CN116478899A - 一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用 - Google Patents

一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用。本发明所述所述制备方法制备得到的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡，能够激发高效的特异性免疫反应，使机体产生较高的特异性抗体，既能引发体液免疫又能引发细胞免疫，多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗制备简单，保护率高，具有良好的安全性。

Description

一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用。
背景技术
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)是上呼吸道的常见共生菌，也是动物的主要病原菌，能在世界范围内引起各种动物患病，可引起猪萎缩性鼻炎、猪肺疫和各种家畜家禽的出血性败血症以及禽霍乱等危害健康生产的传染性疾病，是典型的人畜共患病之一。多杀性巴氏杆菌引起的鸭的疾病又称为鸭霍乱或鸭出血性败血症，是一种急性、高度接触性、败血性传染病，其发病率在30～70％之间，病死率在30～80％之间，临床剖检特征性病变是全身粘膜、浆膜点状出血、出血性肠炎及肝脏的灰白色坏死点。鸭霍乱(鸭出血性败血症)是由多杀性巴氏杆菌引起的一种高度传染性疾病，主要以A:L1型为主，是目前危害养鸭业的主要细菌性疾病之一，在世界各地均有发生，家禽因禽霍乱死亡，给全世界禽类养殖业造成巨大经济损失。
基因工程亚单位疫苗(Sub-unit vaccine)也称生物合成亚单位疫苗/重组亚单位疫苗。多杀性巴氏杆菌的许多外膜蛋白被认为是细菌潜在的毒力因素，在疫苗的研究和发展过程中，常常是研究者的研究对象，其中多杀性巴氏杆菌脂蛋白E(Pasteurellalipoprotein E,PlpE)分子量大小为38kDa左右，是多杀性巴氏杆菌中一个重要的免疫原性外膜蛋白，有研究报道证明，基于PlpE蛋白研制的多杀性巴氏杆菌重组亚单位疫苗能够产生较好的保护效果。该类疫苗具有较高的安全性，不会使动物产生副作用，是多杀性巴氏杆菌疫苗研究的新方向。
外膜囊泡(Outer Membrane Vesicles,OMVs)是由革兰氏阴性细菌自然外含释放的，它是一种球形双层结构，含有脂多糖、外膜蛋白、周质蛋白、细胞质蛋白、DNA和RNA等多种成分。OMVs主要由细菌外膜组成，以天然构象呈现表面抗原，具有免疫原性、自我调节和被免疫细胞吸收等自然特性，最主要的是其能够诱导机体产生更高的特异性抗体或功能性更强的抗体。正是因为它的特殊结构，OMVs被认为是一种新的疫苗候选者，对疫苗的开发具有重要作用。近年来OMVs的成为了研究热点，它的各种结构和生物学特性也被揭示出来，为临床上的应用和发展前景奠定了理论基础。目前，OMVs主要应用在制成疫苗佐剂和亚单位疫苗上。
但目前尚没有高效的递呈多杀性巴氏杆菌抗原的外膜囊泡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用。本发明所述制备方法制备得到的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡，能够激发高效的特异性免疫反应，使机体产生较高的特异性抗体，既能引发体液免疫又能引发细胞免疫。
本发明提供了一种递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡的制备方法，包含以下步骤：
1)将能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组菌株接种于液体培养基中进行培养，得到预培养菌液；
2)将步骤1)所述预培养菌液加入诱导剂进行诱导培养，离心，收集上清液；
3)将步骤2)所述的上清液依次进行过滤除菌、超速离心，收集固相组分，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
优选的是，步骤1)中所述的液体培养基包括氯霉素抗性的LB液体培养基；步骤2)中所述的诱导液体培养基包括添加20wt％的L-Arabinose溶液的氯霉素抗性的LB液体培养基。
优选的是，步骤3)所述收集固相组分后，还包含将收集的固相组分进行重悬，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
优选的是，所述重组菌株包含能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组载体。
优选的是，所述重组菌株以大肠杆菌JC8031作为出发菌株。
优选的是，所述重组载体以pBAD-ClyA作为初始载体。
优选的是，编码所述多杀性巴氏杆菌抗原的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
本发明还提供了上述技术方案所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡在制备多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。
