CN116042543A - 一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及噬菌体组合物和应用 - Google Patents

一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及噬菌体组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及噬菌体组合物和应用，具体涉及微生物技术领域。所述噬菌体为噬菌体16‑7w或噬菌体235c1；其中，所述噬菌体16‑7w属于肌尾病毒科，噬菌体235c1属于短尾噬菌体科。一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体组合物在制备防治沙门氏菌感染的产品中的应用。本发明的噬菌体属于烈性噬菌体，是一种天然的杀菌物质；本发明的噬菌体在宿主体内潜伏期短，爆发量大，裂解效果好，抗菌效果好；本发明的噬菌体具有较高的稳定性，拥有能够更好的抗酸碱以及抗高温的能力，可以保证其在不同环境下的存活时间，可为噬菌体制剂提供更广的应用环境。

Description

一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及噬菌体组合物和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及噬菌体组合物和应用。
背景技术
沙门氏菌是一种常见的食源性病原菌，该菌主要感染人和动物，每年全球约有9380万人因感染沙门氏菌引起腹泻，也给全世界范围内的养殖业造成了重大的经济损失。研究发现，在食品链的各环节中，污染沙门氏菌最严重的是养殖的环节，但菌株血清型别比较单一；其次是零售的环节，但血清型种类丰富；污染相对较低的是屠宰的环节。在我国，沙门氏菌在肉类食品中的检出率20％左右。而鸡肉类产品的污染更为严重，甚至可以达到45.2％。蛋类食品的沙门氏菌污染主要是由于粪便引起的，多数沙门氏菌主要在蛋壳上检出，但是由于生殖道感染或蛋壳破碎，也会导致鸡蛋内部的沙门氏菌污染。
抗生素是治疗细菌性疾病最有效的手段之一，因为其抗菌效果好、副作用小和价格低等特点被广泛应用于各种动物疾病的预防和治疗，同时还被作为饲料添加剂加入多种畜禽的饲料中。但由于抗生素在动物生产中的滥用，很多细菌都产生了相应的耐药性，细菌耐药性不仅严重影响了养殖业，也对人类的生命健康安全造成了重大威胁。
噬菌体(phage)是一种能够特异性感染细菌的病毒，广泛存在于各种环境中，如粪便、土壤、水源甚至人和动物体内。依据其生物学生长周期，噬菌体主要分为两大类：裂解性噬菌体(又称为烈性噬菌体)和溶原性噬菌体(又称为温和噬菌体)。裂解性噬菌体可以通过吸附、侵入、增殖、装配和释放五个过程将宿主细菌裂解并释放子代噬菌体；溶原性噬菌体可以将其基因整合在宿主细菌上，可随细菌染色体的复制而复制。
由于目前细菌耐药的问题愈发严重，而新型抗生素的研发变得相对缓慢，噬菌体疗法作为一种可能的替代疗法重新引起了人们的兴趣。噬菌体鸡尾酒是噬菌体应用中最常见的一种方法，它将多种噬菌体按一定比例混合后制成的。相比于单一噬菌体制剂，噬菌体鸡尾酒治疗过程中更难以出现噬菌体耐受菌株，裂解效果更好，是噬菌体疗法中最常出现的方法。噬菌体鸡尾酒不仅可以应用在治疗多重耐药菌，还可以应用于养殖业和食品工业。
但当前噬菌体制剂也存在一些不足。(1)宿主谱窄。某些噬菌体只裂解一种宿主菌，不能有效杀灭食品中的其他致病菌，单一噬菌体的制剂难以达到像抗生素等抗菌剂的广谱抗菌作用。(2)稳定性差。噬菌体在特定的环境影响中(例如：温度、紫外线、pH等)，效价下降的非常快，导致抑菌的作用持续时间非常短。(3)应用噬菌体制剂后对其应用环境中其他菌群的影响。
发明内容
为此，本发明提供一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体及噬菌体组合物和应用，以解决现有噬菌体宿主谱窄、稳定性差等问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明第一方面提供的一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体，所述噬菌体为噬菌体16-7w或噬菌体235c1；根据透射电镜形态学显示，所述噬菌体16-7w属于肌尾病毒科，噬菌体235c1属于短尾噬菌体科。
噬菌体的基因组分析：噬菌体16-7w的基因组为双链DNA，基因组大小为155665bp，G+C的含量为50％。通过BlastN在线比对工具，发现与其相似度最高的菌株为志贺氏菌噬菌体MK-13，相似度为97.6％，序列覆盖度为88％。通过RAST注释，共注释出200个开放阅读框(ORF)，有129个ORFs为假定蛋白序列，其余71个ORFs为已知功能蛋白。噬菌体235c1的基因组为双链DNA，基因组大小为42111bp，G+C的含量为47％，与其相似度最高的菌株为沙门氏菌噬菌体SE22，相似度为99.89％，序列覆盖度为80％。通过RAST注释，235c1基因组共注释出67个ORFs，其中有14个ORFs为假想蛋白序列，其余53个ORFs为已知功能蛋白。
进一步的，所述噬菌体属于烈性噬菌体。
进一步的，所述噬菌体保藏于北京工商大学，轻工科学技术实验室，保藏条件为：噬菌体裂解液在4℃低温冷藏或在-80℃冷冻；间隔半年至一年，将所保藏的噬菌体活化后重新保藏，保藏编号16-7w为XYLCC NO:P20200001；235c1为XYLCC NO:P20200002。
根据本发明第二方面提供的一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体组合物，所述组合物包括噬菌体16-7w，噬菌体235c1中的一种或几种。
