORF는 아직 기능이 밝혀지지 않은 가정적인 단백질(hypothetical protein)로 판단된다.
39개의 ORF는 크게 대사(metabolism), 패키징(packaging), 구조(sturcutre), 용균 (lysis) 등의 4개의 집단으로 나뉠 수 있다. 박테리오파지를 용원상태로 유지시키는 인테그레이즈(integrase)나 리프레서(repressor) 등은 예측되지 않았으므로 LBC1이 용균성 파지임을 재확인하였다. LBC1의 유전자의 추정되는 기능은 하기 표 1에 나타내었다.
로커스 태그(Locus tag) 시작 종결 기능
LBC1_1 648 166 Hypothetical protein
LBC1_2 1383 667 Hypothetical protein
LBC1_3 2571 1717 Hypothetical protein
LBC1_4 2738 2571 Hypothetical protein
LBC1_5 3265 2738 Hypothetical protein
LBC1_6 3911 3354 Hypothetical protein
LBC1_7 4756 4043 Hypothetical protein
LBC1_8 5241 4813 Hypothetical protein
LBC1_9 5438 5241 Hypothetical protein
LBC1_10 5713 5438 Hypothetical protein
LBC1_11 6086 5715 Hypothetical protein
LBC1_12 6467 6087 Hypothetical protein
LBC1_13 7079 6468 Hypothetical protein
LBC1_14 7221 7048 Hypothetical protein
LBC1_15 7477 7232 Hypothetical protein
LBC1_16 7976 7800 Hypothetical protein
LBC1_17 8504 7992 Hypothetical protein
LBC1_18 8785 8504 Hypothetical protein
LBC1_19 8898 8782 Hypothetical protein
LBC1_20 9362 9039 Hypothetical protein
LBC1_21 9827 9384 Hypothetical protein
LBC1_22 10085 9870 Hypothetical protein
LBC1_23 10821 10087 tRNAHis-5'-guanylyltransferase
LBC1_24 11444 10887 Hypothetical protein
LBC1_25 11678 11541 Hypothetical protein
LBC1_26 13239 11932 Hypothetical protein
LBC1_27 13551 13261 Hypothetical protein
LBC1_28 14565 13615 Hypothetical protein
LBC1_29 15191 14712 Hypothetical protein
LBC1_30 15532 15194 Hypothetical protein
LBC1_31 16205 15570 Hypothetical protein
LBC1_32 16551 16198 Hypothetical protein
LBC1_33 17820 16591 Phage recombinase
LBC1_34 18236 17865 Hypothetical protein
LBC1_35 18637 18248 Hypothetical protein
LBC1_36 20145 18718 putative Fe-S oxidoreductase
LBC1_37 20487 20233 Hypothetical protein
LBC1_38 20794 20489 Hypothetical protein
LBC1_39 21325 20807 Hypothetical protein
LBC1_40 24772 21434 DNA polymerase I (EC 2.7.7.7), phage-associated
LBC1_41 25015 24785 Hypothetical protein
LBC1_42 25191 25012 Hypothetical protein
LBC1_43 25579 25283 Phage integration host factor
LBC1_44 26339 25581 Hypothetical protein
LBC1_45 26667 26500 Hypothetical protein
LBC1_46 27485 26703 Hypothetical protein
LBC1_47 27762 27487 Hypothetical protein
LBC1_48 27987 27775 Hypothetical protein
LBC1_49 28703 28056 Hypothetical protein
LBC1_50 29041 28793 thioredoxin
LBC1_51 29483 29028 Hypothetical protein
LBC1_52 30594 29473 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), beta subunit (EC 1.17.4.1)
LBC1_53 32931 30610 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), alpha subunit (EC 1.17.4.1)
LBC1_54 33637 33068 Hypothetical protein
LBC1_55 33844 33641 Hypothetical protein
LBC1_56 34230 33844 Hypothetical protein
LBC1_57 34555 34214 Hypothetical protein
LBC1_58 35194 34562 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase (EC 3.6.1.23)
LBC1_59 35533 35258 Hypothetical protein
LBC1_60 36775 35708 Phage DNA primase/helicase
LBC1_61 37223 36783 Hypothetical protein
LBC1_62 39267 37366 Phage recombination related exonuclease (EC 3.1.11.-)
LBC1_63 40395 39385 Phage recombination exonuclease
LBC1_64 41931 40462 DNA helicase, phage-associated
LBC1_65 42102 41932 Hypothetical protein
LBC1_66 43840 42176 Hypothetical protein
LBC1_67 45703 43928 DNA helicase, phage-associated
LBC1_68 46031 45759 Hypothetical protein
LBC1_69 46653 46465 Hypothetical protein
LBC1_70 50168 46668 Phage virulence-associated protein
LBC1_71 51206 50184 Hypothetical protein
LBC1_72 52265 51219 Phage baseplate
LBC1_73 53021 52278 Hypothetical protein
LBC1_74 53548 53021 Hypothetical protein
LBC1_75 54408 53551 Hypothetical protein
LBC1_76 54941 54459 Hypothetical protein
LBC1_77 55139 54960 Hypothetical protein
LBC1_78 55676 55164 Hypothetical protein
LBC1_79 58382 55692 Phage capsid and scaffold
LBC1_80 62270 58404 Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (EC 3.1.4.46), phage variant
LBC1_81 64474 62360 Hypothetical protein
LBC1_82 66553 64505 Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (EC 3.1.4.46), phage variant
LBC1_83 68869 66578 Secretory antigen SsaA-like protein
LBC1_84 72846 68911 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.96)
LBC1_85 73363 72908 Hypothetical protein
LBC1_86 73952 73533 Hypothetical protein
LBC1_87 74820 74059 Hypothetical protein
LBC1_88 75771 74941 FIG01237946: Hypothetical protein
LBC1_89 76577 75930 Cell wall-binding protein
LBC1_90 77154 76726 Hypothetical protein
LBC1_91 77407 77177 Hypothetical protein
LBC1_92 79155 77449 Phage major tail sheath
LBC1_93 79447 79184 Hypothetical protein
LBC1_94 80306 79449 Hypothetical protein
LBC1_95 80951 80322 Hypothetical protein
LBC1_96 81736 80951 Hypothetical protein
LBC1_97 82627 81749 Hypothetical protein
LBC1_98 82860 82651 Hypothetical protein
LBC1_99 84402 82954 Phage major capsid protein
LBC1_100 85539 84574 Hypothetical protein
LBC1_101 86352 85555 Hypothetical protein
LBC1_102 88125 86449 Hypothetical protein
LBC1_103 88443 88153 Hypothetical protein
LBC1_104 89431 88592 FIG01226709: Hypothetical protein
LBC1_rna.1 89587 89515 tRNA-Met-CAT
LBC1_rna.2 89673 89592 tRNA-Trp-CCA
LBC1_rna.3 89804 89732 tRNA-Leu-TAG
LBC1_rna.4 89898 89811 tRNA-Leu-TAA
LBC1_rna.5 89985 89909 tRNA-Ile-GAT
LBC1_rna.6 90073 89987 tRNA-Tyr-GTA
LBC1_rna.7 90286 90211 tRNA-Phe-GAA
LBC1_rna.8 90476 90403 tRNA-Pro-TGG
LBC1_rna.9 90556 90485 tRNA-His-GTG
LBC1_rna.10 90710 90640 tRNA-Gln-TTG
LBC1_rna.11 90880 90789 tRNA-Ser-TGA
LBC1_rna.12 90960 90886 tRNA-Arg-TCT
LBC1_rna.13 91134 91058 tRNA-Ile-TAT
LBC1_rna.14 91211 91138 tRNA-Glu-TTC
LBC1_rna.15 91412 91342 tRNA-Asp-GTC
LBC1_rna.16 91494 91419 tRNA-Thr-TGT
LBC1_rna.17 91574 91499 tRNA-Gly-TCC
LBC1_rna.18 91857 91767 tRNA-Ser-GCT
LBC1_rna.19 91936 91862 tRNA-Asn-GTT
LBC1_rna.20 92023 91950 tRNA-Cys-GCA
LBC1_105 92931 93209 Hypothetical protein
LBC1_106 93474 93241 Hypothetical protein
LBC1_107 93814 93491 Hypothetical protein
LBC1_108 94621 94872 Hypothetical protein
LBC1_109 94884 95405 Hypothetical protein
LBC1_110 95692 96111 Hypothetical protein
LBC1_111 96111 97910 Phage terminase, large subunit
LBC1_112 97977 98795 Phage lysin; N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase, family 3 (EC:3.5.1.28)
LBC1_113 98874 99359 Hypothetical protein
LBC1_114 99428 99568 Hypothetical protein
LBC1_115 99750 100331 Hypothetical protein
LBC1_116 100331 100645 Hypothetical protein
LBC1_117 100833 101522 Phosphate starvation-inducible protein PhoH, predicted ATPase
LBC1_118 101545 102519 Hypothetical protein
LBC1_119 102619 104052 Hypothetical protein
LBC1_120 104158 104400 Hypothetical protein
LBC1_121 104390 105280 Thymidylate synthase (EC 2.1.1.45)
LBC1_122 105285 105905 adenylate kinase and related kinases
LBC1_123 105898 106152 Hypothetical protein
LBC1_124 106279 106767 Dihydrofolate reductase (EC 1.5.1.3)
LBC1_125 106781 107563 unknown
LBC1_126 107563 107757 Hypothetical protein
LBC1_127 107757 108017 Hypothetical protein
LBC1_128 108034 108261 Hypothetical protein
LBC1_129 108251 108622 Hypothetical protein
LBC1_130 108612 109067 Hypothetical protein
LBC1_131 109064 109300 Hypothetical protein
LBC1_132 109293 110282 UPF0229 protein YeaH
LBC1_133 110275 110541 Hypothetical protein
LBC1_134 110609 111787 Sulfate adenylyltransferase subunit 2 (EC 2.7.7.4)
LBC1_135 112483 112325 Hypothetical protein
LBC1_136 112986 112741 Hypothetical protein
LBC1_137 113146 112988 Hypothetical protein
LBC1_138 113543 113151 Hypothetical protein
LBC1_139 113771 113556 Hypothetical protein
LBC1_140 114257 113877 Hypothetical protein
LBC1_141 114490 114290 Hypothetical protein
LBC1_142 114768 114490 Hypothetical protein
LBC1_143 115000 114782 Hypothetical protein
LBC1_144 115375 115016 Hypothetical protein
LBC1_145 115870 115433 Hypothetical protein
LBC1_146 116188 115958 Hypothetical protein
LBC1_147 117817 117530 Hypothetical protein
LBC1_148 118124 117810 Hypothetical protein
LBC1_149 118341 118117 Hypothetical protein
LBC1_150 118483 118319 Hypothetical protein
LBC1_151 118747 118496 Hypothetical protein
LBC1_152 119139 118930 Hypothetical protein
LBC1_153 120067 119774 Hypothetical protein
LBC1_154 120306 120064 Hypothetical protein
LBC1_155 120434 120303 Hypothetical protein
LBC1_156 121074 120436 Hypothetical protein
LBC1_157 121301 121086 Hypothetical protein
LBC1_158 121836 121282 Hypothetical protein
LBC1_159 122338 121823 Hypothetical protein
LBC1_160 122920 122501 Hypothetical protein
LBC1_161 123221 122913 Hypothetical protein
LBC1_162 123312 123187 Hypothetical protein
LBC1_163 123647 123432 Hypothetical protein
LBC1_164 124071 123652 Hypothetical protein
LBC1_165 124256 124074 Hypothetical protein
LBC1_166 125035 124460 Endo-1,4-beta-xylanase A precursor (EC 3.2.1.8)
LBC1_167 125417 125052 Phage chromosome segregation protein
LBC1_168 125743 125414 Hypothetical protein
LBC1_169 126125 125745 Hypothetical protein
LBC1_170 126433 126092 Hypothetical protein
LBC1_171 126629 126447 Hypothetical protein
LBC1_172 126805 126629 Hypothetical protein
LBC1_173 127000 126827 Hypothetical protein
LBC1_174 127536 127114 Hypothetical protein
LBC1_175 127966 127538 Hypothetical protein
LBC1_176 128311 127979 Hypothetical protein
LBC1_177 128724 128323 Hypothetical protein
LBC1_178 129067 128726 Hypothetical protein
LBC1_179 129370 129068 Hypothetical protein
LBC1_180 130485 129370 Hypothetical protein
LBC1_181 131228 130482 Metal-dependent hydrolases of the metallobeta-lactamase superfamily
LBC1_182 131692 131447 Hypothetical protein
LBC1_183 132815 131739 Hypothetical protein
LBC1_184 133277 132888 Hypothetical protein
LBC1_185 135352 133313 Hypothetical protein
LBC1_186 135607 135389 Hypothetical protein
LBC1_187 135786 135607 Hypothetical protein
LBC1_188 136075 135893 Hypothetical protein
LBC1_189 137117 136176 Hypothetical protein
LBC1_190 137486 137262 Hypothetical protein
LBC1_191 137886 137488 Hypothetical protein
LBC1_192 138331 137888 Hypothetical protein
LBC1_193 138869 138288 Hypothetical protein
LBC1_194 139081 138884 Hypothetical protein
LBC1_195 139592 139083 Hypothetical protein
LBC1_196 140022 139585 Hypothetical protein
LBC1_197 140261 140019 Hypothetical protein
LBC1_198 140488 140273 Hypothetical protein
LBC1_199 141293 140613 Hypothetical protein
LBC1_200 143490 141427 Cell division protein FtsK
LBC1_201 144133 143840 Hypothetical protein
LBC1_202 144087 144689 Hypothetical protein
LBC1_203 145500 144970 Hypothetical protein
LBC1_204 145707 145528 Hypothetical protein
LBC1_205 145784 145954 Hypothetical protein
LBC1_206 146408 146085 Hypothetical protein
LBC1_207 147515 146421 Hypothetical protein
LBC1_208 147934 147692 Hypothetical protein
LBC1_209 149702 147945 RNA polymerase sporulation specific sigma factor SigF
LBC1_210 150464 149724 RNA polymerase sporulation specific sigma factor SigG
LBC1_211 150902 150636 Hypothetical protein
LBC1_212 151104 150886 Hypothetical protein
LBC1_213 151444 151109 Hypothetical protein
LBC1_214 151822 151457 Hypothetical protein
LBC1_215 152680 151883 Hypothetical protein
LBC1_216 153604 153281 Hypothetical protein
LBC1_217 153789 153604 Hypothetical protein
LBC1_218 154418 153786 Hypothetical protein
LBC1_219 154975 154418 Hypothetical protein
(2) 박테리오파지 LBC2
분리한 박테리오파지 LBC2의 염기서열 분석을 위하여 파지 유전자를 분리하였다. 순수 분리된 박테리오파지 1 mL에 0.5 M EDTA(pH 8.0), 프로테이나아제(proteinase) K, SDS를 첨가하되, 시약을 첨가한 후의 농도가 각각 20 mM, 50 μg/mL, 0.5%가 되도록 하였다. 혼합된 용액은 2시간 동안 56℃로 온도를 유지하며 이후 상온에서 식혔다. 동량의 페놀을 넣고 3000 g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 상층액만을 얻어 PCI(phenol-chloroform-isoamylalcohol)를 다시 한 번 처리하고, 동일한 조건의 원심분리를 수행하였다. 위에서 획득한 상층액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 원심분리하였다. 이 과정을 반복하고 95% 에탄올 1 mL과 3 M 소디움 아세테이트(Sodium acetate, pH 5.2)를 100 μL 첨가하여 -80℃에서 DNA를 침전시킨 뒤 15분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올을 첨가하여 한번 더 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고 DNA를 건조시킨 후, 증류수에 DNA를 녹였다.
