KR102316396B1 - 질산염 제거능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112) 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 우수한 질산염 제거능을 나타내어 질산염 제거를 위한 식품첨가제, 폐수 처리 및 퇴비 발효 용도로 활용될 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 유해 병원균에 대해 우수한 항균 활성 및 항염 활성을 나타내며, 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화를 위해 활용될 수 있다. 나아가 발효용 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

질산염 제거능을 갖는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 및 이를 포함하는 조성물 {Lactobacillus plantarum WiKim0112 having nitrates-scavenging ability and composition comprising the same}
본 발명은 신규한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
유기질소 또는 무기질소 오염물질은 하·폐수 또는 농업용 비료 및 가축의 분뇨 등에서 기인하며, 배출량이 지속적으로 증가하고 있고, 현재는 자연 생태계의 자기 정화능력을 초과하여 논, 밭, 지하수, 하천 및 호수로 다량 유입되어 다양한 환경 문제를 야기하고 있다. 국내의 경우, 대다수 농촌지역에서는, 농업비료 및 농약과 가축분뇨에 의한 질산염(NO3 -) 오염이 가장 큰 비중을 차지하고 있다.
지하수 또는 지표수 내 질산염 이온의 경우, 그 자체로는 인체에 유해한 물질은 아니지만, 질산염이 체내에 흡수되어 혈액 속의 헤모글로빈과 결합하여 메트헤모글로빈증(methemoglobinemia, 청색증)을 유발하며 주로 유아 및 아동들에게 주로 발생한다. 또한, 질산염을 과다 섭취할 경우, 단백질 식품에 존재하는 아민(amine)이나 아미드(amide)가 함유된 음식물 섭취하게 되면 위장관에서 질소 화합물과 반응하여 니트로사민(nitrosamine)이라는 발암물질이 생성될 수 있다고 보고되고 있다.
니트로사민은 국제암연구기관(IARC)에서 암을 일으킬 수 있는 발암 가능한 물질인 그룹 2A 및 그룹 2B로 분류되어 건강에 매우 유해한 것으로 알려져 있다. 또한, 우리나라 국민에게서 위암 발생이 높은 이유는 잘못된 식습관과 관련있고, 염, 헬리코박터균 또는 니트로사민과 같은 물질이 지속적으로 위 점막을 자극하여 위염과 위궤양으로 진행되어 위암 발생에 기여하는 것으로 알려져 있다.
국내 채소류 중 배추, 무, 상추, 시금치, 또는 비트는 가식부뿐만 아니라, 겉잎, 껍질, 밑동/윗동 부분과 같은 부산물 중에도 다량의 질산염이 측정된다. 이에, 채소 중 상기와 같은 부산물을 섭취하거나 가공하는 경우 다량의 질산염에 노출될 가능성이 매우 높을 것으로 판단된다.
상기와 같은 위험을 방지하기 위해, 식품 내 니트로사민 함량을 저감화하는 다양한 방법들이 연구되어 왔다. 그 중에는 김치 부재료로 사용되는 마늘이 질산염, 아질산염, 및 니트로사민 생성 억제 활성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 김치 유래 유산균의 니트로사민 구조 유사체에 대한 강한 항돌연변이 활성이 알려진 바 있다.
한편, 유산균 중에서 섭취시 체내 건강증진 효과를 가져올 수 있는 '살아있는' 세균들을 프로바이오틱스라고 부른다. 국제식량농업기구(FAO)와 세계보건기구(WHO) 전문가 위원회는 프로바이오틱스(Probiotics)를 '살아있는 형태로 적당한 양을 섭취했을 때 건강에 도움이 되는 유익한 작용을 하는 미생물'이라고 정의하였다(비특허문헌 1).
국내 식품의약품안전처에서도, 프로바이오틱스를 '건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균'이라고 정의하면서, 프로바이오틱스가 내산성과 내담즙성을 보유하고 소장까지 이동, 증식 및 부착할 수 있어야 한다고 언급하였다. 또한, 장에서 유효한 효능을 나타내며 비병원성 및 독성이 없어야 한다고 제한하였다. 프로바이오틱스로 사용되는 균주들은 요거트, 치즈와 같은 발효 유제품과 김치, 젓갈 등 발효식품에서 주로 분리되고 있으며, 대표적으로는 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속과 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주가 프로바이오틱스로 많이 사용되고 있다.
국내 식품의약품안전처의 건강기능식품 공전(2019년)에 따른 기준 및 규격으로 허가된 프로바이오틱스로 사용가능한 균주는 총 19종이다. 상세하게는, 락토바실러스 속 11종, 락토코커스 속 1종, 엔테로코커스 속 2종, 스트렙토코커스 속 1종 및 비피도박테리움 속 4종이 있다. 또한, 프로바이오틱스 제품의 일일 섭취량은 108 내지 1010 CFU(colony forming unit)이며, 장내미생물 균총의 균형 및 개선을 통해 장내 유익균 증식과 유해균 억제에 도움을 주며, 배변활동을 원활하게 유지할 수 있도록 도움을 줄 수 있어야 한다.