本发明还提供了一种多杀性巴氏杆菌疫苗，含上述技术方案所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡和药学上可接受的辅料。
本发明提供了一种递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡的制备方法。本发明所述制备方法中重组菌株所表达的多杀性巴氏杆菌目的保护性抗原蛋白能够定位于细菌外泌的外膜囊泡上。本发明所述制备方法制备得到的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡作为保护性抗原可刺激机体产生特异性免疫反应和非特异性免疫反应；所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡结构完整；所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡能够激发高效的特异性免疫反应，免疫原性高，能够诱导机体产生较高的特异性抗体，既能引起体液免疫又能引发细胞免疫，且引起的免疫水平优于灭活疫苗和重组43.1a-PlpE疫苗。本发明的重组OMV疫苗能有效减少细菌在各组织上的定植，保护机体免受细菌的侵袭。此外，本发明的重组OMV疫苗具有很好的免疫保护效果，保护率为100％，保护效果优于灭活疫苗和重组43.1a-PlpE疫苗。
根据本发明实施例中番鸭免疫攻毒保护实验结果表明，本发明提供的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡对番鸭的保护率为100％，重组43.1a-PlpE提供了91.7％的保护率，灭活疫苗提供了58.3％的保护率。间接ELISA法测定番鸭血清多杀性巴氏杆菌抗体，在免疫后14天，OMV-PlpE组和43.1a-PlpE组抗体效价显著高于对照组(p<0.001)，灭活疫苗组也产生了抗体，与对照组相比，差异显著(p<0.05)；免疫后28d，OMV-PlpE组番鸭脾脏中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子表达水平均高于对照组，差异极显著(p<0.001)，43.1a-PlpE免疫组和灭活疫苗脾脏IL-2和IL-10水平高于空白对照组，差异极显著(p<0.001)。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的pBAD-ClyA-PlpE重组质粒酶切图；
图2为重组细菌蛋白表达情况图；
图3为外膜囊泡电镜效果图；
图4为外膜囊泡总蛋白测定标准曲线；
图5为OMV-PlpE目的蛋白Wstern-blot图；
图6为免疫番鸭后血清多杀性巴氏杆菌IgG抗体间接ELISA检测结果；
图7为免疫后脾脏组织中细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的表达水平；
图8为番鸭多杀性巴氏杆菌攻毒后生存曲线；
图9为多杀性巴氏杆菌攻毒后各组织多杀性巴氏杆菌细菌载量结果。
具体实施方式
本发明提供了一种递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡的制备方法，包含以下步骤：
1)将能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组菌株接种于液体培养基中进行培养，得到预培养菌液；
2)将步骤1)所述预培养菌液加入诱导剂进行诱导培养，离心，收集上清液；
3)将步骤2)所述的上清液依次进行过滤除菌、超速离心，收集固相组分，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
本发明将能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组菌株接种于液体培养基中进行培养，得到预培养菌液。在本发明中，所述重组菌株优选包含能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组载体。在本发明中，所述重组菌株优选以大肠杆菌JC8031作为出发菌株。本发明所述重组菌株能够成功表达多杀性巴氏杆菌保护性抗原，并能够生产递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。在本发明中，所述重组载体优选以pBAD-ClyA作为初始载体。在本发明中，编码所述多杀性巴氏杆菌抗原的基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述多杀性巴氏杆菌抗原基因插入在pBAD-ClyA初始载体的XbaI酶切位点和KpnI酶切位点之间。在本发明中，用于构建重组载体的引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
在本发明中，所述的液体培养基优选包括氯霉素抗性的LB液体培养基；所述的诱导液体培养基优选包括添加20wt％的L-Arabinose溶液的氯霉素抗性的LB液体培养基。在本发明中，优选培养至OD值为0.5～0.7，收集预培养菌液。
得到预培养菌液后，本发明将预培养菌液加入诱导剂进行诱导培养，离心，收集上清液。在本发明中，所述诱导培养的时间优选为16h。
