CN111632148A - 脂质转运蛋白抑制剂及其应用和抑菌药物 - Google Patents

脂质转运蛋白抑制剂及其应用和抑菌药物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种脂质转运蛋白抑制剂及其应用和抑菌药物。所述脂质转运蛋白抑制剂的靶点位于MlaFEDB蛋白复合物中的一个或多个氨基酸位点；优选的，所述脂质转运蛋白抑制剂的靶点位于MlaD蛋白、MlaF蛋白以及MlaE蛋白中的至少一个上。本发明研究了MlaFEDB蛋白复合物中参与磷脂转运的关键氨基酸位点，发现MlaD蛋白、MlaE蛋白以及MlaF蛋白中多个氨基酸位点对磷脂转运起着关键性作用，这些氨基酸的功能一旦遭到破坏，能够显著影响磷脂转运效率进而影响细菌存活。因此，以这些氨基酸为靶点开发抗菌药物具有十分重要的意义。

Description

脂质转运蛋白抑制剂及其应用和抑菌药物
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种脂质转运蛋白抑制剂及其应用和抑菌药物。
背景技术
当前，抗生素滥用导致细菌耐药性问题越来越严重，对人类健康问题产生巨大威胁，甚至出现耐药性极强的“超级细菌”。这其中尤其是革兰氏阴性菌非常难以治疗，究其原因主要是因为革兰氏阴性菌表面特有的包膜系统能够阻止有毒物质的进入，并且可以抵御抗生素等物质对其的破坏。研究表明，该包膜系统由内膜(inner membrane，IM)和外膜(outer membrane，OM)及可溶性周质组成。OM具有独特的结构，由不对称分布的磷脂(phospholipids，磷脂)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)组成；而内膜(innermembrane，IM)也具有特定结构，由两层对称分布的磷脂分子组成。当前研究显示，维持外膜脂质的不对称分布对于革兰氏阴性菌的存活至关重要，而一旦打破这一平衡，不仅能够影响细菌存活甚至是致死，而且有利于对抗“超级细菌”的耐药性问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脂质转运蛋白抑制剂及其应用和抑菌药物，所述脂质转运蛋白抑制剂通过影响外膜的磷脂转运效率进而影响细菌存活。
为实现以上目的，本发明提供一种脂质转运蛋白抑制剂，所述脂质转运蛋白抑制剂的靶点位于MlaFEDB蛋白复合物中的一个或多个氨基酸位点。
本发明一些实施例中，所述脂质转运蛋白抑制剂的靶点位于MlaD蛋白、MlaF蛋白以及MlaE蛋白中的至少一个上。
本发明一些实施例中，所述MlaD蛋白中的靶点包括氨基酸位点L143、L146、I147、F150、Y152中的至少一个。
本发明一些实施例中，所述MlaD蛋白中的靶点包括氨基酸位点L143、I147、Y152中的至少一个。
本发明一些实施例中，所述MlaE蛋白中的靶点包括氨基酸位点V69、L70、Q73、V77、Y81、T85、M89、L90、L93、R97、E98、L99、V102、V103、D250中的至少一个；
优选的，所述MlaE蛋白中的靶点包括氨基酸位点V77、Y81、E98中的至少一个。
本发明一些实施例中，所述MlaF蛋白中的靶点包括氨基酸位点R18、R21、K47、H203、R151、S146、E144、R151、Y256、H262中的至少一个；
优选的，所述MlaF蛋白中的靶点包括氨基酸位点S146、R151中的至少一个。
本发明一些实施例中，所述脂质转运蛋白抑制剂包括DNA、RNA、蛋白质、多肽、小肽、化合物中的一种或多种。
本发明一些实施例中，所述脂质转运蛋白抑制剂为能够特异性敲除所述靶点的氨基酸的基因编辑试剂或者特异性与所述靶点的氨基酸结合的抗体或配体。
可以理解的是，所述基因编辑试剂通过对所述靶点的氨基酸的相应基因进行敲除，从而破坏了原位置的氨基酸的功能，影响磷脂转运效率进而影响细菌存活。
本发明一些实施例中，所述基因编辑试剂为基于CRISPR-Cas9的基因编辑试剂。
