CN104161776A - 来自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其调节畜禽免疫应答的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种来自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其调节畜禽免疫应答的用途，先配制成质量百分比为1.5-2.5％的TX-114溶液备用；然后取8-16mL经45-50h培养的丁酸梭菌液离心分层得到菌体湿重；加入TX-114溶液离心得到脂磷壁酸的粗提取物；然后在DEAE-纤维素层析柱上过柱得到脂磷壁酸。本发明具有能够改善畜禽的肠道免疫功能，抑制病原菌在肠粘膜细胞表面的粘附定植，降低肠道传染病发病率，提高畜禽养殖业经济效益的优点。

Description

来自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其调节畜禽免疫应答的用途

技术领域：

本发明涉及调节畜禽免疫应答的丁酸梭菌细胞壁脂磷壁酸，所述免疫应答是由致病菌或其菌体成分诱导。 

背景技术：

肠道传染病是集约化畜禽养殖中最常见的传染病之一，主要由致病性大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌等病原引起。这类疾病的传染性强，死亡率高，对畜禽养殖业的危害十分严重。这些肠道传染病病原还可能从动物传播到人，引发人体肠道疾病，对消费者的身体健康造成潜在威胁。目前，饲料中添加抗菌药物仍是防治畜禽肠道传染病的主要手段。但这一防治手段带来的系列问题已成为社会关注的焦点：(1)长期使用抗菌药物导致病原菌产生耐药性，这给动物甚至人类传染性疾病防控带来了更大的困难；(2)会在畜禽肉蛋奶类产品产生抗菌药物残留，危害消费者的健康；(3)未被畜禽消化、吸收和降解的抗生素随动物粪便排出体外，对土壤、水体造成污染，间接危害消费者的健康。在传统的畜禽养殖过程中，畜禽肠道传染病的发生率则很低。这是因为正常动物肠道中生存者大量共生菌，这些共生菌能够通过群体效应，抑制病原菌在肠道中的粘附、定植与侵染，调控动物肠道免疫应答反应，防止肠道传染病的发生。基于这一背景，人们开发了多种微生态制剂，通过调节动物肠道菌群结构来防治动物肠道传染病。微生态制剂具有不导致细菌产生耐药性、无残留、环境友好等优点，但微生态制剂的作用效果受动物种类、年龄、养殖环境、饲料加工方式和投喂方式等多种因素影响，不易于实施。 

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能够改善畜禽的肠道免疫功能，抑制病原菌在肠粘膜细胞表面的粘附定植，降低肠道传染病发病率，提高畜禽养殖业经济效益的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸。 

本发明运用TritonX-114破碎丁酸梭菌细胞，再用离子交换树脂分离纯化脂磷壁酸，进而利用截留分子量为3500的半透膜进行透析，除去其中的杂质，获得纯的脂磷壁酸；具体制备步骤包括： 

(1)向40-60mmol/L、pH6-7的Tris-HCl缓冲液中加TritonX-114(TRITONX-114CAS:9036-19-5)，配制成质量百分比为1.5-2.5％的TX-114溶液(即TRITONX-114质量百分比为1.5-2.5％的TRITONX-114溶液)，置于4℃冰箱保存，备用； 

(2)取8-16mL经45-50h培养的丁酸梭菌液于若干支质量已知的塑料离心管中，常温、4500-5000rpm离心25-40min，除去上层培养液后再称各管质量，计算得到菌体湿重； 

(3)按照每1g湿菌(步骤2的菌体)添加8-12mL步骤(1)的1.5-2.5％％TX-114溶液的比例混合，磁力搅拌器搅拌裂解菌体25-40min，4℃静置过夜；然后4℃、4500-5000rpm离心25-40min，去除细菌碎片，收集上层提取物；提取物置于45-50℃水浴中25-30min，然后常温4500-5000rpm离心25-40min，收集上层水相，即为脂磷壁酸的粗提取物； 

