CN112342156B - 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用 - Google Patents

一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112342156B
CN112342156B CN202011139649.3A CN202011139649A CN112342156B CN 112342156 B CN112342156 B CN 112342156B CN 202011139649 A CN202011139649 A CN 202011139649A CN 112342156 B CN112342156 B CN 112342156B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bordetella
omv
outer membrane
preparation
omvs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011139649.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112342156A (zh
Inventor
黄叶娥
南黎
肖琛闻
刘燕
鲍国连
季权安
韦强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Academy of Agricultural Sciences filed Critical Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202011139649.3A priority Critical patent/CN112342156B/zh
Publication of CN112342156A publication Critical patent/CN112342156A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112342156B publication Critical patent/CN112342156B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/099—Bordetella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明实施例公开了一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用，属于生物技术领域。一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：1)培养波氏杆菌菌液；2)在10000g，20min，4℃条件下离心，取上清，滤器过滤；3)使用分子量为100kDa的超滤管在5000g，20min，4℃条件下浓缩，所得浓缩液在100000g，4℃条件下超速离心2h，弃上清，沉淀用TE Buffer重悬，于‑80℃冻存。本发明工艺能够提高OMV的产量，为后续工业化大规模批量生产提供参考。本发明通过体内免疫试验证明OMV以及OMV结合铝佐剂能够诱导动物体特异性免疫保护反应，可用于波氏杆菌疫苗的开发，具有广阔的应用前景。

Description

一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用。
背景技术
支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)是一种需氧、高度传染性的革兰氏阴性菌，可引起哺乳动物呼吸道感染，常见于各种家畜和野生哺乳动物的上呼吸道。如造成兔和豚鼠的气管支气管炎(鼻塞)，狗的犬支气管肺炎(犬舍咳嗽)，以及猪的鼻甲萎缩等；还可感染免疫功能低下者(如HIV/AIDS、中性粒细胞减少症、糖尿病、营养不良或移植患者)，造成严重的肺部疾病，甚至危及生命。在规模化养兔场中，波氏杆菌在我国多个省份的兔群中普遍存在，对养殖户造成极大经济损失，已成为兔病防治的一大难题。目前，预防该疾病最有效的措施是接种疫苗。目前市面上，针对兔波氏杆菌的兽用疫苗主要是灭活苗，大部分灭活苗能够引起高血清抗体滴度，但持续时间短，保护率低。由于这种病菌对人类和动物的健康造成重大影响，故亟需研发有效的新型疫苗。