순수 분리된 총 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 박테리오파지 LBC2의 염기서열은 총 157,546bp (서열번호 2) 크기이며, 상기 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다. 결정된 염기서열을 'RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology)' 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분석한 결과, LBC2의 유전체(genome)에서 229개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORFs)이 예측되었고, 이중 47개의 유전자 기능을 예측할 수 있었다.
박테리오파지를 용원상태로 유지시키는 인테그레이즈(integrase)나 리프레서(repressor) 등은 예측되지 않았으므로 LBC2이 용균성 파지임을 재확인하였다. LBC2의 유전자의 추정되는 기능은 하기 표 2에 나타내었다.
로커스 태그(Locus tag) 시작 종결 기능
LBC2_1 783 1046 hypothetical protein
LBC2_2 1196 2323 Transposase
LBC2_3 2503 3513 hypothetical protein
LBC2_4 3939 5066 Transposase
LBC2_5 5286 5975 hypothetical protein
LBC2_6 6146 6943 hypothetical protein
LBC2_7 6960 7883 hypothetical protein
LBC2_8 8195 9625 Phage major capsid protein
LBC2_9 9828 10058 hypothetical protein
LBC2_10 10076 10948 hypothetical protein
LBC2_11 10963 11751 hypothetical protein
LBC2_12 11751 12371 hypothetical protein
LBC2_13 12393 13250 hypothetical protein
LBC2_14 13267 13470 hypothetical protein
LBC2_15 13492 15204 Phage major tail sheath
LBC2_16 15258 15482 hypothetical protein
LBC2_17 16357 17277 hypothetical protein
LBC2_18 17298 17573 hypothetical protein
LBC2_19 17716 18363 Cell wall-binding protein
LBC2_20 18452 20179 hypothetical protein
LBC2_21 20339 20929 hypothetical protein
LBC2_22 21010 22533 hypothetical protein
LBC2_23 22682 23101 hypothetical protein
LBC2_24 23148 23732 hypothetical protein
LBC2_25 23789 27664 Endo-beta-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.96)
LBC2_26 28092 27730 hypothetical protein
LBC2_27 28103 30052 Secretory antigen SsaA-like protein
LBC2_28 30091 31533 Glycerophosphoryl diester phosphodiesterase (EC 3.1.4.46), phage variant
LBC2_29 31589 32383 hypothetical protein
LBC2_30 32380 32913 hypothetical protein
LBC2_31 32924 33664 hypothetical protein
LBC2_32 33680 34726 Phage baseplate
LBC2_33 34742 36280 hypothetical protein
LBC2_34 36303 38915 Cell surface protein
LBC2_35 38928 39326 hypothetical protein
LBC2_36 39343 39522 hypothetical protein
LBC2_37 39662 40195 hypothetical protein
LBC2_38 40213 43635 Phage virulence-associated protein
LBC2_39 43660 43836 hypothetical protein
LBC2_40 43921 45696 DNA helicase, phage-associated
LBC2_41 45816 46646 hypothetical protein
LBC2_42 46728 48506 hypothetical protein
LBC2_43 48565 49284 hypothetical protein
LBC2_44 49332 52076 DNA helicase, phage-associated
LBC2_45 52077 53159 Phage recombination exonuclease
LBC2_46 53259 53390 hypothetical protein
LBC2_47 53484 53714 hypothetical protein
LBC2_48 53689 55572 Phage recombination related exonuclease (EC 3.1.11.-)
LBC2_49 55569 56144 HNH homing endonuclease
LBC2_50 56145 56741 hypothetical protein
LBC2_51 56753 57814 Phage DNA primase/helicase
LBC2_52 57826 58083 hypothetical protein
LBC2_53 58167 58970 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase (EC 3.6.1.23), phage associated
LBC2_54 59241 59528 hypothetical protein
LBC2_55 59556 59930 hypothetical protein
LBC2_56 59961 60179 hypothetical protein
LBC2_57 60169 60735 hypothetical protein
LBC2_58 60807 62216 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), alpha subunit (EC 1.17.4.1)
LBC2_59 62337 62894 Phage-associated homing endonuclease
LBC2_60 63127 64029 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), alpha subunit (EC 1.17.4.1)
LBC2_61 64099 64218 hypothetical protein
LBC2_62 64321 64560 hypothetical protein
LBC2_63 64561 64851 hypothetical protein
LBC2_64 64865 65974 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), beta subunit (EC 1.17.4.1)
LBC2_65 65986 67113 Similarity
LBC2_66 67106 67558 hypothetical protein
LBC2_67 67542 67811 thioredoxin
LBC2_68 67826 68170 hypothetical protein
LBC2_69 68175 68399 hypothetical protein
LBC2_70 68396 68560 hypothetical protein
LBC2_71 68571 68810 hypothetical protein
LBC2_72 68903 70156 hypothetical protein
LBC2_73 70153 70944 hypothetical protein
LBC2_74 70931 71254 hypothetical protein
LBC2_75 71226 71426 hypothetical protein
LBC2_76 71511 71753 hypothetical protein
LBC2_77 71753 72106 hypothetical protein
LBC2_78 72126 72512 hypothetical protein
LBC2_79 72523 72756 hypothetical protein
LBC2_80 72773 73171 hypothetical protein
LBC2_81 73233 73640 hypothetical protein
LBC2_82 73751 75985 DNA polymerase I (EC 2.7.7.7), phage-associated
LBC2_83 76246 76821 HNH homing endonuclease
LBC2_84 76932 77912 DNA polymerase I (EC 2.7.7.7), phage-associated
LBC2_85 78100 78243 hypothetical protein
LBC2_86 78293 78826 hypothetical protein
LBC2_87 78837 79058 hypothetical protein
LBC2_88 79241 80497 hypothetical protein
LBC2_89 80560 80931 hypothetical protein
LBC2_90 81092 81472 HNH homing endonuclease
LBC2_91 81503 81721 hypothetical protein
LBC2_92 82003 83028 RecA protein
LBC2_93 83075 83434 hypothetical protein
LBC2_94 83671 84084 hypothetical protein
LBC2_95 84086 84226 hypothetical protein
LBC2_96 84283 84573 hypothetical protein
LBC2_97 84579 85061 hypothetical protein
LBC2_98 85179 86111 hypothetical protein
LBC2_99 86132 87439 hypothetical protein
LBC2_100 87440 88303 hypothetical protein
LBC2_101 88296 88670 hypothetical protein
LBC2_102 88670 89059 hypothetical protein
LBC2_103 89135 89395 hypothetical protein
LBC2_104 89463 89579 hypothetical protein
LBC2_105 89566 90129 hypothetical protein
LBC2_106 90194 90583 hypothetical protein
LBC2_107 90763 91482 hypothetical protein
LBC2_108 91488 92261 hypothetical protein
LBC2_109 92272 92772 hypothetical protein
LBC2_110 92732 93646 hypothetical protein
LBC2_111 94127 94822 hypothetical protein
LBC2_112 94834 95319 hypothetical protein
LBC2_113 95418 95594 hypothetical protein
LBC2_114 95610 96149 hypothetical protein
LBC2_115 96342 96533 hypothetical protein
LBC2_116 96535 96981 hypothetical protein
LBC2_117 97058 97855 hypothetical protein
LBC2_118 97981 98316 hypothetical protein
LBC2_119 98411 99328 RNA polymerase sporulation specific sigma factor SigF
LBC2_120 99395 99571 hypothetical protein
LBC2_121 99646 99822 hypothetical protein
LBC2_122 99822 99947 hypothetical protein
LBC2_123 100142 100405 hypothetical protein
LBC2_124 100390 101112 Metal-dependent hydrolases of the metallobeta-lactamase superfamily
LBC2_125 101145 101279 hypothetical protein
LBC2_126 101281 101451 hypothetical protein
LBC2_127 101453 101779 hypothetical protein
LBC2_128 101769 102920 hypothetical protein
LBC2_129 102934 103359 hypothetical protein
LBC2_130 103536 104603 hypothetical protein
LBC2_131 105307 104600 HNH homing endonuclease
LBC2_132 105382 105663 hypothetical protein
LBC2_133 105954 105781 hypothetical protein
LBC2_134 106026 106211 hypothetical protein
LBC2_135 106226 106738 hypothetical protein
LBC2_136 107219 106812 hypothetical protein
LBC2_137 107200 107865 hypothetical protein
LBC2_138 108596 107871 HNH homing endonuclease # Phage intron
LBC2_139 108785 111052 Cell division protein FtsK
LBC2_140 111199 111876 Exonuclease sbcC (EC 3.1.11.-)
LBC2_141 111995 112387 hypothetical protein
LBC2_142 112406 112918 hypothetical protein
LBC2_143 113092 113412 hypothetical protein
LBC2_144 113424 113648 hypothetical protein
LBC2_145 113641 113958 hypothetical protein
LBC2_146 113955 114158 hypothetical protein
LBC2_147 114258 114497 hypothetical protein
LBC2_148 114630 114899 hypothetical protein
LBC2_149 115108 115278 hypothetical protein
LBC2_150 115275 115577 hypothetical protein
LBC2_151 115577 115720 hypothetical protein
LBC2_152 115717 115983 hypothetical protein
LBC2_153 116120 116344 hypothetical protein
LBC2_154 116760 116617 hypothetical protein
LBC2_155 117246 117461 hypothetical protein
LBC2_156 117526 117753 hypothetical protein
LBC2_157 117809 118021 hypothetical protein
LBC2_158 118115 118240 hypothetical protein
LBC2_159 118374 118646 hypothetical protein
LBC2_160 118823 118972 hypothetical protein
LBC2_161 119059 119412 hypothetical protein
LBC2_162 119501 120376 hypothetical protein
LBC2_163 120480 120731 hypothetical protein
LBC2_164 120838 121032 hypothetical protein
LBC2_165 121146 121301 hypothetical protein
LBC2_166 121347 121541 hypothetical protein
LBC2_167 121629 121811 hypothetical protein
LBC2_168 121919 122098 hypothetical protein
LBC2_169 122167 122424 hypothetical protein
LBC2_170 122443 122622 hypothetical protein
LBC2_171 122623 122949 hypothetical protein
LBC2_172 123136 123336 hypothetical protein
LBC2_173 124745 125248 hypothetical protein
LBC2_174 125308 125475 hypothetical protein
LBC2_175 126723 125758 hypothetical protein
LBC2_176 126906 126736 hypothetical protein
LBC2_177 127372 127145 hypothetical protein
LBC2_178 127833 127369 hypothetical protein
LBC2_179 127949 127830 hypothetical protein
LBC2_180 128156 127962 hypothetical protein
LBC2_181 128329 128168 hypothetical protein
LBC2_182 128493 128329 hypothetical protein
LBC2_183 129127 128486 hypothetical protein
LBC2_184 129449 129213 hypothetical protein
LBC2_185 129652 129446 hypothetical protein
LBC2_186 129899 129729 hypothetical protein
LBC2_187 130155 129901 hypothetical protein
LBC2_188 131029 130157 hypothetical protein
LBC2_189 131225 131022 hypothetical protein
LBC2_190 131488 131228 hypothetical protein
LBC2_191 131904 131500 hypothetical protein
LBC2_192 132269 131904 hypothetical protein
LBC2_193 132912 132325 hypothetical protein
LBC2_194 133131 132979 hypothetical protein
LBC2_195 133747 133133 hypothetical protein
LBC2_196 134099 133899 hypothetical protein
LBC2_197 134388 134092 hypothetical protein
LBC2_198 134954 134454 Dihydrofolate reductase (EC 1.5.1.3)
LBC2_199 135587 135018 adenylate kinase and related kinases
LBC2_200 136498 135584 Thymidylate synthase (EC 2.1.1.45)
LBC2_201 136743 136537 hypothetical protein
LBC2_202 137532 136939 hypothetical protein
LBC2_203 138956 137535 hypothetical protein
LBC2_204 139935 139048 hypothetical protein
LBC2_205 141384 140011 Il-IS_2, transposase # fragment
LBC2_206 142232 141459 Adenine-specific methyltransferase (EC 2.1.1.72)
LBC2_207 142440 142261 hypothetical protein
LBC2_208 142778 142617 hypothetical protein
LBC2_209 143495 143010 hypothetical protein
LBC2_210 144237 143527 Phosphate starvation-inducible protein PhoH, predicted ATPase
LBC2_211 144648 144310 hypothetical protein
LBC2_212 145195 144641 hypothetical protein
LBC2_213 145945 145670 hypothetical protein
LBC2_214 146214 145942 hypothetical protein
LBC2_215 146511 146266 hypothetical protein
LBC2_216 147445 146564 N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase (EC 3.5.1.28)
LBC2_217 149037 147550 Nicotinamide phosphoribosyltransferase (EC 2.4.2.12)
LBC2_218 149905 149069 Phage ribose-phosphate pyrophosphokinase
LBC2_219 150857 149985 Phage terminase, large subunit
LBC2_220 151933 151007 hypothetical protein
LBC2_221 153086 152187 Phage terminase, large subunit
LBC2_222 153505 153086 hypothetical protein
LBC2_223 154306 153779 hypothetical protein
LBC2_224 154602 154309 hypothetical protein
LBC2_225 155012 155371 hypothetical protein
LBC2_226 155389 155709 hypothetical protein
LBC2_227 155722 155955 hypothetical protein
LBC2_228 156289 156032 hypothetical protein
LBC2_229 157320 156394 Phage antirepressor protein
염기서열을 바탕으로 데이터베이스와 상동성을 비교했을 때 유사도 상위 10위까지의 박테리오파지와 극히 부분적으로만 유사성이 있으므로, 박테리오파지 LBC2는 기보고된 박테리오파지와 유사성이 매우 낮은 신규 파지임을 확인할 수 있었다(도 10).
