JP2014507128A

JP2014507128A - 新規バクテリオファージ及びそれを含む抗菌組成物

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Publication number: JP2014507128A
Application number: JP2013546019A
Authority: JP
Inventors: ヨンヤン，シ; アンシン，ス; テパク，ミン; ウクチョ，ヨン; ヘカン，イン; ミシン，ウン
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2014-03-27
Anticipated expiration: 2031-12-21
Also published as: EP2655603A2; WO2012087037A2; ES2593467T3; JP5666016B2; WO2012087037A3; US8597928B2; KR101335825B1; EP2655603B1; BR112013015635A2; EP2655603A4; US20120156174A1; KR20120070533A; PE20140233A1

Abstract

本発明は、新規バクテリオファージに関し、より具体的には、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis）、サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラガリナルム（Salmonella gallinarum）及びサルモネラプロラーム（Salmonella pullorum）に対して特異的な殺菌活性を有するバクテリオファージ、前記バクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラエンテリティディス又はサルモネラティフィムリウムにより引き起こされるサルモネラ症とサルモネラ食中毒、サルモネラガリナルムにより引き起こされる家禽チフス、及びサルモネラプロラームにより引き起こされる雛白痢を含む感染症の予防又は治療用組成物、前記バクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料、飲用水、洗浄剤及び消毒剤に関する。

Description

本発明は、新規バクテリオファージ及びそれを含む抗菌組成物に関する。

サルモネラ菌は、腸内細菌科の一属に属し、グラム陰性、通性嫌気性の、芽胞を形成しない桿菌であり、ほとんどの菌株は周毛性鞭毛による運動性を有する。サルモネラ菌は、大腸菌（Escherichia coli）と赤痢菌（Shigella）に類似し、５０〜５２％の平均ＧＣ含量を有する。前記サルモネラ属は、ヒトだけでなく、様々な家畜に感染して様々な疾病を引き起こす病原性微生物である。サルモネラ菌種であるサルモネラエンテリカ（Salmonella enterica）は、血清学的分類によりサルモネラガリナルム（Salmonella gallinarum）、サルモネラプロラーム（Salmonella pullorum）、サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis）、サルモネラティフィ（Salmonella typhi）、サルモネラコレラスイス（Salmonella choleraesuis）及びサルモネラダービー（Salmonella derby）を含む様々な血清型（serovar）を有する（非特許文献１，非特許文献２）。これらのうち、サルモネラガリナルム及びプロラムは家禽の病原菌、サルモネラティフィはヒトの病原菌、サルモネラコレラスイス及びサルモネラダービーはブタの病原菌であり、サルモネラエンテリティディス及びサルモネラティフィムリウムはヒト及び動物に病原性を有する。各血清型は各種疾病を引き起こし、農家や消費者に莫大な被害をもたらす。

一方、サルモネラエンテリティディス（以下、「ＳＥ」という）及びサルモネラティフィムリウム（以下、「ＳＴ」という）は、ＳＧやＳＰとは異なり、宿主特異性を持たずに疾病を引き起こす人獣共通感染菌である（非特許文献３）。

ＳＥとＳＴは、家禽、ブタ及びウシにおいてサルモネラ症（salmonellosis）を引き起こす。サルモネラ菌に起因するサルモネラ症は家畜の急性又は慢性感染であり、発熱、腸炎及び敗血症の主要症状を示し、時には肺炎、関節炎、流産及び乳房炎を引き起こす。サルモネラ症は全世界的に発症し、主に夏に最も多く発症する（非特許文献４）。ウシの場合、一般的症状は食欲不振、発熱、黄色下痢便又は粘血便を含む。小ウシの急性感染は早期の死亡をもたらし、妊娠中の感染は敗血症による斃死を引き起こし、早期流産を起こし得る（非特許文献５）。ブタの場合、サルモネラ症は臨床的に急性敗血症、急性腸炎及び慢性腸炎の３つの主要症状を特徴とする。急性敗血症は２〜４カ月齢の子ブタに発症し、発症２〜４日以内にほとんど斃死する。急性腸炎は肥育期に発症し、下痢、高熱、肺炎及び神経過敏を伴う。重症の場合、時には皮膚変色が生じる。慢性腸炎は持続的な下痢を伴う（非特許文献５）。

ＳＥ及びＳＴにより家禽、ブタ及びウシがサルモネラ症を発症すると、薬剤で治療することは困難である。その理由は、サルモネラ菌は各種薬剤に強い耐性を有し、臨床症状の発現時に抗生物質が侵入できない細胞内に寄生するからである。現在まで、抗生物質を含めて、ＳＥとＳＴにより発症するサルモネラ症を抑制する効果的な方法は見出されていない（非特許文献６）。

家畜において、ＳＥ及びＳＴは家畜及びその加工品によりヒトへの感染を引き起こし、サルモネラ菌食中毒を引き起こすことがある。感染した家畜を不適切に調理した製品（例えば、肉製品、家禽製品、鶏卵及びそれらの副産物）を介してヒトに感染する。ヒトにおいて、サルモネラ菌による食中毒は、通常頭痛、発熱、激しい腹痛、下痢、吐き気及び嘔吐の急速な開始を含む。これらの症状は一般に生物の摂取後６〜７２時間以内に発生し、４〜７日間持続し、時には長期間にわたって持続する（非特許文献７）。

アメリカ疾病管理予防センター（ＣＤＣ）の統計によれば、２００５年から２００８年の間に発生したヒトの食中毒の１６％がサルモネラによるものであり、そのうちＳＥが２０％、ＳＴが１８％である。１９７３年から１９８４年の間に発生したヒトのサルモネラ食中毒の場合、伝播に関与する媒介食料として、鶏肉（５％）、牛肉（１９％）、豚肉（７％）、酪農製品（６％）及び七面鳥の肉（９％）が報告されている。１９７４年から１９８４年において、屠殺中のブロイラーに対するバクテリア感染調査は３５％以上のサルモネラ発生程度を示した。１９８３年には、サルモネラ菌はニワトリの５０．６％、七面鳥の６８．８％、ガチョウの６０％、ブタの１１．６％、ウシの１．５％から検出された。また、２００７年に行われた統計によると、サルモネラは生家禽肉及び生豚肉からそれぞれ５．５％及び１．１％検出された。特に、ＳＥはほとんどが汚染された鶏卵や汚染された家禽肉に由来し、ＳＴは汚染された豚肉、家禽肉及び牛肉に由来することが報告されている（非特許文献８）。一例として、１９８８年以降に米国、カナダ、欧州においてＳＥによる食中毒事例が急激に増加したが、疫学的調査の結果、鶏卵や鶏卵を含む料理が原因であることが明らかになった（非特許文献９）。２００２年にＦＡＯとＷＨＯが行ったリスク評価においては、鶏卵と家禽肉から伝播したサルモネラ症のヒトにおける発生率は、家禽類で観察されたサルモネラの有病率と密接な関係を有することが明らかにされた。これは、家禽類のサルモネラの有病率が減少すると、ヒトのサルモネラ症の発生率も減少することを意味する（非特許文献１０）。近年、ピーナッツ、ホウレンソウ、トマト、ピスタチオ、コショウをはじめとして、最近はクッキー生地に至るまで、様々な食材からサルモネラ症が発症しているので、食品安全に対する懸念が提起されている（非特許文献１１）。

これらの理由から、ドイツではサルモネラ菌による感染を必ず報告しなければならない（ドイツ感染症予防法、Ｉｎｆｅｋｔｉｏｎｓｓｃｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚ第６条、第７条による）。１９９０年から２００５年までに公式的に記録された症例数は、約２０万件から約５万件に減少した。ドイツにおいては、５人のうち約１人がサルモネラ菌保菌者であると推定されている。米国においては、毎年サルモネラ菌感染が約４万件報告されている（非特許文献１２）。