外膜囊泡(Out Membrane Vesicle，OMV)是细菌生长过程中分泌的一种直径介于20～250nm的球形纳米结构，其无生命活性并且不可复制，在不同温度和处理下都能保持完整和稳定，包含蛋白质、DNA、RNA、脂多糖(LPS)、酶和肽聚糖等细菌成分，能够有效引起机体对细菌感染的先天性和适应性免疫应答，使得OMVs成为潜在的新型疫苗候选者。许多研究显示OMVs是有前景的对抗细菌感染疫苗候选者，例如流感嗜血菌、多杀巴斯德菌、霍乱弧菌、产肠毒素的大肠埃希菌、百日咳博代杆菌和鼠伤寒沙门菌。脑膜炎奈瑟菌的外膜囊泡(OMVs)已经成功研发成商品化的疫苗。这充分说明OMVs在疫苗的研发方面，有其独特的优势。我们坚信OMVs对于兔波氏杆菌新型亚单位疫苗的研究将具有积极的意义。
OMV的产生一般是细菌对包膜作用压力的普遍反应，往往由多种生存条件引起。当细菌处于恶劣的环境时，各种应激因素如温度、营养物质的消耗和有害化学物质的暴露均可诱导产生OMV。目前OMV的生产流程都是基于批处理的，具有产量低、成本高的特点，OMV生产在足够的数量，纯度和可重复性仍然是一个关键的挑战。
本研究建立兔波氏杆菌OMV最佳制备工艺，以提高OMV的产量，为后续工业化大规模批量生产兔波氏杆菌OMV提供参考，了解兔波氏杆菌OMV的理化性质及蛋白组成，以期为基于OMV的波氏杆菌疫苗设计提供基础信息和潜在策略。并通过体内免疫试验，探究OMV的免疫增强和抗感染效果。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法，包括以下步骤：
1)培养波氏杆菌菌液：将波氏杆菌菌株划线接种于TSA平板，37℃培养36h，挑取单菌落接种于TSB培养基中，37℃、200rpm摇床上培养10h后，按1:100在含有头孢氨苄的TSB培养基中扩大培养；
2)将步骤1)培养获得的菌液，在10000g，20min，4℃条件下离心，取上清，滤器过滤；
3)步骤2)获得的滤液使用分子量为100kDa的超滤管在5000g，20min，4℃条件下浓缩，所得浓缩液在100000g，4℃条件下超速离心2h，弃上清，沉淀用TE Buffer重悬，于-80℃冻存。
进一步地，步骤1)中，所述含有头孢氨苄的TSB培养基中的头孢氨苄浓度为64μg/mL。
进一步地，步骤1)中，扩大培养18h。
进一步地，步骤2)中，所述滤器孔径为0.45μm。
根据本发明实施例的第二方面，本发明提供上述方法制得的波氏杆菌外膜囊泡在制备波氏杆菌疫苗中的应用。
根据本发明实施例的第三方面，本发明提供一种波氏杆菌疫苗，包括上述方法制得的波氏杆菌外膜囊泡和佐剂。
进一步地，所述佐剂为铝佐剂。
本发明实施例具有如下优点：
1.本发明提升了波氏杆菌OMV的产量。波氏杆菌在自然状态下分泌的OMV产量很低，本发明通过添加抗生素赋予细菌一个逆性的环境，以达到促进OMV分泌的目的。通过对制备方法的优化，在保证细菌增殖的基础上，拟最大化提高OMV的产量，为工业化生产提供可能。
2.本发明提升了波氏杆菌OMV的生产效率。本发明方法简单，操作时间短，适合产业化批量生产。
3.波氏杆菌OMV能够有效诱导动物体特异性免疫保护反应，并能有效抵抗波氏杆菌的再次感染。OMV结合铝佐剂能显著提高小鼠和家兔抗原特异性IgG、IgG1、IgG2的水平，小鼠血清杀菌活性显著提升，免疫后小鼠的白细胞、淋巴细胞水平均显著提升，免疫后小鼠经波氏杆菌感染后，肺部含菌量显著降低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为波氏杆菌的最小抑菌浓度检测；
图2为不同培养时间、头孢氨苄浓度、滤膜大小下OMVs蛋白含量；
图3为观察滤液有无活菌；
图4为OMV的TEM、NTA和Zeta电位的结果；
图5为SDS-PAGE分析OMVs蛋白条带；
图6为基因本体论(GO)对波氏杆菌OMVs蛋白进行功能注释和富集分析；
图7为OMV免疫后小鼠血清中OMV特异性IgG(A)、IgG1(B)、IgG2a(C)和IgA(D)的水平；
图8为OMV免疫后小鼠血清中Bb.特异性IgG(A)、IgG1(B)和IgG2a(C)的水平；
图9为OMV免疫后血细胞分析结果；
图10为OMV免疫小鼠经Bb.攻毒后肺部含菌量；
图11为OMV免疫后小鼠血清杀菌活性；
