KR20170093283A - Gdf11을 포함하는 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20170093283A
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Abstract

본 발명은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물, 주름개선용 약학 조성물, 창상 치료용 약학 조성물, 피부재생용 의약외품 조성물, 주름개선용 의약외품 조성물, 창상 치료용 의약외품 조성물, 피부재생용 화장료 조성물, 주름개선용 화장료 조성물, 창상 개선용 화장료 조성물, 섬유아세포 배양용 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 이용하여 섬유아세포를 배양하는 방법 및 상기 줄기세포를 배양하여 GDF11을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 GDF11은 인간 유래 성체 줄기세포 배양액에 포함되어 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 효과를 나타내므로, 보다 다양한 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

GDF11을 포함하는 조성물 및 그의 용도{Composition comprising GDF11 and uses thereof}
본 발명은 GDF11을 포함하는 조성물 및 그의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물, 주름개선용 약학 조성물, 창상 치료용 약학 조성물, 피부재생용 의약외품 조성물, 주름개선용 의약외품 조성물, 창상 치료용 의약외품 조성물, 피부재생용 화장료 조성물, 주름개선용 화장료 조성물, 창상 개선용 화장료 조성물, 섬유아세포 배양용 배지 조성물, 상기 배지 조성물을 이용하여 섬유아세포를 배양하는 방법 및 상기 줄기세포를 배양하여 GDF11을 제조하는 방법에 관한 것이다.
최근 현대인들은 건강한 삶에 대한 관심이 증가하고 있으며, 생활수준이 향상되고 여성의 사회진출 증가, 고령화 사회 등의 변화로 소비자들의 화장품에 대한 욕구는 단순히 아름답게 꾸미기 위한 용도에서 점차 기능적 측면이 강조된 화장품에 관심도가 높아지면서 인체에 무해한 천연 물질에서 찾으려는 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 피부노화는 복합적인 생물학적 현상으로 크게 두 가지 요인으로 구분할 수 있는데 시간이 지남에 따라 진행되는 자연노화(내인성노화)와 외부환경, 특히 자외선에 희한 광노화로 나눈 수 있다. 피부는 항상 산소와 태양관선에 노출되어 있어 이로부터 유발되는 산화적 스트레스는 피부노화를 촉진한다. 피부는 다양한 환경적 요인과 항상 접촉하고 있기 때문에 산화적 스트레스 요인의 공격에 직접적으로 노출되어 있으며, 피부가 다량의 자외선에 노출되면, 피부에서 활성산소종(ROS)이 과잉으로 생성되어, 항산화 방어계는 붕괴되며, 결국 노화를 촉진 시킨다.
인체의 중성구 과립구내에 존재하는 엘라스타제는 진피 내 피부탄력을 유지하는데 중요한 기질 단백질인 엘라스틴을 분해하는 효소이며, 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 상기 엘라스타제의 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우르솔산 등이 엘라스타제 저해제로 이용되고 있지만, 우르솔산은 물이나 오일 등의 용매에는 잘 녹지 않는 성질을 가지고 있기 때문에 제제화하기 어려워 일반적으로 사용하기 어려운 문제점이 있다.
콜라겐은 대부분 피부의 진피층에 존재하며, 피부 전체 건조중량의 약 70~80%를 차지하고 있으며, 세포 외 기질(extracellular matrix)의 주요 구성 성분인 collagen은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질이다. 콜라겐의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 자외선 조사에 의해 콜라겐의 분해 효소인 collagenase의 발현이 촉진되며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.
또한, 기질 단백질의 결핍은 광노화에 있어 중요한 인자중 하나이며, 자외선에 의해 세포 사이를 채우는 성분인 교원질과 탄력질의 합성이 감소하게 되면 다양한 기질 단백질 분해 효소의 발현이 증가 하게 된다. 따라서, 피부 노화의 주된 원인인 콜라겐과 엘라스틴 분해효소인 콜라게나제와 엘라스타제에 의해 분해되며, 진피 층은 피부의 물리 화학적인 성질을 결정하여 모세혈관과 표피에 영양을 공급해주는 중요한 역할을 하므로 피부의 노화와 밀접한 관련이 있다.
