CN117305150B - 一种动物双歧杆菌blh1、直投式发酵剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种动物双歧杆菌blh1、直投式发酵剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种动物双歧杆菌BLH1、直投式发酵剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。本发明从贵州红酸汤中成功分离到了一株耐氧，且能降低“坏”胆固醇LDL‑C的动物双歧杆菌亚种BLH1。菌株BLH1由于对低pH、高胆汁盐条件有高抗性以及强大的拮抗和抗氧化活性，所以具有最大的实际应用潜力。此外，与商业菌株BB12相比，BLH1具有降低“坏”胆固醇、增加“好”胆固醇的优良特性。同时，BLH1也表现出抗生素敏感性，并能产生最高的EPS。这些结果表明，BLH1具有良好的安全性和益生菌特性。因此，BLH1可作为潜在的益生菌用于微生物生态制剂和功能性食品的生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种动物双歧杆菌BLH1、直投式发酵剂及其制备方法和应用。
背景技术
随着人们对健康的日益重视，益生菌的相关研究受到了越来越多的关注。根据联合国粮食及农业组织(粮农组织)和世界卫生组织(世卫组织)专家小组的定义，益生菌是指当给予足够数量的活微生物时，通过改善肠道微生物平衡而对宿主健康有益的活微生物。而最近，国家健康研究所(NIH)将“益生菌”更简单地定义为“旨在对健康有益的活微生物”。目前，已经有许多研究报道了益生菌的功能特性对人体及动物健康的重要性，包括对病原微生物、高血压、炎症、糖尿病、氧化应激等的保护，以及抗氧化活性、免疫调节和降低胆固醇。
含有益生菌的食品，又称为功能性食品。功能食品市场目前最常用的益生菌菌种为乳酸菌和双歧杆菌。双歧杆菌属是占主导地位的肠道微生物群中的一员，具有降低胆固醇、调节肠道微生物平衡、还原硝酸盐、抑制氧化、产生胞外多糖等重要功能。此外，它还是非致病性的，并被普遍认为是安全的。由于这些原因，双歧杆菌在过去一直被广泛用作为益生菌，相关研究也引起了许多学者的关注，特别是新的优良性能微生物菌株的开发。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的动物双歧杆菌BLH1、直投式发酵剂及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种动物双歧杆菌BLH1(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)，所述动物双歧杆菌BLH1于2022年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20221979。
本发明还提供一种直投式发酵剂，所述直投式发酵剂含有所述的动物双歧杆菌BLH1。
优选的是，所述直投式发酵剂含有所述的动物双歧杆菌BLH1。
本发明还提供所述直投式发酵剂的制备方法，利用所述动物双歧杆菌BLH1发酵黄豆，发酵完成后与冻干保护液混合均匀即可。
优选的是，所述发酵黄豆的方法为：薏仁米浸泡、打浆，经糊化、液化、糖化、灭酶处理得到薏仁米糖化液，将黄豆浸泡于所述薏仁米糖化液中12-14h，浸泡完成后利用所述动物双歧杆菌BLH1发酵得到。
优选的是，所述薏仁米浸泡的时间为10-16h；所述打浆时，薏仁米与水的质量比为1:12；
所述糊化、液化、糖化、灭酶为将浆汁用小火加热25-40min至糊化状态；糊化完全后加酶进行酶解，α-淀粉酶用量190-220U/g，液化温度80-90℃，液化时间45-55min；糖化酶用量280-320U/g，糖化温度60-70℃，糖化时间45-55min；最后置于大火高温90-105℃加热4-8min灭酶。
优选的是，所述发酵的条件为：37℃在10％的CO2培养箱发酵培养24-30h。
优选的是，所述冻干保护液为在去离子水中添加质量比为16％的脱脂乳粉、1.2％的抗坏血酸、8％的麦芽糊精和8％的蔗糖。
本发明还提供所述的动物双歧杆菌BLH1或所述的直投式发酵剂在降低总胆固醇含量中的应用。
本发明还提供所述的动物双歧杆菌BLH1或所述的直投式发酵剂在提高HDL-C中的应用。