可以理解的是，所述抗体或配体通过与所述靶点的氨基酸进行结合，能够使所述靶点的氨基酸失去原有功能，从而影响磷脂转运效率进而影响细菌存活。
本发明还提供一种所述脂质转运蛋白抑制剂在制备抑菌药物中的应用。
本发明还提供一种抑菌药物，包括所述脂质转运蛋白抑制剂。
本发明的有益效果：
本发明研究了MlaFEDB蛋白复合物中参与磷脂转运的关键氨基酸位点，发现MlaD蛋白、MlaE蛋白以及MlaF蛋白中多个氨基酸位点对磷脂转运起着关键性作用，这些氨基酸的功能一旦遭到破坏，能够显著影响磷脂转运效率进而影响细菌存活。因此，以这些氨基酸为靶点开发抗菌药物具有十分重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。
图1为MlaFEDB蛋白复合物的表达鉴定结果。其中：a为表达纯化的MlaFEDB蛋白复合物的SDS-PAGE鉴定结果；b为MlaFEDB蛋白复合物的分子筛层析实验结果。
图2为MlaFEDB蛋白复合物中参与磷脂转运主要氨基酸位点的分析结果。其中：a显示MlaD蛋白中参与磷脂转运的主要氨基酸位点；b显示MlaE蛋白中参与磷脂转运的主要氨基酸位点；c显示MlaF蛋白中参与磷脂转运的主要氨基酸位点。
图3为体外磷脂转运系统构建原理及实验结果。其中：a为体外磷脂转运系统构建原理示意图；b为体外磷脂转运系统的荧光发射光谱图；c为体外磷脂转运系统的荧光发射强度随时间变化的示意图。
图4为FRET鉴定影响磷脂转运的关键氨基酸位点的实验结果。其中：a为MlaD蛋白中氨基酸位点突变对磷脂转运效率的影响；b为MlaE蛋白中氨基酸位点突变对磷脂转运效率的影响；c为MlaF蛋白中氨基酸位点突变对磷脂转运效率的影响。
图5为大肠杆菌中关键氨基酸位点突变对细菌存活的影响。其中：a为MlaD蛋白中氨基酸位点突变对细菌存活的影响；b为MlaE蛋白中氨基酸位点突变对细菌存活的影响；c为MlaF蛋白中氨基酸位点突变对细菌存活的影响。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“重量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的重量份为a份，B组分的重量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与重量份数不同的是，所有组分的重量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。
研究发现维持外膜脂质的不对称分布是通过在内外膜及周质中特定的蛋白分子机器系统—MlaABCDEF实现(MlaABCDEF由位于IM的MlaFEDB蛋白复合物，周质的MlaC蛋白，OM的MlaA/OmpF复合物3部分组成)。该分子机器具有识别和提取磷脂的能力，并且在MlaC的参与下，可以在IM和OM之间对磷脂进行转运，以维持外膜脂质的不对称性。这其中，位于IM的4蛋白复合物MlaFEDB尤为重要，MlaFEDB蛋白复合物作为该分子机器的一部分，可识别磷脂并使用ATP水解释放的能量推动磷脂的转运进而维持外膜脂质的不对称分布。因此，一旦扰乱这一过程，那么必将导致磷脂转运受阻，进而影响细菌存活。因此，MlaFEDB蛋白复合物被视为新型的理想抗菌药物靶点。
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
1.1 MlaFEDB蛋白复合物表达纯化
(1)参考大肠杆菌(E.coli)基因组中的MlaFEDB基因，设计特异性引物以聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因，随后将目的基因重组至pTRC99a表达载体中，构建原核表达载体，并且在MlaB蛋白的C端添加8个组氨酸标签(8×His tag)用于蛋白纯化；
(2)待重组载体测序正确后转化入大肠杆菌感受态C43，挑取单克隆于30mL LB培养基中(含100μg/mL Ampicillin)，于37℃扩大培养后接种于400mL LB培养基中过夜培养，随后接种6L LB培养基中，37℃扩大培养待OD600＝1.0时，以200μM IPTG于20℃诱导14-16h；
