CN116286510A - 一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用。本发明的植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC No.26169，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26169。利用植物乳杆菌发酵得到的粗胞外多糖含量大约为400mg/L，可在水产养殖中的应用提供技术支持和科学依据，并为水产养殖病害防治提供新的思路。

Description

一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株产胞外多糖的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
乳酸菌作为一类重要的发酵微生物广泛应用于各种食品发酵加工。乳酸菌生长代谢过程中分泌于细胞壁外的胞外多糖(EPS)具有多种有益人体健康的生物活性，例如益生元作用、免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和调节肠道菌群等。
我国拥有丰富的乳酸菌资源，传统发酵乳制品和其他发酵制品如泡菜、豆豉、酸面团等富含产EPS的乳酸菌菌株。但是我国对乳酸菌资源的开发利用仍非常有限，目前发酵生产用菌种仍然依赖进口。究其原因，主要与生产密切相关的菌种生产性能，如乳酸菌的产EPS特性的基础科学问题仍然不清楚有关，致使生产过程中不能有效地保持菌种的稳定性，以及不同批次产品之间质量的一致性。东北酸菜是我国东北地区的传统发酵食品，拥有复杂的微生物体系，对其发酵过程中的微生物研究已有30年的历史。酸菜中的乳酸菌在耐受不良环境、抑制病原菌生长等方面优于其他乳酸菌。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何改善鱼的肠道健康或/和提高鱼的非特异性免疫酶活力，促进鱼的生长。
为了解决上述问题，本发明提供了一种植物乳杆菌。
本发明提供的植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCCNo.26169，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26169。
本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂含有前文所述的植物乳杆菌和/或所述植物乳杆菌的代谢物。
前文所述的所述的植物乳杆菌的培养物，是将前文所述的的植物乳杆菌在细菌培养基中培养得到的物质。
上述菌剂的活性成分可为上述植物乳杆菌和/或上述植物乳杆菌的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分。
上述菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为生物肥料领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
上述菌剂可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，上述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，所述代谢物可从所述植物乳杆菌的发酵液中获得。所述代谢物可为所述植物乳杆菌的无菌代谢物或所述植物乳杆菌的含菌代谢物。所述植物乳杆菌的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养所述植物乳杆菌，过滤除去液体培养物(发酵液)中的所述植物乳杆菌即得到所述植物乳杆菌的无菌代谢物。所述植物乳杆菌的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养所述植物乳杆菌，收集发酵液，该发酵液即为所述植物乳杆菌的含菌代谢物。
本发明还提供了前文所述的植物乳杆菌或所述的菌剂或所述的培养物在制备鱼饲料中的应用。
本发明还提供了前文所述的植物乳杆菌或所述的菌剂或所述的培养物在制备胞外多糖的应用。
本发明还提供了前文所述的植物乳杆菌或所述的菌剂或所述的培养物在制备产胞外多糖产品中的应用。
本发明还提供了前文所述菌剂的制备方法。
本发明提供的前文所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将前文所述植物乳杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
本发明还提供了一种制备鱼饲料的方法，所述方法包括将前文所述的培养物和鱼基础饲料混合，得到鱼饲料。
本发明还提供了一种制备胞外多糖的方法，包括如下步骤：在培养基中培养前文所述的植物乳杆菌，从所述发酵产物中得到胞外多糖。