(3) 박테리오파지 LEC1
분리한 박테리오파지 LEC1의 염기서열 분석을 위하여 파지 유전자를 분리하였다. 순수분리된 박테리오파지 1 mL에 0.5 M EDTA(pH 8.0), 프로테이나아제(proteinase) K, SDS를 첨가하되, 시약을 첨가한 후의 농도가 각각 20 mM, 50 μg/mL, 0.5%가 되도록 하였다. 혼합된 용액은 2시간 동안 56℃로 온도를 유지하며 이후 상온에서 식혔다. 동량의 페놀을 넣고 3000 g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 상층액만을 얻어 PCI(phenol-chloroform-isoamylalcohol)를 다시 한 번 처리하고, 동일한 조건의 원심분리를 수행하였다. 위에서 획득한 상층액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 원심분리하였다. 이 과정을 반복하고 95% 에탄올 1 mL과 3 M 소디움 아세테이트(Sodium acetate, pH 5.2)를 100 μL 첨가하여 -80℃에서 DNA를 침전시킨 뒤 15분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올을 첨가하여 한번 더 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고 DNA를 건조시킨 후, 증류수에 DNA를 녹였다.
순수 분리된 총 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 박테리오파지 LEC1의 염기서열은 총 168,610bp (서열번호 3) 크기이며, 상기 염기서열은 서열번호 3에 나타내었다. 결정된 염기서열을 'RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology)' 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분석한 결과, LEC1의 유전체(genome)에서 267개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORFs)과 2개의 tRNA가 예측되었고, 이중 123개의 ORF는 아직 기능이 밝혀지지 않은 가정적인 단백질(hypothetical protein)로 판단된다.
144개의 ORF는 크게 대사(metabolism), 패키징(packaging), 구조(sturcutre), 용균 (lysis) 등의 4개의 집단으로 나뉠 수 있다. 숙주 특이성을 결정하는 꼬리 섬유 단백질(tail fiber protein)은 알려진 다른 단백질과 매우 낮은 상동성을 보여 LEC1의 강한 숙주 특이성을 뒷받침할 수 있고, 박테리오파지를 용원상태로 유지시키는 인테그레이즈(integrase)나 리프레서(repressor) 등은 예측되지 않았으므로 LEC1이 용균성 파지임을 재확인하였다. LEC1의 유전자의 추정되는 기능은 하기 표 3에 나타내었다.
로커스 태그(Locus tag) 시작 종결 기능
LEC1_1 176 463 Hypothetical protein
LEC1_2 480 956 Phage endonuclease
LEC1_3 1025 1288 Hypothetical protein
LEC1_4 1539 1739 Hypothetical protein
LEC1_5 1816 2262 Hypothetical protein
LEC1_6 2315 2461 Acridine resistance
LEC1_7 2606 3931 DNA topoisomerase, phage-associated
LEC1_8 4117 4749 Phage transcriptional regulator of middle promoters
LEC1_9 4760 5089 Phage anti-restriction nuclease
LEC1_10 5086 5547 Phage anti-restriction nuclease
LEC1_11 5547 5828 Phage anti-restriction nuclease
LEC1_12 5815 6039 Phage anti-restriction nuclease
LEC1_13 6005 6124 Hypothetical protein
LEC1_14 6114 6413 Hypothetical protein
LEC1_15 6403 6594 Hypothetical protein
LEC1_16 6641 6913 Phage anti-sigma factor
LEC1_17 7573 6914 Phage holin
LEC1_18 8398 7619 Phage tail fibers
LEC1_19 11735 8430 Phage tail fibers
LEC1_20 12400 11744 Phage tail connector protein
LEC1_21 13584 12460 Phage tail connector protein
LEC1_22 17426 13593 Phage long tail fiber proximal subunit
LEC1_23 17547 18464 Phage ribonuclease H (EC 3.1.26.4)
LEC1_24 18472 18741 Phage double-stranded DNA binding protein #T4-like dsbA, late transcriptional regulation #T4 GC1668
LEC1_25 18719 19057 Transcriptional regulator
LEC1_26 19069 19707 Phage DNA helicase loader
LEC1_27 19825 20727 Single stranded DNA-binding protein, phage-associated
LEC1_28 20841 21233 Hypothetical protein
LEC1_29 21295 21543 Hypothetical protein
LEC1_30 21546 22133 Dihydrofolate reductase, phage-associated
LEC1_31 22130 22477 Hypothetical protein
LEC1_32 22493 23353 Thymidylate synthase (EC 2.1.1.45)
LEC1_33 23354 23608 Hypothetical protein
LEC1_34 23696 25951 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), alpha subunit (EC 1.17.4.1)
LEC1_35 26005 27183 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), beta subunit (EC 1.17.4.1)
LEC1_36 27210 27620 Phage endonuclease
LEC1_37 27675 28799 RNA ligase, phage-associated #T4-like RnlA #T4 GC1653
LEC1_38 28862 29362 Phage alc transcription terminator
LEC1_39 29350 29706 Phage spanin Rz
LEC1_40 29703 29993 Phage outer membrane lipoprotein Rz1
LEC1_41 29990 30208 Hypothetical protein
LEC1_42 30266 30565 Hypothetical protein
LEC1_43 30565 30756 Hypothetical protein
LEC1_44 30753 31652 3'-phosphatase, 5'-polynucleotide kinase, phage-associated
LEC1_45 31652 31843 Hypothetical protein
LEC1_46 31824 32048 Hypothetical protein
LEC1_47 32056 32331 Hypothetical protein
LEC1_48 32389 32625 Hypothetical protein
LEC1_49 32612 32737 hypothetical protein
LEC1_50 32746 33738 2-keto-3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase I alpha (EC 2.5.1.54)
LEC1_51 33738 34319 dCMP deaminase (EC 3.5.4.12); Late competence protein ComEB
LEC1_52 34321 34617 Phage tail fibers
LEC1_53 34675 35007 Phage head assembly chaperone protein
LEC1_54 35132 35380 Phage rIII lysis inhibitor accessory
LEC1_55 35649 35828 Hypothetical protein
LEC1_56 35959 36324 Hypothetical protein
LEC1_57 36333 36452 hypothetical protein
LEC1_58 36412 36654 Hypothetical protein
LEC1_59 36707 36847 Hypothetical protein
LEC1_60 36849 37067 Hypothetical protein
LEC1_61 37515 38345 Hypothetical protein
LEC1_62 38355 38624 Hypothetical protein
LEC1_63 38621 40114 DNA ligase, phage-associated
LEC1_64 40114 40302 Hypothetical protein
LEC1_65 40358 42445 RNA polymerase-ADP-ribosyltransferase Alt
LEC1_66 42504 42797 Hypothetical protein
LEC1_67 43792 42830 Phage baseplate tail tube initiator
LEC1_68 44901 43792 Phage baseplate tail tube cap (T4-like gp48)
LEC1_69 46682 44910 Phage baseplate hub
LEC1_70 47149 46679 Phage baseplate hub
LEC1_71 48332 47160 Phage baseplate hub subunit
LEC1_72 49081 48329 Phage baseplate
LEC1_73 49129 49755 Phage baseplate hub assembly chaperone (T4-like gp26)
LEC1_74 49755 50153 Phage baseplate wedge subunit (T4-like gp25)
LEC1_75 50177 50647 Single stranded DNA-binding protein, phage-associated
LEC1_76 50647 50871 Hypothetical protein
LEC1_77 50904 51071 Hypothetical protein
LEC1_78 51363 51130 DNA helicase, phage-associated
LEC1_79 52903 51389 DNA helicase, phage-associated
LEC1_80 52954 53622 Inh inhibitor of gp21 prohead protease
LEC1_81 53632 54762 Phage capsid and scaffold
LEC1_82 54861 55055 Hypothetical protein
LEC1_83 55052 55303 Hypothetical protein
LEC1_84 55420 56418 RNA ligase, phage-associated
LEC1_85 57731 56448 Phage capsid vertex
LEC1_86 57832 58101 Hypothetical protein
LEC1_87 59722 58154 Phage major capsid protein
LEC1_88 60552 59740 Phage prohead assembly (scaffolding) protein
LEC1_89 61227 60586 Phage prohead assembly (scaffolding) protein
LEC1_90 61652 61227 Phage capsid and scaffold
LEC1_91 61879 61652 Phage prohead core protein
LEC1_92 63450 61879 Phage portal vertex of the head
LEC1_93 64026 63535 Phage tail fibers
LEC1_94 66122 64140 Phage tail sheath monomer
LEC1_95 67988 66153 Phage terminase, large subunit
LEC1_96 68466 67972 Phage terminase, small subunit
LEC1_97 69252 68476 Proximal tail sheath stabilization protein
LEC1_98 70114 69350 T4-like phage head completion, neck hetero-dimeric protein (T4-like gp14)
LEC1_99 71042 70116 T4-like phage head completion, neck hetero-dimeric protein (T4-like gp13)
LEC1_100 72517 71075 Phage neck whiskers
LEC1_101 74077 72527 Phage short tail fiber protein #T4-like phage Gp12
LEC1_102 74733 74074 Phage baseplate wedge subunit and tail pin (T4-like gp11)
LEC1_103 76547 74733 Phage baseplate wedge subunit and tail pin (T4-like gp10)
LEC1_104 77410 76547 Phage baseplate wedge tail fiber connector (T4-like gp9)
LEC1_105 78477 77473 Phage baseplate wedge subunit (T4-like gp8)
LEC1_106 81568 78470 Phage baseplate wedge subunit
LEC1_107 83535 81565 Phage baseplate wedge subunit (T4-like gp6)
LEC1_108 83837 83544 Phospholipase
LEC1_109 84313 83840 Hypothetical protein
LEC1_110 86038 84359 T4-like phage baseplate hub + tail lysozyme
LEC1_111 86667 86092 Phage baseplate wedge subunit
LEC1_112 86729 87178 Phage head completion protein
LEC1_113 87181 88002 Phage DNA end protector during packaging
LEC1_114 88105 88689 Phage tail completion protein
LEC1_115 88744 89478 Deoxynucleotide monophosphate kinase (EC 2.7.4.13)
LEC1_116 89483 89713 Phage tail fiber assembly protein
LEC1_117 89713 90168 T4-like Hypothetical protein, T4 GC1584
LEC1_118 90246 90533 Hypothetical protein
LEC1_119 90599 90862 Hypothetical protein
LEC1_120 90932 91117 Hypothetical protein
LEC1_121 91119 91481 Hypothetical protein
LEC1_122 91478 91768 Hypothetical protein
LEC1_123 91773 92072 Hypothetical protein
LEC1_rna.1 92368 92441 tRNA-Met-CAT
LEC1_rna.2 92448 92524 tRNA-Arg-TCT
LEC1_124 92543 92887 Hypothetical protein
LEC1_125 93275 93739 Hypothetical protein
LEC1_126 93978 94241 Hypothetical protein
LEC1_127 94299 94604 Hypothetical protein
LEC1_128 94673 94837 Hypothetical protein
LEC1_129 94890 95117 Hypothetical protein
LEC1_130 95188 95781 Hypothetical protein
LEC1_131 95831 96433 Hypothetical protein
LEC1_132 96402 96797 Hypothetical protein
LEC1_133 96776 97135 Hypothetical protein
LEC1_134 97132 97437 Hypothetical protein
LEC1_135 97447 97719 Hypothetical protein