进一步的，所述噬菌体的总含量为1×107PFU/mL。
根据本发明第三方面提供的一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体组合物在制备防治沙门氏菌感染的产品中的应用。
进一步的，所述产品包括药物、饲料添加剂、清洁剂和消毒剂。
进一步的，所述组合物中，噬菌体16-7w的潜伏期在10min以内，爆发期为40min，爆发量为20.9PFU/cell；噬菌体235c1的潜伏期为20min，爆发期为50min，爆发量为57.1PFU/cell。
进一步的，所述沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌，德尔卑沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，火鸡沙门氏菌，吉伟沙门氏菌，病牛沙门氏菌中的一种或几种。
保藏屠宰车间最常检出的肠炎沙门氏菌为宿主筛选到宽谱噬菌体16-7w,国内食品中最常出现的德尔卑沙门氏菌为宿主，筛选到宽谱噬菌体235c1。噬菌体16-7w在60℃以下可以保持稳定，80℃时235c1可在60min内保持稳定。16-7w和235c1皆为宽谱噬菌体。对16-7w和235c1两株噬菌体进行体外裂解实验，结果表明1h内高浓度的宿主菌大幅度下降。将两株噬菌体混合成为噬菌体鸡尾酒制剂后应用在鸡肉表面时，杀菌的效果优于单一噬菌体，且杀菌率能够达到99.75％。
本发明具有如下优点：
本发明的噬菌体属于烈性噬菌体，是一种天然的杀菌物质；本发明的噬菌体在宿主体内潜伏期短，爆发量大，裂解效果好，抗菌效果好；本发明的噬菌体具有较高的稳定性，能够更好的抗酸碱以及抗高温的能力，可以保证其在不同环境下的存活时间，可为噬菌体制剂提供更广的应用环境。
由本发明的实施例可见，与现有的噬菌体相比，本发明由噬菌体16-7w和噬菌体235c1混合后的混合噬菌体，在短时间内杀灭肠炎沙门氏菌和韦太弗雷登沙门氏菌效果更好；且将两株噬菌体混合成为噬菌体鸡尾酒制剂后应用在鸡肉表面时，杀菌率能够达到99.75％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例1提供的噬菌体16-7w和噬菌体235c1两株噬菌体在双层平板实验中的噬菌斑形态图；其中，A-噬菌体16-7w；B-噬菌体235c1；
图2为本发明实施例1提供的两株噬菌体在透射电镜下观察到的噬菌体颗粒形态；其中，A-噬菌体16-7w；B-噬菌体235c1；
图3为本发明实施例1提供的噬菌体16-7w的一步生长曲线；
图4本发明实施例1提供的噬菌体235c1的一步生长曲线；
图5本发明实施例1提供的噬菌体16-7w的pH稳定性的实验结果图；
图6本发明实施例1提供的噬菌体235c1的pH稳定性的实验结果图；
图7本发明实施例1提供的噬菌体16-7w的热稳定性实验结果图；
图8本发明实施例1提供的噬菌体235c1的热稳定性实验结果图；
图9本发明实施例1提供的宿主菌血清型；
图10本发明实施例1提供的两株噬菌体的裂解活性图；
图11本发明实施例2提供的两株噬菌体的电泳结果图；其中，M为5000bp的marker，1道为235c1，2道为16-7w；
图12本发明实施例2提供的噬菌体16-7w全基因组图谱；其中，A圈代表16-7w噬菌体所编码的99个ORF；B圈代表G+C含量，B圈部分向外表示该区域大于全基因组平均G+C含量，而向内的峰则代表该区域小于全基因组平均G+C含量。C圈和D圈的峰代表G-C/G+C的值，C圈代表大于0，D圈色代表小于0，体现基因组出G+C的偏嗜性；
图13本发明实施例2提供的噬菌体235c1全基因组图谱；其中，A圈代表16-7w噬菌体所编码的99个ORF；B圈代表G+C含量，B圈部分向外表示该区域大于全基因组平均G+C含量，而向内的峰则代表该区域小于全基因组平均G+C含量。C圈和D圈的峰代表G-C/G+C的值，C圈代表大于0，D圈色代表小于0，体现基因组出G+C的偏嗜性；
图14本发明实施例3提供的通过OD600绘制噬菌体16-7w和噬菌体235c1的裂解曲线图；其中，A-噬菌体16-7w；B-噬菌体235c1；
图15本发明实施例3提供的通过细菌计数法绘制沙门氏菌噬菌体16-7w和噬菌体235c1的裂解曲线图；其中，A-噬菌体16-7w；B-噬菌体235c1；
图16本发明实施例3提供的在4℃和25℃下噬菌体16-7w和235c1单独在鸡肉表面杀菌实验；其中，图A和图B分别为4℃下噬菌体16-7w和噬菌体235c1的应用；图C和图D分别为25℃下噬菌体16-7w和噬菌体235c1的应用；
图17本发明实施例3提供的噬菌体16-7w和噬菌体235c1混合杀菌实验；
图18为本发明整体的技术路线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的研究路线图如图18所示。
污水样：采集自北京某医院。
牛粪样本：采集自北京周边养殖场。
分离噬菌体的宿主菌为Sa15370肠炎沙门氏菌(后文简称为17-6c沙门氏菌)、235肠炎沙门氏菌(后文简称为235c沙门氏菌)和Sa14677韦太弗雷登沙门氏菌(后文简称为16-7w沙门氏菌)。噬菌体裂解谱宿主菌如表1所示,共54株不同血清型的沙门氏菌。
表1裂解谱所用宿主菌
培养基：
1.液体LB培养基：1％NaCl、1％胰蛋白胨(Tryptone)、0.5％酵母提取物(YeastExtract)溶于适量去离子水中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
2.半固体LB培养基：在液体LB培养基中再加入0.75％的细菌琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。
