CN112094329B - 脂蛋白运输抑制剂及其应用和抑菌药物 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种脂蛋白运输抑制剂及其应用和抑菌药物，涉及生物医药领域。本申请采用单颗粒冷冻电镜技术与体内功能分析实验研究了LolCDE蛋白复合物中参与脂蛋白运输的关键氨基酸位点，发现LolC蛋白与LolE蛋白中多个氨基酸位点对脂蛋白运输起着关键性作用，这些氨基酸的功能一旦遭到破坏，能够阻断脂蛋白运输进而影响细菌存活。因此，以这些氨基酸为靶点开发抗菌药物具有十分重要的意义。

Description

脂蛋白运输抑制剂及其应用和抑菌药物

技术领域

本申请涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂蛋白运输抑制剂及其应用和抑菌药物。

背景技术

当前，抗生素滥用导致细菌耐药性问题越来越严重，对人类健康问题产生巨大威胁，甚至出现耐药性极强的“超级细菌”。这其中尤其是革兰氏阴性菌非常难以治疗，究其原因主要是因为革兰氏阴性菌表面特有的包膜系统能够阻止有毒物质的进入，并且可以抵御抗生素等物质对其的破坏。研究表明，该包膜系统由内膜(inner membrane，IM)和外膜(outer membrane，OM)及可溶性周质组成。OM具有独特的结构，由不对称分布的磷脂(phospholipids，磷脂)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)及众多膜蛋白分子机器组成；而内膜(inner membrane，IM)也具有特定结构，由两层对称分布的磷脂分子及各类膜蛋白组成。当前研究显示，脂蛋白属于OM蛋白中种类繁多的一大类蛋白，参与维持细菌多种重要功能，而某些脂蛋白或脂蛋白复合物机器对于细菌的存活至关重要，一旦对其破坏，不仅能够影响细菌存活甚至是致死。

脂蛋白是一类具有广泛作用的蛋白质，维持细胞多种生物学功能。当前研究揭示，部分功能重要的细菌蛋白组装机器需要至少一种OM脂蛋白成分才能发挥作用；例如，外膜蛋白折叠机器BamABCDE中的脂蛋白BamB、BamC、BamD、BamE和脂多糖转运复合物LptDE中的脂蛋白LptE。另外，OM脂蛋白参与许多革兰氏阴性菌肽聚糖细胞壁的合成，对于维持细胞壁的完整性必不可少。由此可见，脂蛋白的功能重要且广泛，将这些脂蛋白递送至OM的运输途径既是维持OM完整性的必要过程，也是多种致病菌引起致病的重要原因。因此，通过扰乱脂蛋白运输过程进而阻止脂蛋白运输，使其相应脂蛋白或其复合物组成的蛋白机器无法正常运转，从而达到抑制或杀灭细菌尤其是耐药性极强的超级细菌具有极其重要的研究意义。