LEC1_136 97729 97926 Hypothetical protein
LEC1_137 97989 98228 Hypothetical protein
LEC1_138 98257 99213 Hypothetical protein
LEC1_139 99284 99589 Hypothetical protein
LEC1_140 99591 100277 Hypothetical protein
LEC1_141 100359 100757 Hypothetical protein
LEC1_142 100754 101212 Nudix hydrolase, phage-associated
LEC1_143 101247 101735 Phage lysozyme
LEC1_144 101732 102013 Hypothetical protein
LEC1_145 102072 102485 Phage endonuclease
LEC1_146 102498 102752 Hypothetical protein
LEC1_147 102816 103130 Hypothetical protein
LEC1_148 103157 103735 Hypothetical protein
LEC1_149 103947 104450 Hypothetical protein
LEC1_150 104447 104755 Hypothetical protein
LEC1_151 104762 105124 Pyruvate formate-lyase (EC 2.3.1.54)
LEC1_152 105124 105348 Hypothetical protein
LEC1_153 105338 105604 Hypothetical protein
LEC1_154 105604 105819 Hypothetical protein
LEC1_155 105881 106339 Endoribonuclease, RegB protein
LEC1_156 106348 106890 T4-like Hypothetical protein, T4 GC1559
LEC1_157 106887 107234 Valyl-tRNA synthetase
LEC1_158 107314 107694 Hypothetical protein
LEC1_159 107691 107903 Hypothetical protein
LEC1_160 107900 108106 Hypothetical protein
LEC1_161 108103 108285 Hypothetical protein
LEC1_162 108295 108876 Thymidine kinase (EC 2.7.1.21)
LEC1_163 108904 109116 Hypothetical protein
LEC1_164 109159 109431 Phage rI lysis inhibition regulator
LEC1_165 109499 110056 Hypothetical protein
LEC1_166 110156 110335 Hypothetical protein
LEC1_167 110343 110507 Hypothetical protein
LEC1_168 110599 110814 hypothetical protein
LEC1_169 110860 110982 hypothetical protein
LEC1_170 110979 111158 Hypothetical protein
LEC1_171 111160 111690 Hypothetical protein
LEC1_172 111700 112173 Hypothetical protein
LEC1_173 112173 112727 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_174 112708 113151 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_175 113256 113474 Hypothetical protein
LEC1_176 113544 114479 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_177 114664 114951 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_178 115010 115537 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_179 115600 116595 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_180 116651 117610 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_181 117674 118627 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_182 118627 118932 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_183 118932 119345 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_184 119338 119601 Thioredoxin, phage-associated
LEC1_185 119598 119894 Hypothetical protein
LEC1_186 119913 120269 Hypothetical protein
LEC1_187 120241 120408 Hypothetical protein
LEC1_188 120398 120568 Hypothetical protein
LEC1_189 120570 120992 Pin protease inhibitor
LEC1_190 121028 121501 Phage endonuclease #T4-like phage gp49, endonuclease VII #T4 GC1525
LEC1_191 121498 123315 Ribonucleotide reductase of class III (anaerobic), large subunit (EC 1.17.4.2)
LEC1_192 123312 123782 Ribonucleotide reductase of class III (anaerobic), activating protein (EC 1.97.1.4)
LEC1_193 123897 124112 Hypothetical protein
LEC1_194 124115 124432 Hypothetical protein
LEC1_195 124398 124721 Glutaredoxin
LEC1_196 124887 125135 Hypothetical protein
LEC1_197 125143 125436 Hypothetical protein
LEC1_198 125444 125578 Hypothetical protein
LEC1_199 125575 125775 Hypothetical protein
LEC1_200 125839 126078 Hypothetical protein
LEC1_201 126145 126477 Hypothetical protein
LEC1_202 126474 126701 Hypothetical protein
LEC1_203 126698 126967 Hypothetical protein
LEC1_204 127040 127597 T4-like phage RNA polymerase sigma factor for late transcription
LEC1_205 127587 127796 Hypothetical protein
LEC1_206 127798 128121 Hypothetical protein
LEC1_207 128105 128305 Hypothetical protein
LEC1_208 128360 128518 Hypothetical protein
LEC1_209 128592 129611 Phage recombination-related endonuclease Gp47
LEC1_210 129608 129865 Hypothetical protein
LEC1_211 129852 130091 Hypothetical protein
LEC1_212 130088 131776 Phage recombination-related endonuclease Gp46
LEC1_213 131831 132019 Hypothetical protein
LEC1_214 132032 132448 RNA polymerase, phage-associated
LEC1_215 132491 133177 Sliding clamp DNA polymerase accessory protein, phage associated
LEC1_216 133253 134215 Replication factor C small subunit / Phage DNA polymerase clamp loader subunit
LEC1_217 134217 134777 Phage DNA polymerase clamp loader subunit Gp62
LEC1_218 134780 135148 Phage endoribonulcease translational repressor of early genes, regA
LEC1_219 135230 137941 DNA polymerase (EC 2.7.7.7), phage-associated
LEC1_220 137982 138617 Arabinose 5-phosphate isomerase (EC 5.3.1.13)
LEC1_221 138614 138757 Hypothetical protein
LEC1_222 138799 140484 Hypothetical protein
LEC1_223 140484 140870 Hypothetical protein
LEC1_224 140928 142088 Predicted protease of the collagenase family
LEC1_225 142085 142270 Hypothetical protein
LEC1_226 142366 143082 Deoxycytidylate 5-hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.8)
LEC1_227 143082 143981 Hypothetical protein
LEC1_228 143983 144531 Hypothetical protein
LEC1_229 144631 145803 Phage recombination protein
LEC1_230 145796 146137 Phage capsid and scaffold
LEC1_231 146147 147589 DNA primase/helicase, phage-associated
LEC1_232 147677 148051 Hypothetical protein
LEC1_233 148107 148424 Hypothetical protein
LEC1_234 148421 148609 discriminator of mRNA degradation, phage-associated
LEC1_235 148681 149049 Phage immunity
LEC1_236 149111 149359 Phage immunity
LEC1_237 149423 149716 Sp spackle periplasmic protein
LEC1_238 149718 150368 Hypothetical protein
LEC1_239 150370 150567 Hypothetical protein
LEC1_240 150587 151054 Hypothetical protein
LEC1_241 151094 152116 DNA primase (EC 2.7.7.-) / DNA helicase (EC 3.6.1.-), phage-associated
LEC1_242 152310 152113 Hypothetical protein
LEC1_243 152401 152922 dCTP pyrophosphatase (EC 3.6.1.12), phage-associated
LEC1_244 152968 153204 Phage capsid and scaffold
LEC1_245 153309 153536 Hypothetical protein
LEC1_246 153502 153750 Hypothetical protein
LEC1_247 153811 153927 Hypothetical protein
LEC1_248 153927 154391 Hypothetical protein
LEC1_249 154408 154572 Molybdenum ABC transporter, periplasmic molybdenum-binding protein ModA (TC 3.A.1.8.1)
LEC1_250 154569 154733 Hypothetical protein
LEC1_251 154920 155528 NAD--protein ADP-ribosyltransferase modA (EC 2.4.2.-)
LEC1_252 155681 156427 Phage anti-termination
LEC1_253 156430 156741 Hypothetical protein
LEC1_254 156738 158051 DNA helicase (EC 3.6.1.-), phage-associated
LEC1_255 158061 158738 T4-like phage DexA exonuclease A
LEC1_256 158806 159297 Transcriptional regulator
LEC1_257 159358 159813 Transcriptional regulator
LEC1_258 159823 160242 Transcriptional regulator
LEC1_259 160302 160826 Transcriptional regulator
LEC1_260 160884 161111 cef modifier of suppressor tRNAs, phage-associated
LEC1_261 161111 161521 Hypothetical protein
LEC1_262 161524 161703 Hypothetical protein
LEC1_263 161706 162131 Hypothetical protein
LEC1_264 162195 164012 Topoisomerase IV subunit B (EC 5.99.1.-)
LEC1_265 164055 165155 Hypothetical protein
LEC1_266 165248 165448 Phage rIIA lysis inhibitor
LEC1_267 165461 167674 Phage rIIA lysis inhibitor
(4) 박테리오파지 LEC2
분리한 박테리오파지 LEC2의 염기서열 분석을 위하여 파지 유전자를 분리하였다. 순수 분리된 박테리오파지 1 mL에 0.5 M EDTA(pH 8.0), 프로테이나아제(proteinase) K, SDS를 첨가하되, 시약을 첨가한 후의 농도가 각각 20 mM, 50μg/mL, 0.5%가 되도록 하였다. 혼합된 용액은 2시간 동안 56℃로 온도를 유지하며 이후 상온에서 식혔다. 동량의 페놀을 넣고 3000 g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 상층액만을 얻어 PCI(phenol-chloroform-isoamylalcohol)를 다시 한 번 처리하고, 동일한 조건의 원심분리를 수행하였다. 위에서 획득한 상층액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 원심분리하였다. 이 과정을 반복하고 95% 에탄올 1 mL과 3 M 소디움 아세테이트(Sodium acetate, pH 5.2)를 100 μL 첨가하여 -80℃에서 DNA를 침전시킨 뒤 15분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올을 첨가하여 한번 더 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고 DNA를 건조시킨 후, 증류수에 DNA를 녹였다.
순수 분리된 총 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 박테리오파지 LEC2의 염기서열은 총 167,756bp (서열번호 4) 크기이며, 상기 염기서열은 서열번호 4에 나타내었다. 결정된 염기서열을 'RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology)' 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분석한 결과, LEC2의 유전체(genome)에서 269개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORFs)과 11개의 tRNA가 예측되었고, 이중 113개의 ORF는 아직 기능이 밝혀지지 않은 가정적인 단백질(hypothetical protein)로 판단된다.
156개의 ORF는 크게 대사(metabolism), 패키징(packaging), 구조(sturcutre), 용균 (lysis) 등의 4개의 집단으로 나뉠 수 있다. 박테리오파지를 용원상태로 유지시키는 인테그레이즈(integrase)나 리프레서(repressor) 등은 예측되지 않았으므로 LEC2이 용균성 파지임을 재확인하였다. LEC2의 유전자의 추정되는 기능은 하기 표 4에 나타내었다.