本研究在从东北酸菜中筛选一株高产胞外多糖(extracellularpolysaccharide，EPS)的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HMX2。本研究菌株提取的粗胞外多糖含量约为400mg/L。
本研究分离HMX2所产胞外多糖，以大菱鲆幼鱼为实验材料，通过在饲料中添加不同浓度的HMX2-EPS，研究其对大菱鲆生长性能、消化酶活性和免疫能力的影响，以明确植物乳杆菌HMX2胞外多糖在大菱鲆体内的益生效果。本研究可为益生菌胞外多糖在水产养殖中的应用提供技术支持和科学依据，并为水产养殖病害防治提供新的思路。
保藏说明
菌种名称：植物乳杆菌
拉丁名：Lactobacillus plantarum
菌株编号：HMX2
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年12月08日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.26169。
附图说明
图1为不同的HMX2-EPS添加量对大菱鲆幼鱼肠各相关指标mRNA表达水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
本发明实施例中通过统计软件SPSS 26.0对实验数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。实验结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。
实施例1、菌株的分离鉴定和生长特性研究
1、菌株分离
从东北酸菜中分离筛选到1株高产EPS植物乳杆菌HMX2，取适量的酸菜至100mL的MRS液体培养基中37℃富集培养20h，涂布于含CaCO3(2％)的MRS固体培养基(K2HPO4 0.2g，无水乙酸钠0.5g，酵母粉0.5g，MgSO4 0.05g，牛肉膏1g，柠檬酸铵0.2g，胰蛋白胨1g，葡萄糖2g，硫酸盐0.025g，吐温80 1mL，1.5g-2g琼脂，蒸馏水100mL；121℃灭菌15min)，37℃恒温静置培养48h后，挑取培养基上具有明显透明圈的单菌落，接种在斜面上培养。得到的菌株HMX2均在含40％甘油的MRS液体培养基中于-80℃冷冻保存。
2、菌株鉴定
将步骤1中获得的菌株HMX2接种于MRS培养基中培养20h，按照北京天根细菌基因组DNA提取试剂盒(货号：DP302)说明书提取菌体DNA，采用通用引物，并以其为模板扩增16SrDNA基因组序列。将PCR产物送北京博尚生物技术有限公司进行序列测定，将获得16SrDNA基因序列在NCBI进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。在NCBI网站上进行BLAST序列比对，结果显示该序列与植物乳杆菌的16SrDNA序列同源性超过99％，该菌株HMX2鉴定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，简称植物乳杆菌HMX2。
3、植物乳杆菌HMX2的保藏
植物乳杆菌HMX2并已于2022年12月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC NO：26169；保藏地址：中国北京，中国科学院微生物研究所。以下简称植物乳杆菌CGMCC NO：26169或植物乳杆菌HMX2。
实施例2、利用菌株HMX2制备胞外多糖的研究
1、植物乳杆菌HMX2菌剂的制备
将保存于-80℃甘油管的植物乳杆菌HMX2在室温下融化，按2％(V/V)的接种量接种到已灭菌的MRS液体培养基中，37℃静置培养12h作为活化菌液，按2％(V/V)接种量进行传代培养，37℃培养12h，获得HMX2菌剂，菌悬液的菌浓度为1010cfu/ml。
2、植物乳杆菌HMX2产胞外多糖的能力研究
将植物乳杆菌HMX2连续活化两代后转接至SDM培养基((1L)：胰蛋白胨10g、YNB(酵母氮源)6.7g、K2HPO4 2g、无水乙酸钠5g、柠檬酸钠5g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·H2O0.05g、葡萄糖20g、吐温80 1mL，1mol/L乙酸调pH值为6.6，121℃灭菌15min)中，37℃静置培养16h，然后加入80％ TCA至其在发酵液中最终质量浓度为4g/L。
常温下搅拌2h，4℃、10000r/min离心45min去除发酵液中的细胞和蛋白。取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，4℃冷藏12h，再于4℃、10 000r/min离心30min。采用去离子水复溶沉淀物，并移入透析袋，每8h换一次去离子水，透析24h后冷冻干燥得到胞外多糖。sevage法去除游离蛋白质。