(3)以240mL重悬buffer(50mM Tris pH 7.8，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，10mM咪唑，1mM PMSF)重悬菌液，随后高压破菌；
(4)将破菌后的悬液用4000rpm，4℃，预离心20min，将预离心后的上清液倒入超离管中，140，000×g超离1h，收集细胞膜沉淀；
(5)以重悬buffer(50mM Tris pH 7.8，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，10mMimidazole)配制1wt％DDM(100mL)，将细胞膜沉淀溶解于1wt％DDM中，在室温抽提1h；
(6)将抽提后的液体倒入超离管，140，000×g，离心20min，收集上清；
(7)以超离后的上清过Ni柱，采用buffer(50mM Tris pH7.8，0.3M NaCl，10％(v/v)甘油，0.05wt％DDM)分别配制10mM咪唑，40mM咪唑，250mM咪唑。首先采用10mM咪唑的buffer平衡Ni柱5个柱体积，随后将超离上清样品低速流穿Ni柱两次，结束后以40mM咪唑洗Ni柱20个柱体积，最后采用250mM咪唑洗脱目的蛋白，并以A280测定蛋白浓度。
(8)将目的蛋白以Superdex 200 Increase 10/300层析柱进行分子筛层析进一步分离纯化目的蛋白，并以SDS-PAGE鉴定蛋白表达情况。
SDS-PAGE结果如图1，a所示，从图1，a可以看出，MlaF蛋白、MlaE蛋白、MlaD蛋白、MlaB蛋白的比例正确，说明MlaFEDB蛋白复合物表达成功。分子筛层析实验结果如图1，b所示，通过分子筛层析进一步分离，得到性质较为均一的MlaFEDB蛋白复合物。
1.2 MlaFEDB蛋白复合物与AMP-PNP(ATP非水解类似物)以及磷脂孵育
由于MlaFEDB蛋白复合物具有ATP酶活性，能够利用ATP水解释放的能量转运磷脂底物，因此结合ATP的氨基酸位点对转运效率有极大影响。此外，MlaFEDB蛋白复合物中直接参与识别磷脂底物的氨基酸位点同样重要，破坏这些氨基酸位点很有可能影响磷脂底物的转运。
因此，本申请将MlaFEDB蛋白复合物分别与ATP非水解类似物AMP-PNP以及底物磷脂孵育，随后用于制备冷冻电镜样品，以期解析高分辨率结构，揭示二者与蛋白结合的相关氨基酸位点。
1.3冷冻电镜样品制备
(1)准备无污染的液氮，对用到的制样工具提前清洁并干燥处理；
(2)打开Vitrobot制样机，设置参数，blot time＝3.5s，blot force＝1，waittime＝20s，draintime＝1s，blot total＝1，温度4℃，湿度100％；
(3)准备制样容器，加入液氮预冷容器，随后通入乙烷使乙烷慢慢冷却至固液混合态；
(4)对金网(QUANTIFOIL R1.2/1.3，200目)做辉光放电，将制样容器放在Vitrobot上，夹取金网，取3μL纯化的蛋白复合物样品加入到金网上，接着运行制样程序；
(5)取下金网，迅速转移至样品保存盒，液氮保存待用。
1.4数据收集及处理
(1)将样品保存盒取出置于干净的液氮容器中，随后将金网从样品保存盒中取出转移至上样器中，固定clip ring，加入液氮保持低温；
(2)使用FEI Titan Krios 300kV电镜收集数据，将上样器推入样品台，抽真空，随后打开镜筒阀，寻找冰层合适的区域并标记；
(3)待标记好所有冰层合适的区域后，以一定角度做wobbler，调节Z轴聚焦；
(4)在样品较好的区域拍照检查以确认样品状态是否良好，筛选出所有状态良好的区域在Serial EM软件中设置拍照所需参数以进行大规模数据收集；
(5)将收集的电镜数据照片使用RELION软件挑选形态较好的单颗粒用于三维分类和重构，得到最终的电镜结构。