로커스 태그(Locus tag) 시작 종결 기능
LEC2_1 1156 539 Phage-associated homing endonuclease
LEC2_2 1206 1886 Inh inhibitor of gp21 prohead protease
LEC2_3 1896 3026 Phage capsid and scaffold
LEC2_4 3146 3331 Hypothetical protein
LEC2_5 3318 3596 Hypothetical protein
LEC2_6 3606 4610 RNA ligase, phage-associated
LEC2_7 5923 4640 Phage capsid vertex
LEC2_8 7572 6007 Phage major capsid protein
LEC2_9 8400 7591 Phage prohead assembly (scaffolding) protein
LEC2_10 9069 8431 Phage prohead assembly (scaffolding) protein
LEC2_11 9494 9069 Phage capsid and scaffold
LEC2_12 9730 9494 Phage prohead core protein
LEC2_13 11304 9730 Phage portal vertex of the head
LEC2_14 11879 11388 Phage tail fibers
LEC2_15 12604 11987 hypothetical protein
LEC2_16 14623 12644 Phage tail sheath monomer
LEC2_17 16487 14655 Phage terminase, large subunit
LEC2_18 16965 16471 Phage terminase, small subunit
LEC2_19 17792 16974 Proximal tail sheath stabilization protein
LEC2_20 18604 17834 T4-like phage head completion, neck hetero-dimeric protein (T4-like gp14)
LEC2_21 19535 18606 T4-like phage head completion, neck hetero-dimeric protein (T4-like gp13)
LEC2_22 21024 19567 Phage neck whiskers
LEC2_23 22584 21034 Phage short tail fiber protein #T4-like phage Gp12
LEC2_24 23240 22581 Phage baseplate wedge subunit and tail pin (T4-like gp11)
LEC2_25 25045 23240 Phage baseplate wedge subunit and tail pin (T4-like gp10)
LEC2_26 25911 25045 Phage baseplate wedge tail fiber connector (T4-like gp9)
LEC2_27 26979 25975 Phage baseplate wedge subunit (T4-like gp8)
LEC2_28 29827 26972 Phage baseplate wedge subunit
LEC2_29 32049 30067 Phage baseplate wedge subunit (T4-like gp6)
LEC2_30 32351 32058 Phospholipase
LEC2_31 32888 32352 Hypothetical protein
LEC2_32 34608 32881 T4-like phage baseplate hub + tail lysozyme
LEC2_33 35182 34592 Phage baseplate wedge subunit
LEC2_34 35230 35682 Phage head completion protein
LEC2_35 35682 36506 Phage DNA end protector during packaging
LEC2_36 36613 37143 Phage tail completion protein
LEC2_37 37193 37906 Deoxynucleotide monophosphate kinase (EC 2.7.4.13)
LEC2_38 37906 38136 Phage tail fiber assembly protein
LEC2_39 38136 38591 T4-like Hypothetical protein, T4 GC1584
LEC2_40 38665 38922 Hypothetical protein
LEC2_41 39002 39235 hypothetical protein
LEC2_42 39294 39479 Hypothetical protein
LEC2_43 39479 39877 Hypothetical protein
LEC2_44 39880 40167 Hypothetical protein
LEC2_rna.1 40265 40337 tRNA-Gln-TTG
LEC2_rna.2 40339 40425 tRNA-Leu-TAA
LEC2_rna.3 40431 40504 tRNA-Gly-TCC
LEC2_rna.4 40515 40588 tRNA-Pro-TGG
LEC2_rna.5 40591 40680 tRNA-Ser-TGA
LEC2_rna.6 40686 40761 tRNA-Thr-TGT
LEC2_rna.7 40763 40837 tRNA-Met-CAT
LEC2_rna.8 40851 40937 tRNA-Tyr-GTA
LEC2_rna.9 40942 41016 tRNA-Asn-GTT
LEC2_rna.10 41130 41205 tRNA-His-GTG
LEC2_rna.11 41210 41285 tRNA-Arg-TCT
LEC2_45 41302 41652 Hypothetical protein
LEC2_46 42037 42510 Hypothetical protein
LEC2_47 42753 43016 Hypothetical protein
LEC2_48 43073 43591 Hypothetical protein
LEC2_49 43635 44228 Hypothetical protein
LEC2_50 44276 44878 Hypothetical protein
LEC2_51 44991 45239 Hypothetical protein
LEC2_52 45580 46020 Nudix hydrolase, phage-associated
LEC2_53 46057 46551 T4-like phage baseplate hub + tail lysozyme
LEC2_54 46646 47119 Hypothetical protein
LEC2_55 47261 47800 Hypothetical protein
LEC2_56 47962 48126 Hypothetical protein
LEC2_57 48133 48495 Pyruvate formate-lyase (EC 2.3.1.54)
LEC2_58 48495 48716 Hypothetical protein
LEC2_59 48709 48975 Hypothetical protein
LEC2_60 48975 49253 Hypothetical protein
LEC2_61 49313 49774 Endoribonuclease, RegB protein
LEC2_62 49782 50327 T4-like Hypothetical protein, T4 GC1559
LEC2_63 50320 50667 Valyl-tRNA synthetase
LEC2_64 50664 51131 Hypothetical protein
LEC2_65 51128 51340 Hypothetical protein
LEC2_66 51337 51543 Hypothetical protein
LEC2_67 51540 51713 Hypothetical protein
LEC2_68 51710 51895 Hypothetical protein
LEC2_69 51892 52080 Hypothetical protein
LEC2_70 52082 52663 Thymidine kinase (EC 2.7.1.21)
LEC2_71 52706 52918 Hypothetical protein
LEC2_72 52931 53224 Phage rI lysis inhibition regulator
LEC2_73 53287 53607 Hypothetical protein
LEC2_74 53703 53891 Hypothetical protein
LEC2_75 53891 54094 Hypothetical protein
LEC2_76 54097 54291 Hypothetical protein
LEC2_77 54281 54454 Hypothetical protein
LEC2_78 54646 55188 Hypothetical protein
LEC2_79 55195 55716 Hypothetical protein
LEC2_80 55725 56186 Hypothetical protein
LEC2_81 56186 57196 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_82 57314 58282 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_83 58279 58998 Phage-associated homing endonuclease
LEC2_84 59081 59383 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_85 59444 59971 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_86 60028 60432 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_87 60444 61331 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_88 61340 62362 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_89 62420 63421 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_90 63474 64403 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_91 64400 64789 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_92 64792 65034 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_93 65036 65299 Thioredoxin, phage-associated
LEC2_94 65296 65511 Hypothetical protein
LEC2_95 65514 65684 Hypothetical protein
LEC2_96 65656 65823 Hypothetical protein
LEC2_97 65807 66292 Pin protease inhibitor
LEC2_98 66329 66505 Hypothetical protein
LEC2_99 66548 67021 Phage endonuclease #T4-like phage gp49, endonuclease VII #T4 GC1525
LEC2_100 67018 67464 Ribonucleotide reductase of class III (anaerobic), large subunit (EC 1.17.4.2)
LEC2_101 67433 68836 Ribonucleotide reductase of class III (anaerobic), large subunit (EC 1.17.4.2)
LEC2_102 68925 69659 Phage-associated homing endonuclease
LEC2_103 69734 70126 Ribonucleotide reductase of class III (anaerobic), activating protein (EC 1.97.1.4)
LEC2_104 70119 70232 Hypothetical protein
LEC2_105 70241 70453 Hypothetical protein
LEC2_106 70456 70764 Glutaredoxin
LEC2_107 70922 71098 Hypothetical protein
LEC2_108 71091 71384 Hypothetical protein
LEC2_109 71392 71523 Hypothetical protein
LEC2_110 71524 71724 Hypothetical protein
LEC2_111 71777 72103 Hypothetical protein
LEC2_112 72106 72321 Hypothetical protein
LEC2_113 72318 72587 Hypothetical protein
LEC2_114 72668 73225 T4-like phage RNA polymerase sigma factor for late transcription
LEC2_115 73239 73427 Hypothetical protein
LEC2_116 73429 73746 Hypothetical protein
LEC2_117 73715 73918 Hypothetical protein
LEC2_118 73922 74095 Hypothetical protein
LEC2_119 74162 75364 a-gt alpha glucosyl transferase
LEC2_120 75541 76560 Phage recombination-related endonuclease Gp47
LEC2_121 76557 76820 Hypothetical protein
LEC2_122 76801 77007 Hypothetical protein
LEC2_123 77004 77858 Phage-associated homing endonuclease
LEC2_124 77874 79556 Phage recombination-related endonuclease Gp46
LEC2_125 79612 79800 Hypothetical protein
LEC2_126 79810 80199 RNA polymerase, phage-associated
LEC2_127 80255 80941 Sliding clamp DNA polymerase accessory protein, phage associated
LEC2_128 80991 81950 Replication factor C small subunit / Phage DNA polymerase clamp loader subunit
LEC2_129 81952 82515 Phage DNA polymerase clamp loader subunit Gp62
LEC2_130 82517 82885 Phage endoribonulcease translational repressor of early genes, regA
LEC2_131 82964 85660 DNA polymerase (EC 2.7.7.7), phage-associated
LEC2_132 85844 86080 hypothetical protein
LEC2_133 86091 86471 Phage immunity
LEC2_134 86479 86730 Phage immunity
LEC2_135 86884 87624 Deoxycytidylate 5-hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.8)
LEC2_136 87615 88103 hypothetical protein
LEC2_137 88252 89094 Glucosyl transferase
LEC2_138 89172 90353 Phage recombination protein
LEC2_139 90346 90690 Phage capsid and scaffold
LEC2_140 90700 92127 DNA primase/helicase, phage-associated
LEC2_141 92186 92368 discriminator of mRNA degradation, phage-associated
LEC2_142 92370 92627 Hypothetical protein
LEC2_143 92688 92981 Sp spackle periplasmic protein
LEC2_144 92994 93350 Hypothetical protein
LEC2_145 93352 93516 Hypothetical protein
LEC2_146 93519 94547 DNA primase (EC 2.7.7.-) / DNA helicase (EC 3.6.1.-), phage-associated
LEC2_147 94744 94544 Hypothetical protein
LEC2_148 94816 95334 dCTP pyrophosphatase (EC 3.6.1.12), phage-associated
LEC2_149 95403 95645 Phage capsid and scaffold
LEC2_150 95742 95948 Hypothetical protein
LEC2_151 95948 96289 Hypothetical protein
LEC2_152 96298 96783 Hypothetical protein
LEC2_153 96758 96961 Srh transcription modulator
LEC2_154 96958 97122 Molybdenum ABC transporter, periplasmic molybdenum-binding protein ModA (TC 3.A.1.8.1)
LEC2_155 97115 97585 Molybdenum ABC transporter, periplasmic molybdenum-binding protein ModA (TC 3.A.1.8.1)
LEC2_156 97594 97776 Molybdenum ABC transporter, periplasmic molybdenum-binding protein ModA (TC 3.A.1.8.1)
LEC2_157 97844 98467 NAD--protein ADP-ribosyltransferase modA (EC 2.4.2.-)
LEC2_158 98464 99066 NAD--protein ADP-ribosyltransferase modA (EC 2.4.2.-)
LEC2_159 99192 99947 Phage anti-termination
LEC2_160 99949 100260 Hypothetical protein
LEC2_161 100257 101576 DNA helicase (EC 3.6.1.-), phage-associated
LEC2_162 101598 101843 Phage exonuclease
LEC2_163 101836 102078 Phage exonuclease
LEC2_164 102078 102761 T4-like phage DexA exonuclease A
LEC2_165 102825 103325 Transcriptional regulator
LEC2_166 103328 103870 Transcriptional regulator
LEC2_167 103947 104444 Transcriptional regulator
LEC2_168 104542 104811 Hypothetical protein
LEC2_169 104825 105040 cef modifier of suppressor tRNAs, phage-associated
LEC2_170 105040 105459 Hypothetical protein
LEC2_171 105462 105638 Hypothetical protein
LEC2_172 105641 106012 Hypothetical protein
LEC2_173 106018 106278 Hypothetical protein
LEC2_174 106348 108165 DNA gyrase subunit B (EC 5.99.1.3)
LEC2_175 108220 108423 Phage rIIA lysis inhibitor
LEC2_176 108434 110611 Phage rIIA lysis inhibitor
LEC2_177 110623 111561 Phage rIIB lysis inhibitor
LEC2_178 111590 111784 putative protein
LEC2_179 111966 112151 Hypothetical protein
LEC2_180 112165 112641 Phage endonuclease
LEC2_181 112716 112979 Hypothetical protein
LEC2_182 113126 113239 hypothetical protein
LEC2_183 113344 113541 Hypothetical protein
LEC2_184 113523 113648 Hypothetical protein
LEC2_185 113657 113872 Hypothetical protein
LEC2_186 113932 114387 Hypothetical protein
LEC2_187 114771 116099 DNA topoisomerase, phage-associated
LEC2_188 116096 116245 Transcriptional regulator
LEC2_189 116373 117008 Phage transcriptional regulator of middle promoters
LEC2_190 117019 117348 Phage anti-restriction nuclease
LEC2_191 117345 117500 Hypothetical protein
LEC2_192 117497 117964 Phage anti-restriction nuclease
LEC2_193 117964 118260 Phage anti-restriction nuclease
LEC2_194 118437 118556 Hypothetical protein
LEC2_195 118546 118824 Phage anti-restriction nuclease
LEC2_196 118821 118973 Phage anti-sigma factor
LEC2_197 118986 119258 Phage anti-sigma factor
LEC2_198 119915 119259 Phage holin
LEC2_199 120722 119946 Phage tail fibers
LEC2_200 124065 120754 Phage tail fibers
LEC2_201 124730 124074 Phage tail fibers
LEC2_202 125908 124793 Phage tail connector protein
LEC2_203 129786 125917 Phage long tail fiber proximal subunit
LEC2_204 129891 130808 Phage ribonuclease H (EC 3.1.26.4)
LEC2_205 130817 131086 Phage double-stranded DNA binding protein #T4-like dsbA, late transcriptional regulation #T4 GC1668
LEC2_206 131064 131402 Transcriptional regulator
LEC2_207 131399 132052 Phage DNA helicase loader
LEC2_208 132152 133060 Single stranded DNA-binding protein, phage-associated
LEC2_209 133206 133436 Hypothetical protein
LEC2_210 133480 133866 Hypothetical protein
LEC2_211 133868 134128 Hypothetical protein
LEC2_212 134189 134431 Hypothetical protein
LEC2_213 134442 134801 Hypothetical protein
LEC2_214 134798 135043 Hypothetical protein
LEC2_215 135043 135627 Dihydrofolate reductase, phage-associated
LEC2_216 135647 135994 Hypothetical protein
LEC2_217 136040 136591 Thymidylate synthase (EC 2.1.1.45)
LEC2_218 136720 137457 Phage-associated homing endonuclease
LEC2_219 137713 137916 Thymidylate synthase (EC 2.1.1.45)
LEC2_220 137940 138203 Hypothetical protein
LEC2_221 138157 138483 Hypothetical protein
LEC2_222 138474 140738 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), alpha subunit (EC 1.17.4.1)
LEC2_223 140790 141968 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), beta subunit (EC 1.17.4.1)
LEC2_224 141996 142406 Phage endonuclease
LEC2_225 142459 143583 RNA ligase, phage-associated #T4-like RnlA #T4 GC1653
LEC2_226 143648 144151 Phage alc transcription terminator
LEC2_227 144142 144495 Phage spanin Rz
LEC2_228 144492 144791 Phage outer membrane lipoprotein Rz1
LEC2_229 144788 145018 Hypothetical protein
LEC2_230 145015 145317 Hypothetical protein
LEC2_231 145314 146219 3'-phosphatase, 5'-polynucleotide kinase, phage-associated
LEC2_232 146219 146416 Hypothetical protein
LEC2_233 146409 146609 Hypothetical protein
LEC2_234 146612 146887 Hypothetical protein
LEC2_235 146951 147478 Hypothetical protein
LEC2_236 147472 147708 Hypothetical protein
LEC2_237 147705 148043 Hypothetical protein
LEC2_238 148040 148621 Deoxycytidylate deaminase (EC 3.5.4.12)
LEC2_239 148621 148857 Phage tail fibers
LEC2_240 148858 149166 Phage tail fibers
LEC2_241 149223 149558 Phage head assembly chaperone protein
LEC2_242 149706 149954 Phage rIII lysis inhibitor accessory
LEC2_243 150200 150376 Hypothetical protein
LEC2_244 150487 150819 Hypothetical protein
LEC2_245 150888 151253 Hypothetical protein
LEC2_246 151295 151582 Hypothetical protein
LEC2_247 151582 151779 Hypothetical protein
LEC2_248 151776 151982 Hypothetical protein
LEC2_249 152053 152433 Hypothetical protein
LEC2_250 152430 153272 Hypothetical protein
LEC2_251 153272 153541 Hypothetical protein
LEC2_252 153538 155001 DNA ligase, phage-associated
LEC2_253 154998 155183 Hypothetical protein
LEC2_254 155240 157288 RNA polymerase-ADP-ribosyltransferase Alt
LEC2_255 157292 157678 RNA polymerase-ADP-ribosyltransferase Alt
LEC2_256 157711 158001 Hypothetical protein
LEC2_257 158995 158030 Phage baseplate tail tube initiator
LEC2_258 160089 158995 Phage baseplate tail tube cap (T4-like gp48)
LEC2_259 161870 160098 Phage baseplate hub
LEC2_260 162325 161867 Phage baseplate hub
LEC2_261 163520 162348 Phage baseplate hub subunit
LEC2_262 164269 163517 Phage baseplate
LEC2_263 164320 164946 Phage baseplate hub assembly chaperone (T4-like gp26)
LEC2_264 164946 165344 Phage baseplate wedge subunit (T4-like gp25)
LEC2_265 165411 165824 Single stranded DNA-binding protein, phage-associated
LEC2_266 165824 166051 Hypothetical protein
LEC2_267 166175 166342 Hypothetical protein
LEC2_268 166631 166398 DNA helicase, phage-associated
LEC2_269 167709 166657 DNA helicase, phage-associated
(5) 박테리오파지 LSE1
분리한 박테리오파지 LSE1의 염기서열 분석을 위하여 파지 유전자를 분리하였다. 순수 분리된 박테리오파지 1 mL에 0.5 M EDTA(pH 8.0), 프로테이나아제(proteinase) K, SDS를 첨가하되, 시약을 첨가한 후의 농도가 각각 20 mM, 50 μg/mL, 0.5%가 되도록 하였다. 혼합된 용액은 2시간 동안 56℃로 온도를 유지하며 이후 상온에서 식혔다. 동량의 페놀을 넣고 3000 g에서 5분 동안 원심분리 하였으며, 상층액만을 얻어 PCI(phenol-chloroform-isoamylalcohol)를 다시 한 번 처리하고, 동일한 조건의 원심분리를 수행하였다. 위에서 획득한 상층액에 동량의 클로로포름(chloroform)을 첨가하여 원심분리하였다. 이 과정을 반복하고 95% 에탄올 1 mL과 3 M 소디움 아세테이트(Sodium acetate, pH 5.2)를 100μL 첨가하여 -80℃에서 DNA를 침전시킨 뒤 15분 동안 원심분리한 후, 70% 에탄올을 첨가하여 한번 더 원심분리하였다. 에탄올을 제거하고 DNA를 건조시킨 후, 증류수에 DNA를 녹였다.