图12为OMV免疫后家兔血清抗体和细胞因子含量(A)血清中OMV特异性IgG的含量；血清中IFN-γ(B)和IL-4(C)的含量。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1材料
1.1菌株及主要试剂
兔支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)菌株(北纳生物，BNCC128774)。
Tryptone Soya Agar、Tryptone Soya Broth、Tryptone购自OXOID；Peptone-B(Soy Protein Enzymatic Hydrolysate)购自BBI Life Sciences；MH肉汤Ⅱ购自Solarbio；NaCl为国产分析纯；头孢氨苄(98％)购自源叶生物；TE缓冲液(粉剂，1X)购自上海生工；脱氧胆酸钠(SIGMA)；蔗糖(BIO BASIC INC)；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自Solarbio；4-12％ExpressPlusTM蛋白预制胶、Mops缓冲液(Tris-MOPS-SDS Running BufferPowder)购自GenScript；Marker购自Biorad；1×PBS buffer(Biological Industries,Israel)；Guanidine(Sigma)；Urea(Bio-Rad)；Tris-base(Bio-Rad)；DTT(Bio-Rad)；IAA(Sigma)；Zeba Spin column(Pierce)；Trypsin(Promega)；Chymotrypsin(Sigma)；Glu-C(Wako)；LysC(Wako)。
1.2仪器设备
Model 550酶标仪检测仪(SpectraMax M5)购自Molecular Devices；100kDa超滤管购自Millipore；-80℃冰箱(Thermo702)；染色仪(蛋白快速染色系统L1，GenScript)；扫描仪(PowerLook 2100XL-USB，UMAX)；高速冷冻离心机(High-speed RefrigerateCentrifuge，HITACHI)；恒温培养箱(GNP-9270，上海精宏实验设备有限公司)；摇床(HZ-9210K、DHZ-CA，华利达)；电泳仪(Electrophoresis Power Supply-EPS 601，GEHealthcare)；透射电子显微镜(Hitachi H7650)；ZetaView PMX 110(particle Metrix,Meerbusch,Germany)；nanoLC-QE(Easy-nLC 1000and Q Exactive,Thermo Fisher)；用ZetaView8.04.02软件进行纳米颗粒追踪分析；用Mascot2.2软件进行蛋白质组学数据分析；用GraphPad Prism 8和OriginLab Origin 8.1进行统计分析和作图。
2方法
2.1OMV的制备
将波氏杆菌菌株划线接种于TSA平板，37℃培养36h，挑取单菌落接种于2mL TSB培养基中，37℃、200rpm摇床上培养10h后，按1:100扩大培养，培养液中添加适当的头孢氨苄以提高OMV产量。培养结束后采用稀释涂布分离计数法测定细菌培养中CFUs(ColonyForming Units，菌落形成单位)的数量，将菌液倍比稀释，取106，107，108三个稀释度的菌液各100μL涂TSA板计数，每个稀释度重复3次进行活菌数测定。
使用超滤浓缩法制取兔波氏杆菌OMVs，方法如下：
将上述获得的200mL菌液，计数后在10000g，20min，4℃条件下离心，取上清通过0.45μm的滤器过滤，为确认无活菌，将1mL滤液置于TSA平板上，37℃孵育过夜。之后使用分子量大小为100kDa的超滤管在5000g，20min，4℃条件下浓缩滤液，所得浓缩液在100000g，4℃条件下超离2h，弃上清，沉淀用400μL TE Buffer重悬，于-80℃冻存。
2.2OMV制备条件的优化
对培养时间、抗生素的添加量、滤器孔径大小进行优化，确立波氏杆菌OMV最佳制备工艺。
2.2.1最佳培养时间的确定
将波氏杆菌菌株划线接种于TSA平板，37℃培养36h，挑取单菌落接种于2mL TSB培养基中，37℃、200rpm摇床上培养10h后，按1:100在TSB培养基中扩大培养200mL菌液，培养时间分别设为14h、16h、18h、20h、22h，计数后按2.1描述的步骤和条件制备波氏杆菌OMVs，通过测定不同培养时间下制备的OMVs蛋白含量，确定最佳培养时间。
