CN117701475A

CN117701475A - 一种猪源植物乳杆菌zhr8及其后生元

Info

Publication number: CN117701475A
Application number: CN202410103819.4A
Authority: CN
Inventors: 宦海琳; 闫俊书; 奚雨萌; 张凯; 涂远璐; 李晟
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2024-01-25
Filing date: 2024-01-25
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2044-01-25
Also published as: CN117701475B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌及后生元，具体公开了一种猪源植物乳杆菌ZHR8及其后生元。本发明的猪源植物乳杆菌，其为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum ZHR8，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20222002。本发明具有如下技术效果：1)植物乳杆菌ZHR8高产胞外多糖，菌体的表层蛋白和肽聚糖含量高。2)植物乳杆菌ZHR8及后生元显著抑制大肠杆菌在猪肠上皮细胞的黏附，占据肠道黏附位点，抵抗病原菌的侵袭，显著降低促炎细胞因子，缓解猪肠道细胞的免疫应激。3)ZHR8后生元提高仔猪生产性能，提高仔猪免疫球蛋白含量，减少促炎细胞因子的分泌，减轻仔猪的免疫应激，降低脂多糖应激的侵害，缓解仔猪肠黏膜的免疫屏障受损和机械屏障损伤。

Description

一种猪源植物乳杆菌ZHR8及其后生元

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种乳酸菌及后生元，具体公开了一种猪源植物乳杆菌ZHR8及其后生元。

背景技术

生猪产业是我国畜牧业发展的主导产业。但在“禁抗、非瘟”等环境下，仔猪面对各种应激，肠道疾病增加，免疫力下降，显著影响了生猪的养殖效益。乳酸菌作为动物消化道正常微生物区系中的优势菌群，通过调节机体免疫功能、肠道微生物稳态，增强宿主肠道健康、抵御应激能力，是国内外仔猪肠道微生态研究的热点之一。但是从目前益生菌的应用现状来看，乳酸菌不耐热，需要冻干工艺加工，生产成本高且乳酸菌冻干粉的抗逆性差，活性和效果的不稳定性，限制了其在畜禽养殖中的应用。

后生元是近几年为弥补益生菌在应用过程中出现的一些不足之处而提出的新理念，是指对宿主健康有益的无生命的微生物菌体成分和代谢产物，具有安全性高、稳定性高等优势。后生元不仅含灭活的微生物菌体成分，还含有益生菌在发酵过程中所产生的代谢产物。

目前，后生元主要集中在乳酸菌后生元。中国专利文献CN 116784419 A提供了饲用后生元制剂及其制备方法和应用，乳酸杆菌提高了仔猪的生长性能，但并未研究对病原菌的竞争抑制，也未提及对仔猪免疫性能的作用。中国专利文献CN 116904371A提供了一种促生长的丁酸梭菌与罗伊氏乳杆菌后生元复合物及其制备方法，丁酸梭菌-罗伊氏乳杆菌后生元复合物显著升高小鼠盲肠中微生物群落的多样性，显著降低有害菌的丰度，未提及对猪肠道细胞的影响，也未研究对仔猪生产的影响。

而在植物乳杆菌的研究方面，中国专利文献CN 109504619 A提供了一种植物乳杆菌及其应用，抑制了沙门氏菌在鸡肠道的黏附；中国专利文献CN 111635873A提供了一株植物乳杆菌、其微生态制剂及其制备方法，提高肉鸡的机体免疫力，对低致病性禽流感有预防作用，并且能够防治鸡毒支原体病；这两项专利均在肉鸡的免疫应激下，来研究肉鸡的免疫能力，但菌株都不是来自于猪肠道，都未提及对猪肠道细胞和猪免疫性能的影响。

中国专利文献CN 106906154 B提供了一株植物乳杆菌菌株及其饲料添加剂与饲料，能抑制大肠杆菌，提高仔猪生产性能，但未提及对猪肠道细胞的影响，也未研究在免疫应激下对仔猪免疫性能的影响。