得到上清液后，本发明将上清液依次进行过滤除菌、超速离心，收集固相组分，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。在本发明中，所述收集固相组分后，还包含将收集的固相组分进行重悬，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。本发明所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡能够激发高效的特异性免疫反应，免疫原性高，能够诱导机体产生较高的特异性抗体，免疫后既能够引发体液免疫又能引发细胞免疫。
本发明还提供了上述技术方案所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡在制备多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。
本发明还提供了一种多杀性巴氏杆菌疫苗，含上述技术方案所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡和药学上可接受的辅料。在本发明中，所述辅料优选包括PBS。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种鸭多杀性巴氏杆菌外膜囊泡疫苗的制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明实施例中使用的材料和试剂如下：
菌株与质粒：原核表达质粒pBAD-ClyA载体、大肠杆菌JC8031株由康奈尔大学Yung-fu Chang教授馈赠，大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞购自广东围谷科技有限公司，JC8031株感受态细胞华南农业大学家禽研究室制备并保存。
主要试剂:DL10000和DL2000凝胶电泳Maker购自日本宝生物工程(大连)有限公司；XbaI、KpnI限制性内切酶购自基因生物技术国际贸易(上海)有限公司；LB肉汤、LB琼脂购自广东环凯微生物科技有限公司；氯霉素、50×TAE缓冲液、10×PBS缓冲液、10×TBST缓冲液购自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA纯化试剂盒、小量质粒抽提试剂盒购自美国OMEGA公司；无蛋白快速封闭液、考马斯亮蓝快速染液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、一抗稀释液、化学发光显色液试剂购自上海雅酶生物医药科技有限公司；Anti His-Tag MouseMonoclonal Antibody、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司；二抗CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)购自广州创伟生物科技有限公司。
试剂配制：(1)氯霉素：称取氯霉素干粉0.3g，溶于10mL无水乙醇，配制成浓度为30mg/mL的氯霉素溶液，溶解后用0.22μm滤膜过滤，置于-20℃保存。(2)LB液体培养基：称取21g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至室温后4℃保存。(3)LB固体培养基：称取36g，定容至1L，115℃高压蒸汽灭菌15min，在合适温度时按试验需要加入氯霉素(终浓度为15μg/mL)，迅速倒入灭菌培养皿中，待冷却后倒置于4℃冰箱保存。(4)50％甘油溶液：向100mL锥形瓶中加入25mL甘油和25mL超纯水，115℃高压蒸汽灭菌30min，4℃保存。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
包含多杀性巴氏杆菌抗原基因的重组载体、重组菌株的构建
1)带有同源臂的目的片段PCR扩增
委托常州基宇生物工程有限公司完成PlpE基因的合成，并将PlpE基因连接到质粒pMD19-T上得到含有目的基因片段的克隆质粒pMD19T-PlpE。
多杀性巴氏杆菌抗原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其中加下划线的分别为上下游酶切位点；加粗部分为His标签，斜体部分为终止子。
以公司提供的克隆质粒pMD19T-PlpE为模板，用引物CZ-PlpE-F/R进行PCR扩增含有同源臂的片段。
引物CZ-PlpE-F(SEQ ID NO.2)：
CTTTGAGGTACCTGGTGGTGGCGGCGGTATGTGCAGTGGTGGTGGTG G。
引物CZ-PlpE-R(SEQ ID NO.3)：
GAAAAAAGCCATCAGGCACAGTCTAGACATCACCATCACCATCACTG A。
PCR扩增体系如表1所示，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，确认是否与预期大小相符，目的片段的亮度是否可用于DNA片段回收。本发明中，所述回收纯化PlpE基因片段采用omega DNA纯化试剂盒进行，详细步骤参见试剂盒说明书。