순수 분리된 총 유전자의 염기서열을 결정하였으며, 박테리오파지 LSE1의 염기서열은 총 112,766bp (서열번호 5) 크기이며, 상기 염기서열은 서열번호 5에 나타내었다. 결정된 염기서열을 'RAST(Rapid Annotation using Subsystem Technology)' 프로그램을 이용하여 분석하였다. 분석한 결과, LSE1의 유전체(genome)에서 146개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORFs)과 26개의 tRNA가 예측되었고, 이중 94개의 ORF는 아직 기능이 밝혀지지 않은 가정적인 단백질(hypothetical protein)로 판단된다.
52개의 ORF는 크게 대사(metabolism), 패키징(packaging), 구조(sturcutre), 용균 (lysis) 등의 4개의 집단으로 나뉠 수 있다. 박테리오파지를 용원상태로 유지시키는 인테그레이즈(integrase)나 리프레서(repressor) 등은 예측되지 않았으므로 LSE1이 용균성 파지임을 재확인하였다. LSE1의 유전자의 추정되는 기능은 하기 표 5에 나타내었다.
로커스 태그(Locus tag) 시작 종결 기능
LSE1_1 1697 33 Probable A1 protein
LSE1_2 2503 2087 A2 protein
LSE1_3 2853 2602 Hypothetical protein
LSE1_4 4340 5341 Hypothetical protein
LSE1_5 5731 6225 Hypothetical protein
LSE1_6 6485 6697 Hypothetical protein
LSE1_7 7154 7366 hypothetical protein
LSE1_8 10283 9399 Hypothetical protein
LSE1_9 10710 10360 Hypothetical protein
LSE1_10 11321 10710 Hypothetical protein
LSE1_11 11452 11321 Hypothetical protein
LSE1_12 11673 11506 Hypothetical protein
LSE1_13 12935 12513 Hypothetical protein
LSE1_14 13287 12946 Phage capsid and scaffold
LSE1_15 13738 13271 Hypothetical protein
LSE1_16 14362 14033 Hypothetical protein
LSE1_17 14597 14352 Hypothetical protein
LSE1_18 14875 14594 Hypothetical protein
LSE1_19 15291 14872 Hypothetical protein
LSE1_20 15542 15291 Hypothetical protein
LSE1_21 16048 15617 Hypothetical protein
LSE1_22 17094 16675 Phosphoesterase
LSE1_23 17561 17193 Hypothetical protein
LSE1_24 18424 17561 Serine/threonine protein phosphatase (EC 3.1.3.16)
LSE1_25 18576 18427 hypothetical protein
LSE1_26 19100 18810 Thioredoxin, phage-associated
LSE1_27 19503 19093 Hypothetical protein
LSE1_28 20486 20073 Phage endolysin
LSE1_29 21139 20483 Phage holin
LSE1_30 21895 21296 ATP-dependent Clp protease proteolytic subunit (EC 3.4.21.92)
LSE1_31 22660 21908 Deoxynucleotide monophosphate kinase (EC 2.7.4.13)
LSE1_32 23393 22944 Hypothetical protein
LSE1_33 24048 23350 Hypothetical protein
LSE1_34 24542 24195 Hypothetical protein
LSE1_35 24943 24659 Hypothetical protein
LSE1_36 25236 24940 Hypothetical protein
LSE1_37 25609 25190 Hypothetical protein
LSE1_38 25901 25602 Hypothetical protein
LSE1_39 26175 25894 Hypothetical protein
LSE1_40 26606 26253 Hypothetical protein
LSE1_41 26851 26666 Hypothetical protein
LSE1_42 27071 26916 Hypothetical protein
LSE1_43 27659 27291 Pyruvate formate-lyase (EC 2.3.1.54)
LSE1_44 28040 27846 hypothetical protein
LSE1_rna.1 28153 28078 tRNA-Met-CAT
LSE1_rna.2 28326 28250 tRNA-Ile-GAT
LSE1_45 28534 28328 Hypothetical protein
LSE1_46 28827 28534 Hypothetical protein
LSE1_rna.3 28976 28902 tRNA-Thr-TGT
LSE1_47 29151 28987 Hypothetical protein
LSE1_48 29365 29144 Hypothetical protein
LSE1_rna.4 29455 29381 tRNA-Gly-TCC
LSE1_rna.5 29538 29463 tRNA-Gln-TTG
LSE1_rna.6 29620 29545 tRNA-Gln-CTG
LSE1_49 29829 29629 Hypothetical protein
LSE1_rna.7 29928 29854 tRNA-Arg-ACG
LSE1_50 30579 30406 Hypothetical protein
LSE1_51 31360 30776 Phage-associated homing endonuclease
LSE1_rna.8 31461 31377 tRNA-Leu-TAG
LSE1_rna.9 31546 31468 tRNA-Ala-TGC
LSE1_52 32256 31903 Hypothetical protein
LSE1_rna.10 32355 32282 tRNA-Val-TAC
LSE1_rna.11 32437 32360 tRNA-Lys-TTT
LSE1_53 33055 32891 Hypothetical protein
LSE1_rna.12 33154 33077 tRNA-Met-CAT
LSE1_rna.13 33238 33161 tRNA-Pro-TGG
LSE1_rna.14 33681 33607 tRNA-Gly-GCC
LSE1_rna.15 33961 33885 tRNA-Lys-CTT
LSE1_54 34154 33963 hypothetical protein
LSE1_rna.16 34245 34169 tRNA-Asp-GTC
LSE1_55 34440 34255 hypothetical protein
LSE1_rna.17 34621 34544 tRNA-Asn-GTT
LSE1_rna.18 35212 35138 tRNA-Cys-GCA
LSE1_56 35488 35216 Hypothetical protein
LSE1_57 35810 35538 Hypothetical protein
LSE1_rna.19 35902 35828 tRNA-Phe-GAA
LSE1_rna.20 35985 35909 tRNA-Pseudo-CCA
LSE1_rna.21 36070 35994 tRNA-Glu-TTC
LSE1_rna.22 36168 36078 tRNA-Pseudo-GTA
LSE1_58 36634 36359 Hypothetical protein
LSE1_59 36930 36724 Hypothetical protein
LSE1_60 37066 36944 Hypothetical protein
LSE1_rna.23 37158 37082 tRNA-Leu-TAA
LSE1_61 37505 37167 Hypothetical protein
LSE1_62 37692 37507 Phage antitermination protein Q
LSE1_rna.24 37787 37710 tRNA-Met-CAT
LSE1_rna.25 37881 37793 tRNA-Ser-GCT
LSE1_63 38160 37882 Phage-associated homing endonuclease
LSE1_64 38758 38462 Hypothetical protein
LSE1_65 39542 38865 Ribosyl nicotinamide transporter, PnuC-like
LSE1_66 40599 39544 NadR transcriptional regulator
LSE1_67 41815 40871 Hypothetical protein
LSE1_68 42027 41827 Hypothetical protein
LSE1_rna.26 42128 42054 tRNA-Arg-TCT
LSE1_69 42646 42137 hypothetical protein
LSE1_70 44153 43710 Phage recombination related exonuclease (EC 3.1.11.-)
LSE1_71 44323 44153 Hypothetical protein
LSE1_72 44841 44392 Hypothetical protein
LSE1_73 45164 44847 Hypothetical protein
LSE1_74 46246 45608 Phage tail fiber protein
LSE1_75 46483 46301 Hypothetical protein
LSE1_76 47256 46555 Metallopeptidase, phage-associated
LSE1_77 47499 47287 Hypothetical protein
LSE1_78 47756 47541 Phage tail length tape-measure protein
LSE1_79 48333 47818 Hypothetical protein
LSE1_80 48656 48417 Hypothetical protein
LSE1_81 49248 48772 Ribonuclease HI (EC 3.1.26.4)
LSE1_82 49517 49248 Hypothetical protein
LSE1_83 50718 49864 Thymidylate synthase (EC 2.1.1.45)
LSE1_84 51245 50715 Dihydrofolate reductase, phage-associated
LSE1_85 52390 51245 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), beta subunit (EC 1.17.4.1)
LSE1_86 54888 52498 Ribonucleotide reductase of class Ia (aerobic), alpha subunit (EC 1.17.4.1)
LSE1_87 55397 54909 Phage-associated homing endonuclease
LSE1_88 55703 55461 Hypothetical protein
LSE1_89 56457 55705 Phosphate starvation-inducible protein PhoH, predicted ATPase
LSE1_90 56810 58684 Ribonucleotide reductase of class III (anaerobic), large subunit (EC 1.17.4.2)
LSE1_91 58783 59064 Hypothetical protein
LSE1_92 59074 59277 Hypothetical protein
LSE1_93 59440 60291 NAD-dependent protein deacetylase of SIR2 family
LSE1_94 60269 60427 Hypothetical protein
LSE1_95 60424 60609 Hypothetical protein
LSE1_96 60824 60940 Hypothetical protein
LSE1_97 60968 61102 Hypothetical protein
LSE1_98 61105 61533 Hypothetical protein
LSE1_99 61543 61938 Hypothetical protein
LSE1_100 62555 65344 Phage DNA primase C
LSE1_101 65328 65561 Hypothetical protein
LSE1_102 65631 66335 Hypothetical protein
LSE1_103 66328 66573 hypothetical protein
LSE1_104 66681 67091 Hypothetical protein
LSE1_105 67128 67424 Hypothetical protein
LSE1_106 67595 67783 Hypothetical protein
LSE1_107 67968 68141 hypothetical protein
LSE1_108 68142 68336 hypothetical protein
LSE1_109 68329 69300 DNA ligase, phage-associated
LSE1_110 69503 70273 DNA ligase, phage-associated
LSE1_111 70276 71043 Hypothetical protein
LSE1_112 71132 72598 Hypothetical protein
LSE1_113 72595 73485 DNA primase (EC 2.7.7.-) / DNA helicase (EC 3.6.1.-), phage-associated
LSE1_114 73548 76115 DNA polymerase I (EC 2.7.7.7), phage-associated
LSE1_115 76602 77954 DNA helicase, phage-associated
LSE1_116 78450 79223 Hypothetical protein
LSE1_117 79263 80240 Phage-associated recombinase
LSE1_118 80263 82059 Phage recombination related exonuclease (EC 3.1.11.-)
LSE1_119 82063 82545 Hypothetical protein
LSE1_120 82545 83420 Phage ribonuclease H (EC 3.1.26.4)
LSE1_121 83417 83863 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase (EC 3.6.1.23)
LSE1_122 83841 84098 Hypothetical protein
LSE1_123 87315 84364 Phage tail fibers
LSE1_124 87737 87315 Hypothetical protein
LSE1_125 89740 87743 Phage tail fibers
LSE1_126 92650 89801 Phage tail length tape-measure protein
LSE1_127 93261 92647 Hypothetical protein
LSE1_128 97080 93370 Phage tail length tape-measure protein
LSE1_129 97508 97161 Hypothetical protein
LSE1_130 97995 97591 Hypothetical protein
LSE1_131 98891 97992 Phage tail fibers
LSE1_132 100305 98896 Phage major tail protein
LSE1_133 101588 100821 Hypothetical protein
LSE1_134 102100 101588 Hypothetical protein
LSE1_135 103536 102160 Phage major capsid protein
LSE1_136 104186 103554 Phage capsid and scaffold
LSE1_137 104513 104190 Phage tail fibers
LSE1_138 105727 104510 Phage portal (connector) protein
LSE1_139 105867 105727 Hypothetical protein
LSE1_140 107595 106279 Phage terminase, large subunit
LSE1_141 108077 107595 Hypothetical protein
LSE1_142 109869 108088 Phage-associated receptor-binding protein
LSE1_143 109953 110219 Hypothetical protein
LSE1_144 110842 110979 hypothetical protein
LSE1_145 112116 111382 degrades 5'-deoxyribonucleotides to their corresponding deoxyribonucleosides
LSE1_146 112596 112204 Hypothetical protein
실험예 1: 박테리오파지의 용균성 분석
(1) 박테리오파지 LBC1의 바실러스균 용균성
숙주 B. cereus ATCC 11778 배양액에 일정 농도의 박테리오파지 LBC1을 섞고 일정 시간마다 흡광도를 측정하여 대조군과 비교함으로써 LBC1의 숙주 용균 능력을 확인하였다.