2.2.2最佳抗生素添加量的确定
首先需要确定所使用抗生素的最小抑菌浓度。无菌条件下，将波氏杆菌划线于TSA平板，置于37℃恒温温箱中过夜培养，以达到分离纯化的目的；然后用接菌环挑取单个典型菌落接种于5mL MH肉汤培养，置于37℃恒温摇床中过夜培养；用分析天平称取0.128g头孢氨苄(98％)，溶于10mL超纯水，配成终浓度为12.8mg/mL的储备液10mL，分装后保存于-80℃冰箱。
采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration，MIC)，操作过程及结果判读严格按照CLSI(临床试验室标准化协会)标准进行，具体步骤如下：将MH肉汤培养的菌液，稀释到0.5麦氏比浊度，而后用MH肉汤1:1000稀释，使浓度达到1×105CFU/mL。取灭菌的96孔板，置于无菌操作台上，向第一个孔加入8μL 12.8mg/ml的头孢氨苄和92μL的MH肉汤(头孢氨苄浓度为1024μg/mL)，其他2至11个孔分别加50μL MH肉汤，然后从第一个孔吸取50μL至第二孔，依次倍比稀释，到第10个孔时弃去50μL，第11孔只加50μLMH肉汤，然后每孔加入50μL的菌液(头孢氨苄浓度分别为512，256，128，64，32，16，8，4，2，1，0μg/mL)，第11孔作为阳性对照，第12孔仅加空白肉汤100μL作为阴性对照。将96孔板密封，置于37℃恒温培养箱中孵育20-24h后判定结果，记录细菌浊度值(OD600)。每组试验至少重复三次。结果以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当出现单一跳孔时，记录抑制细菌生长的最高药物浓度为MIC。
确定头孢氨苄对兔波氏杆菌的MIC后，扩大培养时，在TSB培养基中添加头孢氨苄，设定5个浓度分别为1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC，以最佳的培养时间培养，计数后按2.1描述的相同步骤和条件制备波氏杆菌OMV，通过测定不同头孢氨苄浓度培养制备的OMVs蛋白含量，确定头孢氨苄的最佳添加量。
2.2.3最佳滤器孔径大小的确定
设计两组试验，在制备兔波氏杆菌OMVs时，使上清通过0.45μm和0.22μm两种滤器，通过比较不同滤膜对OMVs蛋白含量的影响，确定最佳滤膜孔径大小。
2.3OMV理化性质的研究
2.3.1透射电子显微镜(TEM)
取10μL OMV样品滴在蜡纸上，将铜网与样品液表面接触，静置3-5min，取出铜网，用滤纸吸去多余的样品，稍晾干，再用2％的磷钨酸对样品负染色，晾干后在Hitachi H7650透射电镜下观察OMV的形态，用高灵敏度CCD相机记录试验结果。
2.3.2Zeta电位和纳米颗粒追踪分析(NTA)
用去离子水清洗ZetaView PMX 110仪器的样本池，以聚苯乙烯微球(110nm)校准，再用1×PBS buffer清洗样本池后，将OMV样品用1×PBS buffer稀释10000倍，进样检测，在11个位置重复测量2次，用相应的软件ZetaView 8.04.02进行数据分析，试验温度保持在25℃左右。
2.4OMV蛋白含量的测定与成分分析
2.4.1OMV蛋白含量的测定
使用Bradford蛋白检测试剂盒检测OMV的蛋白含量。按照试剂盒说明书进行操作。以BSA作为蛋白标准品，制备标准曲线。将OMV样品作适当稀释，加20μL到样品孔中。再加入200μL 1×G250染色液，室温放置3-5分钟。用酶标仪测定595nm波长下的吸光度，根据标准曲线计算出OMV样品中的蛋白含量，再按每CFUs的蛋白含量进行定量。试验温度保持在25℃左右。
2.4.2OMV蛋白成分的分析
通过SDS-PAGE对波氏杆菌OMVs样品的蛋白成分进行初步分析。取80μL样品加入20μL 5×Loading Buffer，100℃煮沸20min，置冰上冷却10min，以备上样。将准备好的胶放入电泳槽，倒入Tris-Mops-SDS缓冲液，依次加入Marker和OMV样品，各蛋白样品设三重复。在150V电压下电泳50min。