그러나, 일부 프로바이오틱스 유산균의 경우, 열과 산성에 취약하다는 단점을 갖고 있는데, 이로 인해 장에 도달하기 전 대부분 사멸되며, 장으로 이동한 일부 프로바이오틱스도 오랫동안 정착하지 못하고 배출되기도 한다. 이 경우, 프로바이오틱스가 장내에 생존하면서 대사산물을 생산할 시간이 부족할 뿐만 아니라 일시적으로 프로바이오틱스를 섭취하더라도 장내 유익한 효과를 기대하기가 어려울 수 있다.
따라서, 열과 산성에 내성을 가져 장내 오랫동안 생존할 수 있으면서도 환경오염 및 발암물질로 알려진 질산염에 대한 제거능이 우수한 프로바이오틱스의 개발이 요구되는 실정이다.
Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, London, Ontario, Canada, 30 April-1 May 2002
본 발명은 질산염 제거능, 항균 활성, 항염 및 면역활성이 우수한 신규 프로바이오틱스, 락토바실러스 플란타룸 균주를 제공하고자 한다.
이에, 본 발명자들은 프로바이오틱스로서 아질산염에 대해 내성을 가지면서 질산염에 대한 우수한 제거능을 갖는 유산균 균주를 찾고자 노력한 결과, 신규한 락토바실러스 속 유산균 균주인 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112)를 분리, 동정하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112) 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112)는 김치 유래의 락토바실러스 플란타룸 균주이다. 비록 본 발명에서의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112를 김치에서 분리, 동정하기는 했으나, 이의 입수 경로가 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에의 실시예를 통해 분리된 질산염 제거능이 우수한 미생물의 동정 및 분류를 위한 16S rDNA 염기서열 분석 결과, SEQ ID NO: 3의 핵산서열을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 분석 결과, 상기 미생물은 Lactobacillus plantarum과 가장 높은 분자계통학적 유연 관계를 보였다.
따라서, SEQ ID NO: 3의 16S rDNA 염기서열을 갖는 본 발명의 미생물을 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112)로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2020년 10월 22일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM12811P).
본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 그람 양성균이고 호기적 조건과 혐기적 조건에서 모두 성장이 가능한 통성 혐기성(facultative anaerobe)이며, 포자를 형성하지 않고 운동성이 없으며 세포는 간균의 형태를 취하고 있다.
하기 실시예에서는, 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주가 아질산염에 대한 내성을 가지면서 우수한 질산염 제거능을 갖는 것을 실제 실험으로 확인하였다(실시예 1의 3) 참조).
본 발명에서, “질산염 제거능”은 질산염을 분해시켜 산화질소(Nitric oxide)로 전환함으로써 질산염을 제거하거나 질산염의 농도를 감소시키는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 프로바이오틱스로서, 유산균의 일반적인 정장 효과 및 면역 증강 효과를 갖는다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명에 있어서, '프로바이오틱스(probiotics)'는 사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물'이라는 의미로 이해된다. 프로바이오틱스는 프로바이오틱 활성을 갖는 살아있는 미생물로 단일 또는 복합균주 형태로 사람이나 동물에 건조된 세포 형태나 발효산물 형태로 급여될 경우, 숙주의 장내 균총에 유익한 영향을 미칠 수 있다.
하기 실시예에서는, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112가 우수한 내산성, 내담즙성 및 내열성을 가질 뿐만 아니라, 유해 병원균에 대한 항균 테스트에서 높은 항균력을 보이며, 염증 관련 사이토카인의 발현을 억제시키고 항염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다. 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화 등의 용도뿐만 아니라 유해 병원균의 항균을 위한 용도 및 항염 용도로 다양하게 활용될 수 있다.
이에, 본 발명의 한 구체예에서는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물, 또는 이의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 생균체 또는 사균체로서 존재할 수 있으며, 또한 건조 또는 동결건조된 형태로 존재할 수도 있다. 다양한 조성물 내에 포함시키기 적합한 유산균의 형태 및 제제화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 배양물 또는 발효물이거나, 상기 균주를 유기용매로 추출한 추출물, 상기 균주의 세포막을 용해시키거나 파쇄 또는 균질화 처리한 용해물(또는 파쇄물) 등의 형태로 제제화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 생균으로 존재하는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주를 포함하는 경구 투여용 조성물일 수 있다.
이에, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 질산염 제거용 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 질산염 제거용 식품첨가제 조성물을 제공한다.