根据解析的蛋白结构，AMP-PNP(ATP非水解类似物)以及磷脂与蛋白相互作用位点如图2所示。如图2，a所示，MlaD上的氨基酸位点L143、L146、I147、F150、Y152与磷脂相互作用。如图2，b所示，MlaE上的氨基酸位点V69、L70、Q73、V77、Y81、T85、M89、L90、L93、R97、E98、L99、V102、V103、D250与磷脂相互作用。如图2，c所示，MlaF上的氨基酸位点R18、R21、K47、H203、R151、S146、E144与AMP-PNP(ATP非水解类似物)相互作用。这些氨基酸位点参与磷脂转运，若能筛选到影响功能的关键位点，则能够依据这些位点为靶点，设计新型抗生素，阻断细菌磷脂转运，进而抑制甚至杀灭细菌。
2体外、体内实验鉴定影响磷脂转运的关键氨基酸位点
2.1体外FRET技术鉴定MlaFEDB蛋白复合物转运磷脂的关键氨基酸位点
基于上述冷冻电镜结构，本申请采用FRET技术，建立一个体外转运系统，经氨基酸位点突变，鉴定了MlaFEDB蛋白复合物影响磷脂转运的关键氨基酸功能位点，为以这类关键功能位点为靶点设计新型抗菌药物奠定基础。
(1)基于FRET技术检测体外磷脂转运系统的建立
研究表明荧光染料NBD的激发波长为470nm，发射波长为530nm；荧光染料Rhodamine(Rhod，罗丹明)的激发波长为530nm，发射波长为590nm。根据FRET原理，如果一个荧光基团的发射光谱(发射波长)与另一个基团的吸收光谱(激发波长)有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时，就可观察到荧光能量由一个基团向另一个基团转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。据此，NBD和Rhod两种荧光基团在一定距离时可以发生能量转移现象。因此，本申请采用NBD标记的磷脂NBD-PE和Rhod标记的磷脂Rhod-PE作为荧光标记的磷脂；同时使用无荧光染料的磷脂POPC和磷脂E.coli extract polar分别构建含有内膜蛋白MlaFEDB和外膜蛋白MlaA/OmpF的蛋白脂质体(proteoliposome)。即内膜(IM)定义为将MlaFEDB重构入POPC为磷脂的囊泡中，外膜(OM)定义为将MlaA/OmpF重构入E.coli extract polar及有染料标记的NBD-PE和Rhod-PE为磷脂的囊泡中。随后在添加周质可溶蛋白MlaC的情况下，采用BioTek多功能酶标仪检测NBD-PE和Rhod-PE荧光能量转移情况以判定磷脂跨膜转运。当NBD-PE与Rhod-PE分离，根据FERT原理，其发射波长会从590nm变化至530nm。因此，通过检测530nm处荧光值的变化，可以间接测量磷脂的转运。其具体步骤如下。
①脂质水化：磷脂E.coli extract polar，溶于氯仿，浓度为10mg/mL；磷脂POPC溶于氯仿，浓度为20mg/mL；染料标记的磷脂NBD-PE溶于氯仿，浓度为1mg/mL；Rhod-PE溶于氯仿，浓度为1mg/mL。根据实验所需按照质量比为96:3:1取E.coli extract polar，NBD-PE及Rhod-PE的氯仿溶液混匀，使用氮吹仪轻柔地吹干，加入与E.coli extract polar等体积的基础buffer(20mM Tris，150mM NaCl，2.5mM MgCl2，1mM ATP，pH 7.8)作为标记磷脂混合物，按照E.coli extract polar氯仿溶液体积的一半取POPC的氯仿溶液，使用氮吹仪轻柔吹干，加入与E.coli extract polar氯仿溶液等体积的基础buffer作为非标记的磷脂。加入buffer后将两种磷脂储备液于冰上避光静置5-10分钟水化。