为进一步鉴定OMV中所含的蛋白成分，将OMV样品交由中科新生命公司，采用LC-MS/MS质谱仪进行检测分析。质谱测试原始文件用Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4软件进行查库鉴定及定量分析，针对从UniProt的Bordetella bronchiseptica(2020.03.24下载21311个条目)数据库进行分析。蛋白质鉴定采用以下方法：允许两个缺失的胰蛋白酶切割位点，肽质量容差为20ppm，质谱/质谱容差为0.1Da，设置蛋氨酸氧化、n端乙酰化和半胱氨酸氨基甲酰化的固定修饰，FDR≤0.01。我们通过肽谱匹配(PSMs)的数量来评估OMV蛋白准确性，匹配得越好，可信度越高，我们筛选前30PSMs的蛋白作为OMV主要蛋白进行分析。使用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)对OMV蛋白质分子功能、细胞成分及生物过程进行功能注释和富集分析。
2.5OMV免疫效果研究
2.5.1OMV在小鼠免疫效果的研究
分别用铝佐剂结合OMV(4μg/只，混合比例1：1)和OMV(4μg/只)免疫BABL/c(6周龄，雌性)，另设空白对照组。随机分组，每组6只。三次免疫，每次间隔1周。在最后一次免疫后2周，分别取血分离血清，ELISA检测血清中OMV和Bb.特异性IgG，IgG1，IgG2a以及IgA水平。
ELISA检测方法具体如下：将培养好的波氏杆菌菌液分装到破碎管，每管加2颗钢珠，使用全自动样品快速研磨仪(Tissuelyser-24，上海净信科技)震荡破碎后，转移至1.5ml EP管内，4℃条件下10000rpm离心10min，取上清蛋白用NanoVue Plus分光光度计(GEHealthcare)检测蛋白浓度，之后用PH9.6的碳酸盐缓冲液调整浓度至2μg/ml，在96孔板的每孔加100μl，37℃孵育2小时，之后4℃保存过夜。次日用PBST洗涤，重复三次。96孔板拍干后，每孔加入300μl 5％脱脂乳，在37℃孵育2h，用PBST洗涤三次。用脱脂乳10倍稀释小鼠血清，每孔加入100μl，同时设立阴性和空白对照，37℃孵育1h后用PBST洗涤三次。将HRP偶连山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a抗体(Abcam)分别用脱脂乳100000、50000、50000倍稀释，每孔加入100μl，37℃孵育1h后用PBST洗涤三次，拍干后加入新鲜配制的TMB显色液，每孔加入100μl，置37℃温箱避光孵育5-10min，每孔加入100μl 0.5M H2SO4终止反应，以空白孔调零，用酶标仪测量450nm波长下的OD值。
ELISA检测OMV特异性抗体水平时，则将Bb.菌液替换成OMV(0.2μg/孔)包被96孔板。
血清杀菌试验：将各组小鼠血清在恒温水浴锅中56℃水浴30min灭活补体。取1.5ml EP管，做好各组标记。每管加入30μl的PBS溶液，然后吸取30μl的血清加入第一个管内，吹打数次混合均匀，再吸取30μl的混合液到第2个管，再吹打数次后混匀，取出30μl至第3个管，最后一个管吸取30μl混合液丢弃。吸取测定过没有杀伤活性的豚鼠补体、103CFU/ml的波氏杆菌菌液各15μl到每个管中。每组重复三次。混合均匀后，放置于震荡恒温培养箱内37℃以100rpm转速培养1h之后取出，吸取50μl的混合液涂布于TSA培养基，置于恒温培养箱内37℃过夜培养，使用Scan1200全自动菌落计数仪(Interscience)记录平皿中的菌落数。
免疫后抗感染试验：在最后一次免疫后一周，进行攻毒试验，通过尾静脉注射2.0×105CFU/只的波氏杆菌，攻毒后10天，分离小鼠肺脏，匀浆后，对组织液进行1：10，1：100，1：1000倍比稀释，涂布TSA平皿，进行菌落计数。
2.5.2OMV在家兔上免疫效果的研究
分别用铝佐剂结合OMV(20μg/只，混合比例1：1)和OMV(20μg/只)免疫新西兰大白兔(45天，雌性，6只/组)，另设空白对照组。三次免疫，每次间隔1周。在最后一次免疫后在指定时间点，分别取血分离血清，ELISA检测血清中抗原特异性IgG和细胞因子水平。
3实验结果
3.1OMV最优制备工艺的建立
3.1.1兔波氏杆菌的最小抑菌浓度检测
扩大培养时，在培养基中添加适当的抗生素能够有效提高OMV的产量。为此我们首先确定抗生素的最小抑菌浓度。由图1可知，随着头孢氨苄浓度的减小，兔波氏杆菌菌液OD600值呈平缓-升高-平缓的趋势，细菌浊度值在拐点处存在明显变化，经过统计学分析后，头孢氨苄浓度在128μg/mL的细菌浊度值比64μg/mL的小，且存在显著性差异。因为检测结果以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，故确定头孢氨苄对于兔波氏杆菌的MIC为128μg/mL。