本发明还提供所述的动物双歧杆菌BLH1或所述的直投式发酵剂在降低LDL-C中的应用。
本发明还提供所述的动物双歧杆菌BLH1或所述的直投式发酵剂在降低动脉粥样硬化指数中的应用。
本发明还提供所述的动物双歧杆菌BLH1或所述的直投式发酵剂在EPS生产中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从贵州红酸汤中成功分离到了一株耐氧，且能降低“坏”胆固醇LDL-C的动物双歧杆菌亚种BLH1。菌株BLH1由于对低pH、高胆汁盐条件有高抗性以及强大的拮抗和抗氧化活性，所以具有最大的实际应用潜力。此外，相关益生菌性状研究表明，与商业菌株BB12相比，BLH1具有降低“坏”胆固醇、增加“好”胆固醇的优良特性。同时，BLH1也表现出抗生素敏感性，并能产生最高的胞外多糖(EPS)。这些结果表明，BLH1具有良好的安全性和益生菌特性。因此，BLH1可作为潜在的益生菌用于微生物生态制剂和功能性食品的生产。
使用薏仁米浸泡的黄豆可以简单高效的实现动物双歧杆菌的高密度发酵，动物双歧杆菌的活菌数达1010以上，是薏仁米、黄豆其它处理方式发酵所得活菌数的10倍以上，这有助于其产业化应用。接着制备成功了直投式发酵剂，本发明提供的直投式发酵剂，使发酵剂在实际生产中的运用更加便捷，有助于其产业化推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为26株分离菌株与对照株BL1和BB12的主成分分析图(PCA)；
图2为基于部分16S rDNA序列的邻接系统发生树，节点上的数字表示基于1000个重复的百分比引导值；水平比例尺表示距离为0.1；
图3为动物双歧杆菌还原亚硝酸盐并产生胞外多糖情况，(A)还原亚硝酸盐，(B)产生胞外多糖；
图4为薏仁米、黄豆前处理方式对其固态发酵动物双歧杆菌BLH1的活菌数影响；
图5为发酵时间对薏仁米糖化液浸泡黄豆(A)、蔗糖液浸泡黄豆(B)发酵的动物双歧杆菌的活菌数影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1
本实施例中动物双歧杆菌筛选样品来自贵州红酸汤，商用长双歧杆菌BL1购自中国内蒙古双奇药业股份有限公司，动物双歧杆菌亚属BB12购自科汉森(丹麦，霍尔索尔姆)。
昆明大鼠购自贵州医科大学(中国贵州)。所有大鼠分别在单独通风和无病原体的笼子中饲养在恒温的动物室(22±3℃)中，光/暗循环12h，湿度50±5％。食物和水都免费供应。大鼠正常饮食中含有31％(w/w)蛋白质、5％脂肪、1.9％纤维、1.8％钙、1.3％磷和无氮提取物。适应一周后，对大鼠进行急性毒性和降胆固醇试验。
所有动物实验方案均经贵州大学伦理委员会批准(伦理批准代码：EAE-GZU-2020-P009)，并遵循所有有关动物伦理使用的适用机构和政府法规。
每次试验至少进行三次独立实验。所有数据以均数±标准差(SD)表示。使用SPSS26.0(SPSS，芝加哥，IL，美国)对来自不同分离株的数据进行分析。利用主成分分析法(PCA)筛选最有希望的菌株。
比较时采用Tukeye Kramer事后比较的方差分析法。以p<0.05为差异有统计学意义。
1.与双歧杆菌特征相似的耐氧菌株分离
用0.85％的氯化钠将新鲜的红酸汤稀释后，涂在莫匹罗星琼脂培养基上，双歧杆菌BL1和BB12作为对照，选择性计数双歧杆菌。然后，选择与对照菌株菌落和细胞形状相似的革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性微生物。随后，将所选微生物分散在mPTYG-F平板上，分离平板上有透明圆圈的微生物，用显微镜观察其细胞形状。分离出与对照菌株BL1和BB12具有相似细胞形状(典型膨胀节的不规则杆状)的菌株，测定其对酸和胆盐的耐受性及体外降低胆固醇的能力。
本实施例在20％(v/v)CO2环境下从红酸汤中筛选目标双歧杆菌。首先使用Mupirocin-mucin琼脂和mPTYG-F平板分离出与对照菌株BB12和BL1相似的菌落和细胞形状的革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性微生物。然后，本实施例分析了在20％(v/v)CO2环境下生长良好的分离菌株对酸和胆盐的耐受性以及胆固醇降低率，并通过SPSS进行了主成分分析。
