JPH11505512A

JPH11505512A - マクロファージを調製する方法、ならびにそのためのキットおよび組成物

Info

Publication number: JPH11505512A
Application number: JP8522679A
Authority: JP
Inventors: ローム−ルモン，ジャン−ルー; チョクリ，モハメッド
Original assignee: I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Current assignee: I.D.M.IMMUNO−DESIGNED MOLECULES
Priority date: 1995-01-24
Filing date: 1996-01-24
Publication date: 1999-05-21
Anticipated expiration: 2016-01-24
Also published as: EP0806959A1; US6221576B1; US6140122A; DE69624789D1; ES2185759T3; CA2210449C; DE69624789T2; AU4626596A; ATE227579T1; FR2729570A1; AU720285B2; CA2210449A1; EP0806959B1; WO1996022781A1; US5804442A; FR2729570B1; JP3537443B2

Abstract

(57)【要約】場合により活性化された、マクロファージ、および／または高い抗原提示能を有する単球に由来する細胞を含有する組成物を調製する方法であって、出発組成物中の単球を培養するが、この工程に、出発組成物からの単球以外の成分の少なくともいくつかを、そのような成分に対する抗体を用いて除去する工程を先に行うか、および／または後に続けて行い、そして／あるいは水簸を後に続けて行う。該方法を実施するための組成物およびキットも開示される。

Description

【発明の詳細な説明】マクロファージを調製する方法、ならびにそのためのキットおよび組成物本発明は、マクロファージ、具体的にはヒトのマクロファージ、特に活性化マクロファージ（細胞傷害性マクロファージとも呼ばれる）、または抗原提示のためのマクロファージ（または単球もしくはそれらの前駆細胞に由来する他の細胞）を調製する方法、ならびにこの方法に用い得るキットおよび組成物に関する。マクロファージは、抗腫瘍性応答に主な役割を果たし、癌細胞に対する免疫学的活性化因子によって、活性化することができる（Adams D．and Hamilton T.: Activation of macrophages for tumor cell kill: effector mechanism and re gulation．In Heppner & Fulton（編者），Macrophages and cancer． CRC Pres s，1988， p.27; Fidler I.:Macrophages and metastases．A biological appro ach to cancertherapy．Cancer Res．45:4714，1985）。さらに、マクロファージ、または単球もしくはそれらの前駆細胞に由来する他の細胞は、エンドサイト−シス、消化および表面抗原提示のためのその強い能力によって、特異的な免疫応答を誘導することができる。このようにして、それらは、ワクチン、より具体的には細胞性自家ワクチンの調製のための優れた候補を代表する。特異的免疫応答を特異的に誘導できる抗原をそれらの表面に提示するマクロファージ、または単球由来の他の細胞を、以下の文脈中ではＭＤ−ＡＰＣ（単球由来抗原提示細胞）と呼ぶ。ＭＤ−ＡＰＣは、患者または健康な個体から採取した単核細胞（単球またはそれらの前駆細胞）を１種類（もしくは数種類）の抗原の存在下で培養することによって得られ、それらは培養期間の終りに得られる細胞表面上の断片として発現されることが望ましい。上記の単核細胞とともに培養し得る抗原は、例えば、腫瘍細胞により発現されるか（特に死滅腫瘍細胞の断片）、または病原体により発現される（特に細菌もしくはウイルスタンパク質の断片）抗原である。こうして得られたＭＤ−ＡＰＣは、単核細胞と同時培養した抗原に関連した病状に対するワクチン（特に腫瘍またはウイルス性疾患に対するワクチン）の調製、より詳しくは、出発単核細胞を採取した患者に投与するのが好都合な、自家細胞性ワクチンの調製に用いられる。ＭＤ−ＡＰＣは、上記に定義したもののような抗原断片をコードするＤＮＡ配列による、培養に付された上記の細胞、または培養後に得られる分化した細胞、特にマクロファージのトランスフェクションによって得ることもできる。特に著しい細胞傷害活性を示すマクロファージ［活性化マクロファージまたはＭＡＫ（商品名）とも呼ばれる］、ならびに該マクロファージを得るための培養培地および方法が、１９９３年５月１８日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ９３／０１２３２号の主題であった。上記国際特許出願に定義されたマクロファージを調製する方法は、アフェレーシスによって健康な個体から得た血液細胞に冨む組成物を用いて実施され、１．２５−ジヒドロキシルビタミンＤ₃およびＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）を含有する培養培地での単球培養の工程を含む。好都合には、単球をリンパ球の存在下で約６〜７日間培養し、こうして得られた分化したマクロファージを、培養培地へのγインターフェロン（ＩＦＮ−γ）の添加によって活性化する。この培養工程には、今日までに記載されたマクロファージを得るためのすべての手順においてと同様に、アフェレーシスで得られた血液に由来する組成物に含まれる、単核細胞の部分と、別の赤血球、顆粒球の部分および血小板の部分の分離の工程；ならびに先に行った前記分離工程の後に残留する血小板部分および抗凝固剤の洗浄による除去の工程が先行する。上記の赤血球および顆粒球の分離工程は、特に約１．０〜約１．３g/mlの比重を有する溶液、例えば１．０７７g/mlの比重を有するFicoll Paque溶液(Pharmac ia)中の密度勾配による、単球を含有する培地の遠心分離によって実施するのが一般的である。上記の国際特許出願では、血液に由来する組成物は、アフェレーシスによって得られ、約２００mlの体積中に約７〜９×１０⁹個の白血球を含有する。密度勾配での遠心分離による赤血球および顆粒球の分離工程の後、培養に付された細胞性懸濁物の組成物は、こうして約５００〜１，０００mlの体積中に：ヘマトクリット（赤血球）：該組成物中に存在する白血球数の＜０．１％血小板：＜１０¹⁰個白血球：３〜５×１０⁹個リンパ球：該組成物中に存在する白血球数の５０〜７０％単球：該組成物中に存在する白血球数の３０〜５０％多核球（または顆粒球）：該組成物中に存在する白血球数の＜５％を含有する。培養工程で予め実施される赤血球および顆粒球の除去は、特に、顆粒球が、培養工程の際にマクロファージへの単球の分化を全体的または部分的に阻害することが多いという事実のために、不可欠の工程であると常に考えられている。この阻害は、主として、赤血球、顆粒球および血小板が、それら自身の代謝のために培養培地の成分を用い、こうして単球の発育に必要な備蓄を使い果たし、培養工程が完了できない（通常約６〜７日を要する）ような比率の培養培地の酸性化に至るという事実によると思われる。さらに、顆粒球および血小板は、マクロファージの機能性に対するサプレッサー因子、例えばＴＧＦ（トランスフォーミング成長因子）およびプロスタグランジンを分泌することが特に多いと思われる。したがって、たとえこの分離が、分離前の培地中に存在する単核細胞の約２０〜約５０％、特に約３０％の除去に至るとしても、顆粒球、およびできるだけ多くの血小板を単球から、後者との培養に付す前に分離しなければならないことが、現在では認められている。本発明は、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを得るための新規な方法であって、今日まで記載された最も簡単な手順であり、マクロファージを得るための今日まで記載されたすべての方法のうち、最良の結果を与える方法を提供することを目的とする。本発明はまた、この方法を実施するためのキット（またはケース）を提供することも目的とする。本発明は、本方法の異なる工程を制御するため、特に本発明の方法の出発組成物の単球、および場合によりその他の成分の含有量を制御するため、ならびに求める最終組成物中の、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの含有量を制御するための、内部対照として用いることができる組成物を、該キットの使用者に提供することも目的とする。下記の図面を援用して、本発明を説明する： −図１は、血小板の除去、およびアフェレーシスの産物の洗浄のための組立てを表し、 −図２は、マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを得るための単核細胞の培養の組立てを表し、 −図３は、水簸系の組立てを表す。本発明は、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを得るための方法であって、血液に由来し、アフェレーシスによって得られた組成物中に存在する、一方の赤血球および／または顆粒球部分と、もう一方の他の白血球、特に単球部分との、物理的手段、特に上記の方式での密度勾配での遠心分離による分離の工程を含まない方法に関する。本発明は、特に、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを含有する組成物を調製する任意の方法に関し、血液細胞、具体的には白血球、例えば単球、または後者の前駆細胞に富む、ヒトを起源とする血液に由来する組成物、特にアフェレーシスによって得られるもののような、血液に由来する組成物から開始して、該手順が下記の工程： −好都合には、適切な生理的溶液を用いて、血液に由来する該組成物を、特に後者の体積の約２〜３倍に希釈する工程、 −血液に由来する該組成物を洗浄し、好都合には単なる遠心分離により、該遠心分離から生じた沈降物を、適切な生理的洗浄液中の該沈降物の、特に袋（移送型の）袋中の、例えば該袋に対する圧力によって実施する回収の後に、洗浄し、こうして洗浄液をもう一つの袋または他の容器へと除去して、存在し得る抗凝固剤、種々の残渣および血小板を枯渇させた組成物を回収する工程、 −場合により、上記の、洗浄工程を特に１〜２回の反復する工程、 −上記洗浄工程の後に得られた血液に由来する組成物に含まれる細胞を、特に、好都合には疎水性の袋の中の、適切な培養培地に該細胞を約６日〜１０日間（特に約６〜７日間）入れることによって培養する工程、を包含することを特徴とする方法に関する。この培養工程は、場合により、上記の特定の抗原の存在下で、すなわちＭＤ−ＡＰＣ生産の場合は、特に腫瘍細胞または病原体に特徴的な抗原の存在下で実施し、該培養培地へのγインターフェロンのような活性化因子の添加により、培養培地中に得られたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの活性化工程を続けることもでき、該活性化因子を培養培地の内容物と約１６〜２４時間接触させ、この培養、および場合により活性化の工程は、特に上記に示した手順に従って、培養培地の遠心分離、および該遠心分離から生じた沈降物の洗浄を続けて行うこともでき、この培養、および場合により活性化の工程は：・単球またはそれらの前駆細胞以外の、出発組成物中に存在することが多い成分、特に血小板、赤血球、顆粒球およびリンパ球の全部または一部を、該培養工程の先に行われる洗浄工程後に得られた血液に由来する組成物を、上記の成分の全部または一部に対する抗体と接触させ、上記の成分の全部または一部が該抗体に固定されたまま、単球またはそれらの前駆細胞を含有する溶液を回収することによって除去する工程を先に行い；・ならびに／あるいはマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣ以外の成分の全部または一部を、該培養工程後に得られた血液に由来する組成物を上記のような抗体と接触させ、上記の成分の全部または一部が該抗体に固定されたまま、マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを含有する溶液を回収することによって除去する工程を次に行い；・ならびに／あるいは、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを、該培養工程、およびあり得る上記活性化工程の後に得られた組成物のその他の成分から、特に血小板、赤血球およびリンパ球から物理的手段によって分離する、特に水簸によって精製する工程を続けて行う。本発明は、この分野での公知の考えとは対照的に、制御された量の赤血球、リンパ球、顆粒球および血小板を培養培地が含むときは、単球またはそれらの前駆細胞のマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣへの培養を好結果で完了させることができることを示している、本発明者らが見出したことに基づいている。したがって、本発明は、アフェレーシスによって得られた血液に由来する組成物に含まれる、一方の単核細胞、より具体的には単球の部分と、もう一方の赤血球、顆粒球（および血小板の全部ではないにしても大多数）の部分との、高価で（非常に複雑な材料を要する）時間のかかる物理的手段による分離の工程を省くことができる、マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを得る方法を使用できるという利点を提供する。好都合には、本発明の上記の方法では、ヒト起源の血液に由来する出発組成物、すなわち血液細胞に富む細胞懸濁物の組成物、例えばアフェレーシスから、かつ上記の手順中の培養工程に先行する洗浄工程の前に生じたそれは、該組成物中に存在する白血球の数の約５％より高い、特に約１０〜３０％より高い比率の単球を含むような組成物である。そのような出発組成物は、患者に対して実施されるアフェレーシスの方法を実施に移すことによって好都合に得られるが、この方法は、特に、場合により本明細書で上記および以下に定義したような出発組成物を得るために適応させた方法に従って、いかなる当業者にも公知である任意の手法に従い、かつ任意の材料を用いても実施される。好都合には、上記のヒト起源の血液に由来する出発組成物は、約３％までの赤血球を含むことができ、好ましくは、該組成物中に存在する白血球の数の約１％未満、特に０．３〜０．５％の比率の赤血球を含むようなものである。好都合には、上記のヒト起源の血液に由来する最初の組成物は、下記のようなものである： −血小板の数が、約１５０〜約２００mlの体積中に約２×１０¹¹〜約６×１０¹¹ であり、 −白血球の数が、約１５０〜約２００mlの体積中に約５×１０⁹〜約５×１０¹ ⁰ であり、 −リンパ球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約６０〜約８０％であり、 −単球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約３０％であり、 −顆粒球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約２０％である。出発組成物の洗浄工程は、好ましくは２回繰り返され、血小板の一部、および場合により、最初の組成物を得る工程、特にアフェレーシスのそれの際に用いた試薬、例えば抗凝固剤の実質的な除去を可能にする。好都合には、この工程の間に除去される血小板の百分率は、約８０〜約９０％である。最初の組成物の洗浄工程後に得られる組成物は、好都合には、約６００mlの体積中に下記の成分を含む： −ヘマトクリット：該組成物中に存在する白血球数の０．２〜０．４％、 −血小板：約２〜約６×１０¹⁰個、 −白血球：約４×１０⁹〜約４×１０¹⁰個、 −リンパ球：該組成物中に存在する白血球数の約６０〜約８０％、 −単球：該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約２０％、 −多核球：該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約１５％。本発明の方法の好適実施態様によれば、単球またはそれらの前駆細胞のマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣへの培養および分化の工程は、単核細胞、すなわち単球またはそれらの前駆細胞およびリンパ球、ならびに赤血球（適量、特に上記に示した比率の）、顆粒球および血小板を含むヒト起源の血液に由来する組成物から実施するが、該培養工程は、特に、出発組成物、例えば上記のそれの洗浄工程後に得られた組成物から始めて実施する。培養工程自体に関しては、改変ＩＭＤＭ(Iscove改変ダルベッコ培地、Gibco) 、すなわちＬ−グルタミン(２mM、Gibco)、または好都合にはＬ−アラニル−Ｌ −グルタミン(２mM、Gibco)、ピルビン酸(２mM、Gibco)、インドメタシン(５× １０^-6M 、Sigma)、メルカプトエタノール(３×１０^-5M 、Gibco)および非必須アミノ酸(２％、Gibco)を加えた、Iscoveが改変したダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に基づく特別な即時使用可能な培養培地中で、約６〜約１０日の間実施するのが好ましい。培養の時点で、培地は２〜５％のＡＢ⁺血清（または自家血清）ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンのような抗生物質を補充されることになる。本発明は、より具体的には、Ｌ−グルタミンに代えてＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する、上記の即時使用可能な培養培地に関する。実際、本発明者らは、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含有する上記の即時使用可能な培養培地は、後述する本発明のキットの成分群と一緒に、好都合にも４℃で保存できるが、Ｌ−グルタミン酸を含有する上記即時使用可能な培養培地は、−２０℃で保存しなければならないという証拠を示した。マクロファージへの単球の分化のためには、上記培養培地にＧＭＣＳＦおよびビタミンＤ₃を補充するのが好都合である。ＭＤ−ＡＰＣへの単球またはそれらの前駆細胞の分化のためには、上記培養培地を、上記の抗原との同時培養に用い、好都合にはＧＭＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１３、ＩＬ−４のような１種類もしくは多種類のサイトカイン、および／またはカルシトリオールおよびヒスタミンのようなアジュバントを補充する。活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを得る場合には、培養の終点の約１６〜約２４時間前に、活性化因子、例えばγインターフェロンを上記培養培地に導入するのが好都合である。上記手順の好適実施態様によれば、培養工程後に得られた細胞懸濁物の、約６００〜２，０００mlの体積中の組成は、好都合には下記のとおりである： −リンパ球：約２×１０⁹〜約２×１０¹⁰個、 −マクロファージ（またはＭＤ−ＡＰＣ）：約６×１０⁸〜約６×１０⁹個。この最終組成物は、顆粒球をほとんど、または全く含まず、大部分は培養工程の際にこわれている。上記の培養工程の収率は、好都合には、単核細胞が約８０％であり、マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣへの分化については、（出発単球の数を考慮すると）約５０〜約７０％である。上記の収率は、培養工程の後に得られたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの数と、培養前の組成物中に存在する単球の数との比として算出される。好都合には、上記の本発明の方法の好適実施態様では、上記の培養、および場合により活性化の工程に、特に水簸による精製の工程が続くが、ここで、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを、上記の培養、および場合により活性化の工程後に得られた組成物のその他の成分から、特に血小板、赤血球およびリンパ球から物理的手段によって分離する。好都合には、上記の好適な方法で実施された培養、および場合により活性化の工程に、図３に示した水簸の工程が続くが、これは下記のメカニズムを用いて実施するのが好ましい： −培養、および場合により活性化の工程後に得られる、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを含む組成物を収容する袋（図３ではＢ４で示される）、ならびに場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣが生存できる培地中に水簸系全体を収容できる、生理的溶液（水簸液とも表される）を収容する袋、および空気取入口を、フィルターを備え、３本の分枝を有する輸注器に連結する、 −一旦空気取入口を閉じたならば、蠕動ポンプが袋Ｂ４の内容物を、ローターを備え、水簸室を有する水簸装置内に吸引するが、水簸回路全体への生理的液体の供給は、水簸の全持続時間の間、水簸液を収容する袋の内容物を上記ポンプで吸引することによって確保する、 −水簸ローターの回転速度、およびポンプからの吐出は、ローターに進入する袋Ｂ４の組成物の種々の成分が、それらの大きさの関数として水簸室内に分離される；すなわち最小の大きさの成分が、該室の頂部（水簸装置の出口付近）に最初に移動し、一方最大の大きさの成分、すなわち、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣが該室の出口に最後に移動するようなものとする、 −こうして分離された袋Ｂ４内の組成物の異なる成分を、水簸装置に連結した袋内に別個に捕集する；すなわち血小板や、小さい大きさの種々の残渣を袋Ｃ１内に最初に回収し；次いで赤血球を袋Ｃ２内に、次いでリンパ球を袋Ｃ３およびＣ４内に、最後にマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを袋Ｅ１内に回収して、上記の異なるカテゴリーの成分を、それらのそれぞれの大きさの関数として、水簸装置の回転速度を減じるか、またはポンプの吐出を増大させるかのいずれかによって、水簸装置から抽出する。袋Ｅ１へのマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの回収は、水簸装置のローターを停止し、空気取入口を開くことによって実施できるのが好ましく；こうして、袋Ｅ１には、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物が、好都合には実質的に純粋な形態で含んでいる。上記の好適な方法の変法として、マクロファージもしくはＭＤ−ＡＰＣへの単球またはそれらの前駆細胞の培養および分化の工程には、最初の組成物の洗浄工程後に得られる組成物中に含まれることが多い、単核細胞以外の成分、具体的には単球以外のそれ、例えば上記のようなそれの全部または一部を除去する工程を先に行ってよく、該除去工程は、物理的手段によってではなく、上記成分の全部または一部と、該成分を認識できる抗体との免疫学的反応を実施することによって行う。上記の抗体による除去の工程は、好都合には、出発組成物の洗浄工程から生じた組成物を、固体支持体、特に最初の洗浄工程から生じた該組成物を導入できる移送型の袋の面、または他のいかなる装置の面にも固定された、抗血小板抗体および／または抗赤血球抗体および／または抗顆粒球抗体と接触させることによって実施し、該装置は、場合により、該抗体を固定した面沿いに、該組成物の循環を可能にするよう設置する。該抗体との該組成物の接触は、上記抗体の全部もしくは一部と同時に、または特に、抗血小板抗体を収容する袋、または上記のような他の装置に該組成物を導入し、次いで、抗赤血球抗体を収容する第二の袋内に該組成物を通し、および／または抗顆粒球抗体を収容する第三の袋内に該組成物を通すことによって連続的に、のいずれかで実施し、リンパ球は、培養工程後の水簸工程の際に除去する。本発明の方法のもう一つの好適実施態様によれば、この後者は、水簸工程を包含せず、培養、および場合による活性化の工程には： −出発組成物の洗浄工程から生じた組成物を、固体支持体に、特に上記に示した方式で固定した抗血小板抗体および／または抗赤血球抗体および／または抗顆粒球抗体と接触させる工程を先に行い、該組成物と該抗体との接触は、上記抗体の全部もしくは一部と同時に、または特に上記に示した方式で連続的に、のいずれかで行い、次いで、該組成物を、培養培地を収容する袋内に移し、 −そして培養、および場合による活性化の工程から生じた組成物を、抗リンパ球抗体を収容する上記のような１個（もしくは数個）の袋、または他の装置への該組成物の導入によって、抗リンパ球抗体と接触させる工程、ならびに場合により活性化された、求めるマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を実質的に純粋な形態で回収する工程を続けて行う。好都合には、上記の好適な方法を、出発組成物を洗浄する工程から生じた組成物を抗赤血球抗体、次いで抗血小板抗体、次いで抗顆粒球抗体との連続的な接触で接触させることによって行うときは、培養工程の前にこうして得られた約６００〜約２，０００mlの体積の細胞懸濁物の組成は、好都合には下記のとおりである： −赤血球：＜０．１％、 −血小板：＜１０¹⁰個、 −白血球：約３×１０⁹〜約３×１０¹⁰個、 −リンパ球：該組成物中に存在する白血球数の約６０〜約８０％、 −単球：該組成物中に存在する白血球数の約２０〜約３０％、 −多核細胞：＜５％。上記の好適な方法では、培養工程後に得られた約６００〜２，０００mlの体積の細胞懸濁物の組成は、好都合には、培養工程以前の免疫学的反応の工程を必要としない、前記の好適な手順での培養工程後に得られた細胞懸濁物のものと同一である、すなわち −リンパ球：約２×１０⁹〜約２×１０¹⁰個、 −マクロファージ：約６×１０⁸〜約６×１０⁹個。上記培養工程の収率は、好都合には、前記の好適な手順中に記載のそれと同一、すなわち約８０％の単核細胞、およびマクロファージへの分化については（単球の開始数を考慮すると）約５０〜約７０％である。上記の方法の収率は、これらの方法を、培養工程の後の水簸により、または培養工程前および後の免疫学的反応により行うと、好都合にも同じ程度である。したがって、本発明の上記方法は、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを、実質的に純粋な形態で、特に約８０〜約９５％で、かつ約２０〜約５０％の最終収率（該収率は、最後に得られる精製マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの量と、最初に培養に付された単球の量との比として算出される）で含む細胞懸濁物を得ることができるようなものである。上記本発明の方法の特別に好都合な実施態様によれば、出発細胞懸濁物の組成、および／または上記手順の異なる工程で得られる細胞懸濁物の組成の少なくとも一つ、および／または最終細胞懸濁物の組成は、本発明の方法の追試を好適に実施するための、内部対照（internal control）と呼ばれる組成として扱うことができる。特に好都合な内部対照は、健康な個体から採取された血液から精製され、好都合には、特に凍結乾燥法で固定された、所定量の単球で構成されるものであって、その内部対照は出発組成物中に存在する単球の数の定量を可能にする。特別に好適な内部対照は、水溶液約１〜約２mlの体積中に約２×１０⁶〜約４ ×１０⁶個の凍結乾燥された単球を含むものである。最初の組成物中に存在する単球数の定量は、好都合には、出発組成物のアリコート部分を採取し、採取した分画中に存在することが多い単球を、特に、例えば放射能、酵素または蛍光によって標識化した抗体を用いて標識化し、実施された標識化を適当な任意の装置を用いて顕現し、同じ操作条件下で得られた標識化の強さを該内部対照と比較することによって行う。単球の特定の表面抗原を認識できる標識化抗体は、例えば下記の抗原：すなわちＣＤ１４、ＨＬＡＤＲおよびＣＤ６４に対するものであるのが好都合である。特別に好都合なもう一つの内部対照は、健康な個体から採取し、好都合には、特に凍結乾燥法で固定した血液からの、所定量の、場合により活性化されたマクロファージまたは精製ＭＤ−ＡＰＣから構成され、次いで１〜２ml の適切な溶液中で再構成されたものであって、その内部対照は最終組成物中に存在する、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの数の定量を可能にする。特別に好適な内部対照は、約１〜約２mlの水溶液の体積中に約２×１０⁶〜約４×１０⁶個の凍結乾燥されたマクロファージを含むようなものである。最初の組成物中に存在するマクロファージの数の定量は、最初の組成物のアリコート部分を採取し、採取した分画中に存在する単球を、特に、例えば放射能、酵素または蛍光によって標識化した抗体を用いて標識化し、実施された標識化を適切な任意の装置を用いて顕現し、同じ操作条件下で得られた標識化の強さを該内部対照と比較することによって実施するのが好都合である。マクロファージおよび／またはＭＤ−ＡＰＣの特定の表面抗原を認識できる標識化抗体は、特に下記の論文：すなわちAndreesen et al.，Biology 47: 490-49 7(1990)，Lopez et al,．Journal of Immunotherapy 11: 209-217(1992)，Chokr i et al.，Anticancer Research 12: 2257-2260（1992）に記載された下記の抗原：すなわちＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＭＡＸ−１、ＣＤ６４、ＨＬＡＤＲのうち少なくとも１種類に対する抗体であるのが好都合である。好都合には、上記の内部対照は、特に蛍光性ビーズから選ばれた、単球またはマクロファージのそれに匹敵する直径を有し、出発および最終溶液中の単球やマクロファージのそれぞれによって与えられるのと同一のシグナルを与えることができるビーズから構成される。上記本発明の方法のもう一つの特別に好都合な実施態様によれば、これらの方法を実施に移したときに得られる、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物の制御は、該組成物中のマクロファージが分泌するサイトカインの検出と、場合により測定とによって実施し、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣによるサイトカインの標準的分泌プロフィールと比較することができる。例示として、ＩＬ−１（インターロイキン１）、ＩＬ−６およびＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）のような分泌されたサイトカインの検出は、得られたマクロファージの分化および活性化が生じている培養培地のアリコート部分を採取することによって実施できる。本発明の方法によって得られた、場合により活性化されたマクロファージおよびＭＤ−ＡＰＣは、それらが腫瘍細胞を認識し、かつ殺すことができる能力について（特に細胞傷害性試験による）か、またはＭＤ−ＡＰＣの場合、それらの抗原提示能について、特にそれらが同種異系のリンパ球増殖を誘導できる能力を確認すること（例えばＭＬＲ試験、すなわち混合リンパ球反応）によって試験することができる。これらの試験は、本発明の方法の際に得られたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの機能的単位(functional unit)の数を決定するのを可能にする。本発明は、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を得るためのキット（もしくはケース）にも関し：・洗浄、培養および水簸に必要な以下に挙げるエレメント： −１個または数個の洗浄袋、 −１個または数個の、好ましくは疎水性の培養袋、 −洗浄物の上清の除去のための１個または数個のコネクターおよび針、 −前記の袋の間の１個または数個の連結管、 −場合により、洗浄および培養袋内の１個または数個の注入部位、 −洗浄袋と培養袋との間の連結の開閉を可能にする１個または数個の装置系、特に管に接するクランプの系、 −洗浄および水簸のための生理的溶液を収容する２個の袋、 −空気取入口を有する三叉輸注器、 −輸注器と水簸装置のローターとの間の連結部として働く、ローターに接するシリコンチューブおよび継ぎ手(joint)、 −クランプ系を備えた管によって、場合により互いに連結された１個（または数個）の捕集袋、 −上記の捕集袋と水簸装置のローターとの間の連結部として働く、ローターに接する管および継ぎ手・培養、分化、活性化および制御に必要な、以下に挙げる反応性物質： −１袋の特別な即時使用可能な培養培地、特に、主として改変ＩＭＤＭ、すなわちＬ−グルタミン(２mM、Gibco)またはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン(２mM 、Gibco)、ピルビン酸(２mM、Gibco)、インドメタシン(５×１０^-6M 、Sigma)、メルカプトエタノール(３×１０^-5M 、Gibco)、非必須アミノ酸(２％、Gibco)および２〜５％のＡＢ⁺血清（または自家血清）を加えた、Iscoveの改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ、Gibco)から構成される培養培地、ならびに培養の時点で加えるペニシリンまたはストレプトマイシン、 −培養培地に加えるための、下記の中から選ばれる、好都合には液体もしくは凍結乾燥形態での１種または数種の補充物：＊ＧＭＣＳＦ、＊ビタミンＤ₃、＊インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、＊ＩＬ−４、＊ＴＮＦ−α、＊ヒスタミン、 −場合により、好都合には液体または凍結乾燥形態での、γ−インターフェロンのような活性化因子、 −好都合には、好都合には固定されたか、または凍結乾燥され、場合により標識化された単球、および／または場合により活性化されたマクロファージもしくはＭＤ−ＡＰＣ、あるいは場合により、特に蛍光で標識化された、大きさの選別されたビーズを含む１種（または数種）の内部対照、 −特に蛍光で標識化された１種または数種の抗体、例えば抗原ＣＤ３（ネガティブコントロールの場合に用いるリンパ球に対するマーカー）、ＣＤ４５（白血球全般に対するマーカー）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＭＡＸ−１に対する抗体、を含むことを特徴とするキットに関する。本発明の枠組みで特別に好都合なキットは、下記の２群の形態で提供される： −第Ｉ群は、袋、管、注入部位、クランプ系および三叉輸注器、すなわち洗浄、培養、および水簸による精製に用いられる「乾燥」エレメントを含み、 −第II群は、特定の培養培地、ならびに培養、分化、活性化および品質管理のための反応性試薬を収容する袋を含む。上記のキットは、さらに下記の事項を特徴とする：・第Ｉ群は、二つの箱の形態の二つの下位群で構成される： −アフェレーシスから得られた細胞を洗浄するのに必要な材料を収容する箱Ａ、特に：＊６００mlの容量を有する３個の袋（図１に示した中央の袋Ａ１ならびに回収袋Ａ２およびＡ３）、＊アフェレーシスから生じた細胞を希釈し洗浄するために血液組成物を移送する、袋（図１の袋Ａ１）へと洗浄液を移入するための移送セット、＊洗浄した細胞（図１の袋Ａ１に収容）の培養袋（図２の袋Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）への移送セット、＊培養培地のための、最初は洗浄した細胞（図１の袋Ａ１に収容）への、次いで上記培養袋への移送セット、＊３リットルの容量を有する３個の疎水性培養袋（図２の袋Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）、 −分化したマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを、水簸工程の間に培養物中に存在する他方の細胞から分離するためのエレメントを収容する箱Ｂ、特に：＊収集袋（または図２の貯留袋Ｂ４）、＊空気取入口を有する三叉輸注器、＊シリコンチューブ、およびローターへの２個の継ぎ手、この管と２個の継ぎ手の一方とは、輪注器と水簸装置のローターとの連結部として働き、他方の継ぎ手は、該ローターと、後述する袋の群との連結部として働き、後者の管は、サンプルの採取部位を含む、＊１リットルの容量を有する４個の回収袋（図３の袋Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）と、精製されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの最終分画を収める６００mlの容量を有する袋（図３の袋Ｅ１）と、前記の袋の上清の回収のための６００mlの容量を有する袋（図３の袋Ｅ２）と、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを患者に注入するための袋（図３の袋Ｅ３）との組合せ、・第II群は、場合により温度を４℃に保つ冷却系を有する恒温箱である箱Ｃで表され、特に下記のものを包含する： −上記のとおり、最初に改変ＩＭＤＭから構成される培養培地２リットルの袋、 −下記の液体または凍結乾燥産物を収容する箱：＊抗生物質(ペニシリン、好都合には１，０００U/ストレプトマイシン、好都合には１，０００μg)のフラスコ、＊ビタミンＤ₃(好都合には４〜８μg)のフラスコ、＊ＧＭＣＳＦ(好都合には５×１０⁵〜１０⁶U)のフラスコ、＊γインターフェロン(好都合には２５×１０⁴〜５×１０⁵U)のフラスコ、＊ＩＬ−１３のフラスコ、＊ＩＬ−４のフラスコ、＊ＴＮＦαのフラスコ、＊ヒスタミンのフラスコ、 −上記の１種（または数種）の内部対照、および標識化した抗ＣＤ３、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６４、抗ＭＡＸ−１、抗ＣＤ５４、抗ＣＤ５８、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、特に蛍光で標識化したものを収容する１個または多数のフラスコを収容する箱。本発明は、水簸工程を含む本発明による上記の方法の実現のための、上記に規定したキットの用途にも関する。本発明は、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を得るためのキットであって、下記のもの： −固定された抗赤血球抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −固定された抗血小板抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −固定された抗顆粒球抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −固定された抗リンパ球抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −１個（または数個）の培養袋、 −場合により活性化された精製マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの回収のための１個（または数個）の袋、 −上記の異なる袋の間を連結する管、 −培養培地に加えるための、好都合には液体または凍結乾燥された形態での補充物、特に：＊ペニシリンおよびストレプトマイシンのような抗生物質、＊ＧＭＣＳＦ、＊ビタミンＤ₃、＊ＩＬ−１３、＊ＩＬ−４、＊ＴＮＦα、＊ヒスタミン、 −場合により、好都合には液体または凍結乾燥された形態での、γインターフェロンのような活性化因子、 −好都合には、好都合には固定され、場合により標識化された単球、または場合により活性化されたマクロファージもしくはＭＤ−ＡＰＣを含むか、あるいは場合により特に蛍光で標識化された、上記のような大きさの選別されたビーズからなる１種（または数種）の内部対照、 −特に蛍光で標識化された抗体、例えば抗原ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＡＸ−１およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を含むことを特徴とするキットにも関する。本発明は、より具体的には、免疫学的反応の工程を含む、本発明による上記の方法を実施するための、上記のキットの用途に関する。本発明は、ヒト起源の血液に由来する細胞懸濁物を含む任意の液体組成物に関し、該組成物中に存在する白血球の数の約５％、特に約１０〜約３０％より大きい比率の単球を含むことを特徴とする組成物に関する。本発明は、該組成物中に存在する白血球の数の約３％未満、または約１％未満、特に０．３〜０．５％の比率の赤血球を含むことを特徴とする、上記の任意の組成物に関する。本発明は、より具体的には、 −血小板の数が、約１５０〜約２００mlの体積中に約２×１０¹¹〜約６×１０¹¹ であり、 −白血球の数が、約１５０〜約２００mlの体積中に約５×１０⁹〜約５×１０¹ ⁰ であり、 −リンパ球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約６０〜約８０％であり、 −顆粒球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約２０％であることを特徴とする、上記の任意の組成物に関する。本発明は、より具体的には、特に約５〜１０リットルの体積の血液に対して実施される、アフェレーシスの方法で得られるような上記組成物に関する。本発明は、特に本発明による方法の実施によって、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を得るための、上記組成物の用途であって、該組成物が、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを、場合により希釈した後に、患者に投与することができ、こうして適切な注射可能液として得られる用途にも関する。本発明は、特に上記の純度の比率での、場合により活性化されたマクロファージおよび／またはＭＤ−ＡＰＣを含有し、場合により、許容され得る医薬用賦形剤と結合させて、本発明の方法を実施することによって得られるような組成物（特に医薬またはワクチン）にも関する。本発明は、本発明による方法を実施に移すという枠組み内で内部対照として用いることができる、上記の組成物にも関する。一例として、活性化マクロファージの調製の枠組み内での内部対照は、下記のように表される：内容： −凍結乾燥物１フラスコ（３×１０⁶個／フラスコ） −再構成液１フラスコ。再構成：凍結乾燥物のフラスコを再構成液の溶液１mlで再水和させる。回転によっておだやかに混合する。少なくとも１０分間待ってから、調製物を用いる。使用： −用いる内対照の体積は１００μl（３×１０⁵個の細胞）。 −試験しようとする抗体を加える。 −室温で３０分間インキュベーションする。 −ＰＢＳ１mlを加える（洗浄しない）。 −細胞蛍光測定法によって分析する。調製されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの標識化の百分率および強さを、産生された細胞と比較する。下記の表１は、貯蔵時間との関係での、内部対照として用いた凍結乾燥マクロファージの膜マーカーの成長(evolution)を示す。結果は、陽性の細胞の百分率、および標識化の強さとして表される。「対照」の欄は、本発明の手順に従って培養かつ入手された新鮮な、非凍結乾燥マクロファージで得られた結果に対応する。「７日目」の欄は、凍結乾燥され、凍結乾燥の７日後に再水和された、本発明の方法に従って得られたマクロファージに対応する。「７ケ月目」の欄は、凍結乾燥され、凍結乾燥の７ケ月後に再水和された、本発明の方法に従って得られたマクロファージに対応する。全体として、陽性の細胞の百分率、および標識化の強さは、新鮮なマクロファージと、および７日間または７カ月間凍結乾燥状態で保存されたものと、同等もしくは同様に保たれると言える。したがって、本発明のキットの使用者は、得られると思われる組成物を、キットに装備され、好都合にも同じ方法に従って製造され、そして凍結乾燥された内部対照（または標準）と比較することができる。好都合には、本発明のキットには、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの調製のための、手順の記載された書類が添付される。好都合には、本発明のキットには、方法に沿って使用者を導き、本発明の方法の各工程を有効にするための、自動化されコンピューター化された指示も付随するが、その最終的目標は、本発明の方法の実施によって得られる上記の機能的単位の数を決定することである。例示として、本発明によるキットに添付される、マクロファージを活性化する工程に関する手順の記載された書類を下記のように提供することができる：図面の説明：図１〜３で示される操作の説明は、下記のとおりである：Ｉ−アフェレーシスの産物からの血小板の除去（図１）（１）アフェレーシス袋の内容物を袋Ａ１（容量６００ml）に移す。（２）単核細胞を収容する袋に、ある重量の緩衝生理食塩水溶液を加えて、袋の最終重量を４５０〜５００ｇにする。（３）袋Ａ１を＋４℃、３００×ｇで１０分間遠心分離する。（４）プレスを用いて、上清を袋Ａ２に移す。（５）生理食塩水溶液で４５０ｇまで満たす。（６）袋Ａ１を２回目の遠心分離する。（７）上清を袋Ａ３に移す。・摩擦によって、細胞を遠心分離袋Ａ１からはがす。（８）予め調製しておいた培養培地で６００mlまで満たす。・加えた培養培地の体積を書き留める。・無菌条件下で、対照サンプルを採取する。 II−単核細胞の培養（図２）（９）培養袋Ｂ１、Ｂ２およびＢ３に均等に分配する。（１０）各袋に必要な体積を培養培地で満たす。（１１）培養および活性化の期間の終点で、３個の培養袋の内容物を貯留袋Ｂ４に移す。 III −水簸による分離（図３）・滅菌した水簸室の入口に部分Ｉ（キットの入口）を、そして水簸室の出口にキットの出口（部分II）を接着する。（１２）回路を少なくとも３００mlの水簸液で満たす。（１３）同時に、水簸液の進入路を閉じ、ポンプの吐出を変えることなく細胞懸濁物袋（袋Ｂ４）のそれを開く。すべての細胞が通過したならば直ちに、細胞の袋Ｂ４の進入路を閉じ、水簸液のそれを開く。ポンプの吐出を５００mlごとに増大させ、サンプルを採取する。（１４）マクロファージの大きさを有する細胞が出始めたとき、遠心分離を停止し、水簸溶液の進入路を閉じ、空気取入口を開くことによって、捕集袋Ｅ１への採取を逸らせる。（１５）袋Ｅ１を４００×ｇで１０分間遠心分離する。（１６）上清を袋Ｅ２に移す。（１７）細胞を４％ヒトアルブミン２５０mlの溶液中の懸濁物に戻す。充分に均質化する。（１８）注入袋Ｅ３に移す。図１〜３の凡例は下記のとおりである：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．マクロファージ、特に活性化されたマクロファージ、またはマクロファージ、または特異的な免疫応答を誘導できる特異的表面抗原を提示する、単球に由来するその他の細胞、もしくは単球の前駆細胞（ＭＤ−ＡＰＣとも称され、場合により活性化されている）を含有する組成物を調製する方法であって、血液細胞、より具体的には白血球、例えば単球、または後者の前駆細胞に富む、ヒトを起源とする血液に由来する組成物、特にアフェレーシスによって得られたもののような血液に由来する組成物から出発して、該手順が下記の工程： −好都合には、適切な生理的溶液を用いて、血液に由来する該組成物を、特に後者の体積の約２〜３倍に希釈する工程、 −血液に由来する該組成物を洗浄し、好都合には単なる遠心分離により、該遠心分離から生じた沈降物を、適切な生理的洗浄液中の該沈降物の、特に（移送型の）袋中の、例えば該袋に圧力を働かせることによる回収の後に洗浄し、こうして洗浄液をもう一つの袋または他の容器へと除去して、存在し得る抗凝固剤および種々の残渣を枯渇させ、血小板を減らした組成物を回収する工程、 −場合により、上記の洗浄操作を、特に１〜２回反復する工程、 −上記洗浄工程の後に得られた血液に由来する組成物に含まれる細胞を、特に、袋、好都合には疎水性の袋の中の、適切な培養培地中に約６日〜１０日間（特に約６〜７日間）入れることによって培養する工程、を包含し、この培養工程を、場合により、上記の特定の抗原の存在下で、すなわちＭＤ−ＡＰＣ生産の場合は、特に腫瘍細胞または病原体に特徴的な抗原の存在下で実施し、そして培養培地への活性化因子、例えばγインターフェロンの添加による、該培養培地中に得られるマクロファージまたはＭＤ −ＡＰＣの活性化工程を続けて行ってもよく、該活性化因子を、培養培地の内容物と約１６〜２４時間接触させ、該培養、および場合による活性化の工程には、特に上記に示したように培養培地の遠心分離、および該遠心分離から生じた沈降物の洗浄を続けて行ってもよく、該培養、および場合による活性化の工程は：・単球またはそれらの前駆細胞以外の、出発組成物中に存在し得る成分、特に血小板、赤血球、顆粒球およびリンパ球の全部または一部を、該培養工程の先に行われる洗浄工程後に得られた血液に由来する組成物を、上記成分の全部または一部に対する抗体と接触させ、上記成分の全部または一部が該抗体に固定されたまま、単球またはそれらの前駆細胞を含有する溶液を回収することによって除去する工程を先に行い；・ならびに／あるいはマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣ以外の成分の全部または一部を、該培養工程後に得られる血液に由来する組成物を上記のような抗体と接触させ、上記の成分の全部または一部が該抗体に固定されたまま、マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを含有する溶液を回収することによって除去する工程を続けて行い；・ならびに／あるいは、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ− ＡＰＣを、培養工程、およびあり得る上記活性化工程の後に得られる組成物のその他の成分、特に血小板、赤血球およびリンパ球から物理的手段によって分離する、特に水簸によって精製する工程を続いて行うことを含む方法。２．ヒト起源の血液に由来する出発組成物が、該組成物中に存在する白血球数の約５％より高い、特に約１０〜３０％の比率の単球を含むようなものであることを特徴とする請求項１または２記載の方法。３．ヒト起源の血液に由来する出発組成物が、該組成物中に存在する白血球数の約３％未満、特に０．３〜０．５％の比率の赤血球を含むようなものであることを特徴とする請求項１記載の方法。４．ヒト起源の血液に由来する出発組成物が： −血小板の数が、約１５０〜約２００ml中に約２×１０¹¹〜約６×１０¹¹であり、 −白血球の数が、約１５０〜約２００ml中に約５×１０⁹〜約５×１０¹⁰であり、 −リンパ球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約６０〜約８０％であり、 −顆粒球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約２０％であるようなものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。５．培養、活性化および遠心分離の工程に続いて、図３に示したような水簸の工程を行い、下記のメカニズム、すなわち： −培養、および場合による活性化の後に得られる、場合により活性化されているマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを含む組成物を収容する袋（図３ではＢ４で示される）、ならびに場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣが生存できる培地中に水簸系全体を収容できる、生理学的溶液（水簸液とも表される）を収容する袋、および空気取入口が、フィルターを備え、３本の分枝を有する輸注器に連結され、 −一旦空気取入口を閉じたならば、蠕動ポンプが袋Ｂ４の内容物を、ローターを備え、水簸室を有する水簸装置内に吸引するが、水簸回路全体への生理的液体の供給が、水簸の全持続時間の間、水簸液を収容する袋の内容物を上記ポンプで吸引することによって確保され、 −水簸ローターの回転速度、およびポンプからの吐出は、ローターに進入する袋Ｂ４の組成物の種々の成分が、それらの大きさの関数として水簸室内へ分離され、最小の大きさの成分が、該室の頂部（水簸装置の出口付近）に最初に移動し、一方最大の大きさの成分、すなわち、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣが、該室の出口に最後に移動するようなものとし、 −こうして分離された袋Ｂ４内の組成物の異なる成分を、水簸装置に連結した袋内に別個に捕集し、血小板や、小さい大きさの種々の残渣を袋Ｃ１内に最初に回収し、次いで赤血球を袋Ｃ２内に、次いでリンパ球を袋Ｃ３およびＣ４内に、最後にマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを袋Ｅ１内に回収して、こうして、上記の異なるカテゴリーの成分を、それらのそれぞれの大きさの関数として、水簸装置の回転速度を減じるか、またはポンプの吐出を増大させるかのいずれかによって、水簸装置から抽出し、袋Ｅ１へのマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの回収は、好都合には水簸装置のローターを停止し、空気取入口を開くことによって実施でき、こうして、袋Ｅ１は、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣからなる目的とする組成物を、好都合には実質的に純粋な形態で含んでいる、を用いて実施されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。６．培養、および場合による活性化の工程に： −先だって、出発組成物の洗浄工程から生じた組成物を、特に上記に示した方法で、固体支持体に固定した抗血小板抗体および／または抗赤血球抗体および／または抗顆粒球抗体と接触させる工程を行い、該組成物と該抗体との接触を、上記抗体の全部もしくは一部と同時にか、または特に上記に示した方法で連続的にかのいずれかで行い、次いで、該組成物を、培養培地を収容する袋内に移し、 −そして、続いて、培養、および場合による活性化の工程から生じた組成物を、抗リンパ球抗体を収容する上記のような１個（もしくは数個）の袋、または他の装置へ該組成物を導入することによって、抗リンパ球抗体と接触させる工程、ならびに場合により活性化された、求めるマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を実質的に純粋な形態で回収する工程を行う、ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。７．場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を得るためのキット（もしくはケース）であって：・洗浄、培養および水簸に必要な： −１個または数個の洗浄袋、 −１個または数個の培養袋、好ましくは疎水性の培養袋、 −洗浄物から上清を除去するための１個または数個のコネクター、 −前記の袋の間の１個または数個の連結管、 −場合により、洗浄袋および培養袋内の１個または数個の注入部位、 −洗浄袋と培養袋との間の連結部の開閉を可能にする１個または数個の装置系、特に管に接するクランプの系、 −洗浄および水簸のための生理的溶液を含む２個の袋、 −空気取入口を有する三叉輸注器、 −輸注器と水簸装置のローターとの間の連結部として働く、該ローターに接するシリコンチューブおよび継ぎ手、 −場合により、クランプ系を備えた管によってそれら自体の間で連結された１個（または数個）の捕集袋、 −上記の捕集袋と水簸装置のローターとの間の連結部として働く、ローターに接する管および継ぎ手を包含するエレメントと、・培養、分化、活性化および制御に必要な、 −特別な即時使用可能な培養培地、特に、最初に、改変ＩＭＤＭ、すなわちＬ−グルタミン(２mM、Gibco)またはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン(２mM、Gibc o)、ピルビン酸(２mM、Gibco)、インドメタシン(５×１０^-6M 、 Sigma)、メルカプトエタノール(３×１０^-5M 、Gibco)、非必須アミノ酸(２％、Gibco)を加えた、Iscoveの改変ダルベッコ培地(ＩＭＤＭ、Gibco)；培養の時点で加える２〜５％のＡＢ⁺血清（または自家血清）およびペニシリンならびにストレプトマイシンのような抗生物質から構成される培養培地の袋、 −培養培地に加えるための、下記の中から選ばれる、好都合には液体もしくは凍結乾燥形態での１種または数種の補充物：＊ＧＭＣＳＦ、＊ビタミンＤ₃、＊インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、＊ＩＬ−４、＊ＴＮＦ−α、＊ヒスタミン、 −場合により、好都合には液体または凍結乾燥形態での、γ−インターフェロンのような活性化因子、 −好都合には、好都合には固定されたか、または凍結乾燥され、場合により標識化された単球、および／または場合により活性化されたマクロファージもしくはＭＤ−ＡＰＣ、あるいは場合により、特に蛍光で標識化された、大きさの選別されたビーズを含む１種類（または数種類）の内部対照、 −特に蛍光で標識化された１種類または数種類の抗体、例えば、抗原ＣＤ３（ネガティブコントロールの場合に用いるリンパ球に対するマーカー）、ＣＤ４５（白血球全般に対するマーカー）、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＭＡＸ−１に対する抗体を包含する反応性試薬とを含むことを特徴とするキット。８．下記の２群： −袋、管、注入部位、クランプ系、三叉輸注器、すなわち洗浄、培養、および水簸による精製に用いられる「乾燥」エレメントを含む第Ｉ群、 −該特製の培養培地、ならびに培養、分化、活性化および品質管理のための反応性試薬を収容する袋を含む第II群として示されることを特徴とする請求項７記載のキット。９．・二つの箱の形態の二つの下位群で構成される第Ｉ群： −箱Ａは、アフェレーシスから得られる細胞を洗浄するのに必要な材料、特に：＊６００mlの容量を有する３個の袋（図１に示した中央の袋Ａ１ならびに回収袋Ａ２およびＡ３）、＊アフェレーシスから生じた細胞を希釈かつ洗浄するために血液組成物を移送する、袋（図１の袋Ａ１）へと洗浄液を移すための移送セット、＊洗浄した細胞（図１の袋Ａ１に収容）のための培養袋（図２の袋Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）への移送セット、＊培養培地のための、最初は洗浄した細胞（図１の袋Ａ１に収容）への、次いで上記培養袋への移送セット、＊３リットルの容量を有する３個の疎水性培養袋（図２の袋Ｂ１、Ｂ２およびＢ３）を収容し、 −箱Ｂは、分化したマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを、水簸工程の間に培養物中に存在する他の細胞から分離するためのエレメント、特に：＊収集袋（または図２の貯留袋Ｂ４）、＊空気取入口を有する三叉輸注器、＊シリコンチューブ、およびローターへの２個の継ぎ手であって、この管と２個の継ぎ手の一方とは、輸注器と水簸装置のローターとの連結部として働き、他方の継ぎ手は、該ローターと、後述する袋の群との連結部として働き、後者の管は、サンプルの採取部位を含む、＊１リットルの容量を有する４個の回収袋（図３の袋Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ４）、精製されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの最終分画を収容する６００mlの容量を有する袋（図３の袋Ｅ１）および、前記の袋の上清の回収のための６００mlの容量を有する袋（図３の袋Ｅ２）および、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを患者に注入するための袋（図３の袋Ｅ３）との組合せを収容し、・第II群は、場合により温度を４℃に保つ冷却系を有する恒温箱である箱Ｃで表され、特に： −上記のとおり、最初には改変ＩＭＤＭから構成される培養培地２リットルの袋、 −下記の液体または凍結乾燥産物を収容する箱：＊抗生物質(ペニシリン、好都合には１，０００U/ストレプトマイシン、好都合には１，０００μg)のフラスコ、＊ビタミンＤ₃(好都合には４〜８μg)のフラスコ、＊ＧＭＣＳＦ(好都合には５×１０⁵〜１０⁶U)のフラスコ、＊γインターフェロン(好都合には２５×１０⁴〜５×１０⁵U)のフラスコ、＊ＩＬ−１３のフラスコ、＊ＩＬ−４のフラスコ、＊ＴＮＦαのフラスコ、＊ヒスタミンのフラスコ、 −上記の１種（または数種）の内部対照、および標識化した抗体、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ６４、抗ＭＡＸ−１、抗ＣＤ５４、抗ＣＤ５８、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６および抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、特に蛍光で標識化したそれらを収容する１個または多数のフラスコを収容する箱、を収容することを特徴とする請求項８記載のキット。１０．請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法の実施のための、請求項７〜９のいずれか一項に記載のキットの用途。１１．場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を得るためのキットであって： −固定された抗赤血球抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −固定された抗血小板抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −固定された抗顆粒球抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −固定された抗リンパ球抗体がその内部にある１個（または数個）の袋、 −１個（または数個）の培養袋、 −場合により活性化された、精製マクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの回収のための１個（または数個）の袋、 −上記の異なる袋を連結する管、 −培養培地に加えるための、好都合には液体または凍結乾燥形態での補充物、特に：＊ペニシリンならびにストレプトマイシンのような抗生物質、＊ＧＭＣＳＦ、＊ビタミンＤ₃、＊ＩＬ−１３、＊ＩＬ−４、＊ＴＮＦα、＊ヒスタミン、 −場合により、好都合には液体または凍結乾燥形態での、γインターフェロンのような活性化因子、 −好都合には、好都合には固定され、場合により標識化された単球、または場合により活性化されたマクロファージもしくはＭＤ−ＡＰＣを含むか、あるいは場合により特に蛍光で標識化された、上記の大きさの選別されたビーズからなる１種（または数種）の内部対照、 −特に蛍光で標識化された抗体、例えば抗原ＣＤ３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、抗ＭＡＸ−１およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体、を包含することを特徴とするキット。１２．請求項１〜４および６のいずれか一項に記載の方法の実施のための請求項１１記載のキットの用途。１３．ヒト起源の血液に由来する細胞懸濁物を含有する液体組成物であって、該組成物中に存在する白血球数の約５％より多くの、特に約１０〜約３０％の比率の単球を含むことを特徴とする組成物。１４．前記組成物中に存在する白血球数の約３％未満、特に０．３〜０．５％の比率の赤血球を含むことを特徴とする請求項１３記載の組成物。１５．−血小板の数が、約１５０〜約２００ml中に約２×１０¹¹〜約６×１０¹¹ であり、 −白血球の数が、約１５０〜約２００ml中に約５×１０⁹〜約５×１０¹⁰であり、 −リンパ球の比率が、前記組成物中に存在する白血球数の約６０〜約８０％であり、 −顆粒球の比率が、該組成物中に存在する白血球数の約１０〜約２０％であることを特徴とする請求項１３または１４記載の組成物。１６．特に約５〜１０リットルの体積の血液に対してなされる、アフェレーシスの方法の実施によって得られるような請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の組成物。１７．特に請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法の実施によって、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣの組成物を得るための組成物の用途であって、該組成物が、場合により、場合により活性化されたマクロファージまたはＭＤ−ＡＰＣを希釈した後に、患者に投与することができ、こうして適切な注射液として得られる請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の用途。