②Proteoliposome的制备：将水化后的磷脂储备液置于冰水混合物中，避光水浴超声10分钟，共超声两次。超声完成后将磷脂置于冰上避光静置5分钟，后使用迷你挤压器及0.4μm的膜来回挤压21次，以制成0.4μm的囊泡。随后按照磷脂：DDM质量比1：0.8比例加入5wt％DDM溶液(使用20mM Tris，pH7.8，150mM NaCl溶解制备)，混匀后于冰上避光静置1小时。随后将标记与未标记的磷脂-DDM混合物分别分为外膜组(Outer membrane，OM)与内膜组(Inner membrane，IM)，分别按蛋白：磷脂质量比为1：20比例加入MlaA-OmpF及MlaFEDB或MlaFEDB突变蛋白(Mla-OmpF：MlaFEDB摩尔比为1:1)，混匀后于冰上避光静置1小时。随后，按照比例称取Bio-Beads SM2(Bio-Beads SM2：磷脂质量比为1：120)，经甲醇处理并以无菌ddH2O洗净后加入磷脂/DDM/蛋白混合物，并于4℃避光缓慢旋转2.5小时以去除DDM及多余磷脂。2.5小时后，将去除DDM和多余磷脂的proteoliposome移出备用。
③BioTek多功能酶标仪检测：将标记的IM proteoliposome与未标记的OMproteoliposome各取10μL加入130μL基础buffer中，混匀后均分为70μL/份，分别命名为实验组与对照组。实验组按比例加入MlaC蛋白(MlaC：MlaFEDB或MlaA-OmpF质量比为10：1)，对照组则加入等体积的基础buffer混匀，接着立即按照20μL/孔加入384孔板中，每组共3个平行孔，采用BioTek多功能酶标仪双波长检测并保存数据。
Figure BDA0002532647560000111
④数据处理：
将检测后所得数据导出至EXCEL表格中，以530nm处实验组减去空白组检测数据的差值为每组样品的真实荧光增量，将数据导入Origin9(OriginPro 9.0.0)后经计算得到每组样品数据的均值(Mean)及标准差(Standard Deviation，SD)，取检测时间为X轴，荧光值做Y轴，制作曲线图，以此判定系统建立成功与否。以增量的多少判定磷脂转运的效率。
判定系统为：与未突变的MlaFEDB蛋白复合物相比较，若氨基酸位点突变后检测530nm处荧光值显著降低，则该位点为影响磷脂转运的关键氨基酸位点。
(2)结果
1)体外磷脂转运系统建立
图3为体外磷脂转运系统构建原理及实验结果。
体外建立的磷脂转运系统如图3，a所示。
为了验证体外磷脂转运系统成功建立，本申请首先用荧光测定其发射波长(图3，b)，在反应起始时(ORI)，以470nm激发，吸收峰主要集中在590nm处，而在一段反应后(FIN)，其荧光强度在波长590nm处减少，而在波长530nm处增加，表明存在磷脂转运导致两种染料(NBD和Rhod)分开，初步表明体外磷脂转运系统成功建立。
随后为进一步验证，本申请还设置了未加MgCl2的对照组(-MgCl2)、添加ATP抑制剂AMP-PNP的对照组(+AMP-PNP)以及未加蛋白的对照组(No protein)，经检测，结果显示(图3，c)，只有实验组(MlaFEDB)存在磷脂转运现象，进一步验证体外磷脂转运系统成功建立。
2)体外FRET技术鉴定影响磷脂转运的关键氨基酸位点
随后，在上述建立的系统基础上，采用点突变实验，对MlaFEDB蛋白复合物中的关键氨基酸位点进行突变，改变原有氨基酸性质，探索MlaFEDB蛋白复合物中影响磷脂转运的关键氨基酸位点，结果如图4所示。
图4，a中：MlaD(L143E)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的氨基酸位点L143突变为E(谷氨酸)；MlaD(I147E)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的氨基酸位点I147突变为E(谷氨酸)；MlaD(F150E)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的氨基酸位点F150突变为E(谷氨酸)；MlaD(Y152E)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的氨基酸位点Y152突变为E(谷氨酸)。