よって、家畜及びヒトにサルモネラ症を引き起こすＳＥとＳＴの制御方法が至急求められている。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）と米国農務省（ＵＳＤＡ）の共同の努力により、米国内で１００万件を超える病気を引き起こすサルモネラ症を予防する多くの効果的な方策が開発されている。これらのうち、鶏卵からの汚染を防止するためのＦＤＡによる最終規則が公開されている。ＦＤＡは、米国内の鶏卵メーカーに対して、鶏卵の生産、保存及び運送中の致命的なサルモネラに関する定期的なテストを要求している。その結果、汚染された鶏卵による７万９０００件の疾病及び３０件の死亡を毎年回避できるものと予測される（非特許文献１１）。デンマークにおいて、飼育場でのサルモネラ菌の管理にかかる費用とサルモネラ症による人間全体の健康にかかる費用を比較した費用対効果分析による推定は、サルモネラ菌の管理が２００１年度の１年に少なくとも１４１０万ＵＳドル節約できることを示している（非特許文献１０）。

サルモネラバクテリアに起因する家禽の疾病である家禽チフス（Fowl typhoid, FT）は、病原菌であるサルモネラガリナルム（以下、「ＳＧ」という）に起因する。家禽チフス（ＦＴ）は、ニワトリや七面鳥などの家禽の敗血性疾患であり、高い斃死率を示し、急性又は慢性に進行する。最近の報告によれば、欧州、南米、アフリカ及び東南アジアなどで家禽チフスの発症頻度が高く、その被害が増加している。韓国におけるＦＴの発生は１９９２年以降に報告されており、ＦＴに起因する褐色産卵鶏における経済的損失は非常に深刻である（非特許文献１３，非特許文献１４）。

雛白痢（Pullorum disease）もまた、サルモネラ菌の菌株であるサルモネラプロラーム（以下、「ＳＰ」という）に起因する疾病である。雛白痢は日齢や季節に関係なく発生するが、初生雛期に最も感染しやすい。さる１世紀の間、１〜２週齢未満の雛における深刻な疾病であった。１９８０年代以降、その発生が大幅に減少した。しかし、９０年代中盤以降、再び増加している（非特許文献１３，非特許文献１４）。

韓国においては、９０年代以降、家禽チフスと雛白痢の発生が増加しており、農家に経済的損失を与えている。そこで、２００４年から、弱毒化ＳＧ生ワクチンをブロイラー（broiler）に用いて家禽チフスに対する予防が試みられた（非特許文献１４）。その効果は疑わしく、産卵鶏（Layer）においては卵継代の感染の恐れもあることから、生ワクチンの使用が許可されていない。残念ながら、家禽チフスとは異なり、いまだ雛白痢に対しては商品化された予防策がない。よって、家禽チフス及び雛白痢を予防する新たな方法が至急求められている。

一方、バクテリオファージは、細菌にのみ感染して細菌を破壊する特異タイプのウイルスであり、細菌宿主内でのみ自己増殖することができる。バクテリオファージは、タンパク質の外皮に包まれた一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態で遺伝物質を構成している。バクテリオファージは、この形態的構造及び遺伝的物質に基づいて分類される。正二十面体（icosahedral）の頭部に尾がある形態と、正二十面体の頭部に尾がない形態と、フィラメントの形態とからなる、形態的構造によるバクテリオファージの３つの基本的な構造形態が存在する。これらの尾の構造に基づいて、正二十面体の頭部で線状二本鎖ＤＮＡを遺伝的物質を有するバクテリオファージは、ミオウイルス科（Myoviridae）と、シホウイルス科（Siphoviridae）と、ポドウイルス科（Podoviridae）とからなる３つのファミリーに分けられ、これらはそれぞれ収縮性の尾、長く非収縮性の尾及び短く非収縮性の尾を特徴とする。尾のない正二十面体の頭部及び遺伝的物質としてＲＮＡ又はＤＮＡを有するバクテリオファージは、それらの頭部の形態及び構成成分、並びに外皮の存在により分けられる。遺伝的物質としてＤＮＡを有するフィラメント形態のバクテリオファージは、サイズ、形状、外皮及びフィラメントの構成成分により分けられる（非特許文献１５，非特許文献１６）。

感染中に、バクテリオファージは細菌に付着してそれ自身の遺伝物質を細胞内に注入する。その後、バクテリオファージは、溶菌性（lytic）又は溶原性（lysogenic）の２つの生活環のいずれかを示す。溶菌性のバクテリオファージは、細胞機構を用いてその構成成分を形成する。次に、細胞を破壊又は溶解し、新たなファージ粒子を放出する。溶原性のバクテリオファージは、その核酸を細菌宿主細胞の染色体に組み込み、細菌を破壊することなく細胞と共に複製する。所定の条件下では、溶原性のバクテリオファージは溶菌サイクルに従うように誘導される。

バクテリオファージの発見以来、これらを感染症の治療法に用いるための研究が進められている。しかし、広範囲な抗生物質が一般に用いられる場合、バクテリオファージは宿主特異性（specific target spectrum）を有するので不要なものであると考えられてきた。それにもかかわらず、抗生物質の誤用・乱用により、抗生物質の耐性菌に対する懸念及び食品内の残留抗生物質の悪影響に対する懸念が高まった。特に、動物の成長促進のために飼料に添加する抗生物質（antimicrobial growth promoter, AGP）が抗生物質の耐性を引き起こすことが明らかにされ、よってＡＧＰの使用を禁止する政策が立案されている。欧州連合は、２００６年から全てのＡＧＰの使用を禁止している。また、韓国は、２００９年から一部のＡＧＰの使用を禁止しており、２０１３〜２０１５年には全てのＡＧＰの使用を制限することが検討されている。

このような抗生物質の使用に対する懸念が高まることにより、抗生物質の代替剤としてバクテリオファージに対する関心が再度高まっている。大腸菌（E. coli）Ｏ１５７：Ｈ菌株を制御するための７つのバクテリオファージが特許文献１に開示されている（２００２年登録，大腸菌Ｏ１５７の制御に関するバクテリオファージの使用）。様々な種の微生物を制御する２種のバクテリオファージについては特許文献２に開示されている（２００５年登録，Ｎｙｍｏｘ）。多くの会社は、バクテリオファージを用いた様々な製品を開発するために大いに努力している。ＥＢＩＦｏｏｄＳｙｓｔｅｍ社（欧州）はリステリアモノサイトゲネスによる食中毒を防止する食品添加剤製品であるＬｉｓｔｅｒｉｘ−Ｐ１００を開発し、バクテリオファージ製品として最初に米国ＦＤＡの承認を得た。ファージに基づく製品であるＬＭＰ−１０２もリステリアモノサイトゲネスに対する食品添加剤として開発され、ＧＲＡＳ（Generally regarded as safe）の認証を得た。２００７年にはＯｍｎｉＬｙｔｉｃｓ社が生産したファージに基づく洗浄剤が屠殺過程中の牛肉のＥ．ｃｏｌｉＯ１５７汚染を予防するために開発され、米国農務省（ＵＳＤＡ）の食品安全検査局（Food Safety and Inspection Service, FSIS）の承認を得た。

欧州において、クロストリジウムスポロゲネスファージ（Clostridium sporogenes phage）ＮＣＩＭＢ３０００８とクロストリジウムチロブチリカムファージ（Clostridium tyrobutiricum phage）ＮＣＩＭＢ３０００８は、それぞれ２００３年と２００５年にクロストリジウム汚染を防止する飼料保存剤として登録された。このような研究は、バクテリオファージを家畜生産品において人獣共通病原菌に対する抗生物質として用いるための研究が現在進められていることを示すものである。

しかし、バクテリオファージ研究のほとんどは、大腸菌、リステリア菌及びクロストリジウム菌の制御に集中している。サルモネラ菌もまた人獣共通病原菌であり、これらの病原菌による被害は減少していない。前述したように、ＳＥ及びＳＴは様々な薬剤に対して耐性を示すので、現在韓国においては、伝染病予防法施行令（大統領令第１６９６１号）、伝染病予防法施行規則（保健福祉部令第１７９号）及び国立保健院職制（大統領令第１７１６４号）により全国的な耐性監視を行っている。よって、サルモネラ菌を制御するバクテリオファージの開発が求められている。