表1PrimeSTAR Max DNA聚合酶PCR反应体系
2)线性化载体的纯化
对pBAD-ClyA初始载体进行XbaI和KpnI双酶切，回收片段；酶切体系如表2所示。所述酶切的程序如下：37℃孵育过夜。本发明在所述酶切反应后进行琼脂糖凝胶电泳验证，确认是否与预期大小相符，目的片段的亮度是否可用于DNA片段回收。本发明中，所述回收纯化载体片段采用omegaDNA纯化试剂盒进行，详细步骤参见试剂盒说明书。
表2双酶切反应体系
3)本发明在获得纯化后的PlpE基因片段与pBAD-ClyA载体片段进行连接获得包含多杀性巴氏杆菌抗原基因的重组载体。所述连接的连接体系如表3：
表3连接体系
所述连接的连接程序为50℃连接40min，所述连接的连接产物置于冰上进行转化，具体步骤如下：将感受态细胞DH5a从-80冰箱取出，置于冰上5min后，将10μL连接产物加入其中，用手拨打1.5mL离心管管底轻轻混匀，冰上放置30min，42℃热激45s后，冰上放置2min，转置无菌环境下加入700μL液体LB培养基。将菌液放置于37℃摇床，260rpm振摇培养60min完成重组及抗性复苏。将菌液离心沉淀菌体，吸弃大部分上清液，吹打重悬，全部涂布于含有氯霉素的LB平板，将平板放置于37℃培养箱培养16h。
4)含有目标基因的重组质粒的鉴定
从平板上挑取菌落，接种于5mL含有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，260rpm振摇培养16h后，取3mL菌液用质粒小提试剂盒抽提质粒并进行限制性内切酶酶切鉴定(酶切体系见表4)，37℃反应4h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果，鉴定正确的质粒送华大基因公司进行测序，重组质粒分别命名为pBAD-ClyA-PlpE。
表4双酶切反应体系
质粒测序鉴定：将酶切鉴定成功的质粒送生物公司进行DNA序列测定，用DNAMAN软件拼接测序结果，并进行比对分析。鉴定成功后将剩余菌液扩大培养3～4h，之后与50％甘油溶液按1:1比例加入冻存管，-80℃保存。
采用双酶切对重组质粒进行鉴定，如图1所示(其中泳道1、2：pBAD-ClyA空载、重组pBAD-ClyA-PlpE质粒；M：DL10,000DNA Marker；)，对比DL10000Marker大小，可见电泳所得条带大小与预期值相符，其中PlpE基因969bp，pBAD-ClyA质粒约7000bp。上海生工生物科技有限公司对质粒核苷酸序列测定，测序结果用DNAMAN软件对比分析，结果与预期序列完全一致。
重组表达菌的构建及鉴定
JC8031株大肠杆菌感受态的制备，步骤如下：
无抗性LB平板上划线复苏JC8031株大肠杆菌，置于37℃培养箱中培养16h，挑取单个菌落接种于装有1mL无抗性LB液体培养基试管中，置于37℃220r/min摇床中，培养12h。
以1:100的比例将处于对数期的菌液接种于25mL无抗体的LB液体培养中，37℃，220r/min培养4～5h，至菌液OD600值为0.5～0.7。
取出菌液冰浴30min后，置于离心机中4℃，4000rpm条件下离心10min，收集沉淀。
加入5mL 0.1mol/L浓度的预冷CaCl2溶液，轻微重悬，再次冰浴30min后，4℃，4000rpm离心10min，并重复此步骤。加入1mL预冷的甘油-CaCl2溶液(含15％甘油)，重悬沉淀后，用1.5mL离心管分装，每管100μL，置于-80℃保存备用。
参照实施例1：3)中化学转化法将重组质粒和空载质粒分别转入JC8031感受态细胞中。
参照实施例1：4)方法对重组表达菌进行质粒酶切鉴定、测序鉴定。此外采用SDS-PAGE法鉴定对重组细菌进行蛋白分离鉴定，确保质粒正确表达，具体操作步骤如下：
样品制备：于试管中扩大培养5mL菌液约6h，在OD600值在0.5～0.7之间加入20wt％L-Arabinose诱导过夜。诱导完成后取1mL菌液，4000rpm，4℃离心5min，舍弃上清。加入80μLPBS缓冲液和20μL 5×蛋白Loading Buffer，轻轻吹打重悬。沸水浴5～10min，冷却至室温备用。
胶板制备参考试剂盒使用说明：配制10％SDS-PAGE凝胶，快速混匀并移至分离胶上部间隙中，插入梳子，等待15min。
蛋白电泳：将胶板安装至电泳槽中，注入电泳缓冲液，向胶孔中加入样品，开始跑胶，程序为90V、20min，120V、40min。
染色：将跑好的胶取出，切除多余部分，置于盒子中，加入快速考马斯亮蓝染液没过胶面，染色30min。
成像：将染色胶置于凝胶成像仪中，选择模式拍照。与蛋白Maker条带对比分析条带正确性。鉴定成功后命名为pBAD-ClyA-PlpE,并将菌液扩大培养3～4h，之后与50％甘油甘油溶液按1:1比例加入冻存管，-80℃保存。
诱导表达后的重组菌进行全菌SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，结果如图2所示(其中泳道1、2：JC8031-ClyA未加诱导剂对照、JC8031-ClyA诱导表达；其中泳道3、4：JC8031-PlpE未加诱导剂对照、JC8031-PlpE诱导表达；)，以空载菌作为对照，可见明显的蛋白条带，且蛋白大小(70.6KDa)与预期一致。根据重组细菌蛋白表达的情况说明，pBAD-ClyA-PlpE质粒能够在大肠杆菌JC8031株感受态中表达，且条带明显表达量高。这说明重组表达菌构建成功。将构建成功的重组表达菌命名为JC8031-PlpE，空载表达菌命名为JC8031-ClyA。