질산염을 섭취할 경우, 섭취된 질산염이 아질산염으로 환원될 수 있다. 아질산염은 헤모글로빈과 상호작용하여 산소 운반 능력에 부정적 영향을 미치게 된다. 또한, 아질산염은 2차 아민 및 3차 아민과 반응하여 N-니트로사민을 형성하여 암을 유발시킬 수 있다. 이에, 본 발명은 사람이 섭취하는 식품에 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112을 포함하는 식품첨가제 조성물을 첨가함으로써, 식품 내 함유된 질산염을 제거할 수 있다. 상기 식품첨가제는 질산염이 함유된 채소류, 이로부터 가공된 식품 또는 육제품에 처리할 수 있다.
상기 질산염 제거용 식품첨가제 조성물에 첨가될 수 있는 첨가제로는, 식품 내 질산염을 제거할 수 있거나 육제품의 부패를 방지할 수 있는 성분이라면 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 포함하는, 식품 내 질산염을 제거하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴비 발효용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 정장제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 사람을 포함한 동물의 위장 질환의 예방, 치료, 개선에 이용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 동물은 소, 말, 돼지와 같은 가축을 포함한다. 상기 '위장 질환'으로는 위장 위해 세균 감염 및 염증성 장 질환을 모두 포함하며, 예를 들어 병원성 미생물(대장균, 살모넬라, 클로스트리디움 등)에 의한 감염성 설사, 위장염증, 염증성 장 질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장 급이성 설사 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 정장제 조성물은 경구로 투여하는 것이 바람직하다. 투여량은 위장 질환의 종류, 질환의 정도, 연령, 성별, 인종, 치료 또는 예방 목적 등에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 성인을 기준으로 하루에 1천만 마리에서 1,000억마리를 투여할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다. 락토바실러스 속의 유산균이 정장 효과와 면역 증강 효과를 갖는다는 것은 잘 알려져 있는 사실이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 이러한 유리한 작용으로 인해 의약, 건강기능식품, 식품, 사료, 사료 첨가제 또는 유산균 스타터에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 조성물을 제공한다.
하기 실시예에서는, 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112가 전염증성 사이토카인의 발현을 억제시키고, 항염증성 사이토카인의 발현을 증가시키는 결과를 확인하였다.
상기 항염용 조성물은 염증 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 포함될 수 있다. 상기 염증 질환으로는 염증성 장질환, 염증성 피부질환, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 항염용 조성물은 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 활용될 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐 클로라이드등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
나아가 해당 분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 식품 조성물로 활용될 경우, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 음료, 바 등의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 발효유 등의 음료를 포함할 수 있다. 이에, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 또는 이의 배양물로 이루어지는 발효용 유산균 스타터를 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 비타민복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아추출물 (예를 들어 레바우디오시드A, 글리시르히진 등]) 및 합성향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 항균용 조성물은 E. coli O157:H7, 슈도모나스 아에로기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유해 병원균에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112을 포함하는 유해 병원균에 의한 감염 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 유해 병원균에 의한 감염 질환은 식중독일 수 있다.
또한, 상기 항균용 조성물은 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 활용될 수 있다. 상기 항균용 조성물에 있어서, 약제학적 조성물 및 식품 조성물은 앞서 기술한 내용을 그대로 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 사료첨가제 또는 사료를 제공한다.
사료 첨가제로서 이용될 경우, 상기 조성물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태로 제조될 수 있다. 상기 사료첨가제는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산등의 유기산이나 인산 나트륨, 인산 칼륨, 산성 피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나, 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 사료로서 이용될 경우, 상기 조성물은 통상의 사료 형태로 제제화 될 수 있으며, 통상의 사료성분을 함께 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제 및 사료는 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩, 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
상기 사료첨가제는 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 사료첨가제는 탑드레싱으로서 또는 이들을 동물사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 사료첨가제를 동물사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수전분, 락토오스, 수크로오스, 콩플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 사료첨가제는 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
또한, 상기 사료첨가제 및 사료는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액촉진제 등을 함유할 수 있다. 상기 사료첨가제는 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명의 사료 또는 사료첨가제는 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물식이에 적용할 수 있다.
상기 포유류로서 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치동물, 및 실험용 설치동물뿐만 아니라, 애완동물(예: 개, 고양이) 등에게 사용할 수 있으며, 상기 가금류로서 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 및 메추라기 등에도 사용할 수 있고, 상기 어류로서 송어 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 양은 1회를 기준으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다. 균주를 투여할 경우에는 생균 상태로 투여하는 것이 바람직하며, 섭취 전에 사멸시키거나 감쇄(attenuation) 상태로 투여할 수 있다. 또한, 배양 상등액 등을 사용하여 제조할 경우에는 열처리 과정을 통한 멸균화 과정을 추가적으로 거칠 수 있다. 최소의 효능을 가지는데 필요한 균주량 및 일일 섭취 정도는 섭취자의 신체 또는 건강상태에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 약 106 내지 1012 cfu/g일 수 있으며, 예컨대 107 내지 1011 cfu/g, 108 내지 1010 cfu/g일 수 있다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 우수한 질산염 제거능을 나타내어 질산염 제거를 위한 식품첨가제, 폐수 처리 및 퇴비 발효 용도로 활용될 수 있다. 또한, 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112는 유해 병원균에 대해 우수한 항균 활성 및 항염 활성을 나타내며, 프로바이오틱스로서 사람 또는 동물의 정장, 면역강화를 위해 활용될 수 있다. 나아가 발효용 스타터로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 질산염 함량이 많은 김치로부터 아질산염 내성을 보유한 김치 유래 미생물을 분리한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 상기 아질산염 내성 보유 균주 중 질산염 제거능(감소능)을 갖는 균주로 WiKim0112를 선발한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 상기 선발된 WiKim0112 균주의 균체 생육 및 질산염 제거능(감소능)을 확인한 결과이다.