米国特許第６，４８５，９０２号明細書米国特許第６，９４２，８５８号明細書

Bopp CA, Brenner FW, Wells JG, Strokebine NA. Escherichia, Shigella, Salmonella. In Murry PR, Baron EJ, et al., eds. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999; 467-74 Ryan KJ. Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology (4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9. Zoobises Report; Unitied Kingdom 2003 T.R. Callaway et al., J. Anim. Sci. 86: E163-E172, 2008 www.livestock.co.kr www.lhca.or.kr NSW+HEALTH. 2008.01.14. www.cdc.gov; Centers for Disease Control and Prevention, CDC Agre-Food Safety Information Service, AGROS Domestic and foreign food poisoning occurrence and management trend. February, 2008 Salmonella control at the source; World Health Organigation. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) Information Note No. 03/2007 Jane Black and Ed O'Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8, 2009 en.wikipedia.org/wiki/Salmonella#cite_note-2 クォン・ヨングク, 2000年度鳥類疾病検索結果分析, 韓国国立獣医科学検疫院情報誌, 2001年3月キム・エランら, 2003年国内原種鶏及び種鶏の雛白痢−家禽チフスの感染実態, Korean J. Vet. Res. 46(4): 347-353, 2006 H.W. Ackermann, Frequency of morphological phagedescriptions in the year 2000； Arch. Virol. 146: 843-857, 2001 Elizabeth Kutterら, Bacteriophages Biology and Application, CRC press J. Animal Sci. 43: 910-926, 1976 J. Anim. Sci. 56: 735-739, 1983

抗生物質の誤用・乱用による抗生物質耐性、食品内の残留抗生物質の有害な活性、及び広範囲な抗生物質の使用に伴う問題などを解決するために、本発明者らは家畜の主要な疾病を引き起こすサルモネラ菌を選択的に死滅させる活性を有する新規バクテリオファージを自然界から分離し、その形態的、生化学的及び遺伝的特性を確認した。本発明者らは、前記バクテリオファージが、有益菌に影響を与えることなく、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis, SE）、サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium, ST）、サルモネラガリナルム（Salmonella gallinarum, SG）及びサルモネラプロラーム（Salmonella pullorum, SP）を選択的に死滅させる活性を有し、耐酸性、耐熱性及び耐乾性を有することを確認し、これをサルモネラエンテリティディス又はサルモネラティフィムリウムにより引き起こされる家畜のサルモネラ症、及び汚染された畜産品により引き起こされるサルモネラ食中毒、及びサルモネラガリナルム又はサルモネラプロラームにより引き起こされる感染症、特に、家禽チフス又は雛白痢の予防又は治療用組成物、並びにサルモネラ菌を制御するための様々な製品、例えば動物飼添加剤、動物用飲用水、畜舎消毒剤及び肉製品用洗浄剤にも適用できることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明は、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌に対して特異的な殺菌活性を有する新規バクテリオファージを提供することを目的とする。

また、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされる感染症の予防又は治療用組成物を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、家畜用飼料及び飲用水を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、消毒剤及び洗浄剤を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、前記バクテリオファージを有効成分として含む組成物を用い、サルモネラエンテリティディス又はサルモネラティフィムリウムにより引き起こされる家畜のサルモネラ症又はサルモネラ食中毒を予防又は治療する方法を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、サルモネラガリナルム又はサルモネラプロラームにより引き起こされる感染症の家禽チフス又は雛白痢を予防又は治療する方法を提供することを目的とする。

本発明の新規バクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームに特異的な殺菌活性を有し、優れた耐酸性、耐熱性及び耐乾性を有する。よって、前記バクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームにより引き起こされるサルモネラ症、サルモネラ食中毒、家禽チフス又は雛白痢を含む感染症の予防又は治療に有用であるだけでなく、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームの制御に用いることができる。

ΦＣＪ８の電子顕微鏡写真であり、正二十面体の頭部（isometric capsid）及び長く非収縮性の尾（long non-contractile tail）を特徴とし、シホウイルス科（Siphoviridae）ファミリーの形態型（morphotype）グループに属することを示すものである。サルモネラ菌に対するΦＣＪ８溶菌斑形成を示す写真である。ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰにおいては、ΦＣＪ８溶菌斑が形成されたが、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣ及びＳＤにおいては溶菌斑が形成されなかった。

Ａ：ＳＥ
Ｂ：ＳＴ
Ｃ：ＳＧ
Ｄ：ＳＰ
Ｅ：ＳＡ
Ｆ：ＳＢ
Ｇ：ＳＣ
Ｈ：ＳＤ
分離されたバクテリオファージΦＣＪ８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果であり、４１ｋＤａ、８０ｋＤａ、１５．５ｋＤａ、６０ｋＤａ及び４３ｋＤａの主要構造タンパク質を含むタンパク質パターンを示すものである（ここで、非染色ベンチマークタンパク質ラダー（unstained BenchMark Protein ladder, Invitrogen）をサイズマーカー（size marker）として用いた。）。分離されたバクテリオファージΦＣＪ８のＰＦＧＥ分析結果であり、約４４．１〜４９ｋｂｐの全ゲノムサイズを示すものである（ここで、５ｋｂｐＣＨＥＦＤＮＡサイズスタンダード（5 kbp CHEF DNA size standard, BIO-RAD）をサイズマーカーとして用いた。）。 ΦＣＪ８のゲノムＤＮＡを鋳型とし、次の各プライマーセットを用いたＰＣＲ結果を示す図である。

Ａ：配列番号６及び７のプライマーセットで得られた３．５ｋｂｐ長のＰＣＲ産物
Ｂ：配列番号８及び９のプライマーセットで得られた２．１ｋｂｐ長のＰＣＲ産物
Ｃ：配列番号１０及び１１のプライマーセットで得られた１．６ｋｂｐ長のＰＣＲ産物
Ｄ：配列番号１２及び１３のプライマーセットで得られた１．２ｋｂｐ長のＰＣＲ産物
Ｅ：配列番号１４及び１５のプライマーセットで得られた１．４ｋｂｐ長のＰＣＲ産物
バクテリオファージΦＣＪ８の耐酸性実験結果であり、ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．０、９．０、９．８及び１１．０における生存バクテリオファージ数を示す図である。対照群と比較して、ｐＨ２．５まではバクテリオファージΦＣＪ８の活性が維持されたが、ｐＨ２．５又はそれ以下では活性が完全に消失した。バクテリオファージΦＣＪ８の耐熱性実験結果であり、３７、４５、５３、６０、７０及び８０℃の温度、並びに０、１０、３０、６０及び１２０分の時点における生存バクテリオファージ数を示す図である。バクテリオファージΦＣＪ８は、６０℃、２時間の静置後も活性を失わなかったが、７０℃、２時間の静置後は活性が完全に消失した。バクテリオファージΦＣＪ８の耐乾性実験結果であり、スピードバック濃縮器（SpeedVac concentrator）を用いて６０℃にて１２０分間乾燥させ、乾燥前後の力価変化を測定して相対的な安定性を評価したところ、その活性が約５０倍低下した。バクテリオファージΦＣＪ８を単回で経口投与した場合のラットの体重変化を経時的に示すグラフである。対照群に比べて、投与後１４日経過した場合も有意な体重変化は認められなかった。

黒い四角形：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び２ｍＭのＭｇＣｌ_２の混合溶液を投与した対照群の雄
□：１×１０^１２ｐｆｕの濃度でΦＣＪ８を投与した投与群の雄
●：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び２ｍＭのＭｇＣｌ_２の混合溶液を投与した対照群の雌
○：１×１０^１２ｐｆｕの濃度でΦＣＪ８を投与した投与群の雌

本発明の一態様は、サルモネラエンテリティディス（ＳＥ）、サルモネラティフィムリウム（ＳＴ）、サルモネラガリナルム（ＳＧ）及びサルモネラプロラーム（ＳＰ）に特異的な殺菌活性を有する新規バクテリオファージに関する。