发明内容

本申请的目的在于提供一种脂蛋白运输抑制剂及其应用和抑菌药物，所述脂蛋白运输抑制剂通过阻断细菌脂蛋白的转运进而影响细菌存活。

为实现以上目的，本申请提供一种脂蛋白运输抑制剂，所述脂蛋白运输抑制剂的靶点包括LolC蛋白中的氨基酸位点与LolE蛋白中的氨基酸位点的至少一种。

本申请一些实施例中，所述LolC蛋白中的氨基酸位点包括F51、L55、D352中的至少一个。

本申请一些实施例中，所述LolC蛋白中的氨基酸位点包括L55。

本申请一些实施例中，所述LolE蛋白中的氨基酸位点包括I268、F367、D264、Y366中的至少一个。

本申请一些实施例中，所述LolE蛋白中的氨基酸位点包括I268、Y366中的至少一个。

本申请一些实施例中，所述脂蛋白运输抑制剂包括DNA、RNA、蛋白质、多肽、小肽、化合物中的一种或多种。

本申请一些实施例中，所述脂蛋白运输抑制剂包括能够特异性敲除作为靶点的氨基酸的基因编辑试剂。

可以理解的是，所述基因编辑试剂通过对作为靶点的氨基酸的相应基因进行敲除，从而破坏了作为靶点的氨基酸的功能，阻断脂蛋白运输进而影响细菌存活。

本申请一些实施例中，所述基因编辑试剂为基于CRISPR-Cas9的基因编辑试剂。

本申请一些实施例中，所述脂蛋白运输抑制剂包括能够特异性与作为靶点的氨基酸结合的抗体或配体。

可以理解的是，所述抗体或配体通过与作为靶点的氨基酸进行结合，能够使作为靶点的氨基酸失去原有功能，从而影响阻断脂蛋白运输进而影响细菌存活。

本申请还提供一种所述脂蛋白运输抑制剂在制备抑菌药物中的应用。

本申请还提供一种抑菌药物，包括所述脂蛋白运输抑制剂。

本申请的有益效果：

本申请采用单颗粒冷冻电镜技术与体内功能分析实验研究了LolCDE蛋白复合物中参与脂蛋白运输的关键氨基酸位点，发现LolC蛋白与LolE蛋白中多个氨基酸位点对脂蛋白运输起着关键性作用，这些氨基酸的功能一旦遭到破坏，能够阻断脂蛋白运输进而影响细菌存活。因此，以这些氨基酸为靶点开发抗菌药物具有十分重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。

图1为LolCDE蛋白复合物的表达鉴定结果。其中：a为表达纯化的LolCDE蛋白复合物的SDS-PAGE鉴定结果；b为表达纯化的LolCDE蛋白复合物的分子筛层析实验结果。

图2为LolCDE蛋白复合物中参与脂蛋白运输的主要氨基酸位点的分析结果。其中：a显示LolCDE蛋白复合物与底物脂蛋白结合的情况；b和c显示LolC蛋白、LolE蛋白中与底物脂蛋白相互作用的主要氨基酸位点。

图3为大肠杆菌中关键氨基酸位点突变对细菌存活的影响。其中：a为LolC蛋白中关键氨基酸位点突变对细菌存活的影响；b为LolE蛋白中关键氨基酸位点突变对细菌存活的影响；c为LolC蛋白突变菌表达的LolC突变蛋白的Western blot检测结果；d为LolE蛋白突变菌表达的LolE突变蛋白的Western blot检测结果。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。

“重量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的重量份为a份，B组分的重量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与重量份数不同的是，所有组分的重量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

研究发现，Lol途径负责外膜脂蛋白的运输。Lol途径由LolABCDE五种蛋白组成，共同构成脂蛋白转运途径的蛋白机器。首先，新合成的脂蛋白经过一系列组装形成成熟的脂蛋白，随后成熟的脂蛋白通过Lol途径运输至外膜。LolCDE复合物是一种ABC转运蛋白，包含跨内膜蛋白LolC和LolE的异二聚体以及细胞质LolD的同源二聚体，后者形成水解ATP的核苷酸结合域。LolCDE负责从内膜上大量提取脂蛋白，并将其转移到周质伴侣LolA中。在这一过程中LolCDE起着关键性的作用。研究表明，LolCDE为保守的蛋白机器，破坏其功能会直接导致细菌的死亡，因此脂蛋白转运途径中，LolCDE为十分理想的抗菌靶点。

下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1 LolCDE蛋白复合物表达纯化

1.1包含LolCDE基因的重组载体构建和LolCDE蛋白复合物表达纯化方法

(1)参考大肠杆菌(E.coli)基因组中的LolCDE基因，设计特异性引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因，随后将目的基因重组至pTRC99a表达载体中，构建原核表达载体；

(2)待重组载体测序正确后转化入大肠杆菌感受态C43，挑取单克隆于30mL LB培养基中(含100μg/mL Ampicillin)，于37℃扩大培养后接种于400mL LB培养基中过夜培养，随后接种6L LB培养基中，37℃扩大培养待OD600＝1.0时，以200μM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于20℃诱导14-16h；