中国专利文献CN 110835620A提供了一株植物乳杆菌及其应用，抵抗鼠伤寒沙门菌感染，提高仔猪增重，但未研究植物乳杆菌菌体和代谢产物对大肠杆菌黏附肠上皮细胞的影响，也未提及在免疫应激下对仔猪免疫性能的影响。中国专利文献CN 109777746A提供了从猪分离的菌株，包含了乳酸菌等菌株，抵抗病原菌，但未研究在免疫应激下对仔猪免疫性能的影响。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种猪源植物乳杆菌ZHR8及其后生元。

费苏在“乳酸菌在肠道内黏附定殖的研究进展”(《工业微生物》，2020，50(2))指出：乳酸菌黏附定殖主要是由于胞外多糖、菌体表层蛋白和肽聚糖等菌体及代谢产物。因此，后生元的关键环节在于乳酸菌菌体及其代谢产物，基于微生物对生境的适应性和特异性原理，筛选猪原籍乳酸菌，来源于动物肠道的原籍菌可发挥空间占位效应，占据致病菌的黏附位点，而基于乳酸菌菌体和代谢产物开发后生元制剂，可有效缓解当前仔猪生长中面临的免疫应激和肠道失衡等问题，提高生猪的生产效率。

本发明的第一个发明目的是提供一种猪源植物乳杆菌ZHR8(Lactobacillusplantarum ZHR8)。

本发明的第二个目的是提供猪源植物乳杆菌ZHR8后生元的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述猪源植物乳杆菌ZHR8或ZHR8后生元在制备饲料添加剂中的应用，特别是在制备用于仔猪养殖生产中缓解猪免疫应激的饲料添加剂中的应用。

本发明的猪源植物乳杆菌ZHR8(Lactobacillus plantarum ZHR8)，是从母猪回肠筛选出来的，具有肠道黏附力强、抑制大肠杆菌黏附的乳酸菌；该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学校内，植物乳杆菌LactobacillusplantarumZHR8，保藏号：CCTCC NO：M 20222002，保藏日期为：2022年12月23日。

本发明还提供了利用所述植物乳杆菌ZHR8制备液体后生元的方法，包括如下步骤：采取高密度发酵的方法，将活化好的植物乳杆菌ZHR8以2％接种于发酵培养基中，进行高密度发酵，培养32h，得到发酵液；培养过程中，分别在12h及20h补料至培养基葡萄糖浓度为20g/L，所得到的发酵液在65℃处理30min，得到液体合生元。

另外，本发明还提供了利用上述植物乳杆菌ZHR8制备后生元粉剂的方法，包括如下步骤：

1)高密度发酵：将活化好的植物乳杆菌ZHR8以2％接种于发酵培养基中，进行高密度发酵，培养32h，得到发酵液；培养过程中，分别在12h及20h补料至培养基葡萄糖浓度为20g/L；

2)干燥灭活：将步骤1)所得到的发酵液在65℃处理30min，再与10％辅美粉混合，进行喷雾干燥，获得植物乳杆菌ZHR8后生元粉。

在上述制备液体后生元以及制备后生元粉剂的方法中，

优选地，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨12g/L，牛肉粉6g/L，葡萄糖25g/L，磷酸氢二钾4g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸胺2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L。

优选地，所述的高密度发酵的发酵环境为：温度37℃，湿度70％，pH为5.5，通气量1.2vvm。

优选地，所述的补料培养基为100g/L葡萄糖。

优选地，喷雾干燥时，蠕动速度8rmp，进风150℃，

本发明还提供植物乳杆菌ZHR8或采用上述方法制备的植物乳杆菌ZHR8后生元在制备饲料添加剂中的应用，特别是在制备用于仔猪养殖生产中缓解猪免疫应激的饲料添加剂中的应用。

免疫应激又称免疫激发，包括亚健康状态下动物受到的各种病原侵袭，甚至是病原菌的感染、创伤和内部肿瘤等引起的免疫应激，免疫应激会造成动物厌食，易发疾病，代谢改变，生长减缓，饲养周期延长。本发明中涉及的免疫应激是采用大肠杆菌产生的内毒素——脂多糖来作为应激来源。

