CN1292254C - 检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒 - Google Patents
检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1292254C CN1292254C CN 200510038211 CN200510038211A CN1292254C CN 1292254 C CN1292254 C CN 1292254C CN 200510038211 CN200510038211 CN 200510038211 CN 200510038211 A CN200510038211 A CN 200510038211A CN 1292254 C CN1292254 C CN 1292254C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- apxiv
- kit
- app
- gene
- elisa
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
一种检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae,App)野毒感染的试剂盒,其组成成分如下:细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白包被好的酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、柠檬酸、碳酸氢二钠、EDTA缓冲系统加TMB构成的显色系统、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。其特征是利用聚合酶链反应(PCR)从App血清1型的ApxIV基因中扩增出目的基因,构建了含目的基因的表达质粒pET32a-ApxIV,该质粒转化入宿主菌BL21(DE3),体外表达蛋白经镍柱纯化后作为抗原,建立酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法并优化反应条件形成了检测试剂盒,该试剂盒在App的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要应用价值。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒,属于动物抗原抗体的检测试剂盒的研制,专用于胸膜肺炎放线杆菌(App)的检测、流行病学调查和免疫监测等。
二、背景技术
猪传染性胸膜肺炎(porcine infection pleuropneumonia)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae,App)引起的猪的一种高度传染性呼吸道疾病,以出血性、坏死性肺炎和慢性纤维素性胸膜肺炎为特征。该病已成为当今大型养猪场的三大呼吸道传染病之一,与其它呼吸道疾病相比,其危害性在于具有高发病率和死亡率,尤其在新引进猪群中多呈急性爆发,最急性的死亡率可达80-100%。
App的毒力因子很多,包括荚膜多糖(CPS)、脂多糖(LPS)、外膜蛋白(OMP)、细菌毒素(Apx)、转铁蛋白(Tbp)、蛋白酶、渗透因子、菌毛等,其中Apx是App最重要的毒力因子,不同血清型的菌株可产生4种Apx即Apx I~IV,都具有溶细胞作用,是一种穿孔毒素,属于含重复子毒素(repeats-in-toxin,RTX)家族[1-4]。ApxIV是一种分子量为202kD的蛋白,App的12个血清型均能分泌这种毒素,但具有种属特异性,放线杆菌属中的其他菌株都不分泌这种毒素,ApxIV具有特异的抗原性,与App的其他RXT无交叉性,此外App仅在感染宿主时分泌ApxIV,而在体外培养时不表达该蛋白。
App有12种血清型之多,不同血清型之间缺乏足够的交叉保护性,加之该病原菌极易产生耐药性,因此疫苗免疫是预防本病最有效途径,但是在不同的国家和地区其流行的血清型可能不同,就是同一猪场也可能有多个血清型;目前国内外使用较多的是含有12种血清型中某几种血清型的全菌灭活疫苗,这样就会出现一些养猪场所用的App多价疫苗与其实际流行的血清型不相符合的情况,从而导致疫苗免疫低下或失败,给养猪场造成巨大的经济损失。
本发明基于“App仅在感染宿主时分泌ApxIV”这一特点,利用PCR技术从App血清1型的ApxIV基因中扩增出目的基因,构建了含目的基因的重组表达质粒pET-ApxIV,该质粒转化入宿主菌BL21(DE3),体外表达蛋白经镍柱亲合层析纯化后作为抗原,建立间接ELISA检测方法,并优化ELISA的反应条件形成检测试剂盒,该试剂盒可检测App的野毒感染,指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的是提供一种检测App野毒感染的试剂盒,通过构建一个在原核细胞中表达的高效重组表达质粒,利用重组表达质粒的表达产物为抗原,研制检测App野毒感染的试剂盒,专用于App的检测、流行病学调查和免疫监测。
技术方案 本发明的具体实施方案如下:
一种检测App野毒感染的酶联免疫吸附试ELISA试剂盒,其组成成分如下:细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白包被好的酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲系统加3,3’5,5’-四甲基苯(TMB)构成的显色系统、阳性血清、阴性血清和试剂盒说明书。
上述的ELISA试剂盒,其特征在于包被酶标板所用的抗原即细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白是由基因工程菌株BL21(DE3)体外诱导表达后经镍柱纯化获得,该菌株含重组表达质粒pET32a-ApxIV,该重组表达质粒含有大肠杆菌复制子ori、启动子PT7、外源目的基因ApxIV基因的3’端1078bp和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因,其表达式为:-ori-PT7-ApxIV gene-Amp gene-;此外在其表达质粒pET32a-ApxIV的构建中,设计并合成的一对特异性引物为,
上游引物P1:5’-gca
ggatccaaatttaccgatgtg-3’,
下游引物P2:5’-gta
aagcrrcctcttcaagcgacaca-3’。
本发明的技术方案主要包括以下两个方面:
第一方面构建了表达载体pET32a-ApxIV。根据GenBank发表的App1型的ApxIV序列(序列号:AF021919),利用DNAStar软件分析,选取ApxIV基因3’端5434bp-6511bp(ApxIV C端抗原性较强的359个氨基酸),自行设计一对特异性引物,引物两端分别加限制性酶切位点BamHI和HindIII及保护性碱基(Takara公司合成),下划线部分为酶切位点。
P1:5’-gca
ggatccaaatttaccgatgtg-3’BamH I
P2:5’-gta
aagcttcctcttcaagcgacaca-3’Hind III
通过PCR获取ApxIV目的基因,将获取的目的基因克隆入pMD18-T载体并进行序列测定,将pMD18-T载体上的目的片段酶切后克隆入pET32a载体,构建重组表达质粒pET32a-ApxIV,将重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞,并用双酶切和PCR进行鉴定,鉴定阳性的质粒即为重组表达质粒pET32a-ApxIV。
第二方面通过重组表达质粒pET32a-ApxIV体外高效表达,表达蛋白经镍柱纯化后,测定蛋白浓度,,以纯化蛋白为抗原研制ELISA试剂盒,为了验证ApxIV-ELISA的检测效果,又建立了一个以App荚膜多糖(CPS)粗提物为抗原的CPS-ELISA与之对照。
有益效果 本发明的特点和优点如下:
本发明选取的目的基因较短,只有1078bp,表达载体pET32a-ApxIV构建容易;其次,pET32a-ApxIV的表达产物具有良好的抗原性;第三,基因工程菌株BL21(DE3)(pET32a-ApxIV)表达的蛋白表达量25%~30%;以可溶性形式存在于菌体内部,收集和纯化比较方便;第四,纯化的表达蛋白不需要进行蛋白复性就可用于ELISA试剂盒的研制。
事实证明,本发明细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白具有良好的抗原性,能特异性地检测到人工发病猪血清中的抗ApxIV毒素抗体。ELISA试剂盒检测临床血清样品结果显示在从未使用过App灭活疫苗的猪场收集的血样,对照CPS-ELISA检测结果和本发明试剂盒的检测结果符合率达100%(表4),说明本试剂盒在实际应用中具有良好的特异性和敏感性。表明本发明ELISA试剂盒在检测App野毒感染,在App的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要的应用价值,可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治。
四、附图说明
图1pET32a-ApxIV重组质粒图谱
表达式为:-ori-PT7-ApxIV gene-Amp gene-,它含有大肠杆菌复制子ori、PT7是T7RNA聚合酶/启动子表达系统、外源目的基因为ApxIV 3‘端部分基因,抗性筛选基因为氨苄青霉素Amp基因。
图2目的片段的测序结果
图3pMD18-T载体克隆的酶切图谱
泳道1为DL-15000Marker;泳道2为DL-2000Marker;泳道3~5为pMD18-T载体BamHI、HindIII双酶切。
图4表达重组质粒pET32a-ApxIV的鉴定图谱
泳道1为DL-15000Marker;泳道2为DL-2000Marker;泳道3为pET32a(+)/BamHI、HindIII双酶切;泳道4-5为pET32a-ApxIV/BamHI、HindIII双酶切。
图5重组表达质粒pET32a-ApxIV体外表达的SDS-PAGE图谱
泳道1为低分子量标准蛋白质;泳道2为诱导的pET32a质粒;泳道3~11为重组表达质粒pET-ApxIV 0,2,4,5,6,7,8,9,10小时诱导;泳道12为重组表达质粒pET-ApxIV诱导后超声波裂解上清;泳道13为重组表达质粒pET-ApxIV诱导后超声波裂解沉淀。