采用苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量，具体步骤如下：配制1mg/mL的HMX2胞外多糖溶液以及0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8mg/mL的葡萄糖溶液(作为标准品)，将20μLHMX2胞外多糖溶液或不同浓度的葡萄糖溶液加入到96孔板中，每组做三个平行，每孔中加入20μL 5％苯酚水溶液，充分混匀后，再向每孔中加入100μL浓硫酸，混匀后，室温下保持30min，采用酶标仪检测每孔在480nm下的吸光度。以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8mg/mL葡萄糖溶液反应后的吸光度为纵坐标(y)，葡萄糖浓度为横坐标(x)，制作标准曲线，y＝2.5896x+0.1373，R2＝0.9987，依据葡萄糖浓度与吸光度的线性关系，获得的胞外多糖命名为HMX2-EPS，含量为400mg/L。
实施例3、鱼饲料中添加HMX2胞外多糖对大菱鲆幼鱼生长性能的影响
1、鱼饲料中添加HMX2胞外多糖对大菱鲆幼鱼的影响
1)大菱鲆幼鱼养殖
试验用健康大菱鲆幼鱼购自中国烟台市黄海水产养殖养殖公司。于曝气人工海水中暂养7d，每天虹吸换30％的水量，暂养期间水温控制在(17±1)℃。每日换水后投喂基础饲料(滨州市无棣县青云饲料有限公司，货号C4)。
大菱鲆饲喂实验共设3组，
1)C组((在基础饲料中添加含量0mg/kg的HMX2-EPS获得的实验饲料)；
2)H1组(在基础饲料中添加含量100mg/kg的HMX2-EPS获得的实验饲料)；
3)H2组(在基础饲料中添加含量500mg/kg的HMX2-EPS获得的实验饲料)。
每组设3个重复，每个重复30尾鱼。每天饱食投喂2次(8:00和18:00)，养殖4周。
2)大菱鲆幼鱼样品采集
养殖实验结束后，实验鱼禁食24h。捞取每缸全部的鱼，分别记录总数并称重，计算增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和存活率(SR)等。随机捞取10条鱼，用浓度为100mg/L甲磺酸三卡因(MS 222)迅速将鱼麻醉后解剖分离肠道，并用灭菌的0.85％生理盐水冲洗干净，置于无RNA酶的离心管和冻存管中，并放置在液氮中。取完样后保存在-80℃冰箱，用于测定酶活力和免疫基因的后续实验。
3)生长性能测定
增重率(WGR，％)＝(Wi-W0)/W0×100％；
特定生长率(SGR，％/d)＝(Ln Wi－Ln W0)/t×100％。
饲料系数(FCR)＝Wf/(Wi-W0)；
肥满度(CF，g/cm3)＝W/L3；
存活率(SR，％)＝Ni/N0×100％
式中，W0为大菱鲆的初始体质量(g)，Wi为终末体质量(g)，Wf为大菱鲆的摄入饲料量(g)，L为体长(cm)，W为体质量(g)，N0为初始数量(尾)，Ni为终末数量(尾)，t为养殖实验进行的天数(d)。
饲喂不同浓度的HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼生长指标和存活的影响结果显示(表1)，养殖实验结束后，所有组的大菱鲆参存活率没有显著差异(P＞0.05)；H1和H2组的终体体长、肥满度、增重率和饲料系数显著高于C组(P<0.05)，而H1组和H2组之间无显著性差异；H1组的特定生长率最高，显著高于C组和H2组(P<0.05)。由结果可以看出，饲料中添加HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼的生长具有显著的促进作用，而添加浓度对大菱鲆生长影响不大。
表1.饲料中添加不同含量HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼生长性能的影响
指标 C组 H1组 H2组
初始体长(cm) 5.94±0.07 5.85±0.12 5.93±0.14
初始体重(g) 6.06±0.60 6.25±0.45 6.16±0.31
终末体长(cm) 7.04±0.21b 7.49±0.16a 7.44±0.07a
终末体重(g) 12.87±0.94b 13.29±0.59ab 14.15±0.58a
肥满度(g.cm-3) 3.49±0.07b 3.82±0.08a 3.89±0.11a
增重率(％) 106.32±3.52b 127.11±5.06a 124.80±4.68a
特定生长率(％/d) 255.25±7.14b 264.85±4.04a 257.78±4.38b
饲料系数 1.04±0.08b 1.17±0.04a 1.14±0.05a
存活率％ 98.33±2.36 100.00 98.33±2.36
注：同行不同字母的数据之间存在显著差异(P<0.05)，下同。
4)酶活测定
消化酶活性，包括淀粉酶AMS和脂肪酶LPS。免疫酶活性，包括超氧化物歧化酶SOD、碱性磷酸酶AKP、酸性磷酸酶ACP和过氧化氢酶CAT，使用商业检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)根据制造商的说明。使用双软骨素酸(BCA)蛋白检测试剂盒(Beyotime生物技术公司)测定蛋白浓度。