本发明的植物乳杆菌ZHR8，是根据微生物对生境的适应性和特异性原理本发明从母猪肠道筛选出来的，具有肠道黏附力强，高产胞外多糖、菌体表层蛋白和肽聚糖，抑制大肠杆菌黏附的性能，相对于现有技术，本发明的植物乳杆菌ZHR8及后生元具有如下预料不到的技术效果：

1)本发明的植物乳杆菌ZHR8高产胞外多糖，菌体的表层蛋白和肽聚糖含量高。

2)本发明的植物乳杆菌ZHR8显著抑制大肠杆菌的生长，且能显著抑制大肠杆菌在猪肠上皮细胞的黏附。

3)ZHR8后生元显著抑制大肠杆菌在猪肠上皮细胞的黏附，占据肠道黏附位点，抵抗病原菌的侵袭，显著降低促炎细胞因子，缓解猪肠道细胞的免疫应激。

4)ZHR8后生元提高仔猪平均日增重、平均日采食量，降低料重比，提高仔猪生产性能。

5)ZHR8后生元显著提高仔猪血清免疫球蛋白的含量，减少促炎细胞因子的分泌，减轻仔猪的免疫应激，降低脂多糖应激的侵害，缓解仔猪肠黏膜的免疫屏障受损和机械屏障损伤。

因此，本发明的植物乳杆菌及后生元能有效抑制大肠杆菌在猪肠上皮细胞的黏附，从肠黏膜机械屏障和免疫屏障等方面促进了仔猪肠道健康，减轻仔猪的免疫应激，提升仔猪的免疫性能，有效改善了当前仔猪生长中面临了免疫应激和肠道失衡等问题，可广泛应用于仔猪培育，提高养殖效益。

本发明涉及的微生物的保藏信息如下：

保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；

保藏单位地址：中国武汉；

分类命名：植物乳杆菌ZHR8(Lactobacillusplantarum ZHR8)；

保藏编号为CCTCC NO：M 20222002；

保藏日期为：2022年12月23日。

附图说明

图1为不同植物乳杆菌对大肠杆菌黏附猪肠上皮细胞的抑制作用。

图2为植物乳杆菌ZHR8不同组分对大肠杆菌黏附猪肠上皮细胞的抑制作用。

图3为不同植物乳杆菌对免疫抑制下IPEC-J2细胞因子的影响。

图4为植物乳杆菌ZHR8不同组分对免疫抑制下IPEC-J2细胞因子的影响。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的培养基购自北京奥博星生物技术有限公司。脂多糖来自sigma公司，其他试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1一株高产胞外多糖的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZHR8的筛选1.1分离纯化

称取1g母猪肠道食糜样品加入灭菌的99ml蒸馏水中，利用恒温摇床震荡1h，然后10倍梯度稀释，分别取10^-4、10^-5的样品稀释液涂布在MRS固体培养基上，培养48h，依据菌落的大小、形态和颜色，挑取MRS上生长的单菌落，进行过氧化氢酶实验及革兰氏染色。将过氧化氢酶阴性及革兰氏染色阳性者暂定为乳酸菌，于MRS固体培养基上继续划线纯化2次。-80℃保存于25％甘油的MRS培养基中，菌株分别命名为ZHR8。

1.2生理生化检测

乳酸菌ZHR8在起始pH值为3.0-8.0的培养基上能生长，在20-37℃条件下生长状况良好，在不大于6.5％NaCl的条件下生长状况良好。菌株ZHR8兼性异型发酵乳糖，能较好地利用葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、纤维二糖、麦芽糖、甘露糖、松三糖、核糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇，可缓慢利用淀粉，不能利用蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖，H₂S试验、吲哚试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验均为阴性。

1.3分子鉴定

将固体平板上培养48h的乳酸菌菌株ZHR8，采用菌落PCR扩增，进行16rRNA基因序列鉴定。引物选用细菌的16S rRNA基因扩增通用引物：27F和1492R。PCR反应体系为50μl：Premix Taq25μl，27F和1492R1μl，补充灭菌蒸馏水至50μl，直接将菌落加入反应体系，进行PCR扩增，得到PCR产物。将PCR产物送去测序，结果为SEQ ID NO：1所示序列。