종래에는 콜라겐의 주름개선 효과를 이용하기 위하여 화장품 또는 연고 등과 같은 피부외용제 조성물에 콜라겐을 배합한 제품들이 출시되었으나, 이들 제품들은 콜라겐 자체를 피부 표면에 도포하는 것으로 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 본질적인 주름개선 효과를 나타낼 수 없었다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 콜라겐합성 촉진물질에 대한 관심이 높아졌으며, 종래 알려진 콜라겐합성 촉진물질로는 비타민C, 레티노익산, 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF), 동물태반 유래의 단백질(JP8-231370), 베툴린산(betulinic acid, JP8-208424), 클로렐라추출물(JP9-40523, JP10-36283, 섬유아세포 증식 촉진작용) 등이 있다.
최근에는 줄기세포에 대한 관심이 높아지면서, 분화능을 갖는 줄기세포 또는 그의 추출물이 피부노화를 억제할 수 있음이 보도되었고, 이에 따라 줄기세포를 이용하여 피부노화를 억제하는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제2009-0116659호에는 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선, 미백 또는 노화방지용 화장료 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이러한 줄기세포 배양액에는 무수하게 많은 성분이 포함되어 있기 때문에, 실질적인 주름개선 효과를 나타내는 성분이 무엇인지 아직까지는 확인되지 않았다. 만일, 이러한 주름개선 효과를 나타낼 수 있는 유효성분이 규명되면, 보다 효과적으로 주름을 개선할 수 있는 제품이 개발될 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 종래에 피부의 주름개선효과가 있다고 알려진 인간 유래 성체 줄기세포 배양액으로부터 피부주름을 개선시킬 수 있는 유효성분을 발굴하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 상기 배양액에 포함된 GDF11이 섬유아세포의 증식을 촉진할 뿐만, 아니라, 피부주름을 개선시킬 수 있는 콜라겐의 합성수준을 증가시키고, 콜라게나제의 활성을 억제하여, 피부주름 개선효과를 나타내는 유효성분임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 섬유아세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 배지 조성물을 사용하여 섬유아세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 GDF11의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 종래에 피부의 주름개선효과가 있다고 알려진 인간 유래 성체 줄기세포 배양액으로부터 피부주름을 개선시킬 수 있는 유효성분을 발굴하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 치매예방 또는 치료효과가 있다고 알려진 GDF11(growth differentiation factor 11)에 주목하게 되었다. 상기 GDF11은 운동능력을 회복시키고, 퇴행된 뇌혈관을 재생시키는 단백질로 알려져 있는데, 섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 이동성을 향상시키고, 기질단백질의 발현을 증가시키는 효과를 나타내는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액에 상기 GDF11이 검출됨을 확인하고, 이를 다른 줄기세포의 배양액과 비교한 결과, 다양한 성체줄기세포 중에서도 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액에 다량으로 포함되어 있음을 확인하였다. 이에, 상기 GDF11의 효과를 검증한 결과, GDF11의 발현이 감소되면 인간 유래 성체 줄기세포의 증식속도가 감소하고, 이로부터 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준이 감소함을 확인하였으며, 상기 GDF11의 발현에는 다양한 성장인자(EGF, bFGF, TGF-beta1 또는 vEGF)가 관여할 뿐만 아니라, 섬유아세포에 GDF11을 처리하면, 상기 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 상기 섬유아세포에서 콜라겐과 엘라스틴의 발현을 증가시킴을 확인하였다. 따라서, 상기 GDF11은 섬유아세포의 증식촉진에 의하여 유발될 수 있는 창상치료효과, 피부재생효과, 주름개선효과 등을 촉진할 수 있을 것으로 분석되었다.
이처럼 GDF11이 섬유아세포의 증식 및 이로 인한 피부의 창상치료, 주름개선, 피부재생에 관여한다는 사실은 지금까지 전혀 공지되지 않았고, 본 발명자에 의하여 최초로 규명되었다.