本発明者らは、屠鶏場から下水試料を採取し、それらからＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰに特異的な殺菌活性を有するバクテリオファージを分離した（図２及び表１参照）。電子顕微鏡で形態学的に観察した結果、本発明のバクテリオファージは、正二十面体の頭部（isometric capsid）及び長く非収縮性の尾（long non-contractile tail）を特徴とする、シホウイルス科（Siphoviridae）ファミリーの形態型（morphotype）グループに属するものである（図１参照）。

本発明のバクテリオファージは、約４１ｋＤａ、８０ｋＤａ、１５．５ｋＤａ、６０ｋＤａ及び４３ｋＤａの主要構造タンパク質を含む（図３参照）。

また、本発明のバクテリオファージは、全ゲノムのサイズが約４４．１〜４９ｋｂｐであり（図４参照）、配列番号１〜５からなる群から選択される少なくとも１つの核酸分子を全ゲノムの一部として含む。また、前記ヌクレオチド配列に基づいて他種との遺伝的類似性を比較した結果、本発明のバクテリオファージと既知のバクテリオファージは非常に低い遺伝的類似性を示すので、本発明のバクテリオファージは新規のものである（表２参照）。より具体的には、本発明のバクテリオファージに対して、配列番号６及び７、配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１２及び１３、並びに配列番号１４及び１５からなる群から選択される少なくとも１つのプライマーセットを用いてＰＣＲを行うと、その結果物であるＰＣＲ産物はそれぞれ約３．５ｋｂｐ、２．１ｋｂｐ、１．６ｋｂｐ、１．２ｋｂｐ及び１．４ｋｂｐのサイズを有する（図５参照）。

また、本発明による前記バクテリオファージをＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰに感染させることによる溶菌斑（ソフトアガーにおいて１つのバクテリオファージにより宿主細胞が溶菌されて形成される透明領域）が同じサイズ及び濁度であることが確認された（図２参照）。

本発明のバクテリオファージは、耐酸性及び耐熱性の生化学的特性を有する。広範なｐＨ範囲及び温度範囲でバクテリオファージの安定性を調査した結果、本発明のバクテリオファージは、ｐＨ３．０〜１１．０の範囲（図６参照）、及び３７〜７０℃の温度範囲（図７参照）で生存できることが確認された。また、本発明のバクテリオファージは、高温で乾燥させた後もその活性を安定して維持する耐乾性を有する（図８参照）。このような耐酸性、耐熱性及び耐乾性は、本発明のバクテリオファージが、ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰにより引き起こされる家畜疾病、又は汚染された家畜により引き起こされるヒト疾病の予防又は治療用組成物の生産において、様々な温度及びｐＨ条件下で適用できるようにする。

また、本発明のバクテリオファージは、野生株のＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰに感染させることができる（表３参照）。

本発明のバクテリオファージをラットに経口投与しても、体重変化、死亡個体数、一般症状及び臓器異常に変化がない（図９、表４及び表５参照）。

また、本発明のバクテリオファージをブロイラーの飼料添加剤として使用しても、ブロイラーの成長、臓器や筋肉の発達に悪影響がない（表６及び表７参照）。

効能、消毒能力及び洗浄能力を調査した結果、バクテリオファージを家畜農場に用いると、本発明のバクテリオファージは、サルモネラ（ＳＥ）の繁殖及び排出を抑制することにより、サルモネラ（ＳＥ）を効果的に制御することができ（表８及び表９参照）、陽性対照群として用いられた消毒剤に比べて様々な条件で優れ、所定レベルのサルモネラ殺菌活性を有する。

これらの事実は、本発明のバクテリオファージがサルモネラ菌を制御する様々な製品として適用できることを意味する。

本発明のバクテリオファージは、ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰに対して特異的な殺菌活性及び前述した特性を有するバクテリオファージをΦＣＪ８と命名し、２０１０年１２月１４日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms，ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１１４８Ｐ号として寄託した。

また、本発明の一態様は、前記バクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされた感染症の予防又は治療用組成物に関する。

本発明のバクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームに対して特異的に殺菌活性を有するので、本発明のバクテリオファージをこれらの菌により引き起こされる疾病の予防又は治療に用いることができる。好ましい一態様として、本発明の組成物は抗生物質をさらに含んでもよい。

前記感染症の例は、サルモネラエンテリティディス又はサルモネラティフィムリウムによる疾病としてサルモネラ症又はサルモネラ菌食中毒を含み、サルモネラガリナルムによる疾病として家禽チフスを含み、サルモネラプロラームによる疾病として雛白痢を含むことが好ましいが、これに限定されるものではない。

本発明において、「サルモネラ症」という用語は、サルモネラ菌感染による発熱、頭痛、下痢、嘔吐などの症状を総称するものである。すなわち、サルモネラ症は、腸チフスのような敗血症及び、食中毒、腸炎、急性菌血症のような急性胃腸炎との２つの代表的な症状を伴うサルモネラ属のバクテリア感染である。

本発明において、「予防」という用語は、組成物の投与により疾病を抑制したり、発症を遅延させる全ての行為を意味する。これに関連して、「治療」という用語は、前記組成物の投与により患者の症状を好転させたり、好適に変更させる全ての行為を意味する。

本発明の前記組成物は、５×１０^２〜５×１０^１２ｐｆｕ／ｍＬ、好ましくは１×１０^６〜１×１０^１０ｐｆｕ／ｍＬの量で本発明のバクテリオファージを有効成分として含む。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでもよく、担体と共に製剤化されて食品、医薬品及び飼料添加剤として提供される。

本発明において、「薬学的に許容される担体」という用語は、生物体を刺激せず、有効成分の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。液状溶液として製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌及び生体適合性に優れた、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール及びこれらの成分の２つ以上を混合して用いることができ、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。

本発明の予防又は治療用組成物は、疾患部位に塗布又は噴霧する方法で用いることができ、その他、経口投与又は非経口投与により投与することができ、非経口投与の場合は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与又は局所投与により投与することができる。

本発明による組成物の好適な塗布、噴霧及び投与量は、製剤化方法、投与方式、対象となる動物及び患者の年齢、体重、性別、症状、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感度などの要因により異なる。患者に前記薬学的組成物を投与する場合に、担当の医師又は獣医が適切な医学的判断の範囲内で適切な一日総投与量を容易に決定できることは、当業者にとって明らかである。

本発明の組成物を有効成分として含む経口投与用製剤は、錠剤、トローチ剤、ドロップ剤、水性又は油性懸濁液、調製された粉末又は顆粒、エマルジョン、硬質又は軟質カプセル、シロップ又はエリキシル剤の形態であってもよい。錠剤やカプセルなどの経口投与用形態は、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アミロペクチン、セルロース、ゼラチンなどの結合剤、第二リン酸カルシウムなどの賦形剤、トウモロコシデンプン、サツマイモデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリルフマル酸ナトリウム又は、ポリエチレングリコールワックスなどの潤滑油を含んでもよい。カプセル剤形の場合は、脂肪油などの液体担体をさらに含んでもよい。

非経口投与用剤形の場合、本発明の組成物は、皮下注射、静脈注射、筋肉注射などの注射剤形、坐剤の剤形、呼吸器から吸入可能なエアゾール剤などのスプレー剤形に製剤化することができる。注射剤形に製剤化する場合は、本発明の組成物を安定剤又は緩衝剤と共に水で混合して溶液又は懸濁液とし、これをアンプル又はバイアルの単位投与形態で製剤化することができる。エアゾール剤などのスプレー剤形の場合は、水分散した濃縮物又は湿潤粉末を噴霧するための推進剤などが添加剤と共に配合される。

本発明において、「抗生物質」という用語は、動物に提供されて菌を死滅させたり、それらの成長を阻害する物質又は化合物を意味し、防腐剤、殺菌剤及び抗菌剤を含むものである。前記動物は、ヒトを含む哺乳動物である。本発明のバクテリオファージは、従来の抗生物質に比べてサルモネラ菌に対する特異性が非常に高いという利点があり、有益菌を死滅させることなく、特定の病原菌のみを死滅させることができる。また、本発明のバクテリオファージは、薬物耐性を引き起こさないので、長い製品寿命（life cycling）を有する新規抗生物質として提供される。