(4)先用0.1M(mol/L)pH4.7的醋酸铵缓冲液预平衡DEAE-纤维素层析柱(2×20cm即直径×长度)，然后向脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其体积的0.1MpH4.7的醋酸铵缓冲液，稀释后过柱；用同一缓冲液(0.1MpH4.7的醋酸铵缓冲液)洗脱，直到洗脱液275nm吸光度A275低于0.01，然后用1.0mol/LpH4.7醋酸铵缓冲液洗脱结合于柱上的脂磷壁酸，整个过程用试管收集洗脱液，A₂₇₅监测脂磷壁酸洗脱峰；得到脂磷壁酸。 

作为优选，本发明步骤(1)的Tris-HCl缓冲液为50mmol/L、pH6.5，TX-114溶液质量百分比浓度为2％。 

作为优选，步骤(3)每1g湿菌添加10mL的2％TX-114溶液。 

本发明步骤(2)的丁酸梭菌液培养条件为：37℃厌氧培养，其培养基为MRS培养基，MRS培养基配方：酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温-801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸锰0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20g、蒸馏水1000mL，pH7.0。 

本发明将丁酸梭菌脂磷壁酸用于畜禽养殖中进行应用即来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在畜禽养殖中的应用，该脂磷壁酸在畜禽饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计，为10⁸cfu/g-10¹⁰cfu/g(是“10⁸cfu/g-10¹⁰cfu丁酸梭菌菌体中的磷壁酸成分”的意思；也就是说，原来是直接添加菌体的，现在改为添加同样数量菌体中的磷壁酸成分)。 

本发明上述丁酸梭菌脂磷壁酸在调节畜禽免疫应答中的应用，所述的免疫应答由致病性革兰氏阳性菌和阴性菌或它们的衍生物所诱导。 

本发明所述的脂磷壁酸与其他革兰氏阳性菌的细胞壁脂磷壁酸结构存在差异，该脂磷壁酸不会引起肠粘膜上皮细胞释放炎症因子，所述的炎症因子为IL-2和TNF-α。 

本发明的丁酸梭菌为日本米雅利桑株式会社的MIYAIRIⅡ588菌株。 

本发明的优点和有益效果： 

1.本发明从水产动物的免疫机能调节机制出发，研究了丁酸梭菌脂磷壁酸对病原菌脂多糖诱导的肠粘膜上皮细胞IL-2、TNF-α等炎症因子分泌的影响，分析了丁酸梭菌脂磷壁酸对仔猪、肉鸡攻毒试验的保护作用，证明该脂磷壁酸能够抑制病原技能脂多糖诱导的肠粘膜上皮细胞炎症因子的释放，显著降低致病菌导致的仔猪、肉鸡发明率和死亡率，具有成为新型畜禽免疫调节剂的潜力，市场前景十分看好。 

2.本发明基于益生菌的益生作用机制，分离纯化丁酸梭菌的细胞壁脂磷壁酸，用以调节畜禽肠道免疫机能，防治畜禽肠道传染病。脂磷壁酸是革兰氏阳性菌细胞壁的主要组成成分之一，是一类由多聚磷酸甘油酯或多聚磷酸核糖醇构成的阴离子聚合物，其链上羟基往往被丙氨酸或N-乙酰葡萄糖胺修饰，因此通常还带有正电荷，形成正、负电荷交替出现的链状聚合物结构。磷壁酸对革兰氏阳性菌的生理功能主要包括：(1)维持细菌细胞壁中阳离子的浓度平衡；(2)保护细菌免受抗生素、表面活性剂、溶菌酶和热应激等的损伤；(3)参与细菌细胞分裂，并在参与细菌自溶过程；(4)在革兰氏阳性菌与宿主细胞的互作及免疫调节过程中发挥着十分重要的作用。不同细菌来源的脂磷壁酸结构与性质呈现很大差异。金黄色葡萄球菌脂磷壁酸能够人全血细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等因子的分泌(Morath等，2001，The Journal of Experimental Medicine，193(3):393-398；Hermann等，2002，European Journal of Immunology，32(2):541-551)。肺炎链球菌脂磷壁酸刺激机体细胞产生TNF-α的能力比金黄色葡萄球菌脂磷壁酸弱，这可能是二者结构不同的缘故(HAN等，2003，Infection and Immunity,，71(10):5541-5548)。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)脂磷壁酸则能够抑制金黄色葡萄球菌磷壁酸诱导的TNF-α产生(Kim等，2008，Journal of Microbiology and Biotechnology，18(6):1191-1196)。也有研究发现，植物乳杆菌磷壁酸能够刺激巨噬细胞一氧化氮(NO)的产生，从而发挥抗炎症作用(Kang等，2011，Molecular Immunology,48:2170-2177)。 