3.固体LB培养基：在液体LB培养基中再加入1.5％的细菌琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。
4.1％琼脂糖凝胶：将TBE用超纯水稀释成0.5*TBE电泳液。在0.5*TBE电泳液中加入1％琼脂糖粉末，用微波炉加热5min使其完全溶解，置于56℃水浴锅中水浴冷却。按比加入GoldView核酸染液，稀释成0.5μg/mL。
实施例1
本实施例提供沙门噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析：
1.样本处理
牛粪样本：
(1)将牛粪样本装入50mL离心管，加入适量液体LB培养基震荡至均匀；
(2)5500rpm离心15min，取上清液；
(3)10000rpm离心10min，取上清液；
(4)用0.2μm的针头式滤器过滤上清液。
污水样本：
(1)将不同污水样本分别加入50mL离心管；
(2)5500rpm离心15min，取上清液；
(3)用0.2μm的针头式滤器过滤上清液。
2.沙门氏菌噬菌体的初步分离
采用16-7韦太弗雷登沙门氏菌、17-6肠炎沙门氏菌和235肠炎沙门氏菌做为宿主菌，从样本中分离沙门氏菌噬菌体。
(1)取2mL的各组过滤后的上清液，加入4mL处于对数期生长的宿主菌菌液中，静置过夜，获得增菌液；
(2)增菌液混匀后取1mL，加到灭菌的1.5mL离心管中，10000rpm离心10min；
(3)用0.2μm的过滤器过滤上清液，获得噬菌体原液；
(4)将4mL半固体LB培养基融化，冷却至50℃，加入100μL处于对数期的17-6肠炎沙门氏菌、235肠炎沙门氏菌或16-7韦太弗雷登沙门氏菌液，快速混匀后倒在LB固体培养基上，迅速摇动平板使半固体LB均匀分布，制成双层平板，置于安全柜中至其表面凝固。
(5)取0.5mL噬菌体原液，对照组取0.5mL无菌LB培养基加到双层平板上，用涂布棒均匀刮开，避免破坏上层琼脂，待其干燥后倒置放入37℃温箱。
(6)过夜培养，12h后观察噬菌空斑和菌苔的形成情况，以判断样品中是否含有沙门氏菌噬菌体，每个样品做两组平行。
3.噬菌体的纯化
噬菌体纯化主要通过双层平板法和噬菌斑纯化法进行。
(1)挑选出初步分离过程中出现空班的噬菌体原液，用LB液体培养基进行梯度稀释至10-8；
(2)将半固体LB培养基融化，冷却至50℃，加入100μL宿主菌液，快速混匀后倒在LB固体培养基上，迅速摇动平板使半固体LB均匀分布，制成双层平板，在安全柜中自然晾干；
(3)取100μL的10-4,10-6和10-8浓度梯度的噬菌体原液，分别加到双层平板上，用涂布棒均匀涂布，避免刮破上层平板。干燥后倒置放入37℃温箱，过夜培养。
(4)12h后，观察是否有空斑出现，空斑即噬菌斑，挑选出有噬菌斑的平板，仔细观察噬菌斑的大小，透明度和边缘形状，挑选噬菌斑大的，透明度高，边缘整齐的噬菌斑，用无菌10μL枪头刺穿戳取噬菌斑，放入加入1mL LB培养基的1.5mL离心管，用枪吹打几次，在37℃，200rpm，摇30min，使枪头上和被戳取培养基上的噬菌体分散到培养液中；
(5)加入100μL出于对数期的宿主菌液，静置2-3h，10000rpm离心10min，取上清进行梯度稀释，选取合适浓度梯度的噬菌体液进行双层平板实验；
(6)每种噬菌体重复纯化3-5次，至双层平板中长出大小形态相似的噬菌斑。用0.22μm的滤膜过滤后，保存在4℃冰箱。
4.噬菌体效价的计算
噬菌体的效价(PFU/mL)是指每毫升样品中含有噬菌体的个数，即噬菌体的浓度，通常是通过通常是通过噬菌斑计数法来测定的。
(1)将半固体LB培养基融化，冷却至50℃，加入100μL宿主菌液，快速混匀后倒在LB固体培养基上，迅速摇动平板使半固体LB均匀分布，制成双层平板。
(2)将待测噬菌体用液体LB进行梯度稀释至10-8，取10μL点在双层平板上，每个浓度做三组平行。
(3)干燥后倒置放入37℃温箱，过夜培养。
(4)第二天，记录在某浓度下可计数噬菌斑数。噬菌体效价＝平均噬菌斑数×稀释倍数×100。
5.噬菌体的保藏
噬菌体的裂解液通常是在4℃低温冷藏或在-80℃冷冻。在保藏前要确保噬菌体的效价不会太低，在长期保藏过程中噬菌体的效价会有所下降，所以间隔半年至一年，要将保藏的噬菌体活化后重新保藏。
(1)将效价高于108的噬菌体裂解液用0.22μm的滤膜过滤，向滤液中加入1-2滴氯仿，置于4℃冰箱。
(2)向过滤后的噬菌体裂解液中加入30％的甘油，彻底混匀后置于-80℃冰箱中冷冻保藏。
6.噬菌体的生理生化特征
6.1噬菌体的形态学分析
使用透射电镜对浓缩的噬菌体颗粒进行形态学分析，具体方法参照《分子克隆实验指南》：取效价在108-1010(PFU/mL)的噬菌体颗粒10μL滴加在铜网上，静置沉淀15min，用滤纸吸去多余液体。用2％的磷钨酸染色10min，用滤纸吸去多余液体。彻底干燥后用透射电镜(TEM)观察噬菌体菌体的形态。
由图1可见，两株噬菌体噬菌斑的形态均具有典型的裂解性噬菌体特征，噬菌斑边缘整齐，透明度高。
由图2可见，噬菌体16-7w，其头部立体对称，呈现出典型正多面体结构，头部长径约100nm，尾部长度约135nm，尾部直径约为19nm。按照国际病毒分类委员会分类规则，肌尾病毒科噬菌体具有收缩性、硬度不等且较粗长尾，尾长80-455nm，尾部直径16-20nm，故将该噬菌体归类为有尾噬菌体目(Caudovirales)，肌尾病毒科(Myoviridae)。
噬菌体235c1，其具有典型立体对称头部和非收缩性尾部，头部长径约55nm，尾部长约17nm，符合短尾噬菌体科(Podoviridae)特点。故将该噬菌体归类为有尾噬菌体目，短尾噬菌体科。
2.3.6.2噬菌体最佳感染复数的测定
感染复数(MOI)是指噬菌体感染宿主菌时噬菌体数量与宿主菌数量的比值，即MOI＝PFU/CFU。在噬菌体培养过程中使用最佳MOI培养，能收获最多的噬菌体。具体的实验步骤如下：