また、本発明の一態様は、前記バクテリオファージを有効成分として含む家畜用飼料又は飲用水に関する。

畜産及び水産業で用いられる飼料添加用抗生物質は予防目的で用いられている。しかし、現在用いられている飼料添加剤抗生物質のほとんどは耐生菌の発生を引き起こす傾向にあり、家畜に残留する抗生物質がヒトに伝達されるという問題がある。このような残留抗生物質の摂取は、抗生物質に耐性を有するヒト病原菌を生成し、疾病の拡散を招くことがある。また、通常多くの種類の飼料添加用抗生物質は動物飼料と混合して用いられるので、これは多剤耐性株の発生原因となる。よって、本発明のバクテリオファージは、上記問題を解決することができ、充分に環境にやさしい飼料添加用抗生物質として用いることができる。

本発明による家畜用飼料は、飼料製造時に直接添加したり、飼料に別途に添加する形態に製造することができる。家畜用飼料において、本発明のバクテリオファージは液状又は乾燥状態であり、乾燥した粉末形態で存在することが好ましい。この場合、本発明のバクテリオファージは、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥により乾燥することができるが、前記乾燥過程は本発明を限定するものではない。本発明のバクテリオファージは、粉末形態で飼料の総重量に対して０．０５〜１０重量％、好ましくは０．１〜２重量％の量で混合することができる。前記家畜用飼料は、本発明のバクテリオファージ以外に、飼料の保存性を向上させることのできる通常の添加剤をさらに含んでもよい。

本発明の飼料添加剤には、他の非病原性の微生物をさらに添加することができる。添加できる微生物は、プロテアーゼ、リパーゼ及びインベルターゼを産生するバチルスサブティリス（Bacillus subtilis）、ウシの胃のような嫌気条件で生理的活性及び有機物分解機能を示すラクトバチルス菌株（Lactobacillus sp.）、家畜の体重を増加させ、牛乳の生産量を増やし、飼料の消化と吸収を助けるアスペルギルスオリザエ（Aspergillus oryzae）を含む糸状菌（非特許文献１７）、及びサッカロマイセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）を含む酵母（非特許文献１８）からなる群から選択される。

本発明のバクテリオファージを含む飼料は、穀物類、堅果類、食品加工副産物、海藻、繊維質類、製薬副産物、油類、デンプン類、ミール類及び穀物副産物などの植物性飼料、並びにタンパク質類、無機物類、脂肪類、単細胞タンパク質類、動物性プランクトン類及び食品廃棄物などのような動物性飼料とを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明のバクテリオファージを含む飼料添加剤には、結着剤、乳化剤、保存剤などの品質低下を防止するための添加剤、アミノ酸剤、ビタミン剤、酵素剤、生菌剤、香味剤、非タンパク窒素、ケイ酸塩剤、緩衝剤、着色剤、抽出剤、オリゴ糖などの効用増大のための添加剤があるが、これらに限定されるものではない。

本発明のバクテリオファージを含む飲用水を供給すると、家畜の腸内サルモネラ菌の数を持続的に減少させることができる。その結果、サルモネラに汚染されていない家畜を生産することができる。

また、本発明の一態様は、前記バクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤又は消毒剤を提供する。

本発明のバクテリオファージを有効成分として含む含む消毒剤は、例えば食中毒に対する食品衛生に非常に有用である。具体的には、前記消毒剤は、サルモネラ汚染を予防するための物質又は食品添加剤として用いることができるだけでなく、サルモネラに汚染されていない家畜の生産に用いることができる。サルモネラを除去するために、前記消毒剤を家庭内の下水に噴霧することもでき、家禽小屋、屠殺場、殺処分場、厨房及び炊事施設に適用することもできる。

また、本発明のバクテリオファージを有効成分として含む洗浄剤は、サルモネラ菌により既に感染しているか、又は感染する可能性のある、生きた動物の皮膚、翼などの体の各種部位に用いることができる。

また、本発明の一態様は、前記バクテリオファージ又はそれを含む組成物を用い、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされる感染症を予防又は治療する方法に関する。

本発明の前記組成物は、薬学的製剤の形態で動物に投与したり、家畜の飼料又は飲用水に混合してこれを摂取させる方法で投与することができ、飼料添加剤の形態で飼料に混合して投与することが好ましい。本発明において、前記動物は、ウシ、ブタ、ニワトリ、家禽及びヒトを含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の組成物は、標的組織に到達するものであれば、経口又は非経口の様々な経路を介して投与することができる。具体的には、口腔、直腸、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、経皮、鼻腔内及び吸入経路を介して通常の方式で投与することができる。

本発明の治療方法は、本発明の組成物を薬学的有効量で投与することを含む。担当の医師又は獣医が適切な医学的判断の範囲内で適切な一日総投与量を容易に決定できることは、当業者にとって明らかなことである。特定患者に対する治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、患者の年齢、体重、健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、共に用いられる他の薬剤の有無による実際の組成物などの医薬分野で周知の様々な因子に応じて異なる量で適用することが好ましい。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
サルモネラバクテリオファージの分離
１−１．バクテリオファージのスクリーニング及び単一バクテリオファージの分離
全羅南道務安に位置する屠鶏場及び近所の下水終末処理場から得た各試料５０ｍＬを遠心分離チューブに移し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後上澄液を０．４５μｍフィルターで濾過した。試料濾液１８ｍＬをＳＥ振盪培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μＬ及び１０×ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，最終体積１ｌ）２ｍＬと混合した。これを３７℃にて１８時間培養し、その後培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上澄液を０．４５μｍフィルターで濾過した。０．７％寒天（agar）（ｗ／ｖ）３ｍＬとＳＥ振盪培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μＬの混合液をＬＢプレートに注いで固めた。こうして製造されたプレート上に試料培養濾液１０μＬを塗布し、その後３７℃にて１８時間培養した（０．７％アガーを「トップアガー」として用い、ファージ溶解物の滴定をソフトアガーオーバーレイ（soft agar overlay）方法といわれるトップアガー上で行った。）。

ファージ溶解物を含む培養培地試料を適切に希釈し、ＳＳＥ振盪培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μＬを混合し、その後ソフトアガーオーバーレイ方法により単一溶菌斑を得た。１つの溶菌斑は１つのバクテリオファージから構成されるので、単一バクテリオファージを純粋に分離するために、１つの溶菌斑を採取して４００μＬのＳＭ溶液（ＮａＣｌ５．８ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２ｇ，１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＬ，Ｈ_２Ｏ，最終体積１Ｌ）に入れ、室温にて４時間静置して単一バクテリオファージを分離した。分離したバクテリオファージを増幅するために、単一バクテリオファージ溶液から上澄液１００μＬを採取し、０．７％寒天５ｍＬ及びＳＥ振盪培養液１００μＬと混合し、ＬＢプレート（直径９０ｍｍ）でソフトアガーオーバーレイ方法を行った。溶菌が完了したプレートに５ｍＬのＳＭ溶液を注ぎ、その後室温にて４時間軽く振盪してトップアガー中のバクテリオファージを溶出させた。バクテリオファージが溶出したＳＭ溶液を回収し、その後最終体積の１％となるようにクロロホルム（chloroform）を添加して１０分間十分に混合した。４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後得られた上澄液を０．４５μｍフィルターで濾過し、使用するまで冷蔵保管した。