经过序列分析，该菌鉴定为植物乳杆菌，植物乳杆菌ZHR8已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学校内，植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZHR8，保藏号：CCTCC NO：M 20222002，保藏日期为：2022年12月23日。

1.4ZHR8胞外多糖、肽聚糖和表层蛋白的测定

胞外多糖的测定：将活化好的植物乳杆菌ZHR8以2％接种于1L发酵培养基中，进行高密度发酵，发酵环境为：温度37℃，湿度70％，pH为5.5，通气量1.2vvm，培养32h，补料培养基为100g/L葡萄糖，优化补料策略为，在12h及20h补料至培养基葡萄糖浓度为20g/L。37℃培养32h后，离心10min去除沉淀菌体。上清液加入80％的三氯乙酸溶至终浓度为4％，过夜后，离心去除蛋白质沉淀。将上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置24h，离心取沉淀。沉淀用超纯水溶解，转移至14KDa透析袋中透析48h至多糖呈絮状沉淀析出，絮状物冷冻干燥后即为胞外多糖。用苯酚硫酸法测定多糖含量，用高效液相色谱法测定多糖的单糖组成结构。

肽聚糖的测定：将胞外多糖测定中的菌液4000r/min，离心20min弃去上清。用生理盐水洗涤菌泥得到菌体。菌体与10％三氯乙酸以1：10比例混合均匀，于沸水孵育60mim，待混合液完全冷却，4℃8000r/min离心10min，弃上清留沉淀。用蒸馏水洗涤沉淀3次，以去除残留三氯乙酸。将乙酸-乙酸钠溶液：氯仿：甲醇溶液以4：5：10的比例混合，再与菌体沉淀以20：1的混合均匀，室温静置24小时后，离心取沉淀。将沉淀以固液比1：5的比例溶于Tris-HCL溶液，加入3500U胰酶(1g/L)置于37℃振荡器中处理12h，6000r/min离心10min，留沉淀，真空冷冻干燥后即为肽聚糖。用苯酚硫酸法测定多糖含量。

表层蛋白的测定：将胞外多糖测定中的菌液离心，收集到沉淀菌泥。使用1/20菌液的5mol/L的LiCl溶液，洗涤菌泥并汇集到锥形瓶中，摇床处理(37℃200r/min 30min)，取出后离心取上清液，用0.22μm的滤膜过滤，并用截留分子量8-14KDa的透析袋透析，用10mol/L的硝酸银进行检测，直至没有白色沉淀析出。透析完成后于-20℃冰箱内预冻，随后于冻干机内冻干。采用Bradford法测定蛋白质含量。

经过上述测定，乳酸菌菌株ZHR8胞外多糖的产量为580mg/L。ZHR8胞外多糖是由葡萄糖、鼠李糖和甘露糖等单糖组成，含量分别为65.36％，17.17％和15.46％。表层蛋白含量约为17.32％，肽聚糖总糖含量为26.15％。

实施例2：植物乳杆菌ZHR8后生元的制备

一、液体后生元的制备，采用高密度发酵的方法：将活化好的植物乳杆菌ZHR8以2％接种于5L发酵培养基中，进行高密度发酵，发酵环境为：温度37℃，湿度70％，pH为5.5，通气量1.2vvm，培养32h，补料培养基为100g/L葡萄糖，优化补料策略为，在12h及20h补料至培养基葡萄糖浓度为20g/L，获得的发酵液活菌数达到1.2*10¹⁰CFU/ml，胞外多糖的产量为580mg/L，较优化前(接种于MRS培养基中培养24h)的发酵活菌数为7.6*10⁹CFU/ml，胞外多糖的产量为380mg/L有了显著提高，分别提高了57.9％和52.6％。所得到的发酵液在65℃处理30min，即得到液体后生元。

发酵培养基的配方为：蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨12g/L，牛肉粉6g/L，葡萄糖25g/L，磷酸氢二钾4g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸胺2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L。