(1)将宿主细菌培养至对数期，测量OD600，并将宿主菌梯度稀释至10-10，每个浓度取10μL点板，做三组平行实验。
(2)倒置于37℃培养，第二天对菌落计数，单位体积菌落总数(CFU)＝平均菌落数×稀释倍数×100；
(3)重新培养宿主菌至对数期，测量OD600，调整宿主菌浓度使其等于上文中测量值。
(4)向对数期的宿主菌中加入适量噬菌体使MOI分别为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
(5)将摇菌管放入摇床200rpm，37℃摇4h。
(6)取1mL菌液，放入1.5mL离心管中，10000rpm离心10min，用双层平板法测量上清液效价。通过公式：MOI＝PFU/CFU计算MOI。
(7)同时以不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体为对照。以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。
如表2所示噬菌体16-7w的感染复数的测定结果，在感染复数为0.1时，噬菌体感染宿主菌产生的子代噬菌体效价最高，为1.93×1011PFU/mL，是八组实验中效价最高的一组，所以噬菌体16-7w的最佳感染复数为0.1，用此感染复数对该噬菌体进行扩增最佳。
如表3所示噬菌体235c1的感染复数的测定结果，在感染复数为0.0001时，噬菌体感染宿主菌产生的子代噬菌体效价最高，为2.5x1010 PFU/mL，是八组实验中效价最高的一组，所以噬菌体235c1的最佳感染复数为0.0001。
表2噬菌体16-7w感染复数测定结果
表3噬菌体235c1感染复数测定结果
6.3噬菌体一步生长曲线的测定(one-step growth curve)
噬菌体的一步生长曲线可以定量描述噬菌体的生长规律，即通过双层平板计数法测定不同时间点，裂解液中噬菌体的效价。具体的实验步骤如下：
(1)取对数期的宿主菌，按上文所测最佳MOI加入噬菌体，37℃，水浴10min。
(2)12000rpm离心1min，弃上清。
(3)用LB液体培养基洗涤沉淀两次，以去除未吸附的噬菌体。
(4)将被噬菌体侵染的菌体沉淀加入37℃预热的LB培养基，吹打混匀后，立即放入37℃震荡培养。
(5)在0时刻和每隔10min取样，12000rpm离心10min；
(6)取上清稀释后，利用双层平板法测定效价；分别以不加宿主菌的噬菌体液和不添加噬菌体的宿主菌液作为对照。
(7)以感染时间为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线。根据生长曲线可以计算，噬菌体的平均爆发量。计算公式为：平均爆发量＝爆发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。
如图3所示，通过一步生长曲线可以看出噬菌体16-7w的潜伏期约为10分钟以内，爆发时间为40分钟，然后进入稳定期，通过公式计算可以得到爆发量为20.9±4PFU/cell。
如图4所示，通过一步生长曲线可以看出噬菌体235c1的潜伏期约在20分钟以内，爆发时间为50分钟，然后进入稳定期，通过公式计算可以得到爆发量为57.1±9PFU/cell，具有较高的裂解活性。
6.4噬菌体的pH稳定性
通过改变噬菌体裂解液的pH后用双层平板计数法测效价，探究改变pH对噬菌体稳定性的影响。具体实验步骤如下：
(1)使用HCl和NaOH将LB液体培养基的pH调至2-14；
(2)将100μL无菌噬菌体裂解液加入到900μL pH值为2-14的LB液体培养基中。
(3)放入37℃水浴2h。
(4)通过双层平板法测量各pH梯度中噬菌体的效价。实验设置三个平行。
如图5所示，噬菌体16-7w在pH值为4-12之间都比较稳定，在pH4左右噬菌体效价为2.33x107 PFU/mL，在pH12左右的强碱环境中，效价仍能达到7x107PFU/mL，证明噬菌体16-7w具有很好的pH稳定性。在pH3和pH13的时候噬菌体效价下降较明显，在pH2和pH14时基本无法检测到噬菌斑存在，证明已无噬菌体的存在。
如图6所示，噬菌体235c1在pH值为5-12之间都比较稳定，在pH5左右噬菌体效价为5.4x107 PFU/mL，在pH12左右的强碱环境中，效价仍能达到2.4x107PFU/mL，证明噬菌体235c1具有很好的pH稳定性。在pH3、pH4和pH13的时候噬菌体效价下降较明显，在pH2和pH14时基本无法检测到噬菌斑存在，证明已无噬菌体的存在。
6.5噬菌体的温度稳定性
通过改变噬菌体培养温度，用双层平板计数法测定噬菌体效价，探究噬菌体对温度变化的稳定性。具体实验步骤如下：
(1)取无菌噬菌体液分别置于40、50、60、70、80、90℃金属浴中，分别放置20min、40min和60min；
(2)到时间后立即将噬菌体液冰浴，以降温；
(3)用双层平板法测定噬菌体在每个温度不同时间的效价。以初始的效价作为对照。实验重复三次。
由图7可见，噬菌体16-7w在40-60℃处理20min，40min和60min时效价下降很少，几乎没有变化。在70℃时效价明显下降，60min组下降比20min和40min组稍多。在80℃时，20min和40min组噬菌体效价下降至104PFU/mL左右，60min组已基本检测不到活的噬菌体。在90℃时20min开始就没有活的噬菌体存在。
由图8中可见，噬菌体235c1在40-70℃处理20min，40min和60min时效价下降很少，几乎没有变化。在80℃高温时效价略有下降，但是处理60min后效价仍能达到6.7x107PFU/mL，说明噬菌体235c1的温度稳定性非常好。在90℃时，20min和40min组噬菌体效价分别下降至7.67x105PFU/mL和3.67x104PFU/mL左右，60min组已基本检测不到活的噬菌体。