图6表达蛋白的免疫转印鉴定图
图7测定多糖含量的标准OD值曲线
图8人工感染猪体内抗体的动态变化
图9灭活疫苗免疫猪体内抗体的动态变化
五、具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述
1.引物设计
根据GenBank发表的App1型(shope株购于农业部青岛动检所)的ApxIV序列(序列号:AF021919),利用应用DNAStar软件分析,选取ApxIV基因3’端5434bp-6511bp(ApxIV C端抗原性较强的359个氨基酸),自行设计一对特异性引物,引物两端分别加限制性酶切位点BamHI和HindIII及保护性碱基,下划线部分为酶切位点。
P1:5’-gca
ggatccaaatttaccgatgtg-3’ BamHI
P2:5’-gta
aagcttcctcttcaagcgacaca-3’ HindIII
2.PCR获取ApxIV目的基因
PCR反应条件:94℃预热5min,94℃变性1min,60℃退火40sec,72℃延伸80sec,30个循环,最后一个循环后再延伸10分钟。PCR产物长度为1096bp,将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察,切下目的片段,用小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。
3.将获取的目的基因克隆入pMD18-T载体并进行序列测定
将回收PCR产物4.5μl,与pMD18-T 0.5μl和Solution I 5.0μl,混匀后,4℃连接过夜,用于转化DH5α感受态细胞,挑取单个菌落进行过夜培养,提取质粒,用BamH I、Hind III双酶切,37℃水浴2小时,琼脂糖凝胶电泳鉴定,可以看到一条约1100bp的条带出现(图3)。将双酶切鉴定阳性的细菌寄出,由大连宝生物公司进行序列测定,结果此序列与GenBank上公布的序列相比较,核苷酸同源性为100%(图2),获得pMD18-T载体质粒。
4.重组表达质粒pET32a-ApxIV的构建和鉴定
将已测序鉴定的载体质粒pMD18-T和pET32a(+),用BamHI、HindIII双酶切,电泳后,回收目的片段和pET32a(+),然后用T4DNA连接酶进行连接反应,转化BL21感受态细胞,用氨苄青霉素板筛选,挑取细菌培养,提取质粒进行酶切鉴定,可见目的条带(图4),将阳性重组质粒命名为pET32a-ApxIV。
5.重组表达质粒pET32a-ApxIV的表达和免疫转印
将阳性重组菌菌液以2%的比例接种与LB(Amp+)液体培养基中,37℃、180转/分钟振荡培养2小时后加入终浓度为1mmol/mlIPTG进行诱导表达,分别收集0h、2h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h的菌液。样品用10%SDS-PAGE鉴定,表达产物诱导2小时时即可产生分子量约60kD的目的条带,7~8小时达最高峰(图5)。取8小时的培养物超声波处理,12,000r/min、4℃离心5min分离上清和沉淀,用10%SDS-PAGE鉴定,表达蛋白以可溶形式存在于菌体内部(图5)。并进行转印,然后以兔抗App1血清为一抗,HRP标记的羊抗兔IgG为二抗作免疫转印鉴定,最后用DAB显色试剂盒显色,在醋酸纤维素膜上可见目的条带(图6)。
6.细菌毒素ApxIV表达蛋白经镍柱纯化后,测定蛋白浓度
参照Novagen公司His·bindpurification kit的说明书,细菌毒素ApxIV表达蛋白经镍柱纯化后,测定该蛋白浓度为0.5mg/ml。
7.App荚膜多糖的提取及浓度的测定
7.1荚膜多糖(CPS)的制备(三氯乙酸-丙酮法)
App3(S1421株)、App5(K17株)、App7(WF83株)(购于农业部青岛动检所)各200ml的过夜培养物10,000g离心后收集菌体,用等体积的灭菌去离子水重悬,分别加50ml的三氯乙酸(100%)混匀,4℃、10,000g离心30min,取上清加等体积的丙酮混匀,4℃过夜后10,000g离心30min,用丙酮洗涤沉淀3次,在用5%的醋酸钠溶解沉淀,溶解物用1/3体积的氯仿:正丁醇(4∶1)抽提两次,10,000g离心30min每次取水相,水相中加等体积的丙酮摇匀4℃过夜,10,000g离心30min,沉淀用无水乙醇洗涤3次,室温待乙醇晾干后用10ml灭菌去离子水溶解,-20℃保存备用。
7.2苯酚-浓硫酸法进行CPS的定量测定
取5mg的葡萄糖溶解于100ml的灭菌双蒸水配制成50μg/ml的葡萄糖标准液,吸取该标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,分别加灭菌双蒸水补至2.0ml。分别加入6%苯酚(临用前用80%苯酚溶液配制)1.0ml及浓硫酸5.0ml,静置10min,摇匀,室温放置20min后于490nm测定吸光值(OD)。以糖浓度为横坐标、OD值为纵坐标,绘制标准曲线(表1和图7)。
表1标准液中糖的含量和与其对应的OD值