二、后生元粉剂的制备：首先采用高密度发酵得到发酵液，过程以及所用的发酵培养基，与液体后生元的制备相同，除此之外，还包括干燥灭活这一步骤。

干燥灭活的方法：将所得到的发酵液在65℃处理30min，再与10％辅美粉混合，进行喷雾干燥，蠕动速度8rmp，进风150℃，获得植物乳杆菌ZHR8后生元粉剂。植物乳杆菌ZHR8后生元粉剂含有浓度为6.2*10¹⁰个/g植物乳杆菌ZHR8的细胞。

实施例3：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ZHR8及后生元的抑菌活性研究

将活化后的植物乳杆菌ZHR8按2％的接种量重新转接MRS培养基中，培养24小时得培养液，培养基经离心得上清液和菌体，菌体用等量生理盐水重悬得菌液，另取一份实施例2获得的液体后生元。

以细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌)为指示菌，以LB培养基作为指示细菌的培养基。将甘油保存的指示菌株活化。活化后的菌株按2％的接种量重新转接LA肉汤中，指示细菌37℃条件下培养24h，用生理盐水分别将指示菌液稀释至OD600吸光值为0.1。向培养皿中倾注10mL的高压灭菌过的水琼脂(1.5％琼脂)进行铺底，每个培养皿厚度均一，待素琼脂冷却凝固后，将灭菌后的牛津杯置于琼脂之上。吸取1mL指示菌菌液加入到100mL恒温至50±5℃的LB相应的琼脂培养基中，轻轻摇匀。将上述加过菌液的琼脂培养基倒入放有牛津杯的凝固的琼脂培养皿中，每个平皿倒20-25mL，待其冷却凝固。用镊子取出牛津杯，吸取200μL的ZHR8菌液、上清液和后生元注入到相应的孔内，设立MRS培养液为空白对照，同时在培养皿上做好标记，将培养皿放入4℃冰箱内放置2h进行样品的扩散。将培养皿分别移入37℃培养箱培养。在接下来的18h内观察ZHR8不同组分对指示病原菌的抑菌效果。

结果见表1，从表1可以看出，上清液和后生元对不同病原菌都有抑制作用，其中后生元的抑菌能力均高于菌液和上清液，抑菌圈均大于15mm，而且对大肠杆菌的抑制圈最大，抑菌圈为23.8mm，表明植物乳杆菌后生元对病原菌特别是大肠杆菌有很强的抑菌能力。

表1：植物乳杆菌ZHR8和后生元的抑菌活性(抑菌圈mm)

不同组分	大肠杆菌	沙门氏菌	金黄色葡萄球菌	李斯特菌
					菌液	10.8±0.3	—	—	—
上清液	19.8±0.4	13.1±0.4	15.3±0.4	14.1±0.6
					后生元	23.8±0.6	15.1±0.5	17.3±0.3	18.1±0.4

实施例4：植物乳杆菌ZHR8和后生元对大肠杆菌黏附猪肠上皮细胞的影响

猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞的培养：IPEC-J2细胞来自华拓细胞库，采用DMEM/F12基础培养基培养，并添加10％胎牛血清，5％CO₂、95％相对湿度的37℃细胞培养箱中，24h换液1次.待细胞贴壁生长至80％～90％后用0.25％胰酶消化，细胞传代3次左右后以5×10⁵个/孔的量接种于12孔细胞培养板中，待12孔板细胞培养至单层细胞时进行试验。

菌体悬液的准备：将活化后的植物乳杆菌ZHR8按2％的接种量重新转接MRS培养基，培养24小时得培养液，培养液经离心得上清液和菌体，菌体用等量生理盐水重悬得菌液，另取一份实施例2获得的液体后生元。大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37℃摇床培养8h得到大肠杆菌培养液，通过DMEM/F12调整大肠杆菌培养液的菌数为1*10⁷CFU/ml。同时，以植物乳杆菌WSCF1、植物乳杆菌ZRR、植物乳杆菌ER41等来源于人肠道、牧草和鹅肠道的植物乳杆菌作为对照，培养方式同植物乳杆菌ZHR8。植物乳杆菌WSCF1为人源模式菌株，保藏编号为ATCC BAA-793(购自ATCC)；植物乳杆菌ZRR保藏编号CCTCC No：M2016281(其已经在中国专利CN106148249B中公开)；植物乳杆菌ER41的保藏编号为CCTCC No：M 2021932(其已经在中国专利CN113717887B中公开)