6.6噬菌体裂解谱的测定
通过空斑法测定噬菌体裂解谱。具体实验步骤如下：
(1)制备较高效价的噬菌体裂解液(大于108PFU/mL)
(2)将56株实验室待测沙门氏菌培养至对数期后，取100μL制成双层平板；
(3)将10μL噬菌体滴在上面，干燥后37℃倒置培养，过夜后观察噬菌体滴加的区域是否有空斑出现，若有空斑则证明噬菌体可裂解该宿主菌；
(4)统计3株噬菌体裂解54株沙门氏菌的情况，制成裂解谱。
共选择54株沙门氏菌做为宿主菌，进行裂解谱实验。其中具有39种不同血清型，包含肠炎沙门氏菌4株，德尔卑沙门氏菌6株，鼠伤寒沙门氏菌4株，火鸡沙门氏菌2株，吉伟沙门氏菌2株，病牛沙门氏菌2株，具体血清型如图9所示。
分别对噬菌体16-7w和235c1进行了裂解谱实验，如图10所示。
其中，16-7w的裂解谱最广，可以裂解20株沙门氏菌，包括2株德尔卑沙门氏菌和2株火鸡沙门氏菌，如表5所示。235c1可以裂解9株沙门氏菌，如表6所示。
表5噬菌体16-7w裂解谱
表6噬菌体235c1裂解谱
分离纯化的两株噬菌体16-7w、235c1产生的噬菌斑均具有烈性噬菌体的噬菌斑的特征，初步确认两株噬菌体为烈性噬菌体。烈性噬菌体可以作为天然的杀菌物质，为后续噬菌体鸡尾酒疗法提供备选。在观察噬菌体噬菌斑的过程中发现，培养相同时间后，噬菌体235c1的噬菌斑比的噬菌体16-7w噬菌斑略大，说明噬菌体235c1裂解宿主细胞后复制产生的子代噬菌体更多，裂解效果好。而一步生长曲线中的爆发量和后文的裂解曲线也印证了这一点，这提示了分离筛选噬菌体的过程中，尽量选择噬菌斑大的噬菌体进行分离。
MOI是指噬菌体感染复数，即感染开始是噬菌体与宿主菌的比例。不同噬菌体的最适MOI也不同，16-7w的最适MOI为0.1，235c1的最适MOI为0.0001，少量噬菌体与宿主菌共同培养就能获得109以上大量子代噬菌体，为后续噬菌体治疗裂解病原菌提供大量噬菌体。
通过一步生长曲线实验，测得噬菌体16-7w和235c1的潜伏期分别为10min，20min和20min，爆发期分别为40min，50min和80min，爆发量分别为20.9±4PFU/cell，57.1±9PFU/cell和29.9±7PFU/cell。与之前报道的肠炎沙门氏菌噬菌体PSM6和鼠伤寒沙门氏菌ΦSHDA-1相比，噬菌体16-7w的潜伏时间更短，噬菌体235c1的爆发量更大。理论上不同噬菌体裂解同种宿主菌，潜伏期越短，噬菌体吸附宿主菌更快，释放量越大，噬菌体裂解宿主菌的效果越好，产生的子代噬菌体越多，作为抗菌剂应用的潜力就越大。
通过pH耐受和温度耐受实验，发现噬菌体16-7w在pH4-12之间保持稳定，235c1在pH5-12之间保持稳定。与过往报道沙门氏菌噬菌体相比，噬菌体16-7w和噬菌体235c1的稳定性更好，可以耐受更为极端的酸碱环境。噬菌体16-7w在60℃以下可以保持稳定。之前报道的沙门氏菌噬菌体通常耐受的温度为60-70℃左右，而235c1可以在80℃的温度下保持稳定60min。噬菌体具有较高的稳定性，可为噬菌体制剂提供更广的应用环境，保证噬菌体在不同环境中的存活时间，从而达到对宿主菌的裂解效果。
噬菌体具有特异性裂解宿主菌的特点，对其他生物均不可裂解，这保证了噬菌体应用的安全性，但是裂解谱窄成为噬菌体治疗的最大障碍之一。本实验使用58株沙门氏菌包含39种血清型进行裂解谱实验，16-7w的裂解谱最广，可以裂解20株沙门氏菌，包括18种血清型，235c1可以裂解9株不同血清型的沙门氏菌。与之前报道的沙门氏菌噬菌体PSM6(裂解5种血清型)，OSY-STA(裂解15种血清型)，OSY-SHC(裂解6种血清型)相比，噬菌体16-7w的裂解谱更广，在后续制作抗菌剂的过程中具有更大的应用前景。此外，根据林本夫等人的报道，鼠伤寒和肠炎沙门氏菌在猪和鸡的屠宰车间检出率最高，而在食品中德尔卑沙门氏菌为检出最主要的血清型，噬菌体16-7w能够裂解德尔卑和鼠伤寒沙门氏菌，235c1可以裂解肠炎、德尔卑和鼠伤寒沙门氏菌，上述两种噬菌体均有对食品中常见血清型沙门氏菌的裂解能力，有望应用于食品中沙门氏菌的控制。
实施例2
本实施例提供两株噬菌体的基因组研究：
1.噬菌体的富集
噬菌体富集实验方法依据《分子克隆实验指南》第三版中，使用NACl和PEG8000沉淀提取λ噬菌体的方法，稍作修改，具体实验步骤如下
(1)将宿主菌接种于400mL LB液体培养基，37℃振荡培养至对数期。以最佳MOI加入噬菌体，37℃继续培养至宿主菌完全裂解，已达到扩增噬菌体的目的。
(2)将裂解液在10000rpm，4℃离心10min，取上清测定效价(确保效价大于108)。
(3)向上清液中分别加入DNaseI和RNaseA至终浓度1μg/mL，在室温下作用30min。这一步将消化掉裂解细菌的DNA和RNA，否则后续实验中宿主菌的DNA和RNA会将噬菌体颗粒带走。
(4)称取适量NaCl加入上述液体，使其终浓度达到1mol/L，搅拌溶解后，冰浴1h，NACl可将裂解的细菌碎片和噬菌体分离得更彻底。
(5)8500rpm，4℃离心15min，去除细胞碎片；
(6)量取上清，向其中加入适量PEG8000使其终浓度达到0.1g/mL，缓慢搅拌溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒完全沉淀；
(7)将上述液体10000rpm，4℃离心15min，弃上清，回收噬菌体沉淀，倒置离心瓶使液体流干；
(8)用2mL SM液重悬噬菌体沉淀，再加入等体积三氯甲烷抽提噬菌体悬浮液中的细胞碎片，缓慢颠倒混匀几次；
(9)4000rpm，4℃离心15min，分离有机相和水相，回收上层水相，为浓缩的噬菌体，置于4℃保存。
由电泳结果如图11所示，条带清晰，可以进行下一步测序。
2.噬菌体核酸的提取
采用艾比根公司的λ噬菌体基因组DNA提取试剂盒，提取噬菌体基因组。具体操作步骤按照试剂盒说明书进行操作。