3.本发明分离纯化肠道共生菌丁酸梭菌的脂磷壁酸，该脂磷壁酸能够改善畜禽的肠道免疫功能，抑制病原菌在肠粘膜细胞表面的粘附定植，降低肠道传染病发病率，提高畜禽养殖业经济效益。 

附图说明

图1、丁酸梭菌脂磷壁酸对大肠杆菌脂多糖诱导的肠粘膜上皮组织IL-2分泌的影响。 

图2、丁酸梭菌脂磷壁酸对大肠杆菌脂多糖诱导的肠粘膜上皮组织TNF-α分泌的影响。 

图3丁酸梭菌脂磷壁酸对沙门氏菌感染肉仔鸡回肠组织抗体水平的影响。 

图4丁酸梭菌脂磷壁酸对EPEC诱导仔猪肠粘膜组织IL-1βmRNA表达量的影响。 

图5丁酸梭菌脂磷壁酸对EPEC诱导仔猪肠粘膜组织TNF-αmRNA表达量的影响。 

图6丁酸梭菌脂磷壁酸对EPEC所致仔猪腹泻率的影响。 

图7丁酸梭菌脂磷壁酸的红外光谱图。 

图8丁酸梭菌菌脂磷壁酸的1HNMR谱图。 

具体实施方式

下面通过实施例进一下详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。 

1、丁酸梭菌脂磷壁酸的提取制备方法 

以50mmol/L、pH6.5Tris-HCL缓冲液加TritonX-114配制成2％TX-114溶液，4℃冰箱保存，备用。取10mL经48h培养的丁酸梭菌液(37℃厌氧培养，其培养基为MRS培养基，MRS培养基配方：酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温-801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸锰0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20g、蒸馏水1000mL，pH7.0)于若干支质量已知的塑料离心管中，常温、5000rpm离心30min，除去上层培养液后再称各管质量，计算得到菌体湿重。按照每1g湿菌添加10mL2％TX-114溶液的比例，磁力搅拌器搅拌裂解菌体30min，4℃静置过夜。4℃、5000rpm离心30min，去除细菌碎片，收集上层提取物。提取物50℃水浴30min，常温5000rpm离心30min，轻轻收集上层水相，即为磷壁酸的粗提取物。用0.1MpH4.7的醋 酸铵缓冲液预平衡DEAE-纤维素层析柱(2×20cm)，磷壁酸粗提取物中加入5倍体积的醋酸铵缓冲液，稀释后过柱。用同一缓冲液洗脱，直到洗脱液275nm吸光度A₂₇₅低于0.01，用1.0mol/LpH4.7醋酸铵缓冲液洗脱结合于柱上的磷壁酸，整个过程用试管收集洗脱液，A₂₇₅监测磷壁酸洗脱峰。通过红外和核磁检测，如图7和8所示，得出本发明上述方法获得了丁酸梭菌脂磷壁酸。 

2、肠粘膜组织的分离培养 

新生仔猪心脏采血致死，肉仔鸡则取19日鸡胚。无菌操作取出回肠、结肠组织，以置于含2ug/mL抑肽酶(aprotinin)的pH7.4的PBS中保存，用4℃pH7.4的PBS洗涤数次，小心地将组织切成1cm²的小块。将组织块置于细胞培养板中培养，使其贴壁生长，用于后续研究。 

3、按照相当于丁酸梭菌10⁸cfu/mL到10¹⁰cfu/mL的量，添加丁酸梭菌脂磷壁酸溶液到仔猪及肉鸡肠粘膜组织培养板中，37℃孵育30min后，添加100ng/mL大肠杆菌脂多糖(LPS)，37℃孵育24小时后，分析其IL-2、IL-8、TNF-α等炎症因子的水平。本试验中，未经任何处理的肠粘膜上皮组织为对照组(C)、大肠杆菌LPS处理组(T0)、相当于10⁸cfu/mL丁酸梭菌的脂磷壁酸+LPS组(T1)、相当于10⁹cfu/mL丁酸梭菌的脂磷壁酸+LPS组(T2)、相当于10¹⁰cfu/mL丁酸梭菌的脂磷壁酸+LPS组(T3)。 