3.1.2OMV制备条件的优化
图2为不同培养时间、头孢氨苄浓度、滤膜大小下OMVs蛋白含量。从图2A中可以看出，培养时间为18h时，每CFU单位Bb产生OMV蛋白含量最大；随着头孢氨苄浓度的增大，每CFU单位Bb产生OMV的蛋白含量也增大，1MIC条件下每CFU单位Bb产生OMV蛋白含量比1/2MIC的高(图2B)，但菌液含菌量显著下降，故1MIC条件下得到的总蛋白含量比1/2MIC小；图2C和图3显示，0.45μm滤膜处理的每CFU单位Bb产生OMV的蛋白含量远高于0.22μm滤膜处理组，且两组滤液均没有活菌。因此，确定制备兔波氏杆菌OMV过程中，最佳培养时间为18h，头孢氨苄的最佳亚抑菌浓度为1/2MIC浓度，最佳滤膜大小为0.45μm。需要说明的是，以下内容中的OMV均是在上述筛选的最佳条件下制得。
3.2OMV理化性质研究
3.2.1OMV的TEM、NTA和Zeta电位的结果
图4为OMV的TEM、NTA和Zeta电位的结果。由图可知，OMV呈球形囊泡(图4A)，大小为127.83±0.68nm(图4B)，样品浓度达到1.0×1012Particles/mL，Zeta电位为-36.4±0.75mV(图4C)。
3.3OMV蛋白含量的测定与成分分析
通过SDS-PAGE和LC-MS/MS质谱分析对制得的OMV进行成分分析。图5显示OMV的主要蛋白条带。结合质谱结果分析，构成波氏杆菌OMV的蛋白有多种，OMVs前30PSMs的蛋白成分见表1。其中，丝状血凝素(FHA)、黏附素(PRN)、侵袭素、外膜蛋白A(OmpA)、自主转运蛋白、绒毛蛋白，以及主要蛋白条带P60经质谱鉴定为60kDa伴侣蛋白(GroEL)，P40为鞭毛蛋白(FLA)，这些保护性抗原大多是波氏杆菌已知的毒力相关蛋白。此外，质谱鉴定出的腺苷酸环化酶溶血素(AC-Hly)、外膜孔蛋白(PPP)、脂蛋白(PL)、脂质A脱酰酶PagL、假定的氨基酸ABC转运可溶性结合蛋白(ABC)、赖氨酸/异亮氨酸/缬氨酸结合蛋白(BPP)等均是波氏杆菌OMVs中具有潜力的免疫原性蛋白。
表1波氏杆菌OMVs主要蛋白质鉴定
Figure BDA0002737870140000111
Figure BDA0002737870140000121
Figure BDA0002737870140000131
采用基因本体论(GO)对波氏杆菌OMVs蛋白进行功能注释和富集分析，结果见图6，其中A.OMVs蛋白的生物过程；B.OMVs蛋白的分子功能；C.OMVs蛋白的细胞成分。P＜0.05，每个类别的x轴按照p值从上到下排序，上边的差异比较明显，y轴表示每个类别的蛋白数量和蛋白总数的百分比。
由图6A可知，OMVs蛋白的生物过程富集于蛋白质、核酸等生物合成及代谢过程，部分参与膜构建和膜内蛋白插入，猜测与外膜囊泡的合成相关。从细胞成分上看，OMVs的蛋白富集于核糖体、细胞外膜以及外部封装结构，OMVs蛋白的分子功能富集于核糖体的结构组成及小分子结合等，都说明OMVs的合成与核糖体有关(图6B和图6C)。
3.4OMV免疫效果研究
3.4.1OMV在小鼠上免疫效果研究
小鼠免疫后两周，血清中OMV特异性IgG水平显著升高。铝佐剂混合OMV和单独OMV均能显著提高动物体抗体水平(图7A)。可见OMV免疫后小鼠抗原特异性免疫反应得到显著增强。小鼠血清经倍比稀释后，血清中IgG1和IgG2a均得到了显著提高。其中以铝佐剂混合OMV效果更好(图7B和图7C)。说明Th1和Th2型免疫反应均得到了显著增强。血清中IgA水平已得到显著提升(图7D)。说明OMV免疫对机体粘膜免疫也有显著增强的作用。
为进一步确认OMV免疫后，小鼠对Bb.的免疫效果，我们进一步检测了血清中Bb.特异性的IgG、IgG1和IgG2a的水平。如图8所示，OMV免疫后Bb.特异性IgG、IgG1和IgG2a均得到了显著提高，同时OMV结合铝佐剂的免疫效果显著优于单独OMV。
血细胞分析结果显示，OMV结合铝佐剂免疫后小鼠的白细胞(WBC)和淋巴细胞(SCC)水平显著均提升，单独OMV免疫后小鼠相较于空白组，WBC和SCC亦得到显著的提升。此外，单核细胞(MCC)和中性粒细胞(LCC)在铝佐剂结合OMV组提升较显著，而单独OMV组则差异不显著。可见铝佐剂结合OMV免疫后，动物的细胞免疫水平得到显著增强(图9)。