图4，b中：MlaE(V77)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaE蛋白上的氨基酸位点V77突变为D(天冬氨酸)；MlaE(Y81E)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaE蛋白上的氨基酸位点Y81突变为E(谷氨酸)；MlaE(R97E)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaE蛋白上的氨基酸位点R97突变为E(谷氨酸)；MlaE(E98R)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaE蛋白上的氨基酸位点E98突变为R(精氨酸)。
图4，c中：MlaF(E144A)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaF蛋白上的氨基酸位点E144突变为A(丙氨酸)；MlaF(S146A)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaF蛋白上的氨基酸位点S146突变为A(丙氨酸)；MlaF(R151A)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaF蛋白上的氨基酸位点R151突变为A(丙氨酸)；MlaF(Y265D)表示MlaFEDB蛋白复合物中MlaF蛋白上的氨基酸位点Y265突变为D(天冬氨酸)。
图4结果表明，MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的L143、I147、Y152氨基酸对磷脂转运功能影响显著(图4，a)；MlaE蛋白中的V77、Y81、E98氨基酸对磷脂转运功能影响显著(图4，b)；MlaF蛋白中的S146、R151氨基酸对磷脂转运功能影响显著(图4，c)。
2.2体内功能分析鉴定MlaFEDB蛋白复合物转运磷脂的关键氨基酸位点
为进一步鉴定MlaFEDB蛋白复合物中影响磷脂转运的关键氨基酸位点，本申请设计体内功能分析实验，在体内鉴定了MlaFEDB蛋白复合物影响磷脂转运的关键氨基酸功能位点，为以这类关键功能位点为靶点设计新型抗菌药物进一步奠定坚实的基础。
(1)体内功能分析实验
为了在体内进一步鉴定影响磷脂转运的关键氨基酸位点，本申请以三株大肠杆菌敲除菌(ΔMlaD，ΔMlaE，ΔMlaF)为基础，将MlaFEDB上设计点突变，构建点突变的载体，再分别转化入三株敲除菌株中梯度稀释进行功能分析，验证该位点的氨基酸对细菌存活的影响。本申请分别采用了SDS/EDTA组合物和盐酸氯丙嗪(Chlorpromazine)对关键氨基酸位点突变菌的存活率进行试验。具体实验操作如下：
通过P1噬菌体转导敲除基因的方法获得三株大肠杆菌敲除菌(ΔMlaD，ΔMlaE，ΔMlaF)(卡那霉素抗性)。其中，ΔMlaD为MlaD蛋白被敲除的大肠杆菌，ΔMlaE为MlaE蛋白被敲除的大肠杆菌，ΔMlaF为MlaF蛋白被敲除的大肠杆菌。
随后，通过PCR将大肠杆菌MlaD蛋白、MlaE蛋白、MlaF蛋白中的单个关键氨基酸位点的相应基因位置进行突变，构建入pTRC99a载体(氨苄抗性)，即形成单个关键氨基酸位点突变载体。进行功能分析时，将这些单个关键氨基酸位点突变载体转化入上述敲除菌中，获得单个关键氨基酸位点突变菌，包括MlaD(L143E)、MlaD(I147E)、MlaD(F150E)、MlaD(Y152E)、MlaE(V77D)、MlaE(Y81R)、MlaE(R97E)、MlaE(E98R)、MlaF(E144A)、MlaF(S146A)、MlaF(R151A)、MlaF(Y265D)。上述突变菌名称中，括号内末字母表示突变后的氨基酸，比如，MlaD(L143E)表示：MlaD蛋白中L143位点的氨基酸突变为E(谷氨酸)。
空质粒pTRC99a分别转入ΔMlaD、ΔMlaE、ΔMlaF敲除菌中形成阴性对照(emptyvector)。
质粒pTRC99a-MlaFEDB分别转入ΔMlaD、ΔMlaE、ΔMlaF敲除菌中形成阳性对照(WT，未做突变)。