3噬菌体基因组的建库测序
噬菌体基因组的建库测序工作是由北京化工大学完成，其中建库的试剂为NEB公司的NEBNext Ultra II FS DNA Library；测序平台为Illumina NovaSeq，利用质量控制软件FastQC v0.11.5对原始测序数据质量进行分析，并使用默认参数的Trimmomatic 0.36对低质量序列和接头区域进行过滤。其产生的高质量序列，使用SPAdes v3.13.0软件进行拼接。通过BLASTn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行核酸序列相似性搜索，先在RAST(http://rast.nmpdr.org/)上进行基因注释，然后在BLASTp上进行氨基酸序列比对。
4噬菌体功能基因组学分析
(1)基因组组分分析
利用snapgene软件对噬菌体全长序列进行基因组组分一般性分析，包括四种碱基的组成比例、GC含量。
(2)基因预测
采用RAST在线注释工具对全基因组序列进行基因预测。采用tRNAscan-SE预测全基因组中的tRNA基因。
(3)基因功能注释
应用NCBI的在线软件基本局部比对搜索工具BLASTP对预测的各个基因进行逐个检索分析，推测其基因功能。用画图工具在线软件CGView对两株噬菌体的全基因组进行图谱构建，生成展示序列特性、基本组成片段和功能注释的圆形基因图。
(4)有害基因的筛查用
利用在线工具ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)预测三种噬菌体基因组的抗生素抗性基因。
使用VirulenceFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)筛查三种噬菌体基因组是否存在毒力基因。
16-7w是沙门氏菌噬菌体的全基因组分析表明：噬菌体16-7w的基因组为双链DNA，基因组大小为155665bp，G+C的含量为50％。通过BlastN在线比对工具，发现与其相似度最高的菌株为志贺氏菌噬菌体MK-13，相似度为97.6％，序列覆盖度为88％。
通过RAST在线注释工具对全基因组序列进行基因预测。16-7w基因组共注释出200个开放阅读框(ORF)，其中有77个ORFs分布在正链，有129个ORFs为假想蛋白序列，其余71个ORFs为已知功能蛋白。采用tRNAscan-SE预测出16-7w中共有5个tRNA基因，分别是tRNA-Met-CAT，tRNA-Arg-TCT，tRNA-Asn-GTT，tRNA-Ser-GCT和tRNA-Pro-CGG。利用在线工具CGView所作沙门氏菌噬菌体16-7w的全基因组模式图如图12。
通过对沙门氏菌噬菌体235c1的全基因组分析表明：噬菌体235c1的基因组为双链DNA，基因组大小为42111bp，G+C的含量为47％。通过BlastN在线比对工具，发现与其相似度最高的菌株为沙门氏菌噬菌体SE22，相似度为99.89％，序列覆盖度为80％。
通过RAST在线注释工具对全基因组序列进行基因预测。235c1基因组共注释出67个开放阅读框(ORF)，其中有14个ORFs为假想蛋白序列，其余53个ORFs为已知功能蛋白。采用tRNAscan-SE预测出235c1中共有1个tRNA基因tRNA-Pseudo-CGT。利用在线工具CGView所作沙门氏菌噬菌体235c1的全基因组模式图如图13。
实施例3
本实施例提供沙门氏菌噬菌体16-7w和沙门氏菌噬菌体235c1的裂解特性以及在鸡肉表面杀菌的应用。
宿主菌：16-7韦太弗雷登沙门氏菌和235肠炎沙门氏菌。
1.通过测OD600值分析噬菌体裂解动力学
通过在不同时间段测量OD600值的方法观测宿主菌浓度的变化，反映出噬菌体裂解宿主菌的效果和速度。
(1)将两种宿主菌16-7韦太弗雷登沙门氏菌和235肠炎沙门氏菌培养至对数期，测量OD600值。
(2)按照最适MOI添加适量噬菌体，37℃，150rpm，摇床振荡培养。以只有细菌而不添加噬菌体作为对照组(CK)。
(3)分别在0、1、2、3、4、5h时取样，用酶标仪测定OD600值，并观察其变化。以时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制裂解曲线。实验设置三组平行。
分别以噬菌体16-7w和235c1的最适MOI，添加进对数期的宿主菌。以只有宿主菌，未添加噬菌体作为对照组(CK)。通过测量不同时间段菌液的OD600值，制成裂解曲线。
如图14A所示，CK为对照组，其中只有细菌而没有噬菌体16-7w，可以明显看出宿主菌沙门氏菌的OD600值随时间增加有明显上升，在0h时OD600值在0.43左右，开始培养后一直上升，在5h时OD600值达到0.86。而添加噬菌体16-7w的实验组中OD600值在1-4h时呈现缓慢下降的趋势，到4h时OD600值仅从0.44降为0.38，在5h时OD600值迅速下降到达0.21左右，相比于初始的OD600值，下降的幅度还是比较大的，说明噬菌体16-7w的作用效果比较好。
如图14B所示，可以明显看出对照组中因为没有添加噬菌体235c1，宿主菌沙门氏菌的OD600值随时间增加有明显上升，在0h时OD600值在0.42左右，开始培养后一直上升，在5h时OD600值达到0.77。而添加噬菌体235c1的实验组中OD600值在1-3h时就快速下降，在0-3h时OD600值从0.42降到仅为0.16，在4h-5h时OD600值基本稳定在0.15左右。相比于初始的OD600值，下降的幅度非常大。说明噬菌体235c1作用效果非常好，作用的时间也很短。
2.通过细菌计数法分析噬菌体裂解效力
通过在不同时间段取样，进行菌落计数的方法，观测裂解液中剩余宿主菌的数量，反映出噬菌体的裂解效果和速度。
(1)将两种宿主菌16-7韦太弗雷登沙门氏菌和235肠炎沙门氏菌培养至对数期