糖含量(μg/ml) | 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 |
OD值 | 0 | 0.036 | 0.076 | 0.124 | 0.154 | 0.202 | 0.245 | 0.302 | 0.327 | 0.386 |
分别取待测样品原液、10倍稀释液和100倍稀释液1ml,加灭菌双蒸水补至2.0ml,另取一管加灭菌双蒸水2.0ml。分别加入6%苯酚(临用前用80%苯酚溶液配制)1.0ml及浓硫酸5.0ml,静置10min,摇匀,室温放置20min后于490nm测定吸光值(OD),双蒸水对照管用于OD值测定时仪器的校零。待测样品管的OD值可在标准曲线上求得相应的CP含量,测得提取的App3、5b、7的CPS含量分别为2.4、2.2、3.2mg/ml。
8CPS-ELISA和细菌毒素ApxIV表达纯化蛋白ELISA试剂盒的研制
8.1ELISA试剂盒的组成成分和最佳反应条件
1)抗原最佳包被浓度:表达产物0.625μg/ml的浓度,100μl/孔包被,4℃包被过夜;包被液为0.05M PH9.6的碳酸盐缓冲液(Na2CO3 1.95g,NaHCO3 2.93g,去离子水1000ml);提取的荚膜多糖以3μg/ml的浓度,100μl/孔包被;
2)洗涤液:PBST/Tween-20(NaCL 8g,Na2HPO412H2O 3.6g,KCL 0.2g,KH2PO4 0.2g,Tween-20 0.5ml,去离子水1000ml)
3)最佳封闭液:10%的小牛血清(PBST/Tween-20)
4)血清稀释液:0.01M的PBS(NaCL 8g,Na2HPO412H2O 3.6g,KCL 0.2g,KH2PO4 0.2g,去离子水1000ml),PH7.2
5)血清的最佳稀释浓度:100倍稀释
6)血清与抗原的结合时间:90分钟
7)酶标二抗的最佳稀释浓度和反应时间:20000倍稀释,50分钟
8)显色系统:柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)为缓冲系统加TMB和过氧化氢尿素配制成显色底物,配方:A液(磷酸氢二钠36.82g,柠檬酸10.21g,过氧化氢尿素0.6g,去离子水1000ml),B液(10.5g,EDTA 0.146g,TMB 0.25g,去离子水1000ml)。
9)终止液:2MH2SO4
8.2ELISA的操作程序
1)4℃包被过夜,取出后用洗涤液PBST/Tween-20洗涤3次,每次5分钟。
2)加入100倍稀释好的血清样品,100μl/孔,每次设阳性、阴性和空白对照,37℃孵育90分钟,取出洗涤3次,每次5分钟。
3)加酶标记的二抗,100μl/孔,37℃孵育50分钟,取出洗涤3次,每次5分钟。
4)加底物100μl/孔,37℃孵育10分钟,2M的硫酸终止反应,50μl/孔,酶标仪测吸光值(波长450nm)。
8.3判定标准的确定
分别取猪传染性胸膜肺炎正向间接血凝诊断试剂盒检测阳性、阴性血清100份和40份进行ELISA,并计算它们的OD450平均值和标准差(Standard deviation,SD),以阳性和阴性血清的OD450平均值+3SD的比值大于或等于2.1作为ELISA的判定标准。
8.4保存期试验
按照上述ELISA确定的条件,抗原包被、封闭后,分别在4℃和-20℃保存,于不同时间取出进行ELISA试验,包被ELISA板的保存期在4℃可保存6个月,而在-20℃可保存15个月。
9.本发明ELISA试剂盒的使用说明书
1)加入100倍稀释好的血清样品,100μl/孔,每次设阳性、阴性和空白对照,37℃孵育90分钟,取出洗涤3次,每次5分钟。
2)加酶标记的二抗,100μl/孔,37℃孵育50分钟,取出洗涤3次,每次5分钟。
3)加底物100μl/孔,37℃孵育10分钟,2M的硫酸终止反应,50μl/孔,酶标仪测吸光值(波长450nm)。
4)试剂盒所附的阳性血清的OD450与阴性对照血清的OD450的比值大于2.1时,若待检样品的OD450与阴性对照血清的OD450的比值大于或等于2.1则可判为阳性。
10.ELISA试剂盒的应用
10.1 ELISA试剂盒检测人工感染猪血清样品
App1、3、5b和7活菌分别鼻腔接种3头35日龄小猪(总共12头,实验前用兰州兽医研究所的间接血凝试剂盒检测阴性),15d后再次鼻腔接种;分别采集接种前、第一次接种后15d、第二次接种后15d和25d血清,结果显示App阴性的35日龄猪经鼻腔接种后15天可两种ELISA均可以检测到相应的抗体,再次接种后15天OD值下降,再过10天,OD值上升超过一次接种后15天的值(表2和图8),表明App活菌在猪体内能分泌ApxIV毒素,说明细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白具有良好的抗原性,能特异性地检测到人工发病猪血清中的抗ApxIV毒素抗体。
表2人工感染猪血清样品的平均OD值
接种前 | 一次接种后15天 | 二次接种后15天 | 二次接种后25天 | |
CPSApxIV | 0.2056670.162833 | 0.77580.6735 | 0.68250.6102 | 0.8138890.755889 |