饲料中添加HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼肠道消化酶活性的影响如表2所示，H2组的肠道脂肪酶活力显著高于H1组和C组(P<0.05)；H1组和H2组的淀粉酶活力相似，均显著高于C组(P<0.05)。结果表明，饲料中添加HMX2-EPS有助于提高大菱鲆幼鱼肠道中的消化酶活力。
表2.饲料中添加不同含量HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼肠道消化酶活力的影响
指标 C组 H1组 H2组
脂肪酶/(U/g prot) 23.68±2.11b 25.51±1.23b 35.13±4.76a
淀粉酶/(U/mg prot) 0.42±0.04b 0.59±0.06a 0.64±0.02a
饲料中添加HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼肠道免疫相关酶活力的影响如表3所示，H1组和H2组肠道的碱性磷酸酶活力和酸性磷酸酶活力显著高于C组(P<0.05)，且H1组和H2组间无显著性差异；H2组的超氧化物歧化酶活力最高，其次是H1组，2组之间差异显著且均显著高于C组(P<0.05)；H1组和H2组的过氧化氢酶活力显著高于C组(P<0.05)。饲喂不同浓度的HMX2-EPS可以不同程度的提高大菱鲆幼鱼非特异性免疫酶活力。
表3.饲料中添加不同含量HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼肠道免疫相关酶活力的影响
Figure BDA0004105013590000061
Figure BDA0004105013590000071
5)mRNA的表达分析
采用TRIzol法提取步骤2)中获得的大菱鲆肠细胞的总RNA，用0.1％琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(Thermo，美国)检测RNA完整性和纯度。
以RNA为模板反转录合成cDNA。基于ABI 7500基因定量实时检测系统(ThermoFisher公司，美国)，采用SYBR greenⅠ方法测定超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)的相对表达量(表4)。定量PCR的反应体系为20μL，其中各0.4μL的上下游引物(10μmol/L)、6μL模板、10μL SYBR MixⅠ和3.2μL的DEPC水。反应程序为50℃20s，95℃7min；95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环。采用2-ΔΔCT法检测目的基因的相对表达量。
表4.内参和目的基因定量引物信息
Figure BDA0004105013590000072
饲料中添加HMX2-EPS对大菱鲆幼鱼肠道免疫因子的影响如图1所示，H1和H2组的大菱鲆幼鱼肠道GPX1、CAT和SOD的表达量显著高于C组(P<0.05)，说明添加HMX2-EPS可以提高抗氧化相关基因GPX1、CAT和SOD的表达，从而降低氧化应激损伤，保护大菱鲆幼鱼健康发育。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (9)

1.植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)CGMCC No.26169，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.26169。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的植物乳杆菌和/或所述植物乳杆菌的代谢物。
3.权利要求1所述的植物乳杆菌的培养物，是将权利要求1所述的植物乳杆菌在细菌培养基中培养得到的物质。
4.权利要求1所述的植物乳杆菌、权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的培养物在制备鱼饲料中的应用。
5.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的培养物在制备胞外多糖的应用。
6.权利要求1所述的植物乳杆菌或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的培养物在制备产胞外多糖产品中的应用。
7.权利要求2所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述植物乳杆菌作为活性成分，得到所述菌剂。
8.制备鱼饲料的方法，其特征在于：所述方法包括将权利要求3所述的培养物和鱼基础饲料混合，得到鱼饲料。
9.一种制备胞外多糖的方法，包括如下步骤：在培养基中培养权利要求1所述的植物乳杆菌，从所述发酵产物中得到胞外多糖。
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