(3)以240mL重悬buffer(50mM Tris pH 7.8，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，10mM咪唑，1mM PMSF)重悬菌液，随后高压破菌；

(4)将破菌后的悬液用4000rpm，4℃，预离心20min，将预离心后的上清液倒入超离管中，140，000×g超离1h，收集细胞膜沉淀；

(5)以重悬buffer(50mM Tris pH 7.8，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，10mMimidazole)配制1wt％DDM(100mL)，将细胞膜沉淀溶解于1wt％DDM(十二烷基-beta-D-麦芽糖苷)中，在室温抽提1h；

(6)将抽提后的液体倒入超离管，140，000×g，离心20min，收集上清；

(7)以超离后的上清过Ni柱，采用buffer(50mM Tris pH7.8，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，0.05wt％DDM)分别配制10mM咪唑、40mM咪唑以及250mM咪唑。首先采用10mM咪唑的buffer平衡Ni柱5个柱体积，随后将超离上清样品低速流穿Ni柱两次，结束后以40mM咪唑洗Ni柱20个柱体积，最后采用250mM咪唑洗脱目的蛋白，并以A280测定蛋白浓度。

(8)将目的蛋白以Superdex 200Increase 10/300层析柱进行分子筛层析进一步分离纯化目的蛋白，以SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况及蛋白纯度。

1.2结果分析

SDS-PAGE结果如图1，a所示，从图1，a可以看出，重组表达的LolCDE蛋白复合物中，LolC蛋白、LolD蛋白、LolE蛋白的比例正确，说明LolCDE蛋白复合物表达成功。分子筛层析实验结果如图1，b所示，从图1，b可以看出，吸收光谱仅具有一个吸收峰，也即是说，纯化得到的LolCDE蛋白复合物的性质较均一，纯度较高。

实施例2冷冻电镜结构分析LolCDE蛋白复合物中参与脂蛋白转运的主要氨基酸位点

上述实施例1得到性质均一且稳定的LolCDE蛋白复合物后，采用单颗粒冷冻电镜技术(Single particle cryo-EM)，解析了高分辨率的LolCDE蛋白复合物的结构。

单颗粒冷冻电镜技术是生物医学领域中一项重要的技术，该技术首先需要对生物大分子进行快速冷冻，在低温的环境下使用透射电镜观察生物大分子的结构并拍照成像，这些关键性的工作完成之后，还要经过精细的图像处理和缜密的重构计算以使研究者们对实验观测所得到的图像有一个更加清晰深入的了解，最终得到生物大分子的空间结构。在历经三十多年的发展，单颗粒冷冻电镜技术已成为研究结构生物学极为关键的方法，与X射线晶体学和磁共振技术(nuclear magneticresonance，NMR)共同构成了高解析度的结构生物学研究的必要手段。在蛋白质研究方面，利用该技术能够将超低温速冻的蛋白质分子用电子轰击以产生单个分子的显微镜图像，随后这些图像可以采用软件重建分子的3D形状或结构。重建出的蛋白分子结构对于揭示蛋白质如何发挥作用以及如何用药物靶向蛋白质均非常有用。

2.1冷冻电镜样品的制备

(1)准备无污染的液氮，对用到的制样工具提前清洁并干燥处理；

(2)打开Vitrobot制样机，设置参数，blot time＝3.5s，blot force＝1，waittime＝20s，draintime＝1s，blot total＝1，温度4℃，湿度100％；