实施例2
制备外膜囊泡
1)用实施例1中的重组表达菌JC8031-PlpE制备外膜囊泡
将保存于-80℃的重组菌株取出，置于4℃解冻，培养细菌制备OMVs，具体操作步骤如下：
用接种环蘸取解冻后的两组重组菌液，在氯霉素抗性的培养皿上呈三角形分级划线复苏细菌。
用接种环挑取单个菌落，接种于盛有10mL氯霉素抗性LB液体培养基的试管中，置于条件为220rpm的37℃摇床中，培养过夜。
再按1:100的比例接种到1000mL氯霉素抗性LB液体培养基中，培养至菌液OD600值在0.5～0.7之间。按1:100的比例加入诱导剂20wt％L-Arabinose溶液。同样置于条件为220rpm的37℃摇床中，培养约16h。
4℃，7500rpm，15min离心收集上清，去除沉淀。
在冰浴条件下，将收集到的上清用0.45μm孔径的滤器过滤2次，充分去除菌体。
将上步上清注入超离管中，使用超速离心机在40000rpm、4℃的条件下离心2h。弃上清，将附着于管壁的沉淀用PBS缓冲液冲洗重悬，获得OMVs。此处获得的OMVs作为疫苗进行后续实施例的实验。再将重悬液涂于无抗性LB琼脂平板，进行无菌鉴定后，-20℃贮存。
2)外膜囊泡形态的电镜观察
取纯化的OMVs样品，进行复染后在电子显微镜下观察形态结构。
结果如图3所示，OMVs结构完整，为球形双层纳米结构，直在20～300nm之间，符合预期大小。说明大肠杆菌JC8031株具有高效的OMVs生产能力。
3)BCA法测定外膜囊泡总蛋白浓度。
根据试剂盒说明书，事先配制BSA标准液和BCA工作液，将收集的OMVs稀释一倍，然后用微孔板检测方法进行检测，具体操作如下：
稀释BCA标准品：取标准品分别稀释到最终浓度分别为：2000ug/mL、1000ug/mL、500ug/mL、250ug/mL、125ug/mL。
分别将每个25μL的待检测样品与每个标准品添加于96孔板的微孔中，各孔加入200μLBCA工作液，充分混匀，37℃培养箱中避光静置30min。用酶标仪测定A562nm，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
根据BCA法试剂盒的操作步骤绘制标准曲线(图4)，测定OMVs的总蛋白浓度，结果外膜囊泡总蛋白浓度为OMV-PlpE 3.07μg/μL、OMV-ClyA 2.98μg/μL。
4)外膜囊泡中目标蛋白的鉴定
采用Western-blot对OMV-PlpE进行鉴定，确保样品OMVs能够呈递目标蛋白。具体操作如下：
根据上述步骤先进行10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。同时配制所需试剂：转膜液：取转膜粉加入200mL无水乙醇，用蒸馏水定容至1L，4度冷藏备用。PBSTbuffer：将20×PBSTbuffer稀释为1×PBST。封闭缓冲液：称取5％脱脂奶粉5g，加入PBSTbuffer 100mL，现配现用。
转膜：本发明采用的湿转法，转印液在4℃冰箱提前预冷，SDS-PAGE凝胶转移到转印液中浸泡，按目的蛋白凝胶的大小裁剪PVDF膜，M蛋白分子量较小，使用孔径为0.45μm的PVDF膜。转印条件为恒流220mA转膜1h。
转印结束后取出PVDF膜，用5％脱脂奶粉室温封闭2h(或者4℃过夜)。将His标签蛋白单克隆抗体用一抗稀释液以1:1000的比例稀释，室温孵育1h；然后用TBST在室温下摇床上洗膜3次，每次10min。以1:10000的比例稀释山羊抗鸭IgG，室温下孵育1h；弃去二抗，用TBST洗膜3次，每次5min。将超灵敏ECL化学发光试剂盒中的A液和B液以1:1的比例混合，用滤纸吸尽PVDF膜上残留的TBST，将膜放入Azure C600成像系统工作台上，膜上滴加发光液，调整仪器的参数进行曝光。
根据Wstern-blot结果(图5)可见，重组表达菌所表达的多杀性巴氏杆菌目的保护性抗原蛋白能够定位于细菌外泌的OMVs上，且具有较好的反应原性。
实施例3
番鸭免疫攻毒保护实验
灭活疫苗的制备：将PMWSG-4分离株(已在非专利文献中公开，文献名称为Immunogenicity and protective efficacy of the recombinant Pasteurellamultocida lipoproteins VacJ and PlpE,and outer membrane protein H fromP.multocidaA:1in ducks，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放该生物材料)复苏后并进行平板计数，菌液浓度为8.71×109/mL CFU；在计数后的菌液中慢加入终浓度为0.5％甲醛溶液，180rpm灭活24h；灭活后的菌液4000rpm离心，弃上清，加入20mL无菌PBS重悬，取200μL重悬液涂TSA平板，检测是否灭活成功；在灭活成功的PBS重悬液与单相油包水佐剂以2:3的比例混合，用乳化仪乳化成“油包水”状，4℃保存备用。