１−２．バクテリオファージの大量培養
選択されたバクテリオファージをＳＥにより大量培養した。ＳＥを振盪培養した。１．５×１０^１０ｃｆｕ（colony forming unit）のアリコート（Aliquot）を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そのペレットを４ｍＬのＳＭ溶液に再懸濁した。これにバクテリオファージを１．５×１０^６ｐｆｕ（plaque forming unit）で接種してＭＯＩ（multiplicity of infection）＝０．０００１とし、その後３７℃にて２０分間静置した。この溶液を１５０ｍＬのＬＢ培地が入ったフラスコに接種し、その後３７℃にて５時間培養した。最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加し、２０分間振盪した。ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加し、この溶液を３７℃にて３０分間静置した。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）となるようにＮａＣｌとＰＥＧ（polyethylene glycol）を添加し、その後４℃にてさらに３時間静置した。４℃にて１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を除去した。こうして得られたペレットを５ｍＬのＳＭ溶液に再懸濁し、室温にて２０分間静置した。この懸濁液に４ｍＬのクロロホルムを添加し、十分に混合した。４℃にて４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、その後上澄液を０．４５μｍフィルターで濾過し、グリセリン（glycerol）密度勾配（密度：４０％，５％のグリセリン）を用いた超遠心分離（４℃，３５，０００ｒｐｍ，１時間）によりバクテリオファージを精製した。精製したバクテリオファージをΦＣＪ８と命名した。バクテリオファージΦＣＪ８は３００μＬのＳＭ溶液に再懸濁し、その後力価を測定した。前記バクテリオファージΦＣＪ８は、２０１０年１２月１４日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms，ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１００１４８Ｐ号として寄託した。

〔実施例２〕
ΦＣＪ８のサルモネラ菌感染調査
選択されたバクテリオファージがＳＥ以外のサルモネラ菌に対して溶菌活性を有するか否かを分析するために、他のサルモネラ菌に交差感染を試みた。その結果、ΦＣＪ８はＳＣ（Salmonella choleraesuis）、ＳＤ（Salmonella derby）、ＳＡ（Salmonella arizonae）及びＳＢ（Salmonella bongori）には感染しなかったが、ＳＥ（Salmonella enteritidis）、ＳＴ（Salmonella typhimurium）、ＳＧ（Salmonella gallinarum）及びＳＰ（Salmonella pullorum）には感染した。前記結果を表１及び図１に要約した。

〔実施例３〕
ΦＣＪ８の形態観察
精製されたΦＣＪ８を０．０１％ゼラチン溶液に希釈し、その後２．５％グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）溶液で固定した。前記試料を炭素コーティングされたマイカプレート（ｃａ．２．５×２．５ｍｍ）に滴下し、１０分間順応させ、滅菌された蒸留水で洗浄した。炭素フィルムを銅グリッド（copper grid）に取り付け、２％酢酸ウラニル（uranyl acetate）で３〜５秒間染色し、乾燥した。透過電子顕微鏡（LIBRA 120，Carl Zeiss transmission electron microscope，８０ｋＶ，倍率×１２０，０００〜×２００，０００）で観察したところ、精製されたΦＣＪ８は、形態学的に正二十面体の頭部と長く非収縮性の尾とから構成されることが分かり、シホウイルス科（Siphoviridae）ファミリーの形態型グループに属することを示した。

〔実施例４〕
ΦＣＪ８のタンパク質パターン分析
力価（titer）１０^１２ｐｆｕ／ｍＬの精製されたΦＣＪ８溶液１５μＬと５ＳＤＳ試料溶液３μＬを混合し、５分間沸騰させた。これを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開した。次に、ゲルをクマシーブルー（coomassie blue）で常温にて１時間染色した。図３に示すように、約４１ｋＤａ、８０ｋＤａ、１５．５ｋＤａ、６０ｋＤａ及び４３ｋＤａで主要バンドが観察された。

〔実施例５〕
ΦＣＪ８の全ゲノムＤＮＡサイズ
ΦＣＪ８のゲノムＤＮＡは超遠心分離により抽出した。具体的には、精製されたΦＣＪ８培養液にＥＤＴＡ（ethylene diamine tetraacetic acid，ｐＨ８．０）、タンパク質分解酵素Ｋ（proteinase K）及びＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）をそれぞれ最終濃度が２０ｍＭ、５０μｇ／ｍＬ及び０．５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、その後５０℃にて１時間静置した。同量のフェノール（ｐＨ８．０）を添加して十分に混合した。室温にて１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、得られた上澄液に同量のＰＣ（phenol：chloroform＝１：１）を添加して十分に混合した。室温にて１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行って上澄液を得て、総体積の１／１０の３Ｍ酢酸ナトリウム（sodium acetate）と２倍の体積の冷９５％エタノール（ethanol）を添加し、その後−２０℃にて１時間静置した。その後、０℃にて１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液を完全に除去した。こうして得られたＤＮＡペレットを５０μＬのＴＥ（Tris-EDTA，ｐＨ８．０）溶液に溶解した。抽出したＤＮＡを１０倍に希釈し、ＯＤ_２６０で吸光度を測定して濃度を決定した。１μｇの全ゲノムＤＮＡを１％ＰＦＧＥ（pulse-field gel electrophoresis）アガロースゲルにロードし、その後ＢＩＯ−ＲＡＤＰＦＧＥシステムの７番プログラム（size range 25-100 kbp, switch time ramp 0.4-2.0 seconds, linear shape, forward voltage 180 V, reverse voltage 120 V）を用いて常温にて２０時間展開させた。図４に示すように、本発明のΦＣＪ８のゲノムＤＮＡは約４４．１〜４９ｋｂｐの長さであった。

〔実施例６〕
ΦＣＪ８の遺伝分析
精製されたバクテリオファージΦＣＪ８の遺伝分析は、ΦＣＪ８のゲノムＤＮＡ５μｇをＳａｌＩとＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶとＮｒｕＩ、ＨｉｎＣＩＩとＰｖｕＩＩの制限酵素で同時に処理して開始した。また、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）ベクトルをＥｃｏＲＶで切断し、ＣＩＰ（calf intestinal alkaline phosphatase）で処理した。切断されたゲノムＤＮＡとベクトルの量が３：１となるように混合し、その後１６℃にて２時間ライゲーションした。こうして得られた発現ベクターを大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換させ、その後アンピシリン（ampicillin）及びＸ−ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside）含有ＬＢプレートに接種して青白コロニー選別を行った。選別されたコロニーをアンピシリン含有ＬＢ培地で１６時間振盪培養した。次に、プラスミド精製キット（Promega）を用いてプラスミドを抽出した。

抽出されたプラスミドのクローニングは、Ｍ１３フォワード及びリバース（配列番号１６及び１７）のプライマーセットを用いて確認し、挿入断片のサイズが１ｋｂｐ以上のもののみ選別した。こうして選別されたプラスミドは前記プライマーセットを用いて配列分析した。こうして得られた塩基配列を配列番号１〜５に示し、これらそれぞれは１〜４ｋｂｐのサイズを有する。配列番号１〜５の塩基配列をＮＣＢＩＢｌａｓｔＸとＢｌａｓｔＮプログラムを用いて塩基配列の相同性を分析し、その結果を表２に示す。

〔実施例７〕
ΦＣＪ８特異的プライマーを用いたＰＣＲ分析
ΦＣＪ８を解明するために、ΦＣＪ８に特異的なプライマーを配列番号１〜５の塩基配列を基に作製した。バクテリオファージΦＣＪ８のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び７、配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１２及び１３、並びに配列番号１４及び１５をそれぞれプライマーセットとしてＰＣＲを行った。０．１μｇのバクテリオファージのゲノムＤＮＡと０．５ｐｍｏｌｅの各プライマーセットとなるようにプレミックス（pre-mix, Bioneer）に添加し、最終体積が２０μＬとなるように調整した。９４℃、１０分間の初期変性（denaturation）後、９４℃、１分間の変性、５２℃、１分間のアニーリング（annealing）、及び７２℃、１分間の重合（polymerization）を３５回繰り返し、最終的に７２℃、１０分間の伸張を行うことによりＰＣＲを行った。こうして得られたＰＣＲ産物は、それぞれ約３．５、２．１、１．６、１．２及び１．４ｋｂｐの長さであった。前記結果を図５に示す。