(3)准备制样容器，加入液氮预冷容器，随后通入乙烷使乙烷慢慢冷却至固液混合态；

(4)对铜网做辉光放电，将制样容器放在Vitrobot上，夹取铜网，取3μL纯化的蛋白复合物样品加入到铜网上，接着运行制样程序；

(5)取下铜网，迅速转移至样品保存盒，液氮保存待用。

2.2冷冻电镜数据收集及处理

(1)将样品保存盒取出置于干净的液氮容器中，随后将铜网从样品保存盒中取出转移至上样器中，固定clip ring，加入液氮保持低温；

(2)使用FEI Titan Krios 300kV电镜收集数据，将上样器推入样品台，抽真空，随后打开镜筒阀，寻找冰层合适的区域并标记；

(3)待标记好所有冰层合适的区域后，以一定角度做wobbler，调节Z轴聚焦；

(4)在样品较好的区域拍照检查以确认样品状态是否良好，筛选出所有状态良好的区域在Serial EM软件中设置拍照所需参数以进行大规模数据收集；

(5)将收集的电镜数据照片使用RELION软件挑选形态较好的单颗粒用于三维分类和重构，得到最终的电镜结构。

2.3结果分析

根据解析的蛋白结构，发现LolCDE蛋白复合物结合有底物脂蛋白(Lipoprotein)(图2，a)。随后根据解析的高分辨率冷冻电镜结构，进一步分析其中的氨基酸位点，发现：LolE蛋白上的氨基酸位点I268、F367、D264、Y366(图2，b及图2，c)与底物脂蛋白的N端脂肪酰基链相互作用；LolC蛋白上的氨基酸位点F51、L55、D352(图2，b及图2，c)与底物脂蛋白的N端脂肪酰基链相互作用。推测以上氨基酸位点参与脂蛋白转运，因此若能筛选到影响转运功能的关键氨基酸位点，则能够依据这些位点为靶点，设计新型抗生素，阻断细菌脂蛋白转运，进而抑制甚至杀灭细菌。

实施例3体内功能分析鉴定LolCDE蛋白复合物转运脂蛋白的关键氨基酸位点

为鉴定LolCDE蛋白复合物中影响脂蛋白转运的关键氨基酸位点，本申请设计体内功能分析实验，在体内鉴定了LolCDE蛋白复合物影响脂蛋白转运的关键氨基酸功能位点，为以这类关键功能位点为靶点设计新型抗菌药物进一步奠定坚实的基础。

3.1体内功能分析实验

研究发现，将大肠杆菌基因组中的LolCDE基因完全敲除会直接导致大肠杆菌的死亡，因此本申请采用以下研究策略：

首先采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将大肠杆菌基因组中的LolCDE基因敲除，同时在基因组中插入阿拉伯糖操纵子控制的LolCDE基因，得到大肠杆菌LolCDE基因敲除菌(ΔlolCDE)，ΔlolCDE中LolCDE蛋白复合物的表达受阿拉伯糖(arabinose)调控，当培养体系中添加适当浓度阿拉伯糖时，LolCDE蛋白复合物能够表达，ΔlolCDE能够存活，当培养体系中不含阿拉伯糖时，LolCDE蛋白复合物不会表达，ΔlolCDE不能存活。

为了在体内进一步鉴定LolCDE蛋白复合物中影响脂蛋白运输的关键氨基酸位点，本申请以大肠杆菌LolCDE基因敲除菌(ΔlolCDE)为基础，在LolCDE蛋白复合物上设计点突变，构建点突变载体，再分别转化入大肠杆菌LolCDE基因敲除菌(ΔlolCDE)中梯度稀释进行功能分析，验证突变位点的氨基酸对细菌存活的影响。具体实验操作如下：

通过PCR将大肠杆菌LolC蛋白、LolE蛋白中的单个关键氨基酸位点的相应基因位置进行突变，得到LolCDE突变蛋白基因，插入pTRC99a载体(氨苄抗性)中，得到点突变载体。进行功能分析时，将这些点突变载体转化进入大肠杆菌LolCDE基因敲除菌(ΔlolCDE)，获得突变菌，所述突变菌包括LolC(F51D)DE、LolC(L55D)DE、LolC(D352A)DE、LolCDE(I268D)、LolCDE(F367D)、LolCDE(D264A)、LolCDE(Y366A)。所述突变菌的名称中，括号内末字母表示突变后的氨基酸，比如：