(2)按照最适MOI添加适量噬菌体16-7w和噬菌体235c1，用LB培养基将每组调至相同体积，37℃，150rpm，摇床振荡培养。
(3)分别在0、1、2、3、4、5h时取样，8000rpm，离心5min，并用无菌PBS清洗菌体沉淀两次，最后用无菌PBS重悬菌体沉淀。
(4)将菌液稀释至合适梯度，进行点板计数。以只有细菌而不添加噬菌体作为对照组(CK)。以时间为横坐标，以菌落数量的对数值为纵坐标，绘制裂解曲线。实验设置三组平行。
分别以噬菌体16-7w和235c1的最适MOI，添加进对数期的宿主菌。以只有宿主菌，未添加噬菌体作为对照组(CK)，通过对不同时间段宿主菌的菌落计数，制成裂解动态图。
如图15A所示，CK为对照组，其中只有细菌而没有噬菌体16-7w，可以明显看出宿主菌沙门氏菌的数量随时间增加有明显上升，在0h时宿主菌的数量在1x1010左右，开始培养后宿主菌的数量一直上升，在5h时宿主菌的数量达到2.3x1013。而添加噬菌体16-7w的实验组中宿主菌的数量在5h内呈现下降的趋势，到5h时宿主菌的数量为1x106，相比于初始的宿主菌数量1x1010，下降的幅度还是比较明显，说明噬菌体16-7w能够很好地控制宿主菌。
如图15B所示，可以明显看出对照组中因为没有添加噬菌体235c1，宿主菌沙门氏菌的数量随时间增加有明显上升，在0h时数量在1x1010左右，开始培养后一直上升，在5h时宿主菌的数量达到3x1013。而添加噬菌体235c1的实验组中宿主菌的数量在1-5h中匀速下降，在5h时宿主菌的数量基本稳定在3.6x105左右。相比于初始宿主菌数量1x1010，下降的幅度很大，相比于噬菌体16-7w组的实验，噬菌体235c1裂解宿主菌数量更多，说明噬菌体235c1控制宿主菌的效果很好。
3.两株噬菌体在鸡肉上单独杀菌实验
(1)对肉样进行预处理，用将鸡肉切成表面积为的2x2 cm2肉块，并确保试验表面平整，放置在无菌培养基内。
(2)置于安全柜紫外灯下灭菌处理30min，得到无菌肉样。
(3)将肉样置于无菌培养皿中央，平整的试验切面朝上，用移液枪取25μL的宿主菌(104CFU)随机滴加于肉表面，得到人工污染宿主菌的肉样。将肉样置于安全柜中风干。
(4)用噬菌体对肉样进行处理，取100μL效价为107PFU/mL的噬菌体滴加于样品上，尽量覆盖住滴加宿主菌的位置。
(5)对于不加噬菌体的对照组，滴加无菌SM缓冲液。
(6)将装有样品的培养皿盖好，为了避免改变肉样所处的环境，用封口条将培养皿封住，并将样品分别置于4℃冰箱和25℃恒温箱中储藏。
(7)分别于0、1、2、3、4、5h时取样，用无菌棉签在蘸取LB培养基在鸡肉表面涂抹10次后，放入1.5mL的离心管中充分混匀，8000rpm离心10min，得到含有噬菌体的上清液和含有宿主菌的沉淀，使用LB培养基对宿主菌沉淀清洗两次。
(8)通过双层平板计数法对噬菌体的效价进行测量，通过菌落计数对宿主菌进行计数，分析噬菌体的杀菌效果。
以只有宿主菌，未添加噬菌体作为对照组(CK)，通过对不同时间段宿主菌的菌落计数和噬菌体效价的计算，验证对沙门氏菌的控制效果。
如图16A所示噬菌体16-7w在4℃下单独应用在宿主菌污染的鸡肉表面，未加噬菌体的CK组宿主菌的浓度基本保持稳定在105CFU/mL左右。添加噬菌体16-7w的实验组中，噬菌体16-7w的效价在0-5h基本维持在106PFU/mL左右，而宿主菌的浓度有明显的降低，从0h时的2.1x104CFU/mL，在5h时降低至400CFU/mL，相对于初始浓度降低2个数量级，灭菌率为98.1％。
如图16B所示噬菌体235c1在4℃下单独应用在宿主菌污染的鸡肉表面，未加噬菌体的CK组宿主菌的浓度基本保持稳定在104CFU/mL左右。而添加噬菌体16-7w的实验组中，噬菌体235c1的效价在0-5h基本维持在106PFU/mL左右，而宿主菌的浓度有明显的降低，从0h时的4.2x104CFU/mL，在5h时降低至500CFU/mL，相对于初始浓度降低2个数量级，灭菌率为98.8％。
如图16C所示噬菌体16-7w在25℃下单独应用在宿主菌污染的鸡肉表面，未加噬菌体的CK组宿主菌的浓度在0-5h内稳定上升，从0h时6.67x104CFU/mL，在5h时上升至1.33x107CFU/m。而添加噬菌体16-7w的实验组中，噬菌体16-7w的效价在0-5h基本维持在106PFU/mL左右，而宿主菌的浓度有明显的降低，从0h时的2.7x104CFU/mL，在5h时降低至4000CFU/mL，相对于初始浓度降低1个数量级，灭菌率为85.1％。
如图16D所示噬菌体235c1在25℃下单独应用在宿主菌污染的鸡肉表面，未加噬菌体的CK组宿主菌的浓度在0-5h内稳定上升，从0h时3.33x104CFU/mL，在5h时上升至3x106CFU/mL。而添加噬菌体235c1的实验组中，噬菌体235c1的效价在0-5h基本维持在106PFU/mL左右，而宿主菌的浓度有明显的降低，从0h时的2.33x104CFU/mL，在5h时降低至600CFU/mL，相对于初始浓度降低2个数量级，灭菌率为97.42％。
4.两株噬菌体在鸡肉上的混合杀菌实验
(1)同上获得无菌肉样，同时用两种宿主菌16-7w和235c1(104CFU)共25μL对肉样进行处理。
(2)分别取50μL效价均为107PFU/mL噬菌体16-7w和噬菌体235c1，混合后滴加于样品上，尽量覆盖住滴加宿主菌的位置。
(3)分别于0、1、2、3、4、5h时取样，用无菌棉签在蘸取LB培养基在鸡肉表面涂抹10次后，放入1.5mL的离心管中充分混匀，8000rpm离心10min，得到含有噬菌体的上清液和含有宿主菌的沉淀，使用LB培养基对宿主菌沉淀清洗两次。
(4)通过双层平板计数法对噬菌体的效价进行测量，通过菌落计数对宿主菌进行计数，分析噬菌体的杀菌效果。
