CN113186168B - 一种蘑菇致腐菌噬菌体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一种分离自腐败蘑菇中的肠杆菌的噬菌体，及其作为生物添加成分或生物保鲜剂在食用菌保鲜中的应用。具体为噬菌体BTXBG52，保藏编号CGMCC NO.20708。该噬菌体可以特异性地裂解从腐败食用菌中分离得到的肠杆菌属细菌，且热稳定性强、氯仿耐受性高、释放量大，对食用菌防腐保鲜效果好。全基因组测序结果表明，该噬菌体无毒力因子，且NCBI数据库中的BLAST同源序列比对结果显示，该噬菌体基因组与数据库中目前已知的噬菌体菌株同源性仅为9％。本发明通过利用上述噬菌体制备食品抑菌剂或细菌抑菌剂，可在食用菌防腐保鲜、医疗杀菌、工厂生产中进行应用。

Description

一种蘑菇致腐菌噬菌体及其应用
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及一种分离自腐败蘑菇中的肠杆菌的噬菌体，及其作为生物添加成分或生物保鲜剂在食用菌保鲜中的应用。
背景技术：
食用菌菌体细胞在采摘后会慢慢死亡，附着在菌体上的微生物会迅速繁殖生长，菌菇肉体拥有丰富的水分和养分，导致微生物会大量繁殖并快速导致菌子实体腐烂变质。Santana等人(Santana CC,VanettiMCD,Kaauya MCM.Microbial growth and colour ofminimally processed shitake mushroom stored at differenttemperatures.International Journal of Food Science and Technology,2008,43,1281-1285.)研究了温度变化如何影响香菇中的微生物，储藏过程中的优势腐败菌为嗜温菌、假单胞菌、霉菌与酵母菌，储藏后进行检测发现假单胞菌在储藏过程中繁殖迅猛。微生物生长发育要求适宜的温度和水分，目前有很多关于抑制食用菌腐败菌的报道。如在食用菌菇体外部加食盐，会导致携带的微生物高渗透压，从而发生生理干燥；酸渍法可以有效地延长食用菌保鲜期，原因是液体中的氢离子会杀除或抑制微生物的繁殖(贺新生，张玲，何娟.酸渍食用菌加工过程中的腐败菌抑制效果研究[J].中国食用菌，2003(02)：25-26.)；Cliffe-Byrnes等人(Valerie Cliffe-Byrnes，David O’Beirne.Effects of washingtreatment on microbial and sensory quality of modified atmosphere(MA)packagedfresh sliced mushroom(Agaricusbisporus)[J].Postharvest Biology andTechnology，2007，48(2).)则将鲜切白蘑菇在气调包装下，探究不同的清洗方法对微生物(假单胞菌、嗜温菌和嗜冷菌)数量的影响，并记录感官质量变化，结论是H2O2溶液和ClO2溶液都可以减少假单胞菌的数量，但H2O2溶液效果要好于ClO2溶液，并推荐用3％的H2O2溶液清洗1min随后用4％的D-异抗坏血酸钠喷洒处理，可以有效地延长白蘑菇在货架售卖时间。
尽管上述保鲜方法可有效抑制食用菌中的微生物，延长其货架期，但是化学试剂的残留也会影响食用者健康，食用过多的化学保鲜剂可能会导致人类畸形或癌症。