IL-2水平的分析采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。将标准品、待测样本加入到预先包被鸡(猪)白细胞介素2(IL-2)单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物(TMB)在辣根过氧化物酶(HRP)催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中鸡(猪)白细胞介素2(IL-2)浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中鸡(猪)白细胞介素2(IL-2)含量。结果如图1。 

白细胞介素2(IL-2)是由多种细胞受到刺激后产生的一种前炎症因子，能够刺激机体发生炎症反应。由图1可知，添加丁酸梭菌脂磷壁酸能够显著降低大肠杆菌LPS刺激的鸡、猪肠粘膜上皮细胞炎症因子IL-2的分泌，调节动物机体免疫应激反应，从而保护动物机体健康。 

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种重要的前炎性因子，能够导致机体发生炎症反应， 致病菌脂多糖能够通过刺激多种细胞分泌TNF-α，从而诱导机体发生炎症。由图2可知，丁酸梭菌脂磷壁酸能够显著抑制由大肠杆菌LPS导致的TNF-α的分泌，这说明丁酸梭菌的脂磷壁酸成分能够通过抑制肠粘膜组织炎症因子TNF-α的分泌，发挥抗炎症作用。 

4、按照相当于10⁸cfu/g到10¹⁰cfu/g的菌量，在畜禽饲料中添加丁酸梭菌脂磷壁酸，7日龄AA肉鸡每只每天灌服5.0×10⁴cfu沙门氏菌进行攻毒试验，试验期为14天，分析肉仔鸡发病率、死亡率和肠道粘膜免疫应答水平变化，确定丁酸梭菌脂磷壁酸对AA肉鸡的保护作用。 

表1丁酸梭菌脂磷壁酸对AA肉鸡病死率的影响(％) 

在攻毒试验中，T1组添加相当于10⁸cfu/g丁酸梭菌的脂磷壁酸，T2组添加相当于10⁹cfu/g丁酸梭菌的脂磷壁酸，T3组添加相当于10¹⁰cfu/g丁酸梭菌的脂磷壁酸。 

由表1可知，丁酸梭菌脂磷壁酸能够显著降低沙门氏菌导致的AA肉鸡死亡率和白痢发生率，这可能是由于该磷壁酸成分能够抑制沙门氏菌在肉鸡肠道中的定植，并能够调节其肠道免疫应答反应，提高机体免疫机能。 

从图3可以看出，沙门氏菌感染后，回肠组织IgG水平显著升高，SIgA的水平则没有显著变化。日粮添加丁酸梭菌脂磷壁酸则可以显著提高各感染组的抗体水平，这说明丁酸梭菌脂磷壁酸能够刺激机体免疫机能，产生相关抗体，以抑制病原菌对机体的侵 染。 

5、选取120头28日龄断乳仔猪，按照10⁹cfu/头的剂量灌服致病性大肠杆菌(EPEC)，进行攻毒试验。C组为未攻毒的空白对照组，T0感染对照组，T1组添加相当于10⁸cfu/g丁酸梭菌的脂磷壁酸，T2组添加相当于10⁹cfu/g丁酸梭菌的脂磷壁酸，T3组添加相当于10¹⁰cfu/g丁酸梭菌的脂磷壁酸，进行为期21天的饲养试验。饲养试验结束后，取仔猪回肠粘膜组织、血清，分别测定其IL-1β、TNF-α及免疫球蛋白的表达水平，并统计仔猪腹泻发生率。 

表2丁酸梭菌脂磷壁酸对仔猪血清免疫球蛋白水平的影响(mg/mL) 

由表2可见，添加丁酸梭菌脂磷壁酸的T1、T2、T3组攻毒仔猪血清中IgG、IgA、IgM等抗体的水平显著上升，这说明该脂磷壁酸能够刺激仔猪机体的免疫机能，促进抗体的合成和分泌，从而提升仔猪对抗病原的能力。 