如图17所示为噬菌体16-7w和235c1混合的噬菌体鸡尾酒制剂在25℃下鸡肉表面应用时宿主菌浓度的变化。以只有宿主菌，未添加噬菌体作为对照组(CK)，通过对不同时间段宿主菌的菌落计数，验证对沙门氏菌的控制效果。在未加噬菌体的CK组中宿主菌的宿主菌的浓度在0-5h内稳定上升，从0h时9x104CFU/mL，在5h时上升至5x106CFU/mL。而添加两种噬菌体的实验组中，宿主菌的浓度有明显的降低，从0h时的5.33x104CFU/mL，在5h时降低至133CFU/mL，相对于初始浓度降低2个数量级，灭菌率为99.75％。
噬菌体16-7w和235c1在鸡肉表面杀菌的应用中，不论是在4℃还是25℃的条件下，都是在0-2h时宿主菌的浓度快速下降，说明在噬菌体浓度远大于宿主菌时，起效的时间非常短，这与Soni等人使用效价为108PFU/g的噬菌体p100在三文鱼表面作用2小时降低2个数量级单增李斯特菌实验，杀菌效果相近[1]。Sukumaran等人将FDA批准的沙门氏菌裂解噬菌体制剂(SalmoFresh(TM))以效价109PFU/mL应用在被伤寒沙门氏菌、海德堡沙门氏菌和肠炎沙门氏菌污染的鸡胸肉表面，在0，4和8h后沙门氏菌数量分别减少了0.8，0.9和0.4logCFU/g[2]。与本实验相比，短时间内噬菌体16-7w和235c1混合噬菌体，杀灭肠炎沙门氏菌和韦太弗雷登沙门氏菌效果更好。
在本实验在中4℃的杀菌效果明显优于25℃，但将噬菌体混合后，在25℃时也能达到非常好的杀菌效果。在4℃时，宿主菌无法进行正常的增殖，其浓度一直保持在同一个数量级，有利于噬菌体的杀菌作用。Yang等人对比了用噬菌体单独处理和噬菌体处理配合紫外照射被三种李斯特菌混合污染的鸡胸肉，结果表明单独使用噬菌体处理可使CFU减少0.84log单位，联合使用紫外线处理可使细菌计数减少2.04log单位[3]。该表明仅通过一种技术，完全杀灭病原菌污染是很困难的，结合多种技术能够更好的控制病原菌污染。
[1]Soni K A,Nannapaneni R.Bacteriophage significantly reducesListeria monocytogenes on raw salmon fillettissue[J].J Food Prot,2010,73(1):32-38.
[2]Sukumaran AT,Nannapaneni R,Kiess A,et al.Reduction ofSalmonella onchicken breastfillets stored underaerobic or modified atmosphere packaging bythe application of lytic bacteriophage preparationSalmoFreshTM.[J].Poultryscience,2016,95(3).
[3]Yang S,Sadekuzzaman M,Ha S.Reduction of Listeria monocytogenes onchicken breasts by combinedtreatment with UV-C light and bacteriophageListShield[J].LWT-FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY,2017,86:193-200.
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体组合物，其特征在于，所述组合物包括噬菌体16-7w和噬菌体235c1。
2.根据权利要求1所述一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体组合物，其特征在于，所述噬菌体的总含量为1×107PFU/mL以上。
3.一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体组合物在制备防治沙门氏菌感染的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、饲料添加剂、清洁剂和消毒剂。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组合物中，噬菌体16-7w的最佳感染复数为0.1；噬菌体235c1的最佳感染复数为0.0001。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组合物中，噬菌体16-7w的潜伏期在10min以内，爆发期为40min，爆发量为20.9PFU/cell；噬菌体235c1的潜伏期为20min，爆发期为50min，爆发量为57.1PFU/cell。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌包括肠炎沙门氏菌，德尔卑沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，火鸡沙门氏菌，吉伟沙门氏菌，病牛沙门氏菌中的一种或几种。
8.一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体为噬菌体16-7w或噬菌体235c1；其中，所述噬菌体16-7w属于肌尾病毒科，噬菌体235c1属于短尾噬菌体科。
9.根据权利要求8所述一种宽裂解谱的沙门氏菌噬菌体，其特征在于，所述噬菌体保藏于北京工商大学，轻工科学技术实验室，保藏条件为：噬菌体裂解液在4℃低温冷藏或在-80℃冷冻；间隔半年至一年，将所保藏的噬菌体活化后重新保藏，保藏编号16-7w为XYLCCNO:P20200001；235c1为XYLCCNO:P20200002。
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