바실러스 세레우스만을 배양한 대조군에 비해 바실러스 세레우스에 박테리오파지 LBC1을 섞은 경우, 흡광도가 현저하게 감소하여 박테리오파지 LBC1이 바실러스 세레우스에 대해 용균 효과가 우수함을 확인하였다(도 11).
또한 박테리오파지 LBC1을 처리한 후 84시간이 지나도 대조군에 비해 현저히 적은 흡광도 값을 유지하고 있음을 확인하였다. 일반적으로 박테리오파지를 숙주 세균 배양액에 감염시키면 일정시간 경과 후 파지에 저항성을 가지는 숙주 세균이 급격히 발생하는 것으로 알려져 있으나, LBC1을 처리하면 시간이 경과하여도 LBC1에 대한 저항성을 가지는 바실러스 세레우스균이 거의 나타나지 않았다. 이는 LBC1이 일반적인 박테리오파지 보다 숙주 세균에 대한 사멸효과가 강하다는 것을 나타내는 결과이다(도 12).
(2) 박테리오파지 LBC2의 바실러스 세레우스 용균성
숙주 B. cereus NCCP 14796 배양액에 일정 농도의 박테리오파지 LBC2를 섞고 일정 시간마다 흡광도를 측정하여 대조군과 비교함으로써 LBC2의 숙주 용균 능력을 확인하였다.
바실러스 세레우스만을 배양한 대조군에 비해 바실러스 세레우스에 박테리오파지 LBC2을 섞은 경우, 흡광도가 현저하게 감소하여 박테리오파지 LBC2이 바실러스 세레우스 숙주에 대해 용균 효과가 있음을 확인하였다(도 13).
(3) 박테리오파지 LEC1의 대장균 용균성
숙주 E. coli NCTC 12079 배양액에 일정 농도의 박테리오파지 LEC1을 섞고 일정 시간마다 흡광도를 측정하여 대조군과 비교함으로써 LEC1의 숙주 용균 능력을 확인하였다.
대장균만을 배양한 대조군에 비해 대장균에 박테리오파지 LEC1을 섞은 경우, 흡광도가 현저하게 감소하여 박테리오파지 LEC1이 대장균 숙주에 대해 용균 효과가 있음을 확인하였다(도 14).
또한 박테리오파지 LEC1을 처리한 후 84시간이 지나도 대조군에 비해 현저히 적은 흡광도 값을 유지하고 있음을 확인하였다. 일반적으로 박테리오파지를 대장균 배양액에 감염시키면 8 내지 12시간 경과 후 파지에 저항성을 가지는 대장균이 급격히 발생하는 것으로 알려져 있으나, LEC1을 처리하면 시간이 경과하여도 LEC1에 대한 저항성을 가지는 대장균이 적게 발생하였다. 이는, LEC1이 일반적인 대장균 박테리오파지 보다 대장균에 대한 사멸효과가 강하다는 것을 나타내는 결과이다(도 15).
(4) 박테리오파지 LEC2의 대장균 용균성
숙주 E. coli NCCP 15961 배양액에 일정 농도의 박테리오파지 LEC2를 섞고 일정 시간마다 흡광도를 측정하여 대조군과 비교함으로써 LEC2의 숙주 용균 능력을 확인하였다.
대장균만을 배양한 대조군에 비해 대장균에 박테리오파지 LEC2을 섞은 경우, 흡광도가 현저하게 감소하여 박테리오파지 LEC2이 대장균 숙주에 대해 용균 효과가 있음을 확인하였다(도 16).
또한 박테리오파지 LEC2를 처리한 후 24시간이 지나도 대조군에 비해 현저히 적은 흡광도 값을 유지하고 있음을 확인하였다. 일반적으로 박테리오파지를 대장균 배양액에 감염시키면 8 내지 12시간 경과 후 파지에 저항성을 가지는 대장균이 급격히 발생하는 것으로 알려져 있으나, LEC2를 처리하면 시간이 경과하여도 LEC2에 대한 저항성을 가지는 대장균이 적게 발생하였다. 이는, LEC2이 일반적인 대장균 박테리오파지 보다 대장균에 대한 사멸효과가 강하다는 것을 나타내는 결과이다.
(5) 박테리오파지 LSE1의 살모넬라균 용균성
숙주 S. Enteritidis NCCP 14547 배양액에 일정 농도의 박테리오파지 LSE1을 섞고 일정 시간마다 흡광도를 측정하여 대조군과 비교함으로써 LSE1의 숙주 용균 능력을 확인하였다.
살모넬라균만을 배양한 대조군에 비해 살모넬라균에 박테리오파지 LSE1을 섞은 경우, 흡광도가 현저하게 감소하고 파지 감염 후 5시간이 경과하여도 저항성 균이 나타나지 않아 박테리오파지 LSE1이 살모넬라균 숙주에 대해 용균 효과가 우수함을 확인하였다(도 17).
실험예 2: 박테리오파지의 숙주 특이성 분석
(1) 박테리오파지 LBC1
박테리오파지 LBC1의 숙주 특이성을 확인하기 위해 분리균인 바실러스 세레우스를 포함한 식중독 세균에 대한 용균 활성을 분석하였다.
박테리오파지 LBC1의 숙주 특이성은 적하법(Dropping method)을 통해 결정하였다. 16시간 배양된 세균 배양액과 0.4%의 agar 배지를 섞은 후, 1.5% Agar 배지에 부어서 상온에서 15분간 건조하였고, 그 위에 파지 배양액을 떨어뜨리고, 30℃에서 16시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라그(plaque)를 보이는데, 이는 세균 세포가 완전하게 용해(lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.
실험 결과, 본 발명의 박테리오파지 LBC1는 바실러스 세레우스 외에 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 파라마이코이데스(Bacillus paramycoides) 및 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 등 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 균주 등에 용해 활성을 보였다. 특히 바실러스 세레우스 분리 균주 중 비교적 항생제 내성이 높은 분리균 31 균주에 대해 용균 활성을 측정했을 때, 21 균주에 대해 사멸효과를 보이므로 항생제 내성 균주에 대한 약 68% 용해 활성을 나타냈다.
이외에도 크로노박터 사카자키, 리스테리아 모노사이토제네스, 황생포도상구균, 비브리오균 등에는 효과가 없었으나 대장균 11균주 중 7균주, 살모넬라균 5균주 중 5균주에 대한 용균 활성을 보였다.
용해 활성을 플라그의 투명도에 따라 3단계로 나누어 박테리오파지 LBC1의 용균 활성을 표 6에 나타내었다[+++ : 맑게 용균(clear lysis), ++ : 약간 탁함(turbid), + : 매우 탁함(very turbid), - : 비용균(no lysis)].
숙주박테리아 박테리오파지 LBC1
Bacillus cereus ATCC 10876 -
cereus ATCC 11778 ++
cereus ATCC 14579 +
cereus ATCC 10702 +
cereus ATCC 21768 -
cereus KCTC 1094 +
cereus KFDA 164 -
cereus KFDA 229 -
cereus KFDA 250 -
cereus NCCP 14043 -
cereus NCCP 14796 +
cereus NCCP 15910 -
mycoides ATCC 6462 +
mycoides ATCC 21929 +
mycoides ATCC 6462 +
paramycoides KCTC 33709 +
subtilis KCTC 13429 -
subtilis ATCC 6633 -
subtilis ATCC 6051 -
thuringiensis ATCC 35646 +
thuringiensis ATCC 35866 +
thuringiensis ATCC 13367 +
thuringiensis ATCC 33679 +
thuringiensis KCTC 1510 +
thuringiensis ATCC10792 +
cereus isolate 21/31
Cronobacter sakazakii ATCC 29004 -
Cronobacter sakazakii KCTC 2949 -
Escherichia coli KCTC 1039 ++
Escherichia coli KCTC 2441 -
Escherichia coli NCCP 14540 -
Escherichia coli NCCP 14538 ++
Escherichia coli ATCC 35150 +
Escherichia coli ATCC 43889 +
Escherichia coli ATCC 43890 -
Escherichia coli ATCC 43894 +
Escherichia coli ATCC 43895 -
Escherichia coli NCCP 11091 ++
Escherichia coli NCTC 12079 +
Listeria monocytogenes ATCC 15313
Listeria monocytogenes ATCC 19113 -
Listeria monocytogenes ATCC 19114 -
Listeria monocytogenes ATCC 19115 -
Listeria monocytogenes ATCC 19116 -
Listeria monocytogenes ATCC 19117 -
Listeria monocytogenes KCTC 3569 -
Salmonella Enteritidis ATCC 13076 +
Salmonella Enteritidis KCCM 12021 +++
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ++
Salmonella Typhimurium ATCC 6994 +++
Salmonella Typhimurium DT104 ++
Staphylococcus aureus ATCC 12600 -
Staphylococcus aureus ATCC 13565 -
Staphylococcus aureus ATCC 23235 -
Staphylococcus aureus ATCC 25923 -
Staphylococcus aureus ATCC 33591 -
Staphylococcus aureus ATCC 33593 -
Staphylococcus aureus ATCC 6538 -
Staphylococcus aureus KCCM 12103 -
Staphylococcus aureus KCCM 40050 -
Staphylococcus aureus KCTC 1621 -
Vibrio harveyi KCCM 40866 -
Vibrio harveyi KCTC 2717 -
Vibrio parahaemolyticus KCCM 11965 -
Vibrio parahaemolyticus KCCM 41664 -
Vibrio vulnificus KCTC 2962 -
Vibrio vulnificus KCTC 2980 -
Vibrio vulnificus KCTC 2988 -
(2) 박테리오파지 LBC2
박테리오파지 LBC2의 숙주 특이성을 확인하기 위해 바실러스 세레우스 외의 다양한 균주에 대한 용균 활성을 분석하였다.
박테리오파지 LBC2의 숙주 특이성은 적하법(Dropping method)을 통해 결정하였다. 16시간 배양된 세균 배양액과 0.4%의 agar 배지를 섞은 후, 1.5% Agar 배지에 부어서 상온에서 15분간 건조하였고, 그 위에 파지 현탁액을 떨어뜨리고, 30℃에서 16시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라그(plaque)를 보이는데, 이는 세균 세포가 완전하게 용해(lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.
실험 결과, 본 발명의 박테리오파지 LBC2는 바실러스 세레우스 균주 10 개 중 6개의 균주에 대해 용해 활성을 나타냈고 된장, 선식 등에서 분리한 바실러스 세레우스 균주 중 비교적 항생제 내성이 높은 11개의 분리균주에 대해 8개의 균주에서 사멸효과를 나타내었다.