10.2 ELISA试剂盒检测App四价灭活苗免疫猪血清样品
App1、3、5b和7四价灭活苗免疫12头30日龄猪(实验前用兰州兽医研究所的间接血凝试剂盒检测阴性),分别收集免疫前、免疫后10d、20d、30d、60d、90d血清;在免疫后90d分别以App1、3、5b和7活菌鼻腔攻毒两次,其间间隔15d,并收集两次攻毒后15d的血清,检测结果表明CPS-ELISA可以检测到30日龄猪免疫后相应抗体的动态变化,而ApxIV-ELISA检测不到相应的抗ApxIV抗体即使是活菌攻毒后(见表3和图9)。本试验验证了“App仅在感染宿主时分泌ApxIV毒素,而在体外培养时不表达ApxIV毒素蛋白”这一论断,同时也表明本发明所研制的试剂盒可以检测App野毒感染,可以指导养殖场选择合适的疫苗和药物进行防治,本试剂盒在App的诊断、流行病学调查和免疫监测等方面具有重要的应用价值。
表3灭活疫苗猪血清样品的平均OD值
免疫前0d | 免疫后10d | 20d | 30d | 60d | 90d | 一次攻毒后15d | 二次攻毒后15d | |
CPSApxIV | 0.221250.161167 | 0.44950.21583 | 0.60140.2426 | 0.70180.2478 | 0.69350.23425 | 0.60010.2193 | 0.8598330.207083 | 0.8004170.203 |
10.3 ELISA试剂盒检测临床血清样品
分别收集南京六合、镇江、常州、常熟、苏州五地某猪场血清100、90、80、49和128份,其中后四地猪场猪群均存在严重呼吸道症状,病死猪解剖病变集中于肺部,未使用过App疫苗。结果显示在从未使用过App灭活疫苗的猪场收集的血样,CPS-ELISA检测结果和本发明试剂盒的检测结果符合率达100%(表4),说明本试剂盒在实际应用中局有良好的特异性和敏感性。
表4两种ELISA检测临床血清样品
CPS-ELISA | ApxIV-ELISA | |||
检出数/总数 | 检出率(%) | 检出数/总数 | 检出率(%) | |
六合镇江常州常熟苏州 | 3/10085/9070/8046/49119/128 | 394.487.593.993 | 3/10085/9070/8046/49119/128 | 394.487.593.993 |
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒
<130>说明书
<140>200510038211.5
<141>2005-01-24
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1600
<212>DNA
<213>胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(1600)
<223>
<400>1
agtggagtag caaaggaaag gaacagatgg agggacctgt catacgacac acttaaaagg 60
aatgcaacgt caatggcgat gcctaattgt tacttacagc aggttccaaa gatttgttcc 120
accacgcgtg aaggaatcag attcgactgc tcccaactta catgcaacgt caatatcaat 180
cctcatataa agctgattaa aagttgattt ttaatattaa gaatagcatc ccattcacct 240
cccataacag tgatcatttt gtaacatttt aaagttaagt gactaaaaca taaatttact 300
gttaatttag tgatcttgga tgtaatttat ccatatttat gttacatgca cggtgaagac 360
ttcctgcatt tgggaacatt ttcacttgtc tttctttact tcattcttgt actttaatct 420
atctcaacca agattaagat tctgtatgtt gagaactttg gttagtttat atttgaaaaa 480
aattattgat attattaaaa aaaataacta taaatttaaa aaatattaaa aacatgtaca 540
accaaaacat ctattttaaa tgaagcattt cgaaagcgaa tttgattaaa aaaggatagc 600
catgtgaaag tcaactttga gcatgtgaac aacttattga aatcatttat cattttcaat 660
tagttgaaag tcctaaattt attttttaaa aatcggtttg tttaaaacta aggtgttgat 720
agaataagta tttaattaaa tgcattattt ttagtgtaag aaaaataata attcagtatg 780
ccatgtaatt gatgtggtac gattaagttc gagcaacaaa tcgaaaggag gcggtttttg 840