植物乳杆菌竞争性抑制大肠杆菌对IPEC-J2的黏附：每孔细胞分别同时用1ml植物乳杆菌不同组分和1ml大肠杆菌菌悬液进行处理3h。同时设未经植物乳杆菌处理的为对照组。结束后用无菌PBS清洗3遍，彻底洗去未黏附的菌体后，用0.05％胰酶-EDTA消化细胞，终止消化后离心，弃上清，之后加入100ul0.2％Triton X-100的PBS缓冲液裂解细胞，用伊红美蓝琼脂计数黏附于细胞的大肠杆菌活菌数，并计算植物乳杆菌对大肠杆菌黏附细胞的竞争抑制率，植物乳杆菌对大肠杆菌黏附细胞的竞争抑制率＝(对照组大肠杆菌数－植物乳杆菌组大肠杆菌数)/对照组大肠杆菌数×100％.

植物乳杆菌排斥抑制大肠杆菌对IPEC-J2的黏附：每孔细胞先用1ml植物乳杆菌活处理1.5h，同时设未经植物乳杆菌处理的对照组，之后再用1ml大肠杆菌菌悬液处理1.5h。结束后同竞争性抑制的试验方法计数大肠杆菌数，计算植物乳杆菌对大肠杆菌黏附细胞的排斥抑制率。

植物乳杆菌置换抑制大肠杆菌对IPEC-J2的黏附：每孔细胞先用1ml大肠杆菌处理1.5h，之后再用1ml植物乳杆菌处理1.5h，结束后同竞争性抑制的试验方法计数大肠杆菌数，计算植物乳杆菌对大肠杆菌黏附细胞的置换抑制率。

植物乳杆菌对免疫抑制下IPEC-J2细胞因子的影响：每孔细胞先用1ml植物乳杆菌活处理3h，同时设未经植物乳杆菌处理的对照组。之后再用1ml大肠杆菌菌体悬液处理3h，设未加植物乳杆菌和大肠杆菌的空白组，取细胞培养液用南京建成试剂盒测定细胞因子TNF-a和IL-8。

不同植物乳杆菌和ZHR8不同组分对大肠杆菌黏附猪肠上皮细胞的抑制作用见图1和图2。由图1和图2可知，不同菌株对大肠杆菌黏附的抑制主要是排斥作用，植物乳杆菌抑制致病菌黏附的作用方式存在菌株特异性，其中来源于猪肠道的ZHR8显著抑制大肠杆菌的黏附，占据肠道黏附位点，抵抗病原菌的侵袭。对比上清液和菌液，ZHR8后生元对大肠杆菌黏附的排斥抑制率和竞争抑制率最高。

不同植物乳杆菌和ZHR8不同成分对免疫抑制下IPEC-J2细胞因子的影响见图3和图4。不同菌株通过排斥作用抑制大肠杆菌在肠上皮细胞上的黏附，减少了IPEC-J2细胞促炎因子TNF-a和IL-8的生成，其中，ZHR8菌株对免疫应激猪肠道细胞的保护作用最佳。而在ZHR8不同组分对肠上皮细胞保护作用的结果表明，后生元组的促炎因子最低，显著地缓解猪肠道细胞的免疫应激。

实施例5：植物乳杆菌ZHR8后生元粉在仔猪生产中的应用

在仔猪试验选取28日龄、均重7.2±0.3kg左右的杜长大仔猪90头，为了研究在免疫应激下，后生元对仔猪肠道免疫的保护作用，设置了脂多糖应激组(脂多糖是大肠杆菌产生的内毒素，可作为仔猪应激试验组)。