重组43.1a-PlpE蛋白的制备：从菌株PMWSG-4基因组中扩增出PlpE基因，利用同源重组原理将纯化的PlpE片段连接到pET43.1a载体上。用含有氨苄青霉素(50mg/ml)的LB平板筛选转化子细胞，重组质粒经PCR和限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析验证。将正确的菌液扩大培养后加入终浓度为1mM加入异丙基-b-d-半乳糖糖苷(IPTG)，在25℃以200rpm孵育12时条件下诱导表达。离心收集细胞，用PBS缓冲液重悬菌液并超声破碎。通过镍亲和层析法进行蛋白纯化，使用PBS缓冲液(含250mM咪唑)洗脱蛋白。
43.1a-PlpE油苗的制备：根据测定的重组43.1a-PlpE蛋白的浓度，将重组43.1a-PlpE蛋白用PBS缓冲液稀释至适当的浓度，以确保每0.2mL疫苗含100μg重组43.1a-PlpE蛋白，与单相油包水佐剂以2:3的比例混合，用乳化仪乳化成“油包水”状，4℃保存备用。
自广东温氏食品有限公司购买1周龄番鸭120只，随机分为6组，每组20只。第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分别颈部皮下免疫OMV-PlpE、OMV-ClyA和43.1a-PlpE油苗，免疫剂量为100μg/只，免疫体积为0.2mL/只。第Ⅳ组免疫多杀性巴氏杆菌菌株PMWSG-4灭活疫苗，颈部皮下免疫0.2mL。第Ⅴ和第Ⅵ组颈部皮下注射0.2mL PBS。免疫14天后，相同方式加强免疫1次。分别于免疫前，一免后7天、14天，二免后7天、14天颈部静脉采血(n＝10)，分离血清于-80保存。此外，于一免后14天，二免后14天，采集每组番鸭脾脏(n＝3)，用于后续细胞因子水平检测。二免后14天后分别第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组番鸭进行血清型A型菌株PMWSG-4(基因组NCBI登录号为NZ_CP077723.1)腿部肌肉攻毒，剂量为30LD50/0.5mL。攻毒后24h，采集每组心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织进行组织细菌载量检测。攻毒后连续观察14天，按时记录番鸭发病与死亡情况。
表5番鸭免疫攻毒保护试验及分组
1)番鸭血清抗体检测。
采用间接ELISA检测采血清中抗体水平。具体操作步骤如下：
包被抗原：用包被液将纯化好的PlpE蛋白稀释至0.25ug/mL，100μL每孔滴加到洁净的酶标板中，4℃包被过夜；
洗涤：弃去包被液，用PBST洗板3次，每次每孔300μL，洗涤后甩干；
封闭：在酶标板中每孔加入300μL配置好的5％脱脂奶粉，置于37℃封闭1h。洗涤：同步骤(2)；
孵育一抗：甩干孔内残留的液体，将待测血清用PBST经1：4000稀释后，在酶标板中每孔加入100μL，置于37℃孵育1h。洗涤：同步骤(2)；
孵育二抗：甩干孔内残留的液体，将HRP标记的山羊抗鸡酶标二抗用PBST
经1：5000稀释后，在酶标板中每孔加入100μL，置于37℃孵育1h。洗涤：同步骤(2)；
显色：甩干孔内残留的液体，加入TMB底物，每孔100μL，置于37℃孵育15min；
终止显色：加入2M H2SO4，每孔50μL；
读数：迅速将酶标板放入酶标仪中，读取OD450读数。
结果如图6所示，免疫后14d，所有免疫组均产生抗体，其中43.1a-PlpE、OMV-PlpE组血清IgG水平显著升高，与空白对照差异极显著(p<0.001)。从抗体水平看OMV-PlpE和43.1a-PlpE都可以引起较高的体液免疫反应。
2)番鸭脾脏组织细胞因子水平检测。
将采集的脾脏组织提取RNA，用实时荧光定量PCR方法检测细胞因子(IL-2，IL-4，IL-10，IFN-γ，GAPDH)的相对表达量。按照如下体系配置反应液：7.2μL dd H2O，10μL 2×One Step SYBR GreenMix,1μL One Step SYBR Green Enzyme Mix,1μL RNA模板,上下游引物各0.4μL(工作浓度:10μmol/L)。反应条件如下：逆转录(50℃3min)，预变性(95℃30s)，PCR扩增过程(95℃10s，60℃30s，40个循环)，采集荧光信号过程(95℃15s，60℃60s，95℃15s)。所用引物序列如表6所示：
表6细胞因子引物
结果如图7所示，免疫后28d，OMV-PlpE皮下免疫组脾脏IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平均高于空白对照组，差异极显著(p<0.001)。OMV-ClyA免疫组在免疫后28d脾脏IL-4、IL-10和IFN-γ水平均高于空白对照组，差异极显著(p<0.001)。43.1a-PlpE免疫组和灭活疫苗组免疫后28d，脾脏IL-2和IL-10水平高于空白对照组，差异极显著(p<0.001)，其他细胞因子水平与对照组无明显差异。IL-2和IFN-γ是Th1型细胞因子，在促进T细胞介导的免疫反应起到免疫杀伤的作用；IL-4和IL-10属于TH2细胞因子，促进体液免疫反应。根据结果显示，重组43.1a-PlpE和灭活疫苗主要引起体液免疫反应，而本发明所制备的OMV疫苗除了引起机体体液免疫反应外，还能刺激机体产生Th1型和Th2型细胞免疫反应。
番鸭免疫攻毒保护实验结果