体内抗感染试验结果显示，OMV结合铝佐剂免疫后，小鼠肺部含菌量从显著降低(图10)。此外，OMV免疫后小鼠血清的杀菌活性显著增强(图11)。以上结果均说明OMV结合铝佐剂能有效抵抗该菌的再次感染。
3.4.2OMV在家兔上免疫效果研究
OMV免疫后的家兔血清中OMV特异性抗体水平和Th1(IFN-γ)和Th2(IL-4)型细胞因子水平均得到显著增加(图12)。可见OMV在家兔上亦能起到增强抗原特异性免疫保护反应的作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养波氏杆菌菌液：将波氏杆菌菌株划线接种于TSA平板，37℃培养36h，挑取单菌落接种于TSB培养基中，37℃、200rpm摇床上培养10h后，按1:100在含有头孢氨苄的TSB培养基中扩大培养；
2)将步骤1)培养获得的菌液，在10000g，20min，4℃条件下离心，取上清，滤器过滤；
3)步骤2)获得的滤液使用分子量为100kDa的超滤管在5000g，20min，4℃条件下浓缩，所得浓缩液在100000g，4℃条件下超速离心2h，弃上清，沉淀用TE Buffer重悬，于-80℃冻存；步骤1)中，所述含有头孢氨苄的TSB培养基中的头孢氨苄浓度为64μg/mL；步骤1)中，扩大培养18h；步骤2)中，所述滤器孔径为0.45μm。
2.权利要求1所述方法制得的波氏杆菌外膜囊泡在制备波氏杆菌疫苗中的应用。
3.一种波氏杆菌疫苗，包括权利要求1所述方法制得的波氏杆菌外膜囊泡和佐剂。
4.根据权利要求3所述的波氏杆菌疫苗，其特征在于，所述佐剂为铝佐剂。
CN202011139649.3A 2020-10-22 2020-10-22 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用 Active CN112342156B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011139649.3A CN112342156B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011139649.3A CN112342156B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112342156A CN112342156A (zh) 2021-02-09
CN112342156B true CN112342156B (zh) 2022-08-12

Family

ID=74359756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011139649.3A Active CN112342156B (zh) 2020-10-22 2020-10-22 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112342156B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113151078A (zh) * 2021-04-15 2021-07-23 扬州大学 肠炎沙门菌外膜囊泡和制备方法及其作为禽肠炎沙门菌病亚单位疫苗的应用
CN116478899A (zh) * 2023-04-28 2023-07-25 华南农业大学 一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用
CN117462664A (zh) * 2023-10-29 2024-01-30 浙江省农业科学院 一种多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106811428A (zh) * 2015-11-30 2017-06-09 复旦大学 一种提取细菌外排膜囊泡的方法
CN110079473A (zh) * 2019-03-28 2019-08-02 北京市农林科学院 一种副鸡禽杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用