상술한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "GDF11(growth differentiation factor 11)"이란, "BMP-11(bone morphogenetic protein 11)"이라고도 하며, 사람의 12번 염색체에 존재하는 GDF11 유전자에 의해 발현되는 단백질을 의미한다. 상기 GDF11은 미오스타틴 유사체 단백질로 알려져 있는데, 신경조직의 성장을 억제하는 억제제로서 작용하는 것으로 알려져 있고, 최근에는 운동능력을 회복시키고, 퇴행된 뇌혈관을 재생시키는 효과를 나타내는 치매예방 또는 치료효과가 있다고 보고되었다. 본 발명의 GDF11의 서열정보는 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 등과 같은 공지의 데이터 베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 사람 유래의 GDF11 유전자(NM_005811), 사람 유래의 GDF11 단백질(NP_005802), 마우스 유래의 GDF11 유전자(NM_010272), 마우스 유래의 GDF11 단백질(NP_034402) 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 GDF11은 섬유아세포의 증식촉진을 통한 피부재생 촉진, 주름개선 촉진, 창상 치료촉진 등의 효과를 나타낼 수 있으므로, 이들 효과를 나나내는 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 “인간 유래 성체 줄기세포 배양액”이란, 인간의 성체 줄기세포를 배양하여 수득한 배양물 또는 상기 배양물로부터 줄기세포를 제거한 배양상등액 등을 의미한다. 상기 성체 줄기세포를 배양하여 수득한 배양액에는 상기 성체 줄기세포가 배양하면서 분비한 다양한 물질(예를 들어, GDF1 등)이 포함되어 있어, 상기 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 이용하면 섬유아세포의 증식촉진을 통한 피부재생 촉진, 주름개선 촉진, 창상 치료촉진 등의 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 인간 유래 성체 줄기세포 배양액은 인간의 성체 줄기세포를 배양하여 수득한 배양상등액으로 해석될 수 있는데, 이에 사용되는 성체 줄기세포는 GDF11를 배양액으로 분비할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일례로서 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것일 수 있으며, 본 발명에서는 인간 유래 중간엽 줄기세포 배양액으로서 인간 제대혈유래 중간엽 줄기세포의 배양액을 사용하였다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 섬유아세포의 증식능에 대한 줄기세포 배양액의 효과를 확인한 결과, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포 배양액(HDF CM) 또는 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 보다도 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 세포로부터 분비되는 단백질 총량 또한 증가시킬 수 있음을 확인하였고(도 1), 섬유아세포의 이동성을 촉진시킴을 확인하였다(도 2). 또한, 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질(콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴 등)의 발현수준을 상대적으로 높은 수준으로 향상시키고(도 3a 및 3b), 동물모델에서도 상대적으로 우수한 창상치료효과를 나타냄을 확인하였다(도 4a 및 4b).
이러한 효과를 나타내는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액의 유효성분으로서 GDF11(growth differentiation factor 11)을 대상으로 이의 효과를 분석한 결과, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액에서 GDF11가 대량으로 포함되어 있음을 확인하고(도 5의 a 및 b), 상기 GDF11는 인간 골수, 지방 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 보다 높은 수준으로 분비되고 있음을 확인하였다(도 6의 a 및 b). 또한, 상기 GDF11이 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에 미치는 효과를 분석한 결과, GDF11의 발현수준이 억제되면 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식이 억제되고, 이로부터 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준이 감소되며(도 7의 a 및 b), 상기 GDF11의 발현에는 EGF, bFGF, TGF-beta1 및 vEGF가 관여함(도 8)을 확인하였다.
상기 GDF11이 섬유아세포에 미치는 영향을 분석한 결과, 섬유아세포의 증식을 촉진시키고, 상기 섬유아세포에서 콜라겐과 엘라스틴의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
따라서, 상기 GDF11은 섬유아세포의 증식촉진에 의하여 유발될 수 있는 창상치료효과, 피부재생효과, 주름개선효과 등을 촉진할 수 있을 것으로 분석되었다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 피부재생용, 주름개선용 및 창상 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 GDF11의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 1 X 10-9 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 피부재생용, 주름개선용 및 창상 치료용 약학 조성물과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 다른 하나의 양태로서 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료방법을 제공한다.
본 발명의 용어 "개체"란 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료가 요구되는 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있으나, 상기 질환이 발명된 개체 중에서 인간을 제외한다.