在二免14天后对番鸭进行多杀性巴氏杆菌攻毒。结果如表7和图8所示，空白对照组(Ⅵ)鸭没有出现任何异常症状；攻毒对照组(Ⅴ)鸭在攻毒后出现精神萎靡，行走困难，食欲不振的临床症状，并于攻毒后第1天开始出现死亡，于攻毒后第2天全部死亡；OMV-ClyA免疫组(Ⅱ)鸭在攻毒后也出现精神萎靡等临床症状，并于攻毒后第1天开始出现死亡，于攻毒后第4天全部死亡；OMV-PlpE免疫组(Ⅰ)组鸭均未出现任何异常症状。43.1a-PlpE组(Ⅲ)仅在攻毒后第二天死亡一只，后续未出现死亡情况。灭活疫苗(Ⅳ)从第二天出现死亡，持续至第五天，后续未出现死亡。从攻毒后的保护率来看，灭活疫苗具有58.3％的保护率，43.1a-PlpE组具有91.7％的保护率，而OMV-PlpE免疫组保护率为100％，高于灭活疫苗组和43.1a-PlpE组。说明本发明制备的重组OMV疫苗具有很好的保护效果。
表7.攻毒后鸭的死亡情况及保护率
4)攻毒后各组织细菌载量检测
将采集的心、肝、肺和十二指肠等组织提取RNA，根据多杀性巴氏杆菌特异性基因KMT1设计引物F:5'-TAACGGCAGAGCGGTTTAAT-3'(SEQ ID NO.14),R:5'-GCTGTAAACGAACTCGCCA-3'(SEQ ID NO.15)，用实时荧光定量PCR方法检测细菌载量，反应体系及程序同上述2)番鸭脾脏组织细胞因子水平检测所述。
结果如图9所示，攻毒对照组和OMV-ClyA组各组织细菌载量均高于空白对照组，差异极显著(p<0.001)。灭活疫苗组心脏、肝脏和肺脏组织细菌载量高于空白对照组，差异显著(p<0.05)。OMV-PlpE皮下组和43.1a-PlpE组各组织细菌载量水平与空白对照组无明显差异。与灭活疫苗组相比，本发明所制备的OMV-PlpE疫苗在心脏、肝脏和肺脏组织中显著降低细菌在组织上的定植，保护机体免受细菌侵袭。
由上述实施例可知，本发明提供的包含多杀性巴氏杆菌抗原基因的重组载体，携带的多杀性巴氏杆菌抗原基因能够成功表达，为后续递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡的制备提供了条件。本发明提供的重组菌株所表达的多杀性巴氏杆菌目的保护性抗原蛋白能够定位于细菌外泌的外膜囊泡上。使用本发明的重组OMV免疫番鸭后能够激发高效的特异性免疫反应，能够诱导机体产生较高的特异性抗体，既能引发体液免疫又能引发细胞免疫，且引起的免疫水平优于灭活疫苗和重组43.1a-PlpE疫苗。本发明的重组OMV疫苗能有效减少细菌在各组织上的定植，保护机体免受细菌的侵袭。此外，本发明的重组OMV疫苗具有很好的免疫保护效果，保护率为100％，保护效果优于灭活疫苗和重组43.1a-PlpE疫苗。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
1)将能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组菌株接种于液体培养基中进行培养，得到预培养菌液；
2)将步骤1)所述预培养菌液加入诱导剂进行诱导培养，离心，收集上清液；
3)将步骤2)所述的上清液依次进行过滤除菌、超速离心，收集固相组分，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的液体培养基包括氯霉素抗性的LB液体培养基；步骤2)中所述的诱导液体培养基包括添加20wt％的L-Arabinose溶液的氯霉素抗性的LB液体培养基。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述收集固相组分后，还包含将收集的固相组分进行重悬，获得递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述重组菌株包含能够表达多杀性巴氏杆菌抗原的重组载体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组菌株以大肠杆菌JC8031作为出发菌株。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重组载体以pBAD-ClyA作为初始载体。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，编码所述多杀性巴氏杆菌抗原的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法制备得到的递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡。
9.权利要求8所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡在制备多杀性巴氏杆菌疫苗中的应用。
10.一种多杀性巴氏杆菌疫苗，其特征在于，含权利要求8所述递呈多杀性巴氏杆菌保护性抗原的外膜囊泡和药学上可接受的辅料。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117462664A (zh) * 2023-10-29 2024-01-30 浙江省农业科学院 一种多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104163858A (zh) * 2013-05-16 2014-11-26 普莱柯生物工程股份有限公司 多杀性巴氏杆菌无细胞抗原、制备方法及其应用