도 4는 생화학적 분석 방법을 이용하여 상기 선발된 WiKim0112 균주의 탄소원에 대한 당이용성을 분석한 결과이다.
도 5는 16S rDNA 유전자 염기서열을 이용하여 상기 선발된 WiKim0112 균주의 분자계통학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 내산성, 내담즙성 및 내열성 활성을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 항균 활성을 확인한 결과이다.
도 8은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 응집능을 확인한 결과이다.
도 9는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 장 부착능을 확인한 결과이다.
도 10은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 처리에 따른 전염증성 사이토카인의 발현 수준(a, b, c)과 항염증성 사이토카인의 발현 수준(d, e, f)을 확인한 결과이다.
도 11은 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 용혈현상을 확인한 결과이다.
도 12는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 유해효소 생성 여부를 확인한 결과이다.
도 13은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 및 분리 균주들의 단백질 분해활성 조사 결과를 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 락토바실러스 플란타룸 균주의 특성 확인, 분리 및 동정
1) 아질산염 내성 보유 미생물의 선발
질산염 함량이 많은 채소 유래 김치인 배추김치, 시금치김치, 갓김치, 동치미, 총각김치 및 깍두기를 구입하여 10g을 채취하고 멸균 생리식염수로 십진 희석하였다. 이후, 희석한 김치 시료는 아질산염(200 ppm)을 첨가한 MRS 고체 배지에 도말한 후 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 미생물 중 아질산염 내성을 보유한 김치 유래 미생물, 즉 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 웨이셀라 속(Weissella sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.) 및 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.)을 포함한 총 400 종의 미생물을 분리하였다(도 1).
2) 질산염 제거능(감소능) 보유 균주의 선발
또한, 상기 아질산염 내성 보유 균주 400종은 200 ppm의 질산염(NaNO3)이 첨가된 MRS 액체배지에서 30℃에서 48시간 동안 배양한 후, 원심분리(8,000×g, 15분)하여 배양 상등액 내 질산염이 분해되어 전환된 산화질소(NO) 농도를 Griess reagent kit를 이용하여 분광광도계로 548nm의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 질산염 제거능(감소능)이 우수한 김치 발효 유산균 WiKim0112를 선발하였다(도 2).
3) 선발된 균주의 균체 생육 및 질산염 감소능 확인
선발된 김치 발효 유산균 WiKim0112는 질산염(NaNO3)이 첨가된 MRS 액체 배지에 접종하여 30℃에서 48시간동안 배양하면서 배양 6시간마다 균체의 생육 및 질산염 감소량을 측정하였다. 이때, 균체의 생육은 분광광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였고, 질산염 감소는 질산염 측정기(Nitrate meter)를 이용하여 농도를 측정하였다. 그 결과(도 3), 배양 12시간까지는 초기 질산염이 200 ppm 수준에서 100 ppm 수준으로 급격하게 감소하다가, 배양 24시간부터 48시간까지는 질산염 함량이 48 내지 50 ppm 정도를 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 김치 발효 유산균 WiKim0112의 생육 특성을 조사한 결과, 배양 12시간까지는 급격하게 생육이 증가하다가 배양 18시간부터 정지기(stationary phase)에 도달한 후, 일정하게 생육이 유지되는 것으로 확인하였다.
4) 선발된 균주의 동정
4-1) 생화학적 분석
상기 선발된 김치 발효 유산균 WiKim0112의 동정을 위해, 생화학적(API 50 CHB kit(BioMeriux Co. France)) 분석 방법을 이용하여 균주의 49개 탄소원에 대한 당이용성을 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 리보오스, 글루코오스, 프럭토오스, 말토오스, 멜리바이오스, 수크로오스, 라피노오스, 글루코네이트, 5-케토글루코네이트 등의 탄소원을 이용할 수 있음을 확인하였으며, API 웹 데이터베이스(http://apiweb.biomerieuxcom)을 이용하여 잠정적으로 동정하였다.