1.1耐氧性
将mPTYG肉汤的pH值调整至6.8。将10％双歧杆菌培养物(1×107CFU/mL)接种于mPTYG中(10％v/v)，在20％CO2-80％大气(16.8％O2)中37℃孵育48h。培养后，用mPTYG琼脂平板计算细胞浓度(CFU/mL)。
红酸汤中的微生物适应了胃肠道中的高酸和胆盐，只有耐氧微生物在氧胁迫环境中生长。在耐氧方面，所有分离株均能在20％CO2-80％大气中的mPTYG平板中生长(活细胞>6log CFU/mL)，部分菌株包括BLH1、BH11、BH12、BH25和两株对照株生长良好(活细胞>8logCFU/mL)。动物双歧杆菌的氧耐受性可能与NADH氧化酶和NADH过氧化物酶的酶促能力有关。而胆固醇去除率方面，11株菌株的降胆固醇率为20％～30％，4株菌株的胆固醇去除率超过30％(w/w)。
1.2耐酸性
耐酸性实验过程如下：将mPTYG肉汤的pH分别调至2.0、3.0和6.8。将10％动物双歧杆菌培养物(1×108CFU/mL)(10％v/v)接种于mPTYG中，37℃培养2h后，用mPTYG琼脂平板计算细胞浓度(CFU/mL)。
菌株存活：N＝N0/N1×100％
N0和N1分别表示在pH 2.0～3.0和pH 6.8时的细胞浓度(log CFU/mL)。
耐酸能力方面，所有菌株和对照菌株BL1和BB12在pH 2.0和3.0条件下培养2h后均有较高的存活率(>为90％)。大多数菌株在pH 2.0时表现出较强的耐酸能力(存活率＜95％)，而BH5、BH6、BH10、BH11、BH20、BH22和BH26在pH 3.0时表现出较弱的耐酸能力(<95％)。
1.3胆盐耐受性
胆盐耐受性实验过程如下：将10％动物双歧杆菌培养物(1×108CFU/mL)接种到添加0％(对照)和0.3％-0.5％胆盐的PTYG培养液中，并在37℃20％(v/v)CO2中培养24h。培养结束后，根据细胞存活数测定其胆盐耐受性。
动物双歧杆菌存活率：A＝A0/A1×100％
A0和A1分别表示在0.3％～0.5％胆盐和不含胆盐条件下的存活细胞浓度(logCFU/mL)。
在胆汁盐耐受性方面，9株菌株在0.5％胆汁盐中表现出较高的耐受性，存活率大于90％。BH22和BLH1的存活率最高，达95％。不同细菌的胆盐耐受性与其生物学特性有关。动物双歧杆菌在暴露于胆汁盐后可以形成稳定的胆汁抗性表型。
1.4体外降低胆固醇能力
将10％的细菌(1×108CFU/mL)接种到添加0.1mg/mL胆固醇胶束的mPTYG肉汤中，以未接种组作为对照组。37℃培养48h后，在4℃12000r/min离心10min后，收集上清液。采用邻苯二甲醛法测定上清液和对照组中剩余胆固醇。
通过SPSS 26.0(SPSS，Chicago，IL，USA)使用主成分分析(PCA)来进行定量分析(不同pH水平下的存活率、胆盐浓度、体内耐氧生长和胆固醇降低率)，以选择最有潜力的益生菌菌株。
26株分离株的结果见表1。
表1 革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的26分离株的应激耐受性和降低胆固醇
*注:a、b:1、0表示在pH 2.0(或pH 3.0)条件下，存活率依次为>95％和90％-95％。
c、d:3、2、1分别为>95％、90％～95％、80％～90％、<80％。
e:2、1、0表示分离株的活细胞依次为>8log CFU/mL、7～8log CFU/mL、6～7logCFU/mL。
f:3、2、1、0表示降脂率依次为>35％、30％～35％、20％～30％、<20％。
如表1所示，在26株菌株中，部分菌株表现出较高的耐酸能力，有的则表现出较高的胆盐能力。而有些菌株又表现出高耐氧性，或是表现出高胆固醇去除率。
本实施例进行了主成分分析(PCA)结果如图1所示，28株菌株在PCA图中区分较好，大部分菌株主要分布在第2、3、4象限。70.7％的变异被解释，表明菌株间存在显著差异。根据变量在PCA析因空间中的位置将28株菌株分为I、II、III、IV组。I组(包括BLH1、BH9、BH12、BH23、BH25分离株以及对照菌株BL1和BB12)在酸、胆盐、氧耐受性和降低胆固醇方面最有前景。