CN105497885A (zh) * 2014-09-25 2016-04-20 普莱柯生物工程股份有限公司 一种亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN110272910A (zh) * 2019-06-25 2019-09-24 四川农业大学 一种包括jev抗原基因的重组载体、重组菌株和递呈jev抗原的外膜囊泡及其应用
EP3725371A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-21 BiOMVis Srl Method for the production of outer membrane vesicles and immunogenic compositions thereof
CN112342156A (zh) * 2020-10-22 2021-02-09 浙江省农业科学院 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104163858A (zh) * 2013-05-16 2014-11-26 普莱柯生物工程股份有限公司 多杀性巴氏杆菌无细胞抗原、制备方法及其应用
CN105497885A (zh) * 2014-09-25 2016-04-20 普莱柯生物工程股份有限公司 一种亚单位疫苗及其制备方法和应用
EP3725371A1 (en) * 2019-04-18 2020-10-21 BiOMVis Srl Method for the production of outer membrane vesicles and immunogenic compositions thereof
CN110272910A (zh) * 2019-06-25 2019-09-24 四川农业大学 一种包括jev抗原基因的重组载体、重组菌株和递呈jev抗原的外膜囊泡及其应用
CN112342156A (zh) * 2020-10-22 2021-02-09 浙江省农业科学院 一种波氏杆菌外膜囊泡的制备方法及应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIN-RU WU ET AL.: "Protective immunity conferred by recombinant Pasteurella multocida lipoprotein E (PlpE)", 《VACCINE》, vol. 25, 20 March 2007 (2007-03-20), pages 4140 - 4148 *
KUI XU ET AL.: "A trivalent Apx-fusion protein delivered by E. coli outer membrane vesicles induce protection against Actinobacillus pleuropneumoniae of serotype 1 and 7 challenge in a murine model", 《PLOS ONE》, vol. 13, no. 1, 26 January 2018 (2018-01-26), pages 0191286, XP055874999, DOI: 10.1371/journal.pone.0191286 *
SANDRO ROIER ET AL.: "Immunogenicity of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica outer membrane vesicles", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MEDICAL MICROBIOLOGY》, vol. 303, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 247 - 256 *
WU, J.R. ET AL.: "Pasteurella multocida strain X-73 lipoprotein E (plpE) gene, complete cds，GenBank: EF219452.1", 《GENBANK》, 17 May 2007 (2007-05-17), pages 1 *
易洁等: "革兰氏阴性菌外膜囊泡作为亚单位疫苗的研究进展", 《微生物学报》, vol. 56, no. 6, 31 December 2016 (2016-12-31), pages 911 - 921 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117462664A (zh) * 2023-10-29 2024-01-30 浙江省农业科学院 一种多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用
CN117462664B (zh) * 2023-10-29 2024-09-03 浙江省农业科学院 一种多杀性巴氏杆菌外膜囊泡的制备方法及其应用

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