噬菌体(Bacteriophage或phage)是感染细菌等微生物的病毒，可以特异地裂解宿主菌而不感染人类、动物、植物以及其它非宿主的细菌，几乎对环境不产生压力，且自我增殖快、筛选周期短、在自然界中广泛存在。另一方面，某些噬菌体能够编码一种酶，可降解宿主菌的胞外多糖聚合物(EPS)，从而破坏细菌生物被膜的形成。KIM等(KIM K P,KLUMPP J,LOESSNER M J.Enterobacter sakazakii bacteriophages can prevent bacterialgrowth in reconstituted infant formula[J].International Journal of FoodMicrobiology,2007,115(2):195-203.)分离出两株坂崎肠杆菌噬菌体，并将其应用于婴幼儿配方奶粉中，以抑制宿主菌的生长；EL等(EL H L,ROY J P,KHALIL G E,et al.Efficacyof two Staphylococcus aureus phage cocktails in cheese production[J].International Journal of Food Microbiology,2015,217:7-13.)设计噬菌体鸡尾酒，以控制奶酪中的致病性葡萄球菌，以延长奶酪保质期；YEH等(YEH Y,PURUSHOTHAMAN P,GUPTA N,et al.Bacteriophage application on red meats and poultry:Effects onSalmonella population in final ground products[J].Meat Science,2017,127:30-34.)的研究表明，噬菌体可有效控制肉制品加工过程中沙门氏菌的数量。此外，2006年10月，美国食品医药管理局FDA宣布，ListexTMP100(EBI食品安全公司，荷兰)作为“无毒认证产品”(GRAS)，可以用于清除干酪产品加工过程中可能存在的李斯特氏菌Listeria污染，佐证了噬菌体作为抗菌剂的安全可靠性。
鉴于此，本申请将提供一种分离自腐败蘑菇中的肠杆菌的噬菌体，并利用所述噬菌体防控的方法来预防和控制食用菌中的腐败细菌。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种对分离自腐败蘑菇的肠杆菌具有强烈裂解作用的噬菌体，该噬菌体可单独或者复配使用，并有效抑制肠杆菌的生长与代谢，为食用菌保鲜和货架期的延长提供一种安全、有效、绿色、廉价的噬菌体产品。
本发明首先提供一种噬菌体，该噬菌体具体为蘑菇肠杆菌噬菌体BTXBG52，全基因组测序结果表明，该噬菌体无毒力因子，且NCBI数据库中的BLAST同源序列比对结果显示，该噬菌体基因组与数据库中目前已知的噬菌体菌株同源性最高仅为9％。所述噬菌体BTXBG52已于2020年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC NO.20708。
所述噬菌体BTXBG52对肠杆菌具有强烈的裂解作用，特别是一株分离自腐败蘑菇的肠杆菌(Enterobacter sp.)XBG5，该菌株为发明人从腐败蘑菇中分离出的一株肠杆菌，经16S rDNA鉴定并与NCBI数据库进行比对，发现该菌与MN982857.1相似性为100％，是一株肠杆菌属细菌，最适培养环境为37℃、220r/min，pH＝7的LB培养基，且对食用菌具有一定的致腐性。
肠杆菌(Enterrobacter sp.)XBG5，已于2020年11月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNO.20987。
所述噬菌体BTXBG52，具有以下生物学特征：
(1)本发明筛选的噬菌体效价高，其滴度≥1010pfu/mL，分离得到的烈性噬菌体能够用于预防和控制食用菌中细菌的感染，避免或减少化学防腐剂在食用菌生产、运输中的使用，发展食用菌产业的绿色模式。
(2)噬菌体BTXBG52在固体平板上均可以形成较大透亮空斑，边缘清晰规则，空斑大小为0.58mm。
(3)释放量大，噬菌体BTXBG52的释放量为89.88pfu/Infection Center。