而I组又可分为I1(包括BLH1)、I2(包括BL1、BB12)和I3(包括BH9、BH12、BH25等)3个亚组。I1亚组明显优于I2亚组，I2亚组明显优于I3亚组。此外，BLH1比对照菌株BL1和BB12表现得更好。因此，基于PCA，考虑到对酸、胆盐和氧的耐受性，以及降低胆固醇，最具前景的菌株是BLH1。因此，本发明选择BLH1进行后续实验。
2.鉴定
BLH1通过生理生化和16S rRNA基因分析进行鉴定。
2.1生理生化鉴定
取经革兰氏染色为阳性、具有明显双歧杆菌特性的菌株，按常规方法进行过氧化氢酶试验、糖发酵试验、吲哚试验，对菌株做进一步鉴定。
对菌株BLH1进行生理生化鉴定，结果见表2。由表2可知，菌株BLH1吲哚试验为阴性，不产过氧化氢酶，不产硫化氢，与双歧杆菌属的特征相符。结合菌株形态特征与国标GB4789.34—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验》及伯杰氏细菌鉴定手册进行对比，表明菌株BLH1被初步鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)。
表2菌株BLH1的生理生化试验鉴定结果
注：“+”表示90％以上菌株为阳性，“-”表示90％以上菌株为阴性，“d”表示11％～89％的菌株为阳性。
2.2 16S rRNA分子生物学鉴定
DNA的提取：采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物技术有限公司，中国上海)，方法根据试剂盒说明书。
聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增：引物为27F：AGTTTGATCMTGGCTCAG1492RGGTTACCTTGTTACGACTT。
PCR产物经1％琼脂糖电泳分析后测序，所得序列在美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)中比对，选取相似性较高的菌株的16S rRNA序列，用MEGA软件构建系统发育树。
采用琼脂糖凝胶对菌株BLH1的PCR扩增产物进行电泳检测。将所测得的16SrRNA基因序列提交到NCBI，通过Blast工具在GenBank数据库中进行比对，选取7株同源性较高菌株构建系统发育树，结果见图2。
由图2可知，菌株BLH1所在的最大分支中其所包括的菌株均为双歧杆菌，菌株BLH1的16SrRNA序列与动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)AD011以及动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)YIT4121的同源性达到100％，且属于同一个最小分支中，因此菌株BLH1的鉴定结果为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)。BLH1菌株现在已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中注册并保藏，编号为CCTCC NO：M20221979。
实施例2安全性评价
1.急性毒性试验
24只大鼠适应1周后随机分为两组(n＝12，雌雄各半)：(A)对照组，正常饮食；(B)BLH1组：在生理盐水中添加动物双歧杆菌BLH1的正常饮食。适应结束后，各组分别饲喂1.0mL动物双歧杆菌溶液或PBS缓冲液(对照组)。每天记录动物的外观和体重，持续一周。实验结束后，用戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱位处死动物，并观察大鼠大体形态，解剖内脏。
大鼠一周体重见表3。雄鼠和雌鼠的体重增加量在一周内与对照组无显著差异。大鼠代谢和生理特征正常。颈椎脱位后肝、脾、肺、肾正常。结果表明，BLH1菌株无急性毒性。
表3急性毒性试验
*注:“-”表示无明显变化。
2.药敏试验
采用琼脂覆盖扩散法测定动物双歧杆菌对抗生素的敏感性。取100μL动物双歧杆菌菌液置于灭菌的PTYG琼脂平板中。每个平板上放置抗生素片(中国杭州微生物试剂有限公司)，在37℃20％(v/v)CO2培养箱中孵育48h，测量并记录抑菌圈直径。每组平行进行3次实验，结果取平均值，最后分析是根据国家临床实验室标准委员会(NCCLS)的指导方针进行的。