功能分析实验具体操作为：收获传代培养的细胞沉淀，洗涤两次并在无菌LB培养基中稀释至OD600为0.5进行十倍系列稀释测定细胞活力，稀释范围为10-1至10-6，随后，将5μl稀释的细胞滴到含有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上(含SDS/EDTA组合物或120μg/ml氯丙嗪)，在37℃过夜培养后观察细胞生长。
(2)结果
试验结果显示，SDS/EDTA组合物对于野生型细菌和关键氨基酸位点突变菌的存活的影响没有显著差异(未图示)，而120μg/mL的盐酸氯丙嗪对于野生型细菌和关键氨基酸位点突变菌的存活的影响具有显著的差异(图5)。
图5结果表明，MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的L143、I147、Y152氨基酸对细菌存活影响显著(图5，a)；MlaE蛋白上的V77、Y81、E98氨基酸对细菌存活影响显著(图5，b)；MlaF蛋白上的S146、R151氨基酸对细菌存活影响显著影响显著(图5，c)。
2.3结论
综上所述，结合体外和体内实验，可以获得以下结论：
(1)MlaFEDB蛋白复合物中MlaD蛋白上的L143、I147、Y152氨基酸；MlaE蛋白上的V77、Y81、E98氨基酸；MlaF蛋白上的S146、R151氨基酸对磷脂转运起着关键性作用，而这些氨基酸的功能一旦遭到破坏，能够显著影响磷脂转运效率进而影响细菌存活。因此，以这些氨基酸为靶点开发抗菌药物具有十分重要的意义。
(2)盐酸氯丙嗪能够显著降低上述关键氨基酸的突变菌的存活率。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述脂质转运蛋白抑制剂的靶点位于MlaFEDB蛋白复合物中的一个或多个氨基酸位点。
2.如权利要求1所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述脂质转运蛋白抑制剂的靶点位于MlaD蛋白、MlaF蛋白以及MlaE蛋白中的至少一个上。
3.如权利要求1所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述MlaD蛋白中的靶点包括氨基酸位点L143、L146、I147、F150、Y152中的至少一个。
4.如权利要求3所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述MlaD蛋白中的靶点包括氨基酸位点L143、I147、Y152中的至少一个。
5.如权利要求1所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述MlaE蛋白中的靶点包括氨基酸位点V69、L70、Q73、V77、Y81、T85、M89、L90、L93、R97、E98、L99、V102、V103、D250中的至少一个；
优选的，所述MlaE蛋白中的靶点包括氨基酸位点V77、Y81、E98中的至少一个。
6.如权利要求1所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述MlaF蛋白中的靶点包括氨基酸位点R18、R21、K47、H203、R151、S146、E144、R151、Y256、H262中的至少一个；
优选的，所述MlaF蛋白中的靶点包括氨基酸位点S146、R151中的至少一个。
7.如权利要求1所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述脂质转运蛋白抑制剂包括DNA、RNA、蛋白质、多肽、小肽、化合物中的一种或多种。
8.如权利要求7所述的脂质转运蛋白抑制剂，其特征在于，所述脂质转运蛋白抑制剂为能够特异性敲除所述靶点的氨基酸的基因编辑试剂或者特异性与所述靶点的氨基酸结合的抗体或配体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的脂质转运蛋白抑制剂在制备抑菌药物中的应用。
10.一种抑菌药物，其特征在于，包括权利要求1-8中任一项所述的脂质转运蛋白抑制剂。
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