(4)裂菌能力强，噬菌体BTXBG52在MOI＝10、1、0.1、0.01和0.001的条件下对蘑菇肠杆菌XBG5具有强烈的抑制作用。
(5)热稳定性好，噬菌体BTXBG52经30℃～60℃处理1h后稳定性良好。
(6)对氯仿具有耐受性，噬菌体BTXBG52经氯仿处理后，其滴度仍能达到108pfu/mL。
(7)对食用菌有良好的保鲜效果，噬菌体BTXBG52能够有效抑制食用菌中细菌生长。
本发明还提供一种噬菌体抑菌剂，所述抑菌剂包括噬菌体BTXBG52裂解液或噬菌体BTXBG52裂解液与生物添加剂的混合培养物；
具体地，所述BTXBG52裂解液的制备方法如下：
将纯化后的噬菌体(101-1010pfu/mL)按照5％的接种量加入至对数生长期的宿主菌菌液中，30-42℃、160-220r/min，摇床培养4-6h至菌液澄清，然后将菌液8000r/min离心5-10min，用直径为0.22μm的无菌滤膜对上清液过滤，滤液即为纯化后的噬菌体裂解液。
优选地，所述抑菌剂还包含生理盐水和/或其他生物添加剂，如：纳他霉素、Nisin等。
进一步地，所述噬菌体抑菌剂的制备方法，具体如下：
(1)向纯化后的噬菌体裂解液中加入NaCl使其终浓度不少于0.1M，混匀溶解后冰浴至少1h，然后12000r/min离心20min；
(2)收集上清，加入固体PEG6000至其终浓度不少于10％(w/v)，振荡溶解，4℃静置过夜(保证14h以上)；12000r/min离心20～60min，收集沉淀，并加入生理盐水重悬沉淀，使重悬液滴度不小于108pfu/mL，存入4℃冰箱备用。
(3)进一步地，在上述噬菌体颗粒重悬液中添加一定量的生物添加剂，如：终浓度分别约为0.75mg/mL纳他霉素或1mg/mL的Nisin等，以提高抑菌剂的保鲜效果。
本发明还提供上述噬菌体抑菌剂在食品保鲜中的应用。
进一步地，所述应用是将上述噬菌体抑菌剂用水稀释并制成喷洒液或淋洗液，用于对食品生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少食品加工过程中造成的细菌的污染；
进一步地，所述应用是将上述噬菌体抑菌剂作为食品添加剂，在食品生产和贮藏时加入，用以防止食品加工或贮藏过程中细菌的代谢与生长。
本发明所述的食品指：食用菌、肉制品、水果、蔬菜、奶制品等可直接食用或间接食用的固体或液体类产品。
有益效果：
(1)本发明采用噬菌体BTXBG52特异性裂解从蘑菇中分离出来的肠杆菌XBG5，可在常温和低温条件下有效抑制其代谢和繁殖，减少由该细菌引起的变质，延长食用菌货架期；噬菌体BTXBG52配制成喷洒液和淋洗液，对环境和器具除菌，减少肠杆菌对食品的污染；由于本发明涉及的噬菌体属于天然生物材料，无毒副作用，可作为食品生物保鲜剂。
(2)细菌/宿主菌包括但不限于本实验中分离的肠杆菌XBG5，其他可被本噬菌体裂解的细菌同样适用。
附图说明：
图1噬菌体BTXBG52双层平板噬菌斑图；
图2噬菌体BTXBG52的噬菌斑直径；
图3噬菌体BTXBG52的一步生长曲线；
图4不同MOI下，噬菌体对宿主菌的裂解能力图；
图5不同温度对噬菌体BTXBG52的作用结果图；
图6氯仿对噬菌体BTXBG52的作用结果图；
图7噬菌体对食用菌菌落数的影响。
具体实施方式：
下面通过具体实施例对发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
需要注意的是，本申请分离的噬菌体用于研制针对包括但不限于蘑菇中重要腐败菌如肠杆菌XBG5的噬菌体制剂，控制由微生物引起的食用菌腐败变质，避免或减少化学防腐剂在食用菌生产运输中的使用，减少多重耐药性细菌的富集，对食品安全具有重要意义。
以下通过具体实施方式对本发明作进一步地解释说明。
实施例1：噬菌体BTXBG52的获得
1、食用菌中腐败菌XBG5的分离与鉴定