본 발명의 용어 "치료"란, 본 발명의 GDF11을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물을 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료가 요구되는 개체에 투여하여 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료가 수행되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 피부재생, 주름개선 또는 창상 치료용 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 GDF11이 변성 또는 분해될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것으로, 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유ㆍ고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균ㆍ살충제 등이 이에 포함된다. 본 발명의 의약외품 조성물의 종류나 제형은 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 소독 청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제 비누, 핸드 워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터 충진제 등일 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 GDF11은 상술한 바와 같이, 섬유아세포의 증식을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 섬유아세포의 증식에 의하여 유발되는 피부재생, 주름개선 또는 창상 개선효과를 나타내는 기능성 화장품의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 기능성 화장품은 다양한 기능성 화장품 중에서 피부재생, 주름개선, 창상개선 효과를 나타내어 피부노화 방지에 도움을 주는 제품을 의미하고, 일 례로서 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장품이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않고, 상기 기능성 화장품에 포함되는 GDF11의 함량 역시 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 기능성 화장품은 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 유효성분으로 포함하고, 통상적으로 사용되는 화장료를 추가로 함유할 수 있는데, 예를 들면 수용성 스킨제제화를 위하여 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 솔비톨, 폴리에틸렌글리콜, 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 로커스트빈검, 알란토인, 카라기난 등을 첨가할 수 있으며; 점도와 경도조절제로 밀납, 파라핀 왁스, 스테아릴알콜, 카르나우바 왁스, 칸데릴라 왁스 및 칼슘스테아레이트, 알루미늄스테아레이트, 아연스테아레이트, 위치하젤(witchhazel) 등을 사용할 수 있고; 자외선 흡수제로 부틸메톡시디벤조일메탄, 옥틸메톡시신나메이트 등을 사용할 수 있으며; 안료로는 이산화티탄, 미립자 이산화디탄, 카올린, 나이론 파우다, 탈크, 세리사이트, 마이카, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 체질 안료와 황색산화철, 흑색산화철, 적색산화철, 울트라마린, 산화크롬, 수산화크롬 등의 착색안료를 사용할 수 있고; 보습제로 1,3-부틸렌글리콜, 농글리세린, 에틸렌글리콜 등과 키틴, 키토산, 히아론산, 하이알루로닌산, 젖산, 글리콜산 등의 천연보습 물질들을 이용할 수 있으며; 방부제로 파라옥시안식향산 에스테르류, 이미다졸리디닐우레아 등을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기한 성분들을 제품특성에 따라 1종 또는 2종이상 혼용 배합할 수도 있다.
본 발명의 기능성 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 섬유아세포 배양용 배지 조성물 및 상기 배지 조성물을 이용하여 섬유아세포를 배양하는 방법을 제공한다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액은 섬유아세포의 증식을 촉진시킬 수 있으므로, 상기 GDF11 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액은 섬유아세포를 배양하기 위한 배양용 배지 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 상기 섬유아세포를 배양하기 위한 배양용 배지 조성물을 사용하여 섬유아세포를 배양할 수 있다.
한편, 본 발명에서 제공하는 섬유아세포의 배양방법은 상기 섬유아세포 배양용 배지 조성물에 섬유아세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또 다른 하나의 양태로서 상기 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 GDF11의 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 GDF11의 제조방법은 (a) 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하고, 배양상등액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 배양상등액으로부터 GDF11을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 세포를을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 전반적인 행위를 의미한다.
본 발명의 목적상 상기 배양은 본 발명에서 제공하는 줄기세포를 배양하여 배양상등액으로 분비되는 GDF11을 제조하기 위한 목적으로 수행되며, 이러한 배양방법은 특별히 제한되지 않고, 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(pH 5 내지 9, 바람직하게는 pH 6 내지 8, 가장 바람직하게는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있으며, 배양온도는 특별히 이에 제한되지 않으나 일 예로서, 30 내지 40℃, 다른 예로서 33 내지 37℃, 또 다른 예로서 37℃가 될 수 있고, 배양시간 역시 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 5 내지 15일, 다른 예로서 7 내지 10일, 또 다른 예로서 7일이 될 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
또한, 줄기세포의 원활한 증식을 촉진할 수 있도록, EGF, bFGF, vEGF, TGF-β1 등의 다양한 성장인자를 상기 배지에 추가로 포함할 수 있다.