4-2) 16S rDNA 분석을 통한 동정
또한, 보다 더 정확한 동정을 위해, 16S ribosomal DNA 유전자 서열분석을 통해 WiKim0112를 동정하였다. 상기 선발된 김치 발효 유산균 WiKim0112의 균체를 취하고 멸균된 생리식염수에 균체를 2회 세척한 후, DNeasy tissue kit(Qiagen, Valecia, CA, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA의 16S rDNA 유전자 증폭을 위해 공통 프라이머(universal primer)를 사용하였다. 상기 공통 프라이머는 하기 표 1과 같다. PCR 반응시 0.4 mM의 dNTP, 0.5 units의 Taq polymerase 및 4 mM의 Mg2+가 함유된 Takara Perfect Premix(Takara, Japan) 10 ㎕에 DNA template (20㎍/mL) 1㎕, 1.0 μM의 정방향 프라이머와 1.0 μM의 역방향 프라이머를 각각 1 ㎕씩 넣고 나머지는 증류수를 첨가하여 총 부피가 20 ㎕가 되도록 제조하였다. PCR 증폭은 Mastercycler gradient(Eppendorf, Hamburg, Germany)로 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분(initial denaturation), 94℃에서 45초(denaturation), 52℃에서 45초(annealing), 72℃에서 1분(extension)을 30 사이클 실시하였고, 72℃에서 5분간 최종 extension을 수행하였다. 증폭된 단편으로 염기서열 결정을 수행하였으며, 그 결과는 BLAST search(http://www.ncbi.nlm. nih.gov) 프로그램을 이용하여 GenBank (NCBI, Bethesda, MD, USA)의 ribosomal DNA 유전자 서열분석과 비교하여 동정하였다.
SEQ ID NO 이름 방향 서열(5'-3')
1 Primer_27F 정방향(F) AGAGTTTGATCATGGCTCAG
2 Primer_1492R 역방향(R) GGATACCTTGTTACGACTT
그 결과(도 5), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)과 98% 상동성을 나타내었으며, 유전학적 동정 방법인 16S rDNA 염기 서열 분석을 통해 계통수 미생물 분석한 결과, 락토바실러스 플란타룸 균주와 99% 동일함을 확인하였다. 상기 WiKim0112 균주의 16S rDNA 서열은 SEQ ID NO: 3과 같다.
이에, 상기 김치 발효 유산균 WiKim0112는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) WiKim0112 균주로 명명하였다.
실시예 2: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 프로바이오틱스로서의 활성 확인
상기 실시예 1에서 선발한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 프로바이오틱스 활성을 확인하기 위해 내산성, 내담즙성 및 내열성을 확인하였다.
1) 내산성 확인
위산(pH 3 이하)의 조건에서 생존 가능한 유산균만이 프로바이오틱스 기능성을 나타낼 수 있기 때문에, HCl을 첨가하여 위산과 유사한 환경인 pH 2.5로 조정한 MRS 액체 배지에 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주를 4시간동안 처리하였다.
그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, pH 2.5의 조건에서도 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주가 84.95%의 생존율(p<0.05)을 보여 강한 내산성을 보유하고 있음을 확인하였다.
2) 내담즙성 확인
또한, 프로바이오틱스 유산균은 장관에 도달하기 위해 위액에 대한 내산성 뿐만 아니라, 췌장에서 십이지장까지 분비되는 담즙산에 대한 내성이 요구된다. 내담즙성 조사는 0.3% 황소의 담즙(oxgall)을 함유한 MRS 액체 배지에 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주를 24시간동안 처리하여 확인하였다.
그 결과(도 6), 담즙에 의해 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 생균수가 11.49% 감소하였지만, 88.51% 이상의 생존율을 유지하는 결과를 통해 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주가 담즙산에 의해 큰 영향을 받지 않아 우수한 안정성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
3) 내열성 확인
또한, 프로바이오틱스의 제제화 공정에서 고온의 환경에 노출되면 생균 활성이 감소될 수 있으므로, 유산균의 열 안정성은 프로바이오틱스 선정에 중요한 기준이 된다. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 내열성 조사는 40℃, 50℃ 및 60℃에서 각각 1시간씩 처리한 후, 상기 WiKim0112 균주의 생균수를 측정하여 확인하였다.
그 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 40℃에서 7.10±0.31 log CFU/mL, 50℃에서 6.51±0.13 log CFU/mL, 그리고 60℃에서 4.19±0.08 log CFU/mL의 생균수를 나타내었다(p<0.05). 40℃, 50℃ 및 60℃에서의 열 처리시 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 생존율이 점차 감소하였지만, 50℃까지는 강한 내열성을 나타내었다(도 6).
따라서, 상기 도 6의 결과를 통해, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 위산, 담즙 및 고온과 같은 열악한 환경에서도 생존율이 높았으며, 우수한 프로바이오틱스 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 항균 활성 확인
락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 항균 활성을 확인하기 위해, 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 배양 상등액을 그람 음성 식중독 세균인 E. coli O157:H7(ATCC35150) 및 슈도모나스 아에로기노사(Pseudomonas aeruginosa)(KCCM12539)와, 그람 양성 식중독 세균인 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)(KCCM40307)와 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC25923)에 처리하였다.