(一)本阶段所使用的食用菌为市售食用菌，将其密封保存于无菌均质袋中，置于37℃恒温培养箱中加速腐败。
(二)称取上述腐败食用菌样品5g装于盛有45mL无菌生理盐水的无菌均质袋中，用均质器均质1-2min，此为10-1的均质样品，将该均质液用无菌生理盐水做系列梯度稀释。用移液器取各梯度稀释液1mL于90mm无菌平皿中，倾注约15-20mL已融化并冷却至46℃左右的营养琼脂培养基，并立即转动平皿使菌液与培养基充分混合。待培养基完全凝固后，翻转平板倒置于30℃、37℃和42℃恒温培养箱中静置培养48h(每个实验组三个平行，并以无菌生理盐水做空白对照)。挑取上述培养基中形态不同，菌落数较多的单菌落依次在LB固体培养基中进行三区纯化培养，反复分离纯化3-5次，得到纯化后的细菌，挑取单菌落细菌于无菌LB液体培养基中，37℃、220r/min，摇床培养。取500μL上述纯培养菌液与500μL 60％的甘油混合，-80℃冰箱保藏备用。
(三)对腐败细菌进行16S rDNA鉴定
(1)在无菌条件下，用无菌枪头挑取腐败细菌单菌落至装有5mL无菌LB液体培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12～16h；
(2)取上述细菌培养液1.5mL于EP管中，10000r/min离心5min，弃上清，沉淀用500μL无菌超纯水重悬；
(3)将装有菌悬液的EP管在100℃的金属浴中加热5min，迅速放入-20℃的冰箱中冷冻15min，此为冻融一次，如此反复冻融3次；
(4)将上述装有菌悬液的EP管在室温下解冻后，10000r/min离心10min，取上清1μL作为PCR模板，提取16S rDNA，经16S rDNA鉴定并与NCBI数据库进行比对，发现该菌与MN982857.1相似性为100％，并将其命名为腐败蘑菇的肠杆菌(Enterobacter sp.)XBG5。
所用引物如表1-1所示：
表1-1本研究中用到的引物
Figure BDA0003048424200000061
所用PCR体系如表1-2所示：
表1-2 16S rDNA PCR体系
Figure BDA0003048424200000062
所用PCR条件如表1-3所示：
表1-3 16S rDNA PCR程序
Figure BDA0003048424200000063
Figure BDA0003048424200000071
2、噬菌体的富集
以上述腐败菌XBG5为宿主菌分离噬菌体。
取5mL/g北塘古镇采取的水土混合样置于无菌的50mL离心管中，向其中加入10mL0.9％的无菌生理盐水，震荡混匀后，以8000r/min的速度离心5min，取上清，用直径为0.22μm的无菌滤膜过滤上清液，以去除宿主菌和其他杂菌。
取上述滤液10mL于250mL无菌三角瓶中，向其中加入50mL培养至对数期的宿主菌菌液(OD600≈0.6)，37℃、220r/min，继续摇床培养48h，此为噬菌体富集液。
3、双层平板法分离噬菌体
用移液器取1mL上述噬菌体富集液，以10000r/min的速度离心10min，上清用无菌LB液体培养基做系列稀释，取200μL对数生长期的宿主菌分别与100μL富集液原液、10-1、10-2、10-3倍稀释的富集液混合，并将混合液加入至已经融化的3mL半固体琼脂培养基中混合均匀，立即倾倒于底层为LB固体培养基的平皿(直径为60mm)中，待上层半固体培养基完全凝固后，将平皿倒置于37℃恒温培养箱中静置培养4-8h，观察有无噬菌斑。若产生噬菌斑则证明该样品中含有噬菌体，需进一步纯化；若无噬菌斑，则需更换样品重复上述操作，直到分离出噬菌体。
4、噬菌体的纯化和保存