LolC(F51D)DE表示LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点F51突变为D(天冬氨酸)；

LolC(L55D)DE表示LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点L55突变为D(天冬氨酸)；

LolC(D352A)DE表示LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点D352突变为A(丙氨酸)；

LolCDE(I268D)表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点I268突变为D(天冬氨酸)；

LolCDE(F367D)表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点F367突变为D(天冬氨酸)；

LolCDE(D264A)表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点D264突变为A(丙氨酸)；

LolCDE(Y366A)表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点Y366突变为A(丙氨酸)。

空质粒pTRC99a转入大肠杆菌LolCDE基因敲除菌(ΔlolCDE)中形成阴性对照(empty vector)。

质粒pTRC99a-LolCDE(即携带未突变的LolCDE基因的载体)转入大肠杆菌LolCDE基因敲除菌(ΔlolCDE)中形成阳性对照(WT，未做突变)。

功能分析实验具体操作为：收获传代培养的细胞沉淀，洗涤两次并在无菌LB培养基中稀释至OD₆₀₀为0.5进行十倍系列稀释测定细胞活力，稀释范围为10^-1至10^-6，随后，将5μl稀释的细胞滴到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上，在37℃过夜培养后观察细胞生长。

3.2结果分析

体内功能分析结果表明：与未突变的野生型(WT)和空载体(Empty vector)相比较，LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点F51、L55影响细菌存活(图3，a)；LolE蛋白上的氨基酸位点I268、F367、D264、Y366影响细菌存活(图3，b)；其中LolC蛋白上的氨基酸位点L55以及LolE蛋白上的氨基酸位点I268、Y366抑制最为明显，改变原有氨基酸性质后细菌几乎不能存活。

同时采用抗Flag抗体和抗Myc抗体，以Western blot分别检测LolC点突变的LolCDE突变蛋白(载体序列中插入Flag标签)和LolE点突变的LolCDE突变蛋白(载体序列中插入Myc标签)在各突变体中的表达情况。结果显示LolC点突变的LolCDE突变蛋白(LolC-F51D、LolC-L55D、LolC-D352A)(参见图3，c)以及LolE点突变的LolCDE突变蛋白(LolE-I268D、LolE-F367D、LolE-D264A、LolE-Y366A)(参见图3，d)均能正常表达，说明突变分析结果可靠。

图3，c中，LolC(Flag)DE表示LolCDE蛋白复合物中的LolC蛋白添加Flag标签；

LolC-F51D表示LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点F51突变为D(天冬氨酸)，是前述突变菌LolC(F51D)DE的表达产物；

LolC-L55D表示LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点L55突变为D(天冬氨酸)，是前述突变菌LolC(L55D)DE的表达产物；

LolC-D352A表示LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点D352突变为A(丙氨酸)，是前述突变菌LolC(D352A)DE的表达产物。

图3，d中，LolCDE(Myc)表示LolCDE蛋白复合物中的LolE蛋白添加Myc标签；

LolE-I268D表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点I268突变为D(天冬氨酸)，是前述突变菌LolCDE(I268D)的表达产物；

LolE-F367D表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点F367突变为D(天冬氨酸)，是前述突变菌LolCDE(F367D)的表达产物；

LolE-D264A表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点D264突变为A(丙氨酸)，是前述突变菌LolCDE(D264A)的表达产物；

LolE-Y366A表示LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点Y366突变为A(丙氨酸)，是前述突变菌LolCDE(Y366A)的表达产物。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (2)

1.一种大肠杆菌点突变载体，其特征在于，所述点突变载体将大肠杆菌LolCDE蛋白复合物中LolC蛋白上的氨基酸位点L55突变为D，将大肠杆菌LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点I268突变为D，和/或将大肠杆菌LolCDE蛋白复合物中LolE蛋白上的氨基酸位点Y366突变为A。

2.权利要求1所述的大肠杆菌点突变载体在制备大肠杆菌的基因编辑试剂中的应用。

Images