먼저, TSB(Tryptic soy broth) 배지에 전배양한 병원성 미생물을 TSA 한천 고체 배지에 접종하여 중층 도말하고 배양하였다. 그 후 한천 확산법(agar well diffusion)으로 항균 활성을 조사하였다. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 배양 상등액을 100 ㎕씩 분주하여 흡수시키고, 30℃에서 24시간동안 배양한 후 웰 주변에 생성된 생육 저해환을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이(도 7의 1), E. coli O157:H7의 경우 20 mm의 저해환을 나타냈으며, 슈도모나스 아에로기노사의 경우 26 mm의 저해환을 나타내었다. 또한, 리스테리아 모노사이토제네스의 경우 22 mm의 저해환을 나타냈으며, 스타필로코커스 아우레우스의 경우 20 mm의 저해환을 나타내었다. 반면, 대조구인 MRS 액체 배지에서는 항균 활성을 나타내지 않았다(도 7의 2). 즉, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 상기 실험한 모든 병원성 미생물에 대해 항균 활성을 나타냈음을 알 수 있다.
실시예 4: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 응집능 확인
유산균이 장내에서 병원성 세균의 활성을 억제하는지 확인하기 위해서는 자가응집능 및 병원성 세균과의 공응집능을 확인해야 한다.
이에, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 자가응집능(auto-aggregation) 및 공응집능(co-aggregation) 활성을 확인하였다.
병원성 지시균(indicator strain)으로 E. coli O157:H7(ATCC35150), E. coli(KCTC2571), 리스테리아 모노사이토제네스(ATCC51776) 및 스타필로코커스 아우레우스(ATCC25923) 균주를 사용하였다. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주와 상기 병원성 지시균 4종을 각각 MRS 액체 배지와 Nutrient 액체 배지에 0.5%(v/v)씩 접종하고 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 10,000ⅹg에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 PBS 완충용액에 다시 현탁하여 생균수 1.0ⅹ108 CFU/mL 수준으로 조정하였다. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주와 병원성 지시균(4종)의 현탁액을 각각 2 mL씩 혼합하고 10초간 교반한 후, 37℃에서 4시간동안 정치하면서 자가응집능과 공응집능을 조사하였다.
그 결과(도 8), 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 자가응집능이 30.6%로 나타났으며, 리스테리아 모노사이토제네스 및 스타필로코커스 아우레우스와의 응집율은 가장 높은 수치를 나타낸 것을 확인할 수 있다. 배양 4시간 후, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 리스테리아 모노사이토제네스와의 응집율이 61.3%로 나타났고, 스타필로코커스 아우레우스와의 응집율은 62.7%를 나타내었다. E. coli O157:H7과 E. coli와의 응집율은 각각 33.5%, 33.1%를 나타내었다. 즉, 상기 결과를 통해 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 자가응집능과 병원성 세균을 억제하는 공응집능이 우수한 것으로 판단하였다.
실시예 5: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 장 부착능 확인
프로바이오틱스로 사용하는 유산균이 장관 내에서 유익한 효과를 나타내기 위해서는 인체 내 장관벽 표면에 부착하여 증식할 수 있어야 하며, 장 부착능은 프로바이오틱스 유산균을 선발하는 기준의 하나로 설정되어 있다. 장내에 부착된 프로바이오틱스 유산균이 비생존 유산균에 비해 면역활성 증진 및 항암 효과가 높은 것으로 보고되어 있다.
락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주를 MRS 액체배지 0.5%(v/v) 접종하고, 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 이후 10,000ⅹg에서 15분간 원심분리하여 균주를 취한 후 PBS로 3회 세척 반복하여 균 현탁액(106 내지 107 CFU/mL)을 제조하였다.
Caco-2 세포는 antibiotic-free DMEM(Dulbecco's modified Eagle's minimal essential medium)에 10% 불활성화된 PCS(JRH, USA), 1% 비필수 아미노산(GibcoBRL, USA)이 함유된 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 단층(monolayer)이 형성된 Caco-2 세포에 상기 균 현탁액(106 내지 107 CFU/mL)을 첨가하여 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 배양 종료 후, PBS로 3회 세척하여 부착되지 않은 균체는 제거하였다. Trypsin(200 ㎕)과 0.1%의 triton X-100 용액을 첨가하여 교반한 후, PBS로 부착된 균체는 십진 희석하고 MRS 한천에 도말 및 배양하여 생균수를 측정하였다.
그 결과(도 9), 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 장 상피세포 부착율은 71.60%(106 CFU/mL 첨가)와 87.66%(107 CFU/mL 첨가)로 확인하였다. 대조구로 락토바실러스 플란타룸 ATCC8014 표준균주를 사용하여 비교실험한 결과, 74.0%(106 CFU/mL 첨가)와 78.26%(107 CFU/mL 첨가)로 확인하였다. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주(107 CFU/mL 첨가)의 장 상피세포 부착율이 락토바실러스 플란타룸 ATCC8014 표준균주와 비교했을 때 9.4% 더 증가하여 장 부착능이 우수한 것으로 판단하였다.