CN111454979B (zh) * 2020-04-03 2023-06-06 江苏省农业科学院 一种提高细菌外膜囊泡产量的方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112342156A (zh) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112342156B (zh) 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用
Agan et al. Laboratory diagnosis of Bartonella infections
Salajka et al. Colonization factor different from K88, K99, F41 and 987P in enterotoxigenic Escherichia coli strains isolated from postweaning diarrhoea in pigs
CN105203754B (zh) 基于磁性分离和量子点标记的卡他莫拉菌快速检测方法和试剂盒
CN103018442A (zh) 猪肺炎支原体间接elisa抗体检测试剂盒及应用
CN105203768B (zh) 基于磁性分离和量子点标记的人肺炎支原体快速检测方法和试剂盒
CN105067812A (zh) 牛布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
Cipriano et al. Detection of Vibrio anguillarum antigen by the dot blot assay
CN110327460A (zh) 猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗及制备方法
CN105755118B (zh) 免疫磁珠环介导等温扩增法快速检测副溶血性弧菌的方法
CN106243230B (zh) 一种具有霍乱弧菌毒素a亚基和金黄色葡萄球菌特点的人工蛋白及其应用
CN114752532B (zh) 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用
CN105203769B (zh) 基于磁性分离和量子点标记的人肺炎衣原体快速检测方法和试剂盒
US10961284B2 (en) Recombinant protein antigen of Orientia tsutsugamushi and vaccine composition using the same
CN115887631A (zh) 一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗
TWI629356B (zh) 經修飾之初乳蛋白質及其用途
CN1292254C (zh) 检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒
CN101368167A (zh) 共表达猪瘟病毒t细胞表位与猪细小病毒vp2蛋白的重组干酪乳杆菌及其制备方法
CN116535472B (zh) 一种幽门螺杆菌重组蛋白抗原FlgK及其制备方法与应用
CN109456409A (zh) 用于检测肺炎克雷伯杆菌的特异性抗体组及应用
CN113444157B (zh) 猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0461在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用
CN113461791B (zh) 猪鼻支原体外膜蛋白Mhr_0493在制备猪鼻支原体或其抗体检测试剂盒中的应用
CN105277714B (zh) 基于磁性分离和量子点标记的人副流感病毒快速检测方法和试剂盒
Sun et al. Development of IMBs-qPCR method for detection of foodborne Salmonella
Salazar et al. Establishment of a production process for a novel vaccine candidate against Lawsonia intracellularis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant