CN113893266A - 一种复合马赛菌提取物及其制备方法和其应用 - Google Patents

一种复合马赛菌提取物及其制备方法和其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种复合马赛菌提取物及其制备方法和其应用。本发明的复合马赛菌提取物中含有多种具有调控细胞增殖与分化、细胞修复及细胞营养、维持组织和细胞生长发育等功能的生长因子和蛋白质，促进细胞修复、脏器损伤修复，延缓皮肤衰老，减少甚至消除黑色素沉积，用于关节修复、毛囊修复、脏器损伤修复、皮肤细胞修复、氧化损伤细胞修复等方面，且安全有效。

Description

一种复合马赛菌提取物及其制备方法和其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种复合马赛菌提取物及其制备方法和其应用。
背景技术
头发是人体健康的重要指标之一，并在仪表仪容中发挥着重要作用。现代人受生活忙碌、工作压力、环境污染等因素的影响，出现头发易断裂、提早老化等问题，严重影响个人形象。男女脱发者越来越多并呈现年轻化趋势。《中国脱发人群调查》结果显示，我国脱发人群约2.5亿，脱发发生率高达12%。约60%的人群在25岁左右出现脱发症状，脱发人群呈现成低龄化趋势。研究结果表明，毛囊干细胞数量及活性与脱发直接关联。毛囊干细胞数量及活性降低导致毛囊细胞分化能力减弱，无法完成再生循环，由此导致毛囊闭合而形成永久性脱发。毛囊干细胞的活性决定了毛囊的再生能力。现有的脱发治疗方式包括毛发移植、口服药物或局部施用药物。毛发移植方法给患者带来疼痛，且价格昂贵，影响美观。防脱发药物利用化学物质促进毛囊干细胞生长，但存在一定毒副作用。
细胞是生命活动的基本单位和机体健康的基础。当机体的氧化还原平衡遭到破坏时，会引起氧化还原信号和控制的中断，引发氧化应激损伤而产生多种疾病。脑部氧化应激损伤神经元细胞可引发多种神经退行性疾病，包括记忆力减退、阿尔兹海默症、帕金森症、多发性硬化症等。及时修复损伤细胞需要可以治疗相关病变。现有的细胞修复产品包括活性肽、维生素、益生菌等，存在效果不显著、成本较高等缺陷。为此，临床急需更高效的细胞修复产品。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有细胞修复功效的复合马赛菌提取物，所述提取物的制备包括下述步骤：
（1）将分别冻存的三种马赛菌属微生物M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massilia sp.NR4-1分别置于30-40℃水浴中融化后，平皿涂布，再将其置于25-40℃条件下培养至长出菌落；
（2）分别挑取步骤（1）制得的三种活化菌株的单个菌落，将其分别接种至基础培养基中，再将置于25-40℃、100-300rpm条件下培养36-60h，分别制得三种活化菌株的种子培养液；
（3）将步骤（2）制得的三种活化菌株的种子培养液分别按照接种量为5-20%接种到驯化培养基中，再将其置于20-35℃、100-300rpm条件下培养80-200h，分别制得菌液OD650为0.5-5.0的三种菌液；
（4）将步骤（3）制得的三种菌液按照体积比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）：（0.5-1.5）混合，再按照接种量为5-20%接种到驯化培养基中，置于5-38℃、100-300rpm条件下循环变温培养2-7天，培养期间，每间隔12h接受剂量为3-10mj/cm2的紫外线照射20-60min，过滤，收集菌株,清洗，用磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水、Tris缓冲液的任一种或其组合重悬收集菌株，在10-25℃下培养6-24h,离心，收集离心上清液过滤，收集滤液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
本发明的优选技术方案，步骤（1）的冻存温度为-80℃。
本发明的优选技术方案，步骤（2）中，菌株在基础培养基中的培养条件为：30-37℃、150-200rpm条件下培养40-50h。
本发明的优选技术方案，步骤（3）中，菌株在驯化培养基中的培养条件为：25-30℃、150-250rpm条件下培养120-160h。
本发明的优选技术方案，步骤（3）或步骤（4）中的接种量为8-18%，优选为10-15%。
本发明的优选技术方案，步骤（3）中，制得菌液OD650为0.8-3.0，优选OD650为1.0-2.0。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中，三种菌液的体积比为（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2），优选为1:1：1。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中，驯化培养体系中的循环变温培养条件为：在10-30℃、150-250rpm条件下培养3-5d。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自8℃升温到38℃后，再从38℃降温到8℃；再从8℃升温到38℃，再从38℃降温到8℃，如此循环变温培养。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自10℃升温到35℃后，再从35℃降温到10℃；再从10℃升温到35℃，再从35℃降温到10℃，如此循环变温培养。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自12℃升温到31℃后，再从31℃降温到12℃；再从12℃升温到31℃，再从31℃降温到12℃，如此循环变温培养。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养中的升温和降温速率为0.5-5℃/h，优选为1-4℃/h。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的紫外照射条件为：剂量为5-8mj/cm2，照射30-40min。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的清洗液选自磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水、TBS（Tris NaCl HCl缓冲盐溶液）缓冲液、TBST（tris buffered saline tween）缓冲液、Tris缓冲液的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的清洗次数为1-5次，优选为2-4次。
本发明的优选技术方案，所述过滤为多级过滤，优选过滤级数为2-8级，更优选为3-6级。
本发明的优选技术方案，离心清液经孔径为80um、50um、30um、10um、5um、0.45um、0.22um的膜过滤。
本发明的优选技术方案，所述冻干保护剂选自甘露醇、甘油、右旋糖酐、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯（HES）、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述冻干制剂pH6-8，优选为pH6.5-7.5。
本发明的优选技术方案，每100ml基础培养基的组成为：
Figure 87185DEST_PATH_IMAGE001
本发明的优选技术方案，每100ml基础培养基的组成为：
Figure 207588DEST_PATH_IMAGE002
本发明的优选技术方案，每100ml驯化培养基的组成为：
Figure 456167DEST_PATH_IMAGE003
本发明的优选技术方案，每100ml驯化培养基的组成为：
Figure 320217DEST_PATH_IMAGE004
本发明的另一目的在于提供一种具有细胞修复功能的复合马赛菌提取物的制备方法，包括如下步骤：
（1）将分别冻存的三种马赛菌属微生物M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massilia sp.NR4-1分别置于30-40℃水浴中融化后，平皿涂布，再将其置于25-40℃条件下培养至长出菌落；
（2）分别挑取步骤（1）制得的三种活化菌株的单个菌落，将其分别接种至基础培养基中，再将置于25-40℃、100-300rpm条件下培养36-60h，分别制得三种活化菌株的种子培养液；
（3）将步骤（2）制得的三种活化菌株的种子培养液分别按照接种量为5-20%接种到驯化培养基中，再将其置于20-35℃、100-300rpm条件下培养80-200h，分别制得菌液OD650为0.5-5.0的三种菌液；
（4）将步骤（3）制得的三种菌液按照体积比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）：（0.5-1.5）混合，再按照接种量为5-20%接种到驯化培养基中，置于5-38℃、100-300rpm条件下循环变温培养2-7天，培养期间，每间隔12h接受剂量为3-10mj/cm2的紫外线照射20-60min，过滤，收集菌株,清洗，用磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水、Tris缓冲液的任一种或其组合重悬收集菌株，在10-25℃下培养6-24h,离心，收集离心上清液过滤，收集滤液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
本发明的优选技术方案，步骤（1）的冻存温度为-80℃。
本发明的优选技术方案，步骤（2）中，菌株在基础培养基中的培养条件为：30-37℃、150-200rpm条件下培养40-50h。
本发明的优选技术方案，步骤（3）中，菌株在驯化培养基中的培养条件为： 25-30℃、150-250rpm条件下培养120-160h。
本发明的优选技术方案，步骤（3）或步骤（4）中的接种量为8-18%，优选为10-15%。
本发明的优选技术方案，步骤（3）中，制得菌液OD650为0.8-3.0，优选OD650为1.0-2.0。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中，三种菌液的体积比为（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2），优选为1:1：1。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中，驯化培养体系中的循环变温培养条件为：在10-30℃、150-250rpm条件下培养3-5d。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自8℃升温到38℃后，再从38℃降温到8℃；再从8℃升温到38℃，再从38℃降温到8℃，如此循环变温培养。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自10℃升温到35℃后，再从35℃降温到10℃；再从10℃升温到35℃，再从35℃降温到10℃，如此循环变温培养。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自12℃升温到31℃后，再从31℃降温到12℃；再从12℃升温到31℃，再从31℃降温到12℃，如此循环变温培养。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的循环变温培养中的升温和降温速率为0.5-5℃/h，优选为1-4℃/h。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的紫外照射条件为：剂量为5-8mj/cm2，照射30-40min。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的清洗液选自磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水、TBPS缓冲液、TBST缓冲液、Tris缓冲液的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，步骤（4）中的清洗次数为1-5次，优选为2-4次。
本发明的优选技术方案，所述过滤为多级过滤，优选过滤级数为2-8级，更优选为3-6级。
本发明的优选技术方案，离心清液经孔径为80um、50um、30um、10um、5 um 、0.45um、0.22um的膜过滤。
本发明的优选技术方案，所述冻干保护剂选自甘露醇、甘油、右旋糖酐、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯（HES）、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述冻干制剂pH6-8，优选为pH6.5-7.5。
本发明的优选技术方案，每100ml基础培养基的组成为：
Figure 603431DEST_PATH_IMAGE005
本发明的优选技术方案，每100ml基础培养基的组成为：
Figure 894735DEST_PATH_IMAGE006
本发明的优选技术方案，每100ml驯化培养基的组成为：
Figure 365031DEST_PATH_IMAGE007
本发明的优选技术方案，每100ml驯化培养基的组成为：
Figure 531308DEST_PATH_IMAGE008
本发明的另一目的在于提供一种具有细胞修复功效的药物组合物，所述组合物由复合马赛菌提取物和药学上可接受的载体组成。
本发明的优选技术方案，所述药物组合物为冻干制剂。
本发明的另一目的在于提供复合马赛菌提取物或其药物组合物用于制备细胞修复、脏器损伤修复的任一种或其并发症的制品中的应用。
本发明的优选技术方案，所述细胞修复选自毛囊修复、氧化损伤细胞修复、关节修复、皮肤修复的任一种。
本发明的优选技术方案，所述毛囊修复选自健康毛囊细胞养护、受损毛囊细胞修复、休眠毛囊细胞激活、植发后新毛囊细胞养护的任一种。
本发明的另一目的在于提供复合马赛菌提取物或其药物组合物用于制备治疗痤疮的制品中的应用。
本发明的另一目的在于提供复合马赛菌提取物或其药物组合物用于制备延缓衰老或抗衰的制品中的应用。
本发明的优选技术方案，将复合马赛菌提取物或其药物组合物溶于水或生理盐水中，将其制成浓度为0.1-20%的溶液，再将制得溶液涂抹至病变部位，按摩或滚针至吸收。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1.本发明的复合马赛菌提取物中含有多种具有调控细胞增殖与分化、细胞修复及细胞营养、维持组织和细胞生长发育等功能的生长因子和蛋白质，促进细胞修复、脏器损伤修复，延缓皮肤衰老，减少甚至消除黑色素沉积，用于关节修复、毛囊修复、脏器损伤修复、皮肤细胞修复、氧化损伤细胞修复等方面，且安全有效。
2.本发明的制备方法具有操作简便，绿色环保，成本更优，适用于工业化生产等优点。
附图说明
图1 试验例1免疫组学细胞鉴定结果；
图2 本发明复合马赛菌提取物修复毛囊受损细胞的作用研究；
图3 本发明复合马赛菌提取物修复氧化损伤细胞的作用研究；
图4 本发明复合马赛菌提取物修复黑色素细胞的作用研究；
图5 本发明复合马赛菌提取物修复黑色素细胞的作用研究；
图6 本发明复合马赛菌提取物治疗痤疮的作用研究。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的说明。
每100ml基础培养基的组成为：酪胨(10g)、酵母提取物(0.25g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(1mg)、生物素(1μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(3μg)、叶酸(5μg)、吡哆胺(15μg) 、NaHCO3(0.4g)、半胱氨酸(0.1g)、葡萄糖（0.25g）、玉米淀粉（0.25g）、甘油（0.2g）、鸡蛋清（0.25g）K2HPO4(0.045g)、KH2PO4(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH4)2SO4(0.09g)、MgSO4·7H2O(0.009g)、CaCl2(0.009g)。
每100ml驯化培养基的组成为：酪胨(5g)、酵母提取物(0.25g)、刃天青(0.1mg)、氯化血红素(0.5mg)、生物素(5μg)、钴胺素(1μg)、对氨基苯甲酸(5μg)、叶酸(5μg)、吡哆胺(15μg)、半胱氨酸(0.1g)、NaHCO3(0.4g)、葡萄糖（0.25g）、玉米淀粉（0.25g）、甘油（0.2g）、鸡蛋清（0.5g）K2HPO4(0.045g)、KH2PO4(0.045g)、NaCl(0.09g)、(NH4)2SO4(0.1g)、MgSO4·7H2O(0.009g)、CaCl2(0.009g)、核黄素（0.2g）、甲醇（0.4g）。
三种马赛菌出发菌株M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massiliasp.NR4-1均为商购。
实施例1 本发明复合马赛菌提取物的制备
复合马赛菌提取物的制备包括下述步骤：
（1）将-80℃冻存的三种马赛菌出发菌株M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massilia sp.NR4-1分别取出，将其分别置于37℃恒温水浴中融化后，平皿涂布，将其置于28℃培养箱培养一周至长出菌落；
（2）挑取单个菌落，将其接种至50ml基础培养基中，在37℃、200rpm摇床培养48h，再按照15%的接种量接种到驯化培养基中，在25℃、250rpm条件下培养120h，得到OD650为1.0-2.0的三种菌液；
（3）将三种菌液按1:1:1混合后，按照10%的接种量接种到驯化培养基中，在250prm、10-31℃条件下循环变温培养72h，其中，培养体系的循环变温培养操作为，从10℃升温到31℃，再从31℃降温到10℃，升温和降温速率为3℃/h，每间隔12h接受剂量为10mj/cm2的紫外照射60min；
（4）离心（2000rpm*10min），收集菌株用PBS清洗3次后，将菌株重悬于生理盐水中，并将其置于10-25℃下、200rpm条件下摇床培养12h后，离心（2000rpm*10min），收集离心液，经孔径为80um、50um、30um、10um、0.45um、0.22um的六级膜过滤，再在膜清液中加入重量比为0.7%的甘露糖醇磷酸盐溶液（pH7.4），冻干，即得。
实施例2 本发明复合马赛菌提取物的制备
复合马赛菌提取物的制备包括下述步骤：
（1）将-80℃冻存的三种马赛菌出发菌株M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massilia sp.NR4-1分别取出，将其分别置于37℃恒温水浴中融化后，平皿涂布，将其置于28℃培养箱培养一周至长出菌落；
（2）挑取单个菌落，将其接种至50ml基础培养基中，在37℃、200rpm摇床培养48h，再按照15%的接种量接种到驯化培养基中，在25℃、250rpm条件下培养120h，得到OD650为1.0-2.0的三种菌液；
（3）将三种菌液按1:1:1混合后，按照5%的接种量接种到驯化培养基中，在250prm、8-38℃条件下循环变温培养48h，其中，培养体系的循环变温培养操作为，从8℃升温到38℃，再从38℃降温到8℃，升温和降温速率为1℃/h，每间隔12h接受剂量为3mj/cm2的紫外照射20min；
（4）离心（2000rpm*10min），收集菌株用PBS清洗3次后，将菌株重悬于生理盐水中，并将其置于10-25℃下、200rpm条件下摇床培养12h后，离心（2000rpm*10min），收集离心液，经孔径为80um、50um、30um、10um、0.45um、0.22um的六级膜过滤，再在膜清液中加入重量比为0.7%的海藻糖溶液（pH7.4），冻干，即得。
实施例3 本发明复合马赛菌提取物的制备
复合马赛菌提取物的制备包括下述步骤：
（1）将-80℃冻存的三种马赛菌出发菌株M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massilia sp.NR4-1分别取出，将其分别置于37℃恒温水浴中融化后，平皿涂布，将其置于28℃培养箱培养一周至长出菌落；
（2）挑取单个菌落，将其接种至50ml基础培养基中，在37℃、200rpm摇床培养48h，再按照15%的接种量接种到驯化培养基中，在25℃、250rpm条件下培养120h，得到OD650为1.0-2.0的三种菌液；
（3）将三种菌液按1:1:1混合后，按照15%的接种量接种到驯化培养基中，在250prm、10-35℃条件下循环变温培养120h，其中，培养体系的循环变温培养操作为，从10℃升温到35℃，再从35℃降温到10℃，升温和降温速率为5℃/h，每间隔12h接受剂量为10mj/cm2的紫外照射60min；
（4）离心（2000rpm*10min），收集菌株用PBS清洗3次后，将菌株重悬于生理盐水中，并将其置于10-25℃下、200rpm条件下摇床培养12h后，离心（2000rpm*10min），收集离心液，经孔径为80um、50um、30um、10um、0.45um、0.22um的六级膜过滤，再在膜清液中加入重量比为0.7%的葡萄糖溶液（pH7.4），冻干，即得。
试验例1 本发明复合马赛菌提取物修复毛囊受损细胞的作用研究
1、毛囊细胞的培养：
选取健康志愿者，毛囊用碘伏消毒后，酒精脱碘，拔取志愿者头发数根，用无菌剪刀截取发根部分，将截取的发根部分置于预冷的、含有青霉素和庆大霉素的pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中浸泡5min，用枪头轻轻吹打数次后，取出发根部分，将其转移至多聚赖氨酸包被的24孔板中，促其贴壁，加入1ml培养基（MEM+15%FBS+），再将其置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔3天半更换培养基一次，直至显微镜下观察到贴壁的发根部位呈现铺路石样细胞爬出3天后，剔除发根组织，弃掉培养基，用pH7.2-7.4磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一次，加入适量胰蛋白酶消化，待显微镜下可见细胞团缩后，加入含血清培养基终止消化，1600rpm/5min离心收集细胞,在收集细胞中加入适量培养基调整细胞密度为1×104/ml，将其接种到新的多聚赖氨酸包被过的培养瓶中，转移至37℃、5%CO2培养箱中培养。
通过免疫组学细胞鉴定CK15阳性（绿色）、PI细胞核染色（红色），则确定其为毛囊细胞，结果见图1。
２、毛囊受损细胞的修复研究
空白组：取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种毛囊细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h。按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
模型组：在MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入脂多糖(LPS)，将其配置成含有50ng/ml脂多糖(LPS)的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种毛囊细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含有50ng/ml脂多糖(LPS)的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h，按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
试验组：MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入脂多糖(LPS)，将其配置成含有50ng/ml脂多糖(LPS)的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入实施例1制得的复合马赛菌提取物，将其配置成含有100ug/ml复合马赛菌提取物的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种毛囊细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含有50ng/ml脂多糖(LPS)的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含有100ug/ml复合马赛菌提取物的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h，按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
本发明检测细胞相对活力的方法：弃掉上清液，毎孔加入MTT工作液（0.5mg/mL），将其置于37℃避光孵育2h后，弃掉上清，每孔加150µL DMSO，酶标仪读取OD490。以空白组的细胞相对活力100%，计算模型组和试验组的细胞相对活力，结果见图2。与模型组相比，试验组的细胞相对活力明显提升。
试验例2 本发明复合马赛菌提取物修复氧化损伤细胞的作用研究
商购人成纤维细胞，用DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)培养。
空白组：取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种人成纤维细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h，按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
模型组：在MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入H2O2，将其配置成含有400umol的H2O2的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种人成纤维细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含有400umol的H2O2的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h，按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
阳性对照组：在MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入H2O2，将其配置成含有400umol的H2O2的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
在MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入乙酰半胱氨酸，制得含100umol乙酰半胱酸的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种人成纤维细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含有400umol的H2O2的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含100umol乙酰半胱酸的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h，按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
试验组：在MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入H2O2，将其配置成含有400umol的H2O2的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
MEM/F12完全培养基(含10%FBS)中加入实施例1制得的复合马赛菌提取物，配置为含100ug/ml复合马赛菌提取物的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)。
取DMEM/F12完全培养基(含10%FBS)，按照1×104个/孔接种人成纤维细胞至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含有400umol的H2O2的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换为新鲜的、含100ug/ml复合马赛菌提取物的MEM/F12完全培养基(含10%FBS)，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h，按照本发明的检测方法检测细胞相对活力。
按照本发明的检测方法检测细胞相对活力的方法：弃掉上清液，毎孔加入MTT工作液（0.5mg/mL），置于37℃避光孵育2h后，再弃掉上清液，每孔加150µL DMSO，酶标仪在490nm处读取OD值，以空白组的细胞相对活力为100%，计算各组细胞相对活力，结果见图3。与模型组相比，试验组的细胞相对活力明显提升。
试验例3本发明复合马赛菌提取物修复黑色素细胞的作用研究
商购人黑色素细胞MC，用RPMI-1640+10%FBS培养基培养。
空白组：取RPMI-1640+10%FBS培养基，按照1×104个/孔接种黑色素细胞MC至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的RPMI-1640+10%FBS培养基，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养24h后，按照本发明的检测方法检测黑色素表达率。
试验组：RPMI-1640+10%FBS培养基中加入实施例1制得的复合马赛菌提取物，配置为含100ug/ml复合马赛菌提取物的RPMI-1640+10%FBS培养基。
取RPMI-1640+10%FBS培养基，按照1×104个/孔接种黑色素细胞MC至96孔板，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养12h后；更换新鲜的、含100ug/ml复合马赛菌提取物的RPMI-1640+10%FBS培养基，将其置于培养箱37℃、5%CO2中培养24h，按照本发明的检测方法检测黑色素表达率。
本发明黑色素表达率的检测方法：弃掉上清，毎孔用PBS清洗3次后，毎孔加入1mL含10%（体积比）DMSO的1mol/L NaOH水溶液，将孔板用封口膜封闭后，置于90℃水浴锅中加热30min后，轻轻吹打板底，离心（2000转/5min），收集上清液,将上清液按照分组加入到96孔板中，酶标仪在405nm处读取OD值。以空白组的黑色素表达率为100%，计算试验组的黑色素表达率，结果见图4。与空白组相比，试验组的黑色素表达率明显降低。
弃掉上清，常规分组收集细胞，按照DB Annexin V-FITC/PIApoptosis DetectionKit要求进行染色，细胞流式仪检查，结果见图5。
试验例4 本发明复合马赛菌提取物用于治疗痤疮的作用研究
将实施例1制得的复合马赛菌提取物用生理盐水配置成100ug/ml的复合马赛菌提取物溶液。
患者，男，16岁，面部大面积痤疮超过6个月。每晚睡前洁面后，创面用生理盐水清洁，待自然干燥后涂抹4ml100ug/ml的复合马赛菌提取物溶液30分钟，用清水洗净后，保湿水护肤。一周后，小痘痘消失，发炎部位开始退红并且缩小，局部感染处开始闭合，不再骚痒。20天后一些闭口基本消失，肤色均匀，出油整体降低，患者面部情况前后对比见图6。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (25)

1.一种具有细胞修复功效的复合马赛菌提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
（1）将分别冻存的三种马赛菌属微生物M.violaceinigra B2T，M.putida 6NM-7T，Massilia sp.NR4-1分别置于30-40℃水浴中融化后，平皿涂布，再将其置于25-40℃条件下培养至长出菌落；
（2）分别挑取步骤（1）制得的三种活化菌株的单个菌落，将其分别接种至基础培养基中，再将置于25-40℃、100-300rpm条件下培养36-60h，分别制得三种活化菌株的种子培养液；
（3）将步骤（2）制得的三种活化菌株的种子培养液分别按照接种量为5-20%接种到驯化培养基中，再将其置于20-35℃、100-300rpm条件下培养80-200h，分别制得菌液OD650为0.5-5.0的三种菌液；
（4）将步骤（3）制得的三种菌液按照体积比为（0.5-1.5）：（0.5-1.5）：（0.5-1.5）混合，再按照接种量为5-20%接种到驯化培养基中，置于5-38℃、100-300rpm条件下循环变温培养2-7天，培养期间，每间隔12h接受剂量为3-10mj/cm2的紫外线照射20-60min，过滤，收集菌株,清洗，用磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水、Tris缓冲液的任一种或其组合重悬收集菌株，在10-25℃下培养6-24h,离心，收集离心上清液过滤，收集滤液，加入冻干保护剂，冻干，即得。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）的冻存温度为-80℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，菌株在基础培养基中的培养条件为：30-37℃、150-200rpm条件下培养40-50h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，菌株在驯化培养基中的培养条件为：25-30℃、150-250rpm条件下培养120-160h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）或步骤（4）中的接种量为8-18%，优选为10-15%。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，制得菌液OD650为0.8-3.0，优选OD650为1.0-2.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，三种菌液的体积比为（0.8-1.2）：（0.8-1.2）：（0.8-1.2），优选为1:1：1。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，驯化培养体系中的循环变温培养条件为：在10-30℃、150-250rpm条件下培养3-5d。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自8℃升温到38℃后，再从38℃降温到8℃；再从8℃升温到38℃，再从38℃降温到8℃，如此循环变温培养；或者步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自10℃升温到35℃后，再从35℃降温到10℃；再从10℃升温到35℃，再从35℃降温到10℃，如此循环变温培养；或者步骤（4）中的循环变温培养条件为：培养体系自12℃升温到31℃后，再从31℃降温到11℃；再从12℃升温到31℃，再从31℃降温到12℃，如此循环变温培养。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中的循环变温培养中的升温和降温速率为0.5-5℃/h，优选为1-4℃/h。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中的紫外照射条件为：剂量为5-8mj/cm2，照射30-40min。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中的清洗液选自磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水、TBS缓冲液、TBST缓冲液、Tris缓冲液的任一种或其组合。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中的清洗次数为1-5次，优选为2-4次。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤为多级过滤，优选过滤级数为2-8级，更优选为3-6级。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，离心清液经孔径为80um、50um、30um、10um、5um、0.45um、0.22um的膜过滤。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻干保护剂选自甘露醇、甘油、右旋糖酐、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯（HES）、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、山梨醇中的任一种或其组合。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冻干制剂pH6-8，优选为pH6.5-7.5。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每100ml基础培养基的组成为：
Figure 424832DEST_PATH_IMAGE002
优选每100ml基础培养基的组成为：
Figure 810814DEST_PATH_IMAGE003
。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每100ml驯化培养基的组成为：
Figure 59392DEST_PATH_IMAGE004
优选每100ml驯化培养基的组成为：
Figure 923443DEST_PATH_IMAGE005
。
20.如权利要求1-19任一项所述的方法制备得到的具有细胞修复功效的复合马赛菌提取物。
21.一种具有细胞修复功效的药物组合物，所述组合物由如权利要求1-19任一项所述的方法制备得到的复合马赛菌提取物和药学上可接受的载体组成，优选所述药物组合物为冻干制剂。
22.如权利要求1-19任一项所述的方法制备得到的复合马赛菌提取物或如权利要求21所述的药物组合物用于制备细胞修复、脏器损伤修复的任一种或其并发症的制品中的应用，优选所述细胞修复选自毛囊修复、氧化损伤细胞修复、关节修复、皮肤修复的任一种，更优选所述毛囊修复选自健康毛囊细胞养护、受损毛囊细胞修复、休眠毛囊细胞激活、植发后新毛囊细胞养护的任一种。
23.如权利要求1-19任一项所述的方法制备得到的复合马赛菌提取物或如权利要求21所述的药物组合物用于制备治疗痤疮的制品中的应用。
24.如权利要求1-19任一项所述的方法制备得到的复合马赛菌提取物或如权利要求21所述的药物组合物用于制备延缓衰老或抗衰的制品中的应用。
25.如权利要求22-24任一项所述的应用，将复合马赛菌提取物或其药物组合物溶于水或生理盐水中，将其制成浓度为0.1-20%的溶液，再将制得溶液涂抹至病变部位，按摩或滚针至吸收。
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