ggcatgctat agggcatttg gttccgtaca aatatgcaaa taagtttaaa tgtaattttg 900
atggggccct ctctgttgac agtgggtatt cggggtgaat ttgtgcggtg catctcgagt 960
tttataaaga tcgcaaagtc catctttctg cggtggaagt catgtctact catcattgct 1020
ttattgaaag caaactactt tgaatgtatt tcttatcctg ttttatcatt catactgtta 1080
atgttgataa attgttacaa caggatgaaa ataagatagg acttagaaaa gggtgtattg 1140
ggtaagccgg ttgatttgga tttaatctgt accacttatt ttcattttgt tttcttttta 1200
tcagttttac tggtttaatg aatttgattt tatatttaaa aaaaatcaaa tataaatgtt 1260
tagttgccat cagcattagg atatcaacca catgtcaagc atgattgctt aatttgattt 1320
aaatatatat aataataaat gaaaattgac tttttggttg gatgataaca tcacttatgt 1380
aagctaaaat tgcaatttaa aatcagaaaa tgaaatcctc gagttctttt tcattcatac 1440
tttcataaat tcaactatag ttaataatag atcataaatg cagtccagtt tcttataata 1500
aaaaaacaag gtaggtctta aattcttata aatgcaagca gtccagtttc tgaaataaca 1560
aggcaaatta gttttctgag tgactaaaaa gttagggagc 1600
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>上游引物P1
<222>(1)..(24)
<223>
<400>2
gcaggatccaaatttaccga tgtg 24
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>下游引物P2
<222>(1)..(26)
<223>
<400>3
gtaaagcttcctcttcaagc gacaca 26
Claims (2)
1.一种检测胸膜肺炎放线杆菌App野毒感染的酶联免疫吸附试ELISA试剂盒,由细菌毒素ApxIV纯化表达蛋白包被好的酶标板、辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG抗体、柠檬酸、碳酸氢二钠、乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲系统加3,3’5,5’-四甲基苯(TMB)构成的显色系统、阳性血清、阴性血清利试剂盒说明书组成,其特征在于:包被酶标板所用的抗原即ApxIV片段纯化表达蛋白是由基因工程菌株BL21体外诱导表达获得,该菌株含表达质粒pET32a-ApxIV,重组表达质粒pET32a-ApxIV,含有大肠杆菌复制子ori、启动子PT7、外源目的基因ApxIV基因的3’端1078bp和抗性筛选基因氨苄青霉素Amp基因,其表达式为:-ori-PT7-ApxIV gene-Amp gene-。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒,其特征在于,其表达质粒pET32a-ApxIV的构建中,设计并合成的一对特异性引物为,
上游引物P1:5’-gcaggatccaaatttaccgatgtg-3’,
下游引物P2:5’-gtaaagcttcctcttcaagcgacaca-3’。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200510038211 CN1292254C (zh) | 2005-01-24 | 2005-01-24 | 检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200510038211 CN1292254C (zh) | 2005-01-24 | 2005-01-24 | 检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1645148A CN1645148A (zh) | 2005-07-27 |
CN1292254C true CN1292254C (zh) | 2006-12-27 |
Family
ID=34876235