아울러, 배양물로부터 GDF11을 회수하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 GDF11 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하다.
본 발명에서 제공하는 GDF11은 인간 유래 성체 줄기세포 배양액에 포함되어 섬유아세포의 증식을 촉진시키는 효과를 나타내므로, 보다 다양한 피부재생용, 주름개선용 또는 창상 치료용 제품의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 증식능에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 사진(A), 흡광도 수준을 나타내는 그래프(B), 세포수 수준을 나타내는 그래프(C) 및 단백질 발현총량의 수준을 나타내는 그래프(D)이다.
도 2는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 이동성에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 3a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 단백질 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 3b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 RT-PCR 분석사진이다.
도 4a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)의 창상 치료효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
도 4b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 창상 동물모델의 창상부위의 면적을 비교한 결과를 나타내는 조직사진이다.
도 5의 a는 RT-PCR 및 realtime qPCR을 수행하여 섬유아세포(HDF), 인간 지방 유래 줄기세포(AD-MSC) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 발현되는 GDF11 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5의 b는 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6의 a는 대조군(CTL)으로 사용된 인간 골수 유래 줄기세포 배양액(BM-MSC CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)에 포함된 GDF11의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이고, 도 6의 b는 상기 웨스턴블럿 분석결과를 정량분석한 그래프이다.
도 7의 a는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 GDF11의 효과를 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 발현억제에 따른 콜라겐의 발현수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은 대조군(a), EGF(b), bFGF(c), TGF-beta1(d) 또는 vEGF(e)이 처리된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 처리시간 및 농도에 따른 GDF11의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 GDF11이 처리된 섬유아세포에서 섬유아세포의 증식수준(도 9의 a), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제1형 콜라겐의 발현수준(도 9의 b 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준(도 9의 c 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 엘라스틴의 발현수준(도 9의 d 및 f) 및 상기 섬유아세포에서 발현되는 MMP1의 발현수준(도 9의 e 및 f)을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 줄기세포 배양액의 수득
실시예 1-1: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액의 수득
제대혈로부터 분리된 인간 제대혈 줄기세포(1.89 X 105 세포수)를 10% FBS를 포함하는 EGM-2(endothelial growth medium)에 접종하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 48시간 동안 배양하고, 배양된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 다시 H1 배지에 접종하고, 96시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액을 수득하였다. 이때, H1 배지로는 EGF, bFGF, vEGF 및 TGF-β1을 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다.
실시예 1-2: 인간 지방 유래 줄기세포 배양액의 수득
흡입지방조직을 PBS로 세척하고, 1㎕/㎖의 프리모신(primocin) 및 1mg/㎖의 제1형 콜라게나아제를 가한 다음, 37℃에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 원심분리(2000rpm, 5분)하여 침전된 세포를 수득하고, 상기 세포를 배양액(0.2% primocin, 1% glutamax 및 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지)에 현탁시키고, 여과한 다음, 다시 원심분리(1000rpm, 5분)하여 침전된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 용해완충액(ACK lysing buffer, Gibco)에 넣고 1분 동안 반응시켰다. 이어, 상기 세포(1.89 X 105 세포수)를 PBS로 세척하고, K-NAC 배지(5% FBS, 20mM ascorbic acid 1% 및 400mM N-acetyl-L-cysteine 0.5%를 포함하는 keratinocyte-SFM media)에 접종하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서, 48시간 동안 배양하고, 배양된 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 다시 무혈청배지(H1 media, DMEM 배지)에 접종하고, 96시간 동안 배양한 다음, 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 수득하였다.
실시예 2: 섬유아세포의 증식능에 대한 세포 배양액의 효과
섬유아세포(HDFs)를 96-웰 플레이트에 각 웰당 1 X 103 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 가하고 72시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로는 H1 배지를 가하고 배양한 것을 사용하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양물에 CCK-8 kit에 포함된 CCK-8 10㎕를 가하고, 3시간 동안 반응시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하여 각 섬유아세포의 증식능을 측정 및 비교하였다(도 1).