具有抗生素耐药性的益生菌的使用引起了人们的关注，益生菌微生物对抗生素的耐药性被认为有助于在抗生素治疗期间在胃肠道中存活。5个类别包括19种抗生素(表4)，并用于评估BLH1。BLH1对青霉素、头孢菌素、大环内酯类和四环素敏感。但BLH1对氨基糖苷类药物耐药。有结果表明，长芽孢杆菌JDM301对环丙沙星有较高的耐药性，对万古霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟和利福平敏感。因此，动物双歧杆菌能否将耐药性传递给下一代，特别是当耐药因子由质粒编码时，还需要进一步研究。
表4菌株BLH1的药敏试验
*注：R表示拮抗，M表示中敏，S表示敏感。
3.质粒测定
动物双歧杆菌亚种BLH1的质粒利用TIAN Prep Mini质粒试剂盒(北京天根生物技术有限公司)提取。
外源性细菌进入机体后可携带对人体肠道菌群产生耐药的质粒，导致人体产生耐药性，益生菌的质粒易使人类产生耐药性。在以往的研究中，双歧杆菌质粒携带的概率低于其他菌属。24种双歧杆菌中有5种存在于质粒中，9种人源双歧杆菌质粒中仅存在长双歧杆菌和短双歧杆菌。而动物双歧杆菌BLH1没有质粒，因此，它没有机会通过质粒将耐药性传递给下一代。
4.氨基脱羧酶活性测定
在37℃条件下，将100μL动物双歧杆菌培养物覆盖于预先制备的BASM琼脂平板上。待菌液完全吸收后，于37℃20％(v/v)CO2培养箱中倒置48h，观察培养板中菌落颜色。
BLH1不具有氨基脱羧酶。许多益生菌具有氨基酸脱羧酶，可产生生物胺，而生物胺是毒物的主要成分。当它们大量摄入时，会引起非自然或毒性作用，包括头痛、呼吸系统疾病和心悸。各种食源性益生菌的生物胺产量有显著差异。因此，BLH1无脱羧酶活性。
5.溶血试验
将动物双歧杆菌亚种BLH1在血琼脂平板(广东环开微生物有限公司)上交叉划线后，在20％CO2培养箱中37℃培养48h，观察是否存在溶血现象。
溶血性细菌侵入会导致溶血。而我们的结果结果表明BLH1无溶血活性。Vesterlunds表明乳酸菌不具有溶血活性。
实施例3益生菌性状评价
1.体内降胆固醇
适应1周后，将48只大鼠随机分为4组(n＝12，雌雄各半)：(A)对照组，正常饮食；(B)HC组，高胆固醇饮食；(C)HC+BB12组：高胆固醇饮食+双歧杆菌BB12饮水；(D)HC+BLH1组，高胆固醇饮食+饮用水中添加动物双歧杆菌BLH1。在实验开始前一周，所有大鼠都适应了各自的饮食。
高胆固醇饮食中含有86.5％(w/w)的正常饮食，12.0％猪油，1.0％胆固醇和0.5％胆酸钠。每组大鼠每日给予1.0mL生理盐水或双歧杆菌(1×108CFU/毫升生理盐水)，连续20天。在干预期结束时，首次从眶后静脉采血。第二次用戊巴比妥麻醉后，从眼球中取血并处死。以1299×g离心10min，从血液中分离血清。用酶标仪测定总胆固醇(TC)、HDL-C和LDL-C。
动脉粥样硬化指数(AI)的计算公式如下：AI＝LDL-C/HDL-C。
BLH1菌株对大鼠血清胆固醇、HDL-C、LDL-C和AI的影响如表5所示。
表5菌株BLH1对大鼠血清胆固醇、HDL-C、LDL-C和AI的影响
*注：同一列中小写字母的不同表示均值差异显著(p<0.05)。
从表5可以看出，菌株BLH1对大鼠血清胆固醇、HDL-C、LDL-C和AI的影响。BLH1和BB12均能显著降低TC、LDL-C和AI，升高HDL-C(p<0.05)。BLH1在降低TC、提高HDL-C、降低AI和LDL-C方面效果最好。
LDL-C可导致血管中胆固醇的积累，是冠状动脉疾病发生和发展的主要因素。为了减少心血管疾病的发生，有必要降低血清中的LDL-C。相反，HDL-C通过清除血液中的胆固醇，调节LDL-C的浓度，从而防止动脉粥样硬化。因此，HDL-C被称为“好”胆固醇，LDL-C被称为“坏”胆固醇。TC与心血管疾病密切相关，AI是国际医学界开发的衡量动脉粥样硬化程度的指标。因此，AI指数越高，患心血管疾病的程度越高。
体内胆固醇含量每降低1％，患心血管疾病的风险就降低3％。通过饮食干预来减少饱和脂肪和胆固醇已被认为是降低LDL-C的重要治疗方式，例如食用含有有益双歧杆菌的发酵产品，可以降低胆固醇，从而降低心血管疾病的发病率。本发明研究结果表明，BLH1是一种能降低坏LDL-C、提高好HDL-C的优良菌株，因此该菌株可能是未来减轻心血管相关症状的良好候选食品成分。