실시예 6: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 항염증 및 면역관련 유전자 발현 수준 확인
염증 반응은 체내에서 세균이나 바이러스와 같은 외부인자가 유입될 경우, 면역세포가 이를 인지하여 다양한 염증매개 물질을 분비함으로써 몸을 보호해주는 기전이다. 염증 반응에 관여하는 주세포는 대식세포(macrophage)로 알려져 있으며, 여러 자극이나 면역세포들이 분비하는 사이토카인에 의해 활성화된다.
사이토카인은 면역계에서 매개체 역할을 하며 전염증성(pro-inflammatory)과 항염증성(anti-inflammatory) 사이토카인으로 구분된다. 친염증성 사이토카인에는 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-1β, IL-6 등이 있으며, 염증 반응과 동시에 증가한다. 통증, 부종, 고열 등의 염증 반응을 유발하고, 염증 부위로 면역세포의 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
항염증성 사이토카인에는 IFN-γ, IL-4, IL-10 등이 있다. 특히 IFN-γ는 면역적 자극에 의해 T 림프구 세포에서 생산되어 특이적인 항바이러스 작용을 나타내는 당단백질이며, 면역조절기능과 항종양 및 MHC(major histocompatibility) 유도 활성 작용을 하는 것으로 알려져 있다. IL-4와 IL-10은 다양한 세포에서 생성되는 중요한 면역조절 사이토카인으로, 염증 반응 억제뿐만 아니라 B 세포, T 세포, 대식세포 등 다양한 면역세포의 증식과 분화를 조절하는 것으로 알려져 있다.
antibiotics-free DMEM 배지에서 배양한 대식세포에 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주(106 내지 107 CFU/mL)를 첨가하였다. 대식세포 유래 RNA는 TRIzol 시약으로 추출하였고, TOPscript RT DryMIX kit를 이용하여 추출한 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 정량 real-time PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다. PCR 반응은 Real-time PCR mix(SolGent, Daejeon, Korea)와 Roche LightCycler®96 system(Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 증폭하였다. PCR 반응은 95℃에서 15분(initial denaturation), 95℃에서 10초(denaturation), 60℃에서 10초(annealing), 72℃에서 10초(extension)을 60 사이클 실시하였고, 37℃로 냉각하였다. 합성된 cDNA는 정량 RT-PCR을 사용하여 친염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)과 항염증성 사이토카인(IFN-γ, IL-4, IL-10)의 mRNA 발현을 확인하였다.
SEQ ID NO 이름 방향 서열(5'-3')
4 Primer_TNF-a 정방향(F) AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT
5 역방향(R) AGG GCA ATG ATC CCA AAG TAG ACC
6 Primer_IL-1b 정방향(F) TGT ACC TGT CCT GCG TGT TGA AAG
7 역방향(R) CTG GGC AGA CTC AAA TTC CAG CTT
8 Primer-IL-6 정방향(F) ACA GCC ACT CAC CTC TTC AGA AC
9 역방향(R) TTT TCT GCC AGT GCC TCT TTG C
10 Primer-IL-4 정방향(F) TCA TTT TCC CTC GGT TTC AG
11 역방향(R) AGA ACA GAG GGG GAA GCA GT
12 Primer_IL-10 정방향(F) TCA GGG TGG CGA CTC TAT
13 역방향(R) TGG GCT TCT TCT AAA TCG TTC
14 Primer_IFN-r 정방향(F) ATA TCT TGG CTT TTC AGC TC
15 역방향(R) CTC CTT TTT CGC TTC CCT GT
16 Primer_GAPDH 정방향(F) GAC CCC TTC ATT GAC CTC AAC TAC
17 역방향(R) ATG ACA AGC TTC CCG TTC TCA G
도 10의 a, b, c에서 보는 바와 같이, 염증 관련 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-6)은 LPS로 유도한 대조군에서 발현양이 가장 높게 나타났으며, 실험군 중에서 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(LPLB)와 락토바실러스 플란타룸 ATCC8014(LP8014) 표준균주를 사용하여 비교실험한 결과, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(LPLB)에서 통계적으로 유의하게 발현양이 낮아 염증 억제 효과가 우수한 것으로 확인하였다.
항염증성 사이토카인(IFN-γ, IL-4, IL-10) 유전자 발현 수준은 실험군 중에서 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(LPBP, 107 CFU/mL) 첨가시 Th1 사이토카인인 IFN-γ, IL-4, IL-10의 생성이 급격하게 증가하여 락토바실러스 플란타룸 ATCC8014(LP8014) 표준균주보다 높은 생성 효과를 나타내었다(도 10의 d, e, f). 이는 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 전처리로 인한 항원제시 세포의 활성화가 Th 세포에 강한 공동자극(costimulatory) 효과를 제공했기 때문인 것으로 판단하였다. 상기 결과를 통해 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 항염증 활성과 면역조절 활성이 우수한 것으로 확인하였다.