도 1은 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 증식능에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 사진(A), 흡광도 수준을 나타내는 그래프(B), 세포수 수준을 나타내는 그래프(C) 및 단백질 발현총량의 수준을 나타내는 그래프(D)이다. 도 1에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포 배양액(HDF CM) 또는 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 보다도 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 세포로부터 분비되는 단백질 총량 또한 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실시예 3: 섬유아세포의 이동성 분석
섬유아세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지를 제거하고, 배양용기의 바닥에 스크래치를 형성시킨 다음, PBS로 세척하였다. 이어, 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 가하고 72시간 동안 배양하였다. 이때, 대조군으로는 H1 배지를 가하고 배양한 것을 사용하였다. 배양이 종료된 후, 상기 스크래치 부위로 이동된 섬유아세포의 수준을 현미경으로 확인하였다(도 2).
도 2는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포의 이동성에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 현미경 사진이다. 도 2에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포 배양액(HDF CM) 또는 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 보다도 섬유아세포의 이동성을 촉진시킴을 확인하였다.
실시예 4: 섬유아세포의 기질단백질의 발현분석
실시예 4-1: 웨스턴블럿 분석
섬유아세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 가하고 24시간 동안 배양한 다음, 배양된 각 섬유아세포를 대상으로 제1형 콜라겐(collagen I), 제4형 콜라겐(collagen IV), 피브로넥틴(Fibronectin) 또는 엘라스틴(Elastin)에 대한 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 3a). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
도 3a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 단백질 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 3a에서 보듯이, 피브로넥틴과 엘라스틴은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 섬유아세포에서 상대적으로 가장 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 4-2: RT- PCR 분석
상기 실시예 4-1에서 배양된 각 섬유아세포로부터 총 RNA를 수득하고, RT-Premix(Bioneer)를 이용하여 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 cDNA를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, mRNA 수준에서 제1형 콜라겐(Type I collagen), 제3형 콜라겐(Type III collagen) 또는 피브로넥틴(Fibronectin)의 발현수준을 비교하였다(도 4b). 이때, 내부대조군으로는 GAPDH를 사용하였다.
collagen type I F: 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3'(서열번호 1)
collagen type I R: 5'-tcaaggtttccaaggacctg-3'(서열번호 2)
collagen type III F: 5'-aaaggggagctggctacttc-3'(서열번호 3)
collagen type III R: 5'-gcgagtaggagcagttggag-3'(서열번호 4)
fibronectin F: 5'-tgaagaggggcacatgctga-3'(서열번호 5)
fibronectin R: 5'-gtgggagttgggctgactcg-3'(서열번호 6)
도 3b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 섬유아세포에서 발현되는 다양한 기질단백질의 발현수준에 미치는 영향을 비교한 결과를 나타내는 RT-PCR 분석사진이다. 도 3b에서 보듯이, 제3형 콜라겐과 피브로넥틴은 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 섬유아세포에서 상대적으로 가장 높은 수준으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 5: 창상 동물모델의 치료효과 분석
먼저, 5주령의 누드마우스 등쪽에 바이옵시 펀치(biopsy Punch)를 이용하여 6mm 피부 전층박리상처를 유도하여, 창상 동물모델을 제작하였다.
24시간이 경과된 후, 상기 제작된 창상 동물모델의 창상부위에 각각 200㎕의 섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 도포하고 실리콘 밴드를 사용하여 창상부위에 상기 각 배양액을 고정시켰다. 72시간 후에 동일한 작업을 반복수행하였다. 이때, 대조군으로는 H1 배지를 도포한 창상 동물모델을 사용하였다. 끝으로, 상기 도포된 창상 동물모델을 7일 동안 사육한 다음, 상처크기의 감소수준을 비교하였다(도 4a).
도 4a는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)의 창상 치료효과를 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 4a에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 가장 우수한 창상치료효과를 나타냄을 확인하였다.
한편, 상기 동물모델의 창상부위를 적출하고, 창상부위의 단면을 비교하였다(도 4b).
도 4b는 대조군(CTL), 섬유아세포 배양액(HDF CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 처리된 창상 동물모델의 창상부위의 면적을 비교한 결과를 나타내는 조직사진이다. 도 4b에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)이 가장 우수한 창상치료효과를 나타냄을 다시한번 확인하였다.