2.粘附性分析
冷冻Caco-2细胞在37℃下解冻并在1000×g和37℃条件下离心5分钟。Caco-2电池在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；HyClone，Laboratories Inc.，Logan，UT，USA)中生长，该培养基补充有20％灭活的胎牛血清(FBS；HyClone)，置于37℃、含有95％(v/v)加湿空气和5％(v/v)CO2的培养箱中。将Caco-2细胞(2×104个细胞/mL)接种于6孔组织培养板(补充无菌22nm×22nm盖玻片)中，每48h更换培养液培养16d，充分分化。用Hanks溶液洗涤细胞三次以去除多余的未附着细胞。每孔分别加入1mL动物双歧杆菌悬液(1×108CFU/mL)和2mLDulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)溶液，并在37℃下在5％CO2下培养1h。培养结束后，用无菌Hanks液洗涤3次，去除未结合的细菌，加入无水甲醇覆盖玻璃进行固定。取出无菌盖玻片进行革兰氏染色。随机选取50个细胞和20个切面，在光学显微镜下观察细胞粘附情况。计算BLH1和BB12菌株对Caco-2细胞的粘附值。
益生菌作为功能性补充剂的一个主要特点是其对消化的应激耐受性。益生菌粘附于宿主肠道上皮细胞的能力被认为是建立预先定植的重要因素。粘附和定植特性可以使益生菌长期发挥对宿主的最大作用。因此，以BB12为对照，利用Caco-2细胞进行体外粘附实验。BLH1和BB12菌株对Caco-2细胞的黏附值分别为6.66±0.32CFU/cell和5.12±0.46CFU/cell。结果表明，BLH1具有良好的粘附价值。
3.亚硝酸盐降解
菌株降解亚硝酸盐的测定根据GB5009.3-2010方法测定，将菌株按3％(v/v)接种于NaNO2的浓度为100μg/mL的MRS液体培养基中，分别于0h、12h、24h测定NaNO2的残留量。
亚硝酸盐存在于多种食品中，作为食品添加剂广泛应用于食品工业；此外，它还是亚硝胺的前体，经常摄入富含亚硝酸盐的食物可导致高铁血红蛋白血症和癌症。BLH1、BB12对亚硝酸盐的还原能力如图3中A所示。24h后，三株菌株的亚硝酸盐还原率(p>0.05)均超过90％，可见三株菌株均能很好地还原亚硝酸盐。
本实验对动物双歧杆菌产生胞外多糖的能力进行了检测，如图3中B所示。结果显示，48h后，BLH1和BB12分别为118.03和110.76mg/L，在体外有显著性差异(p<0.05)。胞外多糖包裹的细胞对胃酸和胆盐有较高的耐受性，并能提高益生菌在胃肠道的黏附能力，有助于长寿。动物双歧杆菌胞外多糖具有良好的清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力，对脂质氧化和红细胞溶血有一定的抑制作用。BLH1和BB12均产生胞外多糖，这表明它们是益生菌，并部分解释了它们的抗氧化和粘附特性。
4.抗氧化性评价
对动物双歧杆菌发酵上清液、动物双歧杆菌细胞及动物双歧杆菌无细胞提取物进行抗氧化活性测定。测定超氧阴离子自由基清除率、DPPH清除率、羟自由基清除率及还原能力，以分析动物双歧杆菌主要位置的活性物质。动物双歧杆菌的抗氧化情况如表6所示。
表6动物双歧杆菌的抗氧化情况
*注：同一行中小写字母的不同表示均值差异显著(p<0.05)。
由表6可知，发酵上清液对羟基自由基和DPPH的清除能力均显著高于细菌细胞和胞外提取物，由此可以推断，细胞上清液中存在清除羟基自由基和DPPH的物质。菌株BLH1的羟基自由基清除率(DPPH)显著高于BB12(68.05％，p<0.05)，两种菌株对DPPH的清除率差异无统计学意义。在超氧阴离子清除方面，胞外提取液清除能力最强。因此，两株双歧杆菌的超氧阴离子清除物质主要存在于细胞内。而还原能力与OD700值成正比，两株菌均具有较高的还原能力，菌株动物双歧杆菌BLH1显著高于BB12(3.083)。结果表明，BLH1是一种良好的抗氧化剂。
5.模拟进入肠道的转运过程
模拟胃液：胃蛋白酶溶于0.2％NaCl中至终浓度3.0g/L，用1M HCl调节pH为2.0。模拟胃液经0.22μm微孔膜过滤灭菌。