실시예 7: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 안정성 확인
프로바이오틱스 유산균을 식품에 적용하기 위해서는 인체에 유해한 물질이 생성되지 않아야 하기 때문에, 본 실험을 통해 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 용혈성 및 유해효소에 대한 생성 여부를 확인하였다.
1) 용혈성 확인
먼저, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 안정성을 확보하기 위해, 용혈성 검사를 수행하였다. 프로바이오틱스 유산균의 용혈성을 측정하기 위한 배지로는 5%의 양의 혈액(sheep blood)을 MRS에 첨가하고 1.5% 한천(agar)을 첨가한 고체 배지와 액체 배지를 제조하였다. 5%의 양 혈액 한천 고체 배지에 획선 도말하여 30℃에서 24시간동안 배양한 후 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주 주위의 환의 형태를 통해 용혈성 유무를 판단하였고, 5% 양의 혈액 액체 배지에서는 상기 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주를 접종 및 배양한 후 배양액을 원심분리하여 침전 유무와 혼탁도를 통해 용혈성 반응을 확인하였다.
용혈성은 적혈구의 불완전 용해로 인한 녹색의 불투명한 환을 생성하는 α형 용혈(α-hemolysis), 적혈구를 완전히 용해시켜 황색의 환을 생성하는 β형 용혈(β-hemolysis), 그리고 용혈 현상이 발생하지 않는 γ형 용혈(γ-hemolysis)로 구분된다.
그 결과(도 11), 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 경우 용혈현상이 나타나지 않는 것을 통해 안정성이 우수함을 확인하였다.
2) 유해효소 확인
프로바이오틱스 유산균이 안정성을 확보하기 위해서는 벤조피렌을 발암물질로 전환하는 발암효소(유해효소)인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)를 생성하지 않아야 한다. 이에, 본 실험에서는 API zym kit를 이용하여 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주에서의 발암효소(β-글루쿠로니다아제 및 β-글루코시다아제)의 활성 유무를 확인하였다.
구체적으로, MRS 한천에서 24시간동안 배양한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 콜로니를 취하여 현탁 배지(suspension medium)와 혼합한 후, API zym kit에 분주하여 37℃에서 4시간동안 혼합액을 배양하였다. 발색시약인 zym A와 zym B를 각각 혼합액에 첨가하여 5분동안 발색시킨 후 색의 강도를 통해 효소 활성을 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주는 발암효소인 β-글루쿠로니다아제 및 β-글루코시다아제에 대한 활성을 나타내지 않았다. 상기 결과를 통해 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주의 발암에 대한 안정성을 확인할 수 있으며, 향후 안전한 프로바이오틱스 유산균으로서 다양한 분야로 활용이 가능할 것으로 판단하였다.
실시예 9: 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 단백질 분해활성 확인
육제품의 부패는 미생물이 생산하는 효소에 기인하며, 단백질이 분해되면서 발생하는 다양한 대사물은 악취 생성의 원인이 되므로, 이와 같이 육제품에 적용하기 위해서는 단백질 미분해능이 검토되어야 한다.
따라서, 김치로부터 분리한 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112의 단백질 분해활성을 확인하기 위해, 2% 스킴 밀크 아가(skim milk agar) 고체 배지에 배양한 WiKim0112의 배양액 100㎕를 적가하여 30℃에서 48시간동안 배양한 후, 콜로니 주변에 투명한 분해환이 형성되는지 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 균주 배양액에서는 단백질 분해활성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12811P 20201022
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Claims (13)

  1. 수탁번호 KCCM12811P 의 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112{Lactobacillus plantarum WiKim0112}.
  2. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 질산염 제거용 식품첨가제 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 식품첨가제 조성물은 질산염 제거를 통한 육제품 부패를 방지하기 위한 것인 질산염 제거용 식품첨가제 조성물.
  4. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112(Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 포함하는, 식품 내 질산염을 제거하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 식품은 질산염이 함유된 채소류로부터 가공된 것 또는 육제품인 식품 내 질산염을 제거하는 방법.
  6. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴비 발효용 조성물.
  7. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 염증 질환은 염증성 장질환, 염증성 피부질환, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 E. coli O157:H7, 슈도모나스 아에로기노사(Pseudomonas aeruginosa), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유해 병원균에 대한 항균용 조성물.
  9. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 및 치료용 약학 조성물.
  10. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물.
  11. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 정장제 조성물.
  12. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물로 이루어진 것인 발효용 유산균 스타터.
  13. 락토바실러스 플란타룸 WiKim0112 (Lactobacillus plantarum WiKim0112; 수탁번호 KCCM12811P), 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제 조성물.
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