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200510038211 Expired - Fee Related CN1292254C (zh) | 2005-01-24 | 2005-01-24 | 检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1292254C (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103941015A (zh) * | 2013-03-15 | 2014-07-23 | 河南省农业科学院 | 猪胸膜肺炎放线杆菌内毒素抗体快速检测试纸条 |
CN104678105A (zh) * | 2015-01-16 | 2015-06-03 | 镇江市第一人民医院 | 检测Cripto-1的酶联免疫试剂盒及其制备方法 |
CN106093384A (zh) * | 2016-08-08 | 2016-11-09 | 河南省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种含有猪传染性胸膜肺炎放线杆菌抗体和猪肺炎支原体抗体的elisa检测试剂盒及其制备方法 |
-
2005
- 2005-01-24 CN CN 200510038211 patent/CN1292254C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1645148A (zh) | 2005-07-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103293306B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒抗体检测胶体金免疫层析试纸条制备方法 | |
CN107176977B (zh) | 牛支原体MbovP730蛋白在自然感染和疫苗免疫鉴别中的应用 | |
LiHua et al. | Evaluation of an outer membrane protein as a vaccine against Edwardsiella anguillarum in Japanese eels (Anguilla japonica) | |
CN101508978B (zh) | 一株鸡源h9n2禽流感病毒毒株的分离鉴定和纯化方法及其应用 | |
CN108823218A (zh) | 鸡传染性法氏囊病病毒vp2基因、其表达产物、其亚单位疫苗及应用 | |
CN110642927B (zh) | 一种蛋白在制备预防化脓隐秘杆菌感染的药物中的应用 | |
CN1292254C (zh) | 检测猪胸膜肺炎放线杆菌野毒感染的试剂盒 | |
CN112342156A (zh) | 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用 | |
CN1286971C (zh) | 一种单克隆抗体,包含该单克隆抗体的检测试剂盒及应用 | |
CN100526452C (zh) | 一种鸡禽流感疫苗免疫与病毒野毒感染的胶体金免疫层析快速鉴别诊断试剂盒及应用 | |
CN102443053A (zh) | 猪链球菌2型hp0245基因编码蛋白作为保护性抗原的应用 | |
Yang et al. | Protective immunity by DNA vaccine against Micropterus salmoides rhabdovirus | |
CN1916633A (zh) | 检测梅毒螺旋体的方法及试剂盒 | |
Wang et al. | TLR4 agonist combined with trivalent protein JointS of Streptococcus suis provides immunological protection in animals | |
CN114752532B (zh) | 一株能同时黏附定植和改变小鼠易感性的大肠杆菌分离株及其应用 | |
CN111621506A (zh) | 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用 | |
CN1218962C (zh) | 生长抑素卵黄抗体及其制备 | |
CN110382519A (zh) | 恙虫病东方体的全新重组蛋白抗原以及使用上述重组蛋白抗原的疫苗组合物 | |
TW201237170A (en) | Method of examining Riemerella anatipestifer and its kit | |
CN115068600A (zh) | 抗病毒蛋白免疫增强剂在h9n2禽流感灭活苗中的应用 | |
CN104726413A (zh) | 一株牛支原体nadh氧化酶的单克隆抗体 | |
CN1928562A (zh) | 一种检测狂犬病病毒的酶联免疫试剂盒 | |
CN104610456A (zh) | 一种 h7n9 亚型禽流感亚单位疫苗的制备方法及应用 | |
CN109608541B (zh) | 一种抗猪产肠毒素大肠杆菌卵黄抗体及其制备方法 | |
CN1458168A (zh) | 重组猪流感病毒np抗原、其制备方法及在诊断中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20061227 Termination date: 20110124 |