由于初次分离得到的噬菌体可能为混合噬菌体，因此需要对其进行纯化处理。具体操作方法为：用无菌移液器枪头挑取单个噬菌斑，置于装有1mL无菌LB液体培养基的EP管中，37℃、220r/min，摇床培养1h后，8000r/min离心5min，用直径为0.22μm的无菌滤膜对上清液过滤，得噬菌体裂解液，并用无菌LB液体培养基做系列稀释，取200μL对数生长期的宿主菌菌液与100μL稀释后的噬菌体裂解液混合，并将混合液加入至已经融化并冷却至46℃的3mL半固体琼脂培养基中混合均匀，立即倾倒于底层为LB固体培养基的平皿中，待上层半固体培养基完全凝固后，将平皿倒置于37℃恒温培养箱中静置培养4-8h。如此反复多次，直至平皿内的噬菌斑大小、形态均一。
将纯化后的噬菌体(101-1010pfu/mL)按照5％的接种量加入至对数生长期的宿主菌菌液中，37℃、220r/min，摇床培养4-6h至菌液澄清，然后将菌液8000r/min离心5-10min，用直径为0.22μm的无菌滤膜对上清液过滤得噬菌体裂解液，取500μL纯化后的噬菌体裂解液与等体积的60％(v/v)无菌甘油混匀于冻存管中，置于-80℃保存。
5、噬菌体的鉴定
(一)噬菌体基因组的提取
(1)扩增噬菌体：取一环斜面培养保存的宿主菌接种于无菌LB液体培养基中振荡培养12-16h后，将其按3％的接种量接种于300mL无菌LB培养基中，培养至对数生长期(OD600＝0.6)，加入100～500μL噬菌体裂解液，37℃、220r/min摇床培养至宿主菌完全裂解。
(2)破碎宿主细胞并去除其基因组：在上述裂解液中加入DNase I和RNase I至终浓度为5μg/mL，37℃培养箱温浴1h，继续添加NaCl至终浓度不小于0.1M，混匀溶解后冰浴1h，10000r/min离心20min，取上清。
(3)浓缩噬菌体：向上述上清液中加入PEG6000至终浓度大于10％(w/v)，缓慢震荡溶解后置于4℃冰箱过夜。将过夜的噬菌体裂解液10000r/min离心40～80min，弃上清，用1/50体积的TM缓冲液重悬沉淀。
(4)去除宿主菌基因组：向重悬液中加入DNase I和RNase I至终浓度不小于10μg/mL，37℃静置培养3h(期间可酌量补加酶)。
(5)噬菌体的蛋白外壳变性：加入EDTA(pH＝8.0)至其终浓度为10mM，以终止DNaseI和RNase I的活性。继续加入SDS至终浓度为0.5％，破坏噬菌体的蛋白外壳。加入蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，混合均匀，56℃水浴至少4h，以充分消化外膜蛋白。
(6)加入等体积的DNA提取酚试剂，震荡混匀，10000r/min离心10min，收集上清(反复抽提2～3次至无蛋白膜生成)上清液加入等体积核酸提取液，混合均匀后，10000r/min离心10min收集上清。
(7)加入2.5倍体积的冰的95％乙醇，混合均匀后-20℃静置2h以上，10000r/min离心10min使基因组沉淀。
(8)加入75％乙醇(500～600μL)于上述沉淀中，将离心管上下颠倒数次，12000r/min离心5min，弃上清。
(9)将上述EP管在培养箱中干燥10min，用无酶水重悬基因组，保存于-20℃冰箱中，并用0.8％的琼脂糖电泳检测。
(二)噬菌体基因组的测序
将噬菌体基因组送至中国北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序，测序平台为Illumina NovaSeq PE150。对测序结果进行图像识别，得到的Row Reads为1042Mb，使用readfq(version 10)对原始数据进行过滤，去除包含Adapter的序列和低质量数据，得到Clean Data为923Mb。使用SOAP denovo(version 2.04)，SPAdes，ABySS组装软件进行组装，并最终使用CISA软件进行整合。采用GapClose(Version:1.12)等软件对初步组装结果进行优化和补洞，从而得到最终组装结果。
全基因组测序结果表明，该噬菌体无毒力因子，且NCBI数据库中的BLAST同源序列比对结果显示，该噬菌体基因组与数据库中目前已知的噬菌体菌株同源性仅为9％。确定本发明分离获得的噬菌体BTXBG52为一种全新噬菌体。
6、噬菌体滴度及噬菌斑大小的测定
用无菌液体LB对噬菌体裂解液进行系列稀释，双层平板法测其滴度，观察并选取噬菌斑数在30～300之间的平板计噬菌斑数，重复三次取平均值，按照公式(1-1)计数噬菌体滴度。
Figure BDA0003048424200000091
——C：噬菌体滴度(pfu/mL)；
——n：稀释倍数；
——a：平均噬菌斑数，单位pfu；
——v：所取样品体积(mL)
用游标卡尺测量噬菌斑大小，并记录，结果显示噬菌体BTXBG52滴度为1010PFU/mL，噬菌斑直径为0.58mm
实施例2：噬菌体BTXBG52一步生长曲线的绘制
取一环斜面培养保存的宿主菌接种于无菌LB液体培养基中振荡培养12-16h后，将其按3％的接种量转接至100mL无菌LB液体培养基中，37℃、220r/min摇床培养至对数生长期(OD600≈0.6)，4000r/min离心8min收集菌体。将菌体重悬于500μL无菌液体LB中，向其中加入500μL稀释后的噬菌体颗粒，使其MOI＝10-4(MOI＝噬菌体滴度/宿主菌菌浓)，静置吸附1min后，立即10000r/min离心1min弃上清，以去除游离的噬菌体颗粒，沉淀迅速用100mL的液体LB重悬，将重悬液立即置于37℃、220r/min的摇床中，每隔5min取样，用双层平板法测定噬菌体0～100min过程中的滴度，每个时间点重复三次取滴度平均值，并绘制一步生长曲线，结果如图3所示，噬菌体BTXBG52潜伏期为41min，释放量为86.29pfu/InfectionCenter。
一步生长曲线有三个阶段：潜伏期、裂解期和平稳期。潜伏期(Latent period)是指噬菌体从侵染宿主细胞到释放子代噬菌体所需的时间，该时期内噬菌体数量基本不变。裂解期(Rise phase)是指子代噬菌体装配成熟并裂解宿主细胞而释放，该时期内噬菌体数目会成指数级增长。平台期(Plateau)是噬菌体裂解期末，宿主细胞被全部裂解，其数目稳定在最高处。释放量是指每个被感染的宿主细胞释放的子代噬菌体数目，通常那些释放量大，潜伏期短的噬菌体被认为具有较好的应用前景，其计算方法如(1-2)所示：
Figure BDA0003048424200000101
实施例3：噬菌体BTXBG52裂菌能力的测定
挑取LB固体培养基上的宿主菌XBG5单菌落，接种于5mL无菌LB液体培养基中，37℃、220r/min，摇床培养12h后，10倍倍比系列稀释，平板涂布法测定其活菌数，用无菌LB培养基稀释宿主菌菌液，使其菌浓为107cfu/mL。取纯化后的噬菌体裂解液扩增至滴度为109pfu/mL，将宿主菌菌液与噬菌体裂解液按照不同MOI(MOI＝噬菌体滴度/宿主菌菌落数)混合，并分装于96孔板中，每个MOI设置5个平行。将96孔板置于37℃、160r/min，震荡培养10h，每隔30min用酶标仪测其培养液的OD600，以OD600平均值为纵坐标，时间为横坐标，绘制抑菌曲线。
如图4所示，噬菌体BTXBG52在不同的MOI(0.0001-100)条件下均具有较好的裂菌活性。
实施例4：噬菌体BTXBG52热稳定性的测定
取1mL滴度为1010pfu/mL噬菌体裂解液于1.5mL无菌EP管中，分别在30、40、50、60和70℃下水浴下处理1h，37℃处理为对照，将不同温度处理后的噬菌体裂解液用无菌液体LB做系列稀释，通过双层平板法测定不同温度处理下噬菌体滴度，每个温度设置三个平行。
结果如图5所示，噬菌体XBG52裂解液经在30、40、50和60℃水浴1h处理后，滴度虽有所下降，但仍高于107PFU/mL。随温度的升高，噬菌体存活率降低，70℃处理1h后，检测不到噬菌体存在，表明噬菌体基本失活。
实施例5：噬菌体BTXBG52对氯仿敏感性实验
取滴度为1010pfu/mL的噬菌体BTXBG52裂解液500μL与500μL氯仿混合，上下颠倒轻摇2min。8000r/min离心5min，上清液即为氯仿处理后的噬菌体裂解液，对照组不加氯仿，其余处理相同。实验重复三次取平均值，双层平板法测上清噬菌体的滴度。
结果如图6所示，经氯仿处理后，噬菌体BTXBG52的滴度为109pfu/mL，具有一定的氯仿耐受性。
实施例6：食用菌保鲜实验
1、食用菌样品处理
本实验所用食用菌由天津市蓟县中亿建良食用菌种植专业合作社提供，并于当日运送至实验室，剔除腐烂变质菇体，用毛刷轻轻刷净菌体杂物，及时放入4℃冰箱内预冷2h，挑选菇体大小均匀、成熟度一致，无明显机械损伤的蟹味菇分组，紫外照射1h备用。
2、人工感染
取一环斜面培养保存的宿主菌XBG5接种于无菌LB液体培养基中振荡培养12-16h后，以3％的接种量转接至10mL的无菌LB培养基中，37℃、220r/min摇床培养至对数期(OD600＝0.6，菌浓约为107cfu/mL)，用移液枪吸取100μL菌悬液均匀涂抹于食用菌表面，使该腐败菌污染试材表面。
3、噬菌体喷淋处理
将噬菌体裂解液梯度稀释后取200μL喷淋于各实验组，使其MOI＝0.1，MOI＝1，MOI＝10(MOI＝0组喷淋等量无菌LB培养基)。将喷涂完成后的蟹味菇封上保鲜膜，转移至25℃、相对湿度为80-85％的条件下存放，然后用消毒牙签在用保鲜膜密闭的平皿上均匀戳3-4个小孔，使体系内的积水散失，每24h测定其表面的微生物数量。
4、食用菌菌落总数测定
采用棉拭取样法，无菌条件下，在子实体表面取3个约1cm2大小的区域，将灭菌棉签用无菌水稍沾湿，在子实体每个选定区域揩抹多次，随后将棉签立即剪断，投入10mL无菌生理盐水中振荡培养(120r/min、37℃、30min)，制备10-1菌悬液，梯度稀释后涂布测菌落数。
结果如图7所示，噬菌体处理可以使食用菌中的微生物数量降低1-3个数量级。由此可见，噬菌体对抑制该种腐败菌生长具有积极作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (8)

1.一种噬菌体BTXBG52，其特征在于，保藏编号CGMCC NO.20708。
2.包含权利要求1所述噬菌体BTXBG52的噬菌体抑制剂。
3.如权利要求2所述的噬菌体抑制剂，其特征在于，所述噬菌体抑制剂为包含噬菌体BTXBG52裂解液，或噬菌体BTXBG52裂解液与生物添加剂的混合培养物。
4.如权利要求3所述的噬菌体抑制剂，其特征在于，所述噬菌体BTXBG52裂解液的制备方法如下：将纯化后的噬菌体按照5%的接种量加入至对数生长期的宿主菌菌液中，30-42℃、160-220 r/min，摇床培养4-6 h至菌液澄清，然后将菌液8000 r/min离心5-10 min，用直径为0.22μm的无菌滤膜对上清液过滤，滤液即为纯化后的噬菌体裂解液。
5.如权利要求4所述的噬菌体抑制剂，其特征在于，所述抑菌剂还包含生理盐水和/或生物添加剂。
6.如权利要求5所述的噬菌体抑制剂，其特征在于，所述生物添加剂为纳他霉素或Nisin。
7.权利要求2所述噬菌体抑制剂的制备方法，其特征在于，具体如下：
（1）向纯化后的噬菌体裂解液中加入NaCl使其终浓度不少于0.1 M，混匀溶解后冰浴至少1 h，然后12000 r/min 离心20 min；
（2）收集上清，加入固体PEG6000至其终浓度不少于10%，振荡溶解，4 ℃静置过夜；12000 r/min 离心 20~60 min，收集沉淀，并加入生理盐水重悬沉淀，使重悬液滴度不小于108 pfu /mL；
（3）上述噬菌体颗粒重悬液中添加生物添加剂。
8.权利要求1所述噬菌体BTXBG52或权利要求2所述噬菌体抑制剂在食用菌保鲜中的应用。
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