模拟肠液：将胰蛋白酶和胆盐依次均匀分散于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，终浓度分别为1.0和4.5g/L。用0.1M NaOH调节溶液pH为7.4，模拟肠液经0.22μm微孔膜过滤灭菌。
将菌株培养物接种到模拟胃液中，并在37℃下培养。通过测定0h、2h胃液中活菌总数分析胃液中菌株的耐受性。
在胃液中培养2小时后，将1mL培养物接种到9mL模拟肠液(pH＝7.4)中，并在37℃下培养2h，模拟肠道运输。通过测定2h肠液中活菌来分析菌株在肠液中的耐受性。
结果显示，BLH1和对照菌株BB12在模拟胃肠道中的存活率均大于95％。BLH1和BB12在模拟胃液(GJ，模拟胃)和模拟肠液(IJ，模拟肠)中的表达无明显差异，这一发现表明BLH1能够在胃肠道环境中存活。
实施例4直投式动物双歧杆菌发酵剂的制备
1.菌种制备
将动物双歧杆菌BLH1接种到mPTYG培养基，温度设定为37℃中培养36小时，离心收集菌体，并重悬于无菌生理盐水中(菌种浓度为1.0×108CFU/mL)，备用。
2.薏仁米和黄豆原料的不同浸泡方式对其固态发酵动物双歧杆菌的影响
(1)薏仁米糖化液浸泡黄豆
1)薏仁米浸泡：将挑选好的薏仁米置于装有清水的盆中清洗，再将薏仁米沥干，放置于含有蒸馏水的盆中，浸泡12h。
2)打浆：将已浸泡好的薏仁米沥干，再置于蒸馏水中，按质量比为薏仁米：水＝1：12进行打浆；
3)糊化、液化、糖化、灭酶：将浆汁用小火加热30min至糊化状态；糊化完全后加酶进行酶解，高温a-淀粉酶用量200U/g，液化温度85℃，液化时间50min；糖化酶用量300U/g，糖化温度65℃，糖化时间50min；最后置于大火高温加热5min灭酶。
4)黄豆清洗过后用制备好的薏仁米糖化液浸泡12-14h，比例为1：2.5。浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
(2)薏仁米、黄豆一起浸泡
将挑选好的薏仁米、黄豆置于装有清水的盆中清洗，沥干，再混匀(薏仁米黄豆质量比1：5)，浸泡12-14h。浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
(3)蔗糖溶液浸泡
用4.5％蔗糖溶液替代蒸馏水浸泡薏仁米或黄豆。浸泡好后加1％NaCl混匀，灭菌。
(4)固态发酵
将灭菌冷却后的薏仁米浸泡的黄豆、薏仁米和黄豆简单混和浸泡物、蔗糖溶液浸泡的薏仁米或黄豆，分别按4％的接种量BLH1，发酵24-30小时，发酵温度37℃。
3.冻干制备
利用BLH1发酵黄豆，发酵条件：37℃在10％的CO2培养箱发酵培养24-30h。
将发酵完成的黄豆100g与25mL冻干保护液(用100mL去离子水然后以这个为基数添加质量比为16％的脱脂乳粉、1.2％的抗坏血酸、8％的麦芽糊精和8％的蔗糖，配成冻干保护剂溶液)混合均匀，于-20℃冰箱预冻24h，真空冷冻干燥40h，取出后于37℃、180r/min摇床复水16h后取样用BLH1平板培养基培养16h，检测其活菌数，计算存活率。同时不加冻干保护剂的做为对照组。冻干后粉碎得直投式动物双歧杆菌发酵剂。
存活率＝(冷冻干燥前的活菌数/冷冻干燥后的活菌数)×100％
4.直投式发酵剂发酵黄豆
将直投式发酵剂BLH1配成1×108cfu/mL的种子液，接种发酵薏仁米浸泡的黄豆，分别按4％的接种量BLH1，发酵24小时，发酵温度37℃。发酵完成后，测其活菌数。同时利用非直投式发酵剂得到的相同浓度种子液进行对比发酵，测其活菌数，这作为对照组。
薏仁米、黄豆前处理方式对其固态发酵动物双歧杆菌BLH1的活菌数影响检测结果如图4所示，薏仁米、黄豆前处理方式对其固态发酵动物双歧杆菌BLH1的活菌数有显著的影响：蔗糖浸泡黄豆、蔗糖浸泡薏仁米、蔗糖浸泡薏仁米黄豆、薏仁米糖化液浸泡黄豆(这里浸泡液糖浓度相同)后接种相同浓度的动物双歧杆菌BLH1发酵30小时后，动物双歧杆菌活菌数分别是：11.13、10.92、11.04和13.53，薏仁米糖化液浸泡黄豆发酵的活菌数高于其它前处理方式活菌数100余倍，最高达407倍。
这说明薏仁米和黄豆本可以实现动物双歧杆菌BLH1的高密度发酵，这同时也说明薏仁米糖化液浸泡黄豆，可实现薏仁米与黄豆的营养互补，这样才能实现薏仁米和黄豆的高值作用：大幅度提高活菌数，用简单的方法获得高密度发酵的效果。
推测薏仁米糖化液浸泡黄豆后，可能具有以下几方面作用：(1)营养成分组合成一体，有助于发挥二者间的营养互补作用；(2)薏仁米和黄豆有可能都存在促动物双歧杆菌生长的因子，但二者组合在一体才能发挥二者间的协同增效作用；(3)薏仁米糖化液浸泡黄豆的过程中可能发生了未知的生化反应，新生成了能大幅度促动物双歧杆菌生长的增值因子。
图2实际上表明动物双歧杆菌在薏仁米糖化液浸泡的黄豆和蔗糖溶液浸泡的黄豆这两种条件下的生长曲线。可以明显看出，动物双歧杆菌在薏仁米糖化液浸泡的黄豆上生长在整个30小时内都处于快速生长期，而且趋势上看如果进一步延长生长时间，依然会快速生长繁殖。而动物双歧杆菌在蔗糖溶液浸泡的黄豆上在生长到12小时生长就变缓慢，然后到24小时就到达稳定期。对比结果可知，动物双歧杆菌在薏仁米糖化液浸泡的黄豆上生长而获得的活菌数比蔗糖溶液浸泡的黄豆上高出百倍以上。这再一次说明，薏仁米糖化液浸泡的黄豆激发了动物双歧杆菌的生长潜能，用薏仁米糖化液浸泡的黄豆来培养高浓度动物双歧杆菌是一种简单有效的方法，这对于薏仁米和黄豆的高值化利用也都具有重要意义。
使用冻干保护剂得到的存活率为92.6％，而不用抗冻保护剂直接进行冻干的存活率为71.6％。这说明薏仁米浸泡的黄豆本身就具有较好的抗冻功能。
利用动物双歧杆菌直投式发酵剂和直接培养种子液都调成相同的浓度发酵薏仁米糖化液浸泡的黄豆进行高密度发酵，所得活菌数10.69±0.16(直投式发酵剂)和10.76±0.12(直接培养种子液)，二者无显著差异，说明效果基本相同。这说明直投式发酵剂制备是成功的，可以进行应用以简化生产。
综上可知，本发明从贵州红酸汤中成功分离到了一株耐氧，且能降低“坏”胆固醇LDL-C的动物双歧杆菌亚种BLH1。在所有分离株中，菌株BLH1由于对低pH、高胆汁盐条件有高抗性以及强大的拮抗和抗氧化活性，所以具有最大的实际应用潜力。此外，相关益生菌性状研究表明，与商业菌株BB12相比，BLH1具有降低“坏”胆固醇、增加“好”胆固醇的优良特性。同时，BLH1也表现出抗生素敏感性，并能产生最高的EPS。这些结果表明，BLH1具有良好的安全性和益生菌特性。因此，BLH1可作为潜在的益生菌用于微生物生态制剂和功能性食品的生产。
使用薏仁米浸泡的黄豆可以简单高效的实现动物双歧杆菌的高密度发酵，动物双歧杆菌的活菌数达1010以上，是薏仁米、黄豆其它处理方式发酵所得活菌数的10倍以上，这有助于其产业化应用。接着制备成功了直投式发酵剂，使用黄豆作为菌株载体制备直投式发酵剂，使发酵剂在实际生产中的运用更加便捷，有助于其产业化推广。动物双歧杆菌直投式发酵剂可以应用于各个领域，包括食品工业、农业和医药。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）BLH1，其特征在于，所述动物双歧杆菌BLH1于2022年12月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M20221979。
2.一种直投式发酵剂，其特征在于，所述直投式发酵剂由权利要求1所述的动物双歧杆菌BLH1发酵黄豆制得，发酵完成后与冻干保护液混合均匀即可；
所述发酵黄豆的方法为：薏仁米浸泡、打浆，经糊化、液化、糖化、灭酶处理得到薏仁米糖化液，将黄豆浸泡于所述薏仁米糖化液中12-14h，浸泡完成后利用权利要求1所述动物双歧杆菌BLH1发酵得到；
所述冻干保护液为添加质量比为16%的脱脂乳粉、1.2%的抗坏血酸、8%的麦芽糊精和8%的蔗糖的去离子水。
3.如权利要求1所述的动物双歧杆菌BLH1或权利要求2所述的直投式发酵剂在制备降低总胆固醇含量的产品中的应用。
4.如权利要求1所述的动物双歧杆菌BLH1或权利要求2所述的直投式发酵剂在制备提高HDL-C的产品中的应用。
5.如权利要求1所述的动物双歧杆菌BLH1或权利要求2所述的直投式发酵剂在制备降低LDL-C的产品中的应用。
6.如权利要求1所述的动物双歧杆菌BLH1或权利要求2所述的直投式发酵剂在制备降低动脉粥样硬化指数的产品中的应用。
7.如权利要求1所述的动物双歧杆菌BLH1或权利要求2所述的直投式发酵剂在胞外多糖生产中的应用。
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