〔実施例８〕
ΦＣＪ８のｐＨに対する安定性
ΦＣＪ８が家畜の胃腸内の低いｐＨで生存できるか否かを確認するために、広範なｐＨ範囲（ｐＨ２．１、２．５、３．０、３．５、４．０、５．５、６．４、６．９、７．４、８．２、９．０、９．８及び１１．０）でその安定性を調査した。様々なｐＨ溶液（酢酸ナトリウム緩衝液（sodium acetate buffer）（ｐＨ２．１、４．０、５．５及び６．４）、クエン酸ナトリウム緩衝液（sodium citrate buffer）（ｐＨ２．５、３．０及び３．５）、リン酸ナトリウム緩衝液（sodium phosphate buffer）（ｐＨ６．９及び７．４）、並びにトリス塩酸塩（Tris-HCl）（ｐＨ８．２、９．０、９．８及び１１．０））は０．２Ｍの濃度を有する。各ｐＨの溶液１８０μＬとバクテリオファージ溶液（１．１×１０^１１ｐｆｕ／ｍＬ）２０μＬを混合し、常温にて２時間静置した。これらを段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各希釈液１０μＬを３７℃にて１８時間培養し、ファージ溶液の力価を測定した。ｐＨ変化による力価変化を比較して相対的安定性を確認した。その結果、前記バクテリオファージは、ｐＨ３．０までは活性を失わずに安定性を維持した。しかし、ｐＨ２．５又はそれ以下では活性が消失した。前記結果を図６に示す。

〔実施例９〕
ΦＣＪ８の温度安定性
バクテリオファージを飼料添加剤として用いる場合に剤形化過程で発生する熱に対する安定性を確認するため、次の実験を行った。１．０×１０^１１ｐｆｕ／ｍＬの力価のΦＣＪ８溶液２００μＬを３７、４５、５３、６０、７０及び８０℃にてそれぞれ０、１０、３０、６０及び１２０分間静置した。処理した実験培養液を段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各希釈液１０μＬを３７℃にて１８時間培養し、ファージ溶液の力価を測定した。温度及び静置時間による力価変化を比較して相対的安定性を測定した。その結果、前記バクテリオファージは、６０℃にて２時間静置しても活性を失わなかった。しかし、前記バクテリオファージは、８０℃にて１０分以上静置すると活性を急速に消失した。前記結果を図７に示す。

〔実施例１０〕
ΦＣＪ８の乾燥に対する安定性
バクテリオファージを飼料添加剤として用いる場合に剤形化過程で発生する乾燥条件に対する安定性を確認するため、次の実験を行った。耐熱性実験結果に基づき、本実験は高温乾燥条件（６０℃にて１２０分間）で行われた。ΦＣＪ８溶液（６．０×１０^１１ｐｆｕ／ｍＬ）２００μＬをスピードバック（Speed-Vacuum Concentrator 5301, Eppendorf）で乾燥させた。こうして得られたペレット（pellet）をＳＭ溶液２００μＬに入れ、４℃にて１日間完全に再懸濁した。前記溶液を段階希釈し、ソフトアガーオーバーレイ方法で各希釈飼料１０μＬを３７℃にて１８時間培養し、ファージ溶液の力価を測定した。乾燥前後の力価の変化を比較して相対的安定性を測定した。その結果、本発明のバクテリオファージΦＣＪ８の活性は約５０倍の減少を示した。前記結果を図８に示す。

〔実施例１１〕
ΦＣＪ８の野生サルモネラ菌株に対する感染範囲の調査
ＳＥ（ＳＧＳＣＳＥ２２８２）、ＳＴ（ＡＴＣＣＳＴ１４０２８）、ＳＧ（ＳＧＳＣＳＧ２２９３）及びＳＰ（ＳＧＳＣＳＰ２２９５）以外にも、ΦＣＪ８の溶菌活性を、ソウル大学校獣医科大学鳥類疾病学室、国立獣医科学検疫院及び疾病管理本部で分離した、韓国野生株ＳＥ（４９菌株）、ＳＴ（２５菌株）、ＳＧ（５３菌株）、ＳＰ（１９菌株）、ＳＣ（７菌株）及びＳＤ（３菌株）で調査した。

各菌株の振盪培養液（ＯＤ_６００＝２）１５０μＬを混合し、ΦＣＪ８溶液（１０^１０ｐｆｕ／ｍＬ）１０μＬをソフトアガーオーバーレイ方法で３７℃にて１８時間培養し、溶菌斑形成の有無を観察した。バクテリオファージΦＣＪ８は、ＳＥ、ＳＴ、ＳＧ及びＳＰの全てに対して９５％の溶菌活性を示す。前記結果を表３に要約した。

〔実施例１２〕
ΦＣＪ８の毒性評価
サルモネラ症、サルモネラ食中毒、家禽チフス及び雛白痢の予防に安定して用いるために、前記バクテリオファージの毒性をｉｎｖｉｖｏ評価した。毒性評価は単回経口用量で行った。本評価においては、ラットにΦCJ８を単回経口投与して急性毒性を調査し、ΦＣＪ８の概略の致死量を得た。特定病原体不在（ＳＰＦ）の７週齢のラット雌雄（それぞれ１０匹）を毒性試験の前日に絶食させた。投与当日に経口ゾンデを用いて１×１０^１３ｐｆｕの濃度のΦＣＪ８を雌雄それぞれ５匹に経口投与し、対照群として残りの雌雄それぞれ５匹には２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌと２ｍＭのＭｇＣｌ_２の混合溶液を経口投与し、経口投与４時間後に飼料給与を再開した。投与当日は投与３０分後に観察を始め、４時間毎に観察した。その後、１４日間は１日１回臨床徴候を観察して記録した。その結果、ΦＣＪ８の毒性による死亡個体及び毒性症状はなかった。前記結果を表４〜６に示す。投与前並びに投与１日、３日、７日、１０日及び１４日後の体重変化を観察して記録した。図９に示すように、対照群と比較して、有意な体重変化は観察されなかった。前記結果はΦＣＪ８が食欲減少や体重変化の原因となるいかなる毒性反応も引き起こさないことを示すものである。また、剖検及び目視観察においても、明確な異常は見られなかった。よって、新規バクテリオファージΦＣＪ８には毒性がない。

〔実施例１３〕
ΦＣＪ８の飼料添加剤としての効率
ΦＣＪ８を家畜に飼料として使用する場合の安定性及びサルモネラに対する予防効果を調査するために、家畜の成長、臓器と筋肉の相対的重量を測定した。本実験においては、２日齢のロス種ブロイラー雄鶏（平均体重４１．４ｇ）３２０匹を供試し、５週間飼育した。これらは４つの処理群（対照群：基本飼料，ＢＰ−１：基本飼料＋ΦＣＪ８０．０５％，ＢＰ−２：基本飼料＋ΦＣＪ８０．１０％，ＢＰ−３：基本飼料＋ΦＣＪ８０．２０％）に分けて８回繰り返し、完全乱塊法（RCBD: Randomized Completely Block Design）で１０匹を１群として配置した。ここで、ΦＣＪ８の力価は１０^９ｐｆｕ／ｇであった。その後、実験はトウモロコシ・大豆を基礎とした飼料で行い、２段階の飼料プログラムを用いた。段階Ｉにおいては、粗タンパク質含有量２３．０％、リジン含有量１．１９％を含む飼料を２週間与えた。段階ＩＩにおいては、粗タンパク質含有量２１．０％、リジン含有量１．０５％を含む飼料を３週間与えた。他の全ての栄養素は韓国家畜飼養標準（家禽，２００７）に適合するか、それ以上であった。

その結果、５週間にわたる飼料内のΦＣＪ８の添加はブロイラーの成長に何らの悪影響も及ぼさなかった（表７）。肝臓、脾臓、腹部脂肪、胸の筋肉、脚の筋肉などの臓器と筋肉の相対的重量においても処理期間における有意な差は観察されなかった（表８）。これらの結果は、ΦＣＪ８を０．０５〜０．２％の濃度で添加してもブロイラーの成長又は臓器及び筋肉の発達に悪影響を及ぼさないことを意味する。ブロイラーの雛の繁殖から５週間の持続的なΦＣＪ８の添加給与においても成長活動や臓器及び筋肉の発達などに悪影響を及ぼさず、ΦＣＪ８の安定性が確認された。これらの結果は、病原菌に対する特異的な殺菌活性ゆえにΦＣＪ８が給与された鶏肉の消費者において、サルモネラエンテリティディスによる食中毒を予防できることを示すものである。