按照平均分配原则随机分成3个处理组：对照组和脂多糖组均饲喂基础日粮；后生元+脂多糖组：饲喂添加800mg/kg后生元的基础日粮，后生元采用实施例2获得的后生元粉剂，每个处理3个重复，每个重复10头仔猪。预试验为期3d，正式试验为28d，试验期间，猪自由采食及饮水，记录采食量。于正式试验第28d清晨开始禁食，仔猪称重，统计仔猪生产性能(平均日采食量、平均日增重、料重比)。在脂多糖组和后生元+脂多糖组中，每个重复取1头仔猪腹膜注射100μg/kg BW的脂多糖，同时对照组每个重复取1头仔猪注射相应剂量的灭菌生理盐水。脂多糖注射4h后，仔猪采集血液，静置，在低温离心机中4000r/m离心15min，取上清液-20℃保存。

测定血浆的二胺氧化酶(DAO)、一氧化氮合成酶(NOS)和一氧化氮(NO)的含量以及血清免疫球蛋白lgA、lgG、lgM、TNF-a和IL-8含量，直接用试剂盒进行测定，所用试剂盒采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测。

结果见表2—表4。

表2ZHR8后生元对仔猪生长性能的影响

同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下表同

表3ZHR8后生元对脂多糖应激仔猪DAO、NOS活性和NO含量的影响

表4ZHR8后生元对脂多糖应激下仔猪免疫性能的影响

由表2可知，与对照组相比，饲粮中添加ZHR8后生元提高仔猪平均日增重、平均日采食量，降低料重比，其中，平均日采食量、日增重比对照组提高5.80％和9.60％，料重比下降0.06。

由表3可知与对照组相比，脂多糖应激显著提高了血浆中NO和NOS的含量(P<0.05)，与应激组相比，ZHR8后生元显著降低血浆中NOS和NO含量。肠黏膜细胞受损或脱落时，DAO和NOS会释放入肠细胞间隙淋巴管和血管，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内，导致血液DAO和NOS活性升高，从而引起畜禽出现炎症现象。炎症应激指标的结果表明，ZHR8后生元能缓解免疫应激下仔猪的肠道机械损伤，减轻脂多糖应激对肠黏膜机械屏障的侵害。

由表4可知，与对照组相比，脂多糖应激显著降低了血清IgG和IgM含量，提高了促炎细胞因子IL-8和TNF-α含量(P<0.05)；与脂多糖组相比，ZHR8后生元显著提高了血清免疫球蛋白IgG和IgM含量，降低了促炎细胞因子IL-8和TNF-α含量。免疫球蛋白和细胞因子的结果表明，脂多糖应激引发仔猪产生炎症反应，ZHR8后生元显著提高了断奶仔猪的免疫性能，有效缓解仔猪肠黏膜的免疫屏障受损。

以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种猪源植物乳杆菌，其特征在于，其为植物乳杆菌Lactobacillus plantarumZHR8，于2022年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20222002。

2.利用如权利要求1所述植物乳杆菌ZHR8制备液体后生元的方法，包括如下步骤：采取高密度发酵的方法，将活化好的植物乳杆菌ZHR8以2％接种于发酵培养基中，进行高密度发酵，培养32h，得到发酵液；培养过程中，分别在12h及20h补料至培养基葡萄糖浓度为20g/L，将所得到的发酵液在65℃处理30min，得到液体合生元。

3.利用如权利要求1所述植物乳杆菌ZHR8制备后生元粉剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨5g/L，大豆蛋白胨12g/L，牛肉粉6g/L，葡萄糖25g/L，磷酸氢二钾4g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸胺2g/L，七水硫酸镁0.2g/L，四水硫酸锰0.05g/L。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的高密度发酵的发酵环境为：温度37℃，湿度70％，pH为5.5，通气量1.2vvm。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的补料培养基为100g/L葡萄糖。

7.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZHR8或如权利要求2或3所述方法制备的植物乳杆菌ZHR8后生元在制备饲料添加剂中的应用。

8.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZHR8或如权利要求2或3所述方法制备的植物乳杆菌ZHR8后生元在制备用于仔猪养殖生产中缓解猪免疫应激的饲料添加剂中的应用。