실시예 6: GDF11 (growth differentiation factor 11)에 대한 분석
실시예 6-1: GDF11에 대한 RT- PCR 분석
H1 배지를 사용하여 배양된 섬유아세포, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포로부터 각각의 총 RNA를 수득하고, 이로부터 각각의 cDNA를 합성하였다. 상기 합성된 각 cDNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용한 realtime qPCR 및 PCR을 수행하여 GDF11의 mRNA 수준을 비교하였다(도 5의 a 및 b). 이때, 내부대조군으로는 RPL13A를 사용하였다.
GDF11 F: 5'-gatcctggacctacacgacttc-3'(서열번호 7)
GDF11 R: 5'-ggccttcagtacctttgtgaac-3'(서열번호 8)
RPL13A F: 5'-gcacgaccttgagggcagcc-3'(서열번호 9)
RPL13A R: 5'-catcgtggctaaacaggtactg-3'(서열번호 10)
도 5의 a는 RT-PCR 및 realtime qPCR을 수행하여 섬유아세포(HDF), 인간 지방 유래 줄기세포(AD-MSC) 또는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 발현되는 GDF11 mRNA 수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 5의 b는 RT-PCR을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 5의 a 및 b에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(UCB-MSC)에서 GDF11가 대량으로 발현됨을 확인하였다.
실시예 6-2: GDF11에 대한 웨스턴블럿 분석
섬유아세포 배양액, 실시예 1-1에서 수득한 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 실시예 1-2에서 수득한 인간 지방 유래 줄기세포 배양액을 여과한(0.22um syringe filter) 다음, 이들 각 배양액을 농축하고, 농축된 각 배양액을 대상으로 GDF11에 대한 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6의 a 및 b).
도 6의 a는 대조군(CTL)으로 사용된 인간 골수 유래 줄기세포 배양액(BM-MSC CM), 인간 지방 유래 줄기세포 배양액(AD-MSC CM) 또는 인간 제대혈 유래 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)에 포함된 GDF11의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이고, 도 6의 b는 상기 웨스턴블럿 분석결과를 정량분석한 그래프이다. 도 6a 및 6b에서 보듯이, 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 배양액(UCB-MSC CM)에 상대적으로 높은 수준의 GDF11가 포함되어 있음을 확인하였다.
실시예 7: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 기능분석
실시예 7-1: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 GDF11의 기능분석
인간 제대혈 줄기세포를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 배양된 세포에 각각 25nM의 대조군 siRNA 또는 GDF11에 대한 siRNA(siGDF11)를 처리하고, 72시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 각 세포를 계대배양한 후, 동일한 조건의 siRNA를 각각 처리하고 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 세포를 수득하고, 이를 24웰 플레이트에 각 웰당 4 X 104 세포수의 밀도로 접종한 다음, 2일 동안 배양하면서, 실시예 2의 방법에 따라, 이들 세포의 증식능을 비교하고(도 7의 a), 실시예 4-1 및 6-1의 방법에 따라 상기 각 세포에서 발현되는 GDF11, 제1형 콜라겐(collagen I) 및 제3형 콜라겐(collagen III)의 mRNA 수준을 비교하였다(도 7의 b). 이때, 내부대조군으로는 RPL13A를 사용하였다.
도 7의 a는 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식에 미치는 GDF11의 효과를 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 발현억제에 따른 콜라겐의 발현수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 7의 a에서 보듯이, GDF11의 발현이 감소되면 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 증식속도가 감소됨을 확인하였고, 도 7의 b에서 보듯이, GDF11의 발현이 감소되면 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 제3형 콜라겐의 발현수준이 감소됨을 확인하였다.
실시예 7-2: 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11의 발현기전 분석
인간 제대혈 줄기세포를 100mm 배양용기에 5 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 80 내지 90%의 포화도가 되면, 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 X 105 세포수의 밀도로 접종하고, 24시간 동안 배양하였다. 이어, 100X 글루타맥스(glutamax)를 포함하는 DMEM 배지로 교체하고, EGF, bFGF, vEGF 또는 TGF-beta1을 각각 1 또는 10ng/㎖의 농도로 처리하였으며, 1, 3 및 6일 동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 각 세포로부터 총 RNA를 수득하고, 이로부터 cDNA를 합성한 다음, SYBR Green PCR 장치를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다(도 8의 a 내지 e). 이때, 대조군으로는 H1 배지를 처리한 세포를 사용하였다.