〔実施例１４〕
ΦＣＪ８のＳＥ繁殖及び糞便排出に対する抑制効果
ΦＣＪ８のサルモネラに対する予防又は治療の可能性を確認するために、その抑制効果をニワトリで測定した。効能評価は、厳格にサルモネラ制御が行われる養鶏農場の種鶏２７０匹を対象とした。１日齢産卵鶏２７０匹を３つの処理群及び陽性対照群（１群当たり６０匹）、並びに陰性対照群（３０匹）に分け、グループ別に隔離飼育した。

前記３つのΦＣＪ８処理群には１０^５、１０^７、１０^９ｐｆｕ／ｋｇの濃度のバクテリオファージΦＣＪ８を含む飼料をそれぞれ与え、陽性対照群及び陰性対照群には一般飼料を与えた。各処理群の６０匹のうち３０匹の雛にＳＥ（サルモネラエンテリティディス：５×１０^７ＣＦＵ／ｂｉｒｄ）（「攻撃接種群」）を経口接種し、残りの３０匹の雛（「接触感染群」）はＳＥ接種した雛と同居飼育した。ＳＥ接種７日、１４日及び２１日後に、攻撃接種群及び接触感染群のそれぞれ１０匹の雛の盲腸糞からＳＥを分離し、定量分析した。ＳＥ接種７日、１４日及び２１日後に、処理群と対照群の飼育施設の出入り口、床及び換気フィルターから試料を収集し、定量的なサルモネラ分離を比較した。

ＳＥ接種７日、１４日及び２１日後に、陽性対照群に比べて、腸内のサルモネラの減少が、１０^７及び１０^９ｐｆｕ／ｋｇのΦＣＪ８を投与した接種群及び接触感染群において観察された。１０^７及び１０^９ｐｆｕ／ｋｇのΦＣＪ８を投与した接種群は、非投与群に比べて、ＳＥによる環境汚染の減少を示し、これは本発明のバクテリオファージΦＣＪ８が環境へのＳＥ排泄を抑制することを意味する。ΦＣＪ８投与はまた、接種群の腸内のＳＥ増殖を抑制し、これは環境へのＳＥ排泄の減少をもたらし、結果として、同居飼育された接触感染群へのＳＥ繁殖を防止した。前記結果を図９及び図１０に示す。

本発明の新規バクテリオファージは、有益菌に影響を与えることなく、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームに特異的な殺菌活性を有し、優れた耐酸性、耐熱性及び耐乾性を有するので、前記バクテリオファージは、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームにより引き起こされる感染症、特に、サルモネラ症、サルモネラ食中毒、家禽チフス及び雛白痢の予防又は治療に有用であるだけでなく、治療剤、抗生物質、飼料、動物のための飲用水、消毒剤及び洗浄剤に適用することができる。

本発明を説明するために好ましい態様を示したが、当業者であれば、請求の範囲に示す発明の範囲及び精神を逸脱しない限り、様々な変形、追加及び置換が可能であることを理解するであろう。

ＫＣＣＭ１１１４８Ｐ

１−２．バクテリオファージの大量培養
選択されたバクテリオファージをＳＥにより大量培養した。ＳＥを振盪培養した。１．５×１０^１０ｃｆｕ（colony forming unit）のアリコート（Aliquot）を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そのペレットを４ｍＬのＳＭ溶液に再懸濁した。これにバクテリオファージを１．５×１０^６ｐｆｕ（plaque forming unit）で接種してＭＯＩ（multiplicity of infection）＝０．０００１とし、その後３７℃にて２０分間静置した。この溶液を１５０ｍＬのＬＢ培地が入ったフラスコに接種し、その後３７℃にて５時間培養した。最終体積の１％となるようにクロロホルムを添加し、２０分間振盪した。ＤＮａｓｅＩとＲＮａｓｅＡをそれぞれ最終濃度１μｇ／ｍＬとなるように添加し、この溶液を３７℃にて３０分間静置した。最終濃度がそれぞれ１Ｍと１０％（ｗ／ｖ）となるようにＮａＣｌとＰＥＧ（polyethylene glycol）を添加し、その後４℃にてさらに３時間静置した。４℃にて１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して上澄液を除去した。こうして得られたペレットを５ｍＬのＳＭ溶液に再懸濁し、室温にて２０分間静置した。この懸濁液に４ｍＬのクロロホルムを添加し、十分に混合した。４℃にて４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行い、その後上澄液を０．４５μｍフィルターで濾過し、グリセリン（glycerol）密度勾配（密度：４０％，５％のグリセリン）を用いた超遠心分離（４℃，３５，０００ｒｐｍ，１時間）によりバクテリオファージを精製した。精製したバクテリオファージをΦＣＪ８と命名した。バクテリオファージΦＣＪ８は３００μＬのＳＭ溶液に再懸濁し、その後力価を測定した。前記バクテリオファージΦＣＪ８は、２０１０年１２月１４日付けで韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms，ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１）に寄託番号第ＫＣＣＭ１１１４８Ｐ号として寄託した。

Claims

シホウイルス科（Siphoviridae）ファミリーの形態型（morphotype）グループに属し、サルモネラエンテリティディス（Salmonella enteritidis）、サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、サルモネラガリナルム（Salmonella gallinarum）及びサルモネラプロラーム（Salmonella pullorum）からなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラバクテリアに対して特異的な殺菌活性を有する、分離されたバクテリオファージであって、次の属性の１つで特定されるものである。
ｉ）前記バクテリオファージは、正二十面体の頭部（isometric capsid）及び長く非収縮性の尾（long non-contractile tail）から構成された形態学的構造を有する。
ii）前記バクテリオファージは、全ゲノムのサイズがが４４〜４９ｋｂｐである。
iii）４０〜４３ｋＤａ、７９〜８２ｋＤａ、１４〜１６ｋＤａ、５９〜６２ｋＤａ及び４１〜４４ｋＤａのサイズの主要構造タンパク質を有する。
前記バクテリオファージが、図１に示す形態を有するものである請求項１に記載のバクテリオファージ。
前記バクテリオファージが、配列番号１〜５からなる群から選択される少なくとも１つの核酸分子をゲノム全体の一部として含むものである請求項１に記載のバクテリオファージ。
前記バクテリオファージは、そのゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び７、配列番号８及び９、配列番号１０及び１１、配列番号１２及び１３、並びに配列番号１４及び１５からなる群から選択される１つ又はそれ以上のプライマーセットを用いたＰＣＲを行う際に、約１〜４ｋｂｐのサイズのＰＣＲ産物を生じるものである請求項１に記載のバクテリオファージ。
前記バクテリオファージが、ｐＨ３．０〜１１．０の範囲で耐酸性を有し、３７〜７０℃の範囲で耐熱性を有し、６０℃の乾燥条件で耐乾性を有するものである請求項１に記載のバクテリオファージ。
前記バクテリオファージが、寄託番号ＫＣＣＭ１１１４８Ｐで同定されるものである請求項１に記載のバクテリオファージ。
請求項１〜６のいずれかのバクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされる感染症の予防又は治療用組成物。
前記サルモネラエンテリティディス又はサルモネラティフィムリウムにより引き起こされる感染症がサルモネラ症又はサルモネラ食中毒であり、サルモネラガリナルムにより引き起こされる感染症が家禽チフスであり、サルモネラプロラームにより引き起こされる感染症が雛白痢である請求項７に記載の組成物。
請求項１〜６のいずれかのバクテリオファージを有効成分として含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされる感染症の予防又は治療用の抗生物質組成物。
請求項１〜６のいずれかのバクテリオファージを有効成分として含む、家畜用飼料又は飲用水。
請求項１〜６のいずれかのバクテリオファージを有効成分として含む、消毒剤又は洗浄剤。
請求項１〜６のいずれかのバクテリオファージを、それを必要とする動物に投与する段階を含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされる感染症を予防又は治療する方法。
請求項７の組成物を、それを必要とする動物に投与する段階を含む、サルモネラエンテリティディス、サルモネラティフィムリウム、サルモネラガリナルム及びサルモネラプロラームからなる群から選択される少なくとも１つのサルモネラ菌により引き起こされる感染症を予防又は治療する方法。