다만, 본 발명의 박테리오파지 LBC2는 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 파라마이코이데스(Bacillus paramycoides), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 살모넬라(Salmonella), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 크로노박터 사카자키(Cronobacter sakazakii), 비브리오(Vibrio) 등 대표적인 식중독 균에는 용해활성을 보이지 않고 오직 바실러스 세레우스에만 특이적으로 용해활성을 나타내었다.
용해 활성을 플라그의 투명도에 따라 3단계로 나누어 LBC2의 바실러스 세레우스에 대한 용균 활성을 표 7에 나타내었다[+++ : 맑게 용균(clear lysis), ++ : 약간 탁함(turbid), + : 매우 탁함(very turbid), - : 비용균(no lysis)].
숙주박테리아 박테리오파지 LBC2
Bacillus cereus ATCC 14579 -
cereus ATCC 10702 +
cereus ATCC 21768 +
cereus KCTC 1094 -
cereus KFDA 164 +
cereus KFDA 229 +
cereus KFDA 250 +
cereus NCCP 14043 -
cereus NCCP 14796 +
cereus NCCP 15910 -
cereus isolate 8/11
mycoides ATCC 6462 -
mycoides ATCC 21929 -
mycoides ATCC 6462 -
paramycoides KCTC 33709 -
pseudomycoides KCTC 3862 -
subtilis KCTC 13429 -
subtilis ATCC 6633 -
subtilis ATCC 6051 -
thuringiensis ATCC 35646 -
thuringiensis ATCC 35866 -
thuringiensis ATCC 13367 -
thuringiensis ATCC 33679 -
thuringiensis KCTC 1510 -
thuringiensis ATCC10792 -
Escherichia coli NCCP 13667 -
coli NCCP 13721 -
coli NCCP 14010 -
coli NCCP 14020 -
coli NCCP 14538 -
coli NCCP 15647 -
coli NCCP 15739 -
coli NCCP 15954 -
coli NCCP 15956 -
coli NCCP 15961 -
Listeria monocytogenes ATCC 15313 -
monocytogenes ATCC 19111 -
monocytogenes ATCC 19115 -
monocytogenes ATCC 19113 -
monocytogenes ATCC 19114 -
monocytogenes ATCC 19116 -
monocytogenes ATCC 19117 -
monocytogenes NCCP 14714 -
monocytogenes NCCP 15743 -
Salmonella Dublin NCCP 12232 -
Enteritidis NCCP 14771 -
Enteritidis NCCP 16206 -
Paratyphi NCCP 12213 -
Paratyphi NCCP 14759 -
Typhi NCCP 13699 -
Typhi NCCP 14641 -
Typhimurium NCCP 12219 -
Typhimurium NCCP 16207 -
Staphylococcus aureus ATCC 13565 -
aureus ATCC 23235 -
aureus ATCC 33591 -
aureus ATCC 6538 -
aureus ATCC 12600 -
aureus ATCC 25923 -
aureus NCCP 14565 -
aureus NCCP 14749 -
aureus NCCP 14751 -
aureus NCCP 14754 -
Cronobacter sakazakii ATCC 29004 -
sakazakii ATCC 29544 -
Vibrio harveyi ATCC 14126 -
harveyi ATCC 35084 -
parahaemolyticus KACC 12670 -
parahaemolyticus NCCP 13712 -
parahaemolyticus NCCP 13713 -
parahaemolyticus NCCP 14551 -
parahaemolyticus NCCP 16526 -
vulnificus KCTC 2980 -
vulnificus KCTC 2984 -
vulnificus KCTC 2988 -
(3) 박테리오파지 LEC1
박테리오파지 LEC1의 숙주 특이성을 확인하기 위해 분리균인 대장균을 포함하여, 바실러스 세레우스, 크로노박터 사카자키, 리스테리아 모노사이토제네스, 살모넬라, 황생포도상구균 등 56 균주에 대한 용균 활성을 분석하였다.
박테리오파지 LEC1의 숙주 특이성은 적하법(Dropping method)을 통해 결정하였다. 16시간 배양된 세균 배양액과 0.4%의 Agar 배지를 섞은 후, 1.5% Agar 배지에 부어서 상온에서 15분간 건조하였고, 그 위에 파지 배양액을 떨어뜨리고, 37℃에서 8시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라그(plaque)를 보이는데, 이는 세균 세포가 완전하게 용해(lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.
실험 결과, 본 발명의 박테리오파지 LEC1은 대장균 외에 실험에 사용한 식중독 세균은 감염시키지 못하고 대부분의 대장균 균주에는 용해 활성을 보여 대장균 특이적 높은 용균 활성을 보임을 확인하였다. 용해 활성을 플라그의 투명도에 따라 3단계로 나누어 LEC1의 대장균에 대한 용균 활성을 표 8에 나타내었다[+++ : 맑게 용균(clear lysis), ++ : 약간 탁함(turbid), + : 매우 탁함(very turbid), - : 비용균(no lysis)].
숙주박테리아 박테리오파지 LEC1
Bacillus cereus ATCC 10876 -
ATCC 11778 -
ATCC 14579 -
Bacillus mycoides ATCC 6462 -
KCCM 40260 -
Cronobacter sakazakii ATCC 29004 -
KCTC 2949 -
Listeria monocytogenes ATCC 19113 -
ATCC 19114 -
ATCC 19115 -
ATCC 19116 -
KCTC 3569 -
Salmonella Enteritidis ATCC 13076 -
KCCM 12021 -
Salmonella Typhimurium ATCC 14028 -
ATCC 6994 -
DT104 -
Staphylococcus aureus ATCC 33593 -
ATCC 6538 -
KCCM 12103 -
KCCM 40050 -
KCTC 1621 -
E. coli DH5α +++
OE50 +++
NCTC 12079 +++
NCCP 13937 +
DH10B +
BL21(DE3) +++
ER2738 ++
ATCC 47000 ++
ATCC 10536 +
ATCC 9637 +
ATCC 11775 -
ATCC 43890 ++
ATCC 43889 ++
ATCC 43894 ++
ATCC 35150 +++
NCCP 11091 ++
ATCC 43895 +++
NCCP 14540 -
NCCP 12537 ++
NCCP 12551 +
NCCP 13581 -
NCCP 13667 +++
NCCP 13721 -
NCCP 14010 -
NCCP 14020 +++
NCCP 14538 ++
NCCP 15647 +
NCCP 15656 -
NCCP 15739 ++
NCCP 15954 +
NCCP 15956 ++
NCCP 15961 +++
ATCC 25922 -
ATCC 8739 ++
(4) 박테리오파지 LEC2
박테리오파지 LEC2의 숙주 특이성을 확인하기 위해 대장균 내의 다양한 균주에 대한 용균 활성을 분석하였다.
박테리오파지 LEC2의 숙주 특이성은 적하법(Dropping method)을 통해 결정하였다. 16시간 배양된 세균 배양액과 0.4%의 agar 배지를 섞은 후, 1.5% Agar 배지에 부어서 상온에서 15분간 건조하였고, 그 위에 파지 배양액을 떨어뜨리고, 37℃에서 8시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라그(plaque)를 보이는데, 이는 세균 세포가 완전하게 용해(lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.
실험 결과, 본 발명의 박테리오파지 LEC2는 34개의 대장균 균주 중 30개의 균주에 대한 용균 활성을 보여 넓은 범위의 숙주를 감염시킬 수 있음을 확인하였다. 용해 활성을 플라그의 투명도에 따라 3단계로 나누어 LEC2의 대장균에 대한 용균 활성을 표 9에 나타내었다[+++ : 맑게 용균(clear lysis), ++ : 약간 탁함(turbid), + : 매우 탁함(very turbid), - : 비용균(no lysis)].
숙주박테리아 박테리오파지 LEC2
E. coli DH5α +
OE50 +
NCTC 12079 +
NCCP 13937 +
DH10B +
BL21(DE3) +
ER2738 +
ATCC 47000 +
ATCC 10536 +
ATCC 9637 +
ATCC 11775 +
ATCC 43890 +
ATCC 43889 +
ATCC 43894 +
ATCC 35150 +
NCCP 11091 +
ATCC 43895 +
NCCP 14540 -
NCCP 12537 +
NCCP 12551 +
NCCP 13581 -
NCCP 13667 +
NCCP 13721 -
NCCP 14010 +
NCCP 14020 +
NCCP 14538 +
NCCP 15647 +
NCCP 15656 -
NCCP 15739 +
NCCP 15954 +
NCCP 15956 +
NCCP 15961 +
ATCC 25922 +
ATCC 8739 +
(5) 박테리오파지 LSE1
박테리오파지 LSE1의 숙주 특이성을 확인하기 위해 살모넬라균 내의 다양한 균주에 대한 용균 활성을 분석하였다.
박테리오파지 LSE1의 숙주 특이성은 적하법(Dropping method)을 통해 결정하였다. 16시간 배양된 세균 배양액과 0.4%의 agar 배지를 섞은 후, 1.5% Agar 배지에 부어서 상온에서 15분간 건조하였고, 그 위에 파지 배양액을 떨어뜨리고, 37℃에서 8시간 정치 배양시켰다. 균주가 파지에 대해 감수성을 갖는 경우, 플래이트상에 투명한 영역, 즉 플라그(plaque)를 보이는데, 이는 세균 세포가 완전하게 용해(lysis)된 결과임을 증명하는 것이다. 만약 감수성이 약한 경우는 뿌연 영역이 생기거나, 독립적인 볼드 스팟이 나타난다.
실험 결과, 본 발명의 박테리오파지 LSE1은 분리균인 S. Enteritidis 외의 살모넬라 파라티피(Salmonella Paratyphi), 살모넬라 티피(Salmonella Typhi), 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium) 등 다른 혈청형에도 용균 활성을 보여, 살모넬라균 내의 넓은 용균 활성을 확인하였다. 용해 활성을 플라그의 투명도에 따라 3단계로 나누어 LSE1의 살모넬라균에 대한 용균 활성을 표 10에 나타내었다[+++ : 맑게 용균(clear lysis), ++ : 약간 탁함(turbid), + : 매우 탁함(very turbid), - : 비용균(no lysis)].
숙주박테리아 박테리오파지 LSE1
Salmonella Enteritidis ATCC 13076 ++
Enteritidis KCCM 12021 +++
Enteritidis NCCP 14547 +++
Enteritidis NCCP 14771 ++
Enteritidis NCCP 16206 +++
Paratyphi NCCP 14759 +++
Typhi NCCP 13699 +
Typhi NCCP 14641 ++
Typhimurium ATCC 14028 +
Typhimurium ATCC 43971 +
Typhimurium ATCC 6994 +++
Typhimurium DT104 +
Typhimurium NCCP 12219 +
Typhimurium NCCP 12241 +
Typhimurium NCCP 12245 +
Typhimurium NCCP 16207 +
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[수탁번호]
기탁기관명: 생물자원센터(KCTC)
수탁번호: KCTC 15076BP
수탁일자: 2022.09.19
기탁기관명: 생물자원센터(KCTC)
수탁번호: KCTC 15077BP
수탁일자: 2022.09.19
기탁기관명: 생물자원센터(KCTC)
수탁번호: KCTC 15078BP
수탁일자: 2022.09.19
기탁기관명: 생물자원센터(KCTC)
수탁번호: KCTC 15079BP
수탁일자: 2022.09.19
기탁기관명: 생물자원센터(KCTC)
수탁번호: KCTC 15089BP
수탁일자: 2022.09.20
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Figure PCTKR2023016794-appb-img-000002
Figure PCTKR2023016794-appb-img-000003
Figure PCTKR2023016794-appb-img-000004
Figure PCTKR2023016794-appb-img-000005

Claims (22)

  1. 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 대한 특이적 사멸능을 갖는 박테리오파지.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 KCTC 15078BP로 기탁된 박테리오파지.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 KCTC 15089BP로 기탁된 박테리오파지.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 KCTC 15076BP로 기탁된 박테리오파지.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 KCTC 15079BP로 기탁된 박테리오파지.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 박테리오파지는 KCTC 15077BP로 기탁된 박테리오파지.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스균은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 파라마이코이데스(Bacillus paramycoides) 및 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터 선택된 1종 이상인 것인, 박테리오파지.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 살모넬라균은 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium), 살모넬라 타이피(Salmonella Typhi) 및 살모넬라 파라티피(Salmonella Paratyphi)로부터 선택된 1종 이상인 것인, 박테리오파지.
  9. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 항생제.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항생제는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균의 성장 억제 또는 용균능을 가지는 것인, 항생제.
  11. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 소독제.
  12. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 세척제.
  13. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 식품 첨가제 조성물.
  14. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
  15. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 첨가제 조성물.
  16. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 사료 조성물.
  17. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증은 바실러스 세레우스 감염증, 급성위장관염, 식중독, 대장균 감염증, 출혈성 대장염, 요독증후군, 혈소판 감소성 자반증, 살모넬라균 감염증 또는 장티푸스인 것인, 조성물.
  19. 제1항의 박테리오파지를 대상에 처리하는 단계를 포함하는 세균 살균 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 세균은 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라인 것인, 살균 방법.
  21. 제1항의 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료 방법.
  22. 바실러스균, 대장균 또는 살모넬라균에 의한 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 제1항의 박테리오파지 또는 이를 포함하는 조성물의 용도.
PCT/KR2023/016794 2022-10-28 2023-10-26 신규한 박테리오파지 lbc1, lbc2, lec1, lec2, 또는 lse1 및 이의 용도 WO2024091038A1 (ko)

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