도 8은 대조군(a), EGF(b), bFGF(c), TGF-beta1(d) 또는 vEGF(e)이 처리된 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 처리시간 및 농도에 따른 GDF11의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8에서 보듯이, 각각의 경우에 모두 GDF11발현이 증가함을 확인하였고, 6일차때 가장 높은 발현을 확인하였다. 또한, 상기 4가지 인자를 동시에 처리한 경우 발현이 더욱 증가함을 확인하였다.
이러한 결과는, 상기 4가지 인자가 제대혈 유래 중간엽 줄기세포에서 GDF11발현 조절에 관여함을 암시하는 것으로 분석되었다.
실시예 8: 섬유아세포에서 GDF11의 기능분석
섬유아세포를 배양하면서, 0, 0.01, 0.1 또는 0.2㎍/㎖의 GDF11을 처리하고, 배양이 종료된 후, 섬유아세포의 증식수준, 상기 섬유아세포에서 발현되는 제1형 콜라겐의 발현수준, 상기 섬유아세포에서 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준, 상기 섬유아세포에서 발현되는 엘라스틴의 발현수준 및 상기 섬유아세포에서 발현되는 MMP1의 발현수준을 비교분석하였다(도 9).
도 9는 GDF11이 처리된 섬유아세포에서 섬유아세포의 증식수준(도 9의 a), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제1형 콜라겐의 발현수준(도 9의 b 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 제3형 콜라겐의 발현수준(도 9의 c 및 f), 상기 섬유아세포에서 발현되는 엘라스틴의 발현수준(도 9의 d 및 f) 및 상기 섬유아세포에서 발현되는 MMP1의 발현수준(도 9의 e 및 f)을 비교한 결과를 나타내는 그래프 및 사진이다. 도 9의 a에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 섬유아세포의 증식이 촉진되고, 도 9의 b 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 제1형 콜라겐의 발현이 촉진되지만, 과도하게 증가하면 오히려 발현이 억제됨을 확인하였으며, 도 9의 c 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 제3형 콜라겐의 발현이 촉진되고, 도 9의 d 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, 엘라스틴의 발현이 촉진되지만, 과도하게 증가하면 오히려 발현이 억제됨을 확인하였으며, 도 9의 e 및 f에서 보듯이, GDF11의 농도가 증가할 수록, MMP1의 발현이 억제되지만, 과도하게 증가하면 오히려 발현이 증가됨을 확인하였다.
상기 결과로부터, GDF11이 상기 콜라겐 및 엘라스틴이 관여하는 피부의 재생 및 주름개선을 촉진하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
<110> Kang Stem Biotech CO., LTD. <120> Composition comprising GDF11 and uses thereof <130> KPA160091-KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcaaggtttc caaggacctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcaaggtttc caaggacctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aaaggggagc tggctacttc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcgagtagga gcagttggag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgaagagggg cacatgctga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtgggagttg ggctgactcg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gatcctggac ctacacgact tc 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggccttcagt acctttgtga ac 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcacgacctt gagggcagcc 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catcgtggct aaacaggtac tg 22

Claims (16)

  1. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 약학 조성물.
  2. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 약학 조성물.
  3. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 유래 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    섬유아세포의 증식을 촉진시키는 것인 조성물.
  7. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 의약외품 조성물.
  8. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 의약외품 조성물.
  9. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 치료용 의약외품 조성물.
  10. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 피부재생용 화장료 조성물.
  11. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물.
  12. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 창상 개선용 화장료 조성물.
  13. GDF11(growth differentiation factor 11) 또는 이를 포함하는 인간 유래 성체 줄기세포 배양액을 포함하는 섬유아세포 배양용 배지 조성물.
  14. 제13항의 섬유아세포 배양용 배지 조성물에 섬유아세포를 접종하고 배양하는 단계를 포함하는, 섬유아세포의 배양방법.
  15. (a) 인간 유래 성체 줄기세포를 배양하고, 배양상등액을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득한 배양상등액으로부터 GDF11(growth differentiation factor 11)을 회수하는 단계를 포함하는, GDF11의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 인간 유래 성체 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반으로부터 유래된 것인 방법.
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