本研究运用荧光定量PCR技术，研究了丁酸梭菌脂磷壁酸对致病性大肠杆菌诱导的仔猪肠粘膜组织IL-1β、TNF-αmRNA表达的影响，结果如图4、5。 

从图4、图5可以看出，攻毒对照组(T0)仔猪肠粘膜组织IL-1β、TNF-α等2种炎症因子mRNA的水平显著升高(P＜0.01)，丁酸梭菌脂磷壁酸能够显著抑制由致病性大肠杆菌因子的肠粘膜组织炎症因子的升高，当日粮中脂磷壁酸添加量相当于10¹⁰cfu/g丁酸梭菌时，其TNF-α的表达水平已接近未攻毒的空白对照组，作用效果显著。这些结果表明，丁酸梭菌脂磷壁酸可以通过调节肠粘膜组织炎症因子的表达，发挥免疫调节作用，抑制致病菌引起的炎症反应。 

从图6可以看出，每头每天灌服10⁹cfuEPEC可以引起断乳仔猪腹泻(P＜0.01)，而日粮添加丁酸梭菌脂磷壁酸可以显著降低EPEC引起的仔猪腹泻发生率(P＜0.01)，这说明丁酸梭菌脂磷壁酸具有很好的防治仔猪腹泻的效果，具有开发成为一种新型安全添加剂的潜力。 

Claims (7)

1.一种来自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于：该脂磷壁酸为由如下制备步骤制备而成的脂磷壁酸：

(1)向40-60mmol/L、pH6-7的Tris-HCl缓冲液中加TritonX-114，配制成质量百分比为1.5-2.5％的TX-114溶液，置于4℃冰箱保存，备用；

(2)取8-16mL经45-50h培养的丁酸梭菌液于若干支质量已知的塑料离心管中，常温、4500-5000rpm离心25-40min，除去上层培养液后再称各管质量，计算得到菌体湿重；

(3)按照步骤(2)制得的每1g湿菌添加8-12mL步骤(1)的1.5-2.5％％TX-114溶液的比例混合，磁力搅拌器搅拌裂解菌体25-40min，4℃静置过夜；然后4℃、4500-5000rpm离心25-40min，去除细菌碎片，收集上层提取物；提取物置于45-50℃水浴中25-30min，然后常温4500-5000rpm离心25-40min，收集上层水相，即为脂磷壁酸的粗提取物；

(4)先用0.1mol/LpH4.7的醋酸铵缓冲液预平衡DEAE-纤维素层析柱，然后向脂磷壁酸粗提取物中加入5倍其体积的0.1MpH4.7的醋酸铵缓冲液，稀释后过柱；用同一缓冲液洗脱，直到洗脱液275nm吸光度A275低于0.01，然后用1.0mol/LpH4.7醋酸铵缓冲液洗脱结合于柱上的脂磷壁酸，整个过程用试管收集洗脱液，A275监测脂磷壁酸洗脱峰；得到脂磷壁酸。

2.根据权利要求1所述的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于：该脂磷壁酸与其他革兰氏阳性菌的细胞壁脂磷壁酸结构存在差异，该脂磷壁酸不会引起肠粘膜上皮细胞释放炎症因子，所述的炎症因子为IL-2和TNF-α。

3.根据权利要求1所述的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于：步骤(1)的Tris-HCL缓冲液为50mmol/L、pH6.5，TX-114溶液质量百分比浓度为2％。

4.根据权利要求1所述的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于：步骤(3)中每1g湿菌添加10mL的2％TX-114溶液。

5.根据权利要求1所述的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸，其特征在于：步骤(2)的丁酸梭菌液培养条件为：37℃厌氧培养，其培养基为MRS培养基，MRS培养基配方：酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、吐温-801g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸锰0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

6.一种权利要求1所述的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在畜禽养殖中的应用，该脂磷壁酸在畜禽饲料中的添加量以丁酸梭菌的量计，为108cfu/g-1010cfu/g。

7.一种权利要求1所述的来自丁酸梭菌的脂磷壁酸在在调节畜禽免疫应答中的应用，所述的免疫应答由致病性革兰氏阳性菌和阴性菌或它们的衍生物所诱导。