CN117946913A - 一株粪肠球菌xy3及其在制备降糖和抗衰老食品药品中的应用 - Google Patents
一株粪肠球菌xy3及其在制备降糖和抗衰老食品药品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于益生菌及其应用技术领域，具体涉及一株粪肠球菌XY3及其在制备降糖和抗衰老食品药品中的应用。为进一步开发利用粪肠球菌的益生功能，本发明从中国广东地区一名健康成年人的粪便样品中分离纯化得到一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株，该菌株可产生和分泌透明质酸，可抑制α‑葡萄糖苷酶活性，可产生和分泌谷胱甘肽，可抑制乙酰胆碱酯酶活性，可抑制黄嘌呤氧化酶活性，有望应用于美白和抗衰老，降糖，抗氧化、抗炎和抗过敏，促进肠道吸收和蠕动，预防和缓解高尿酸血症和痛风等方面，在降糖和抗衰老等领域具有重要的潜在应用前景。
Description
技术领域
本发明属于益生菌及其应用技术领域，具体涉及一株粪肠球菌XY3及其在制备降糖和抗衰老食品药品中的应用。
背景技术
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是革兰氏阳性菌，过氧化氢阴性球菌，是人和动物肠道内主要菌群之一。粪肠球菌(E.faecalis)是一种兼性厌氧型革兰氏阳性乳酸菌，菌体形态为球状或链状，大多数成双或短链状排列，通常不运动，直径为0.5-1.0微米，无荚膜，无芽孢，对环境适应力和抵抗力强，可耐受四环素、卡那霉素、庆大霉素等多种抗生素，生长条件要求不严格。此外，粪肠球菌可利用精氨酸为能源，发酵山梨醇，但不能发酵阿拉伯糖。
粪肠球菌是人类肠道的正常寄居菌，存在于大约90-95％的人体当中。这种细菌通常是生命早期定植于人类胃肠道的首批微生物之一，在肠道免疫系统的发育中发挥着重要作用。《饲料添加剂品种目录(2013)》将粪肠球菌划分为可以添加到饲料中的菌种，其在动物肠道内可形成生物薄膜而附着于动物肠道的粘膜上，并且其上发育、生长和繁殖。而且，粪肠球菌能够将饲料中的纤维变软，提高饲料的转化率。
粪肠球菌是人和动物肠道内的主要菌群之一，能产生天然抗生素，有利于机体健康；还能产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境；还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降。同时，粪肠球菌为消化道内正常存在的一类微生物，在肠黏膜中具有较强的耐受和定植能力，并且是一种兼性厌氧的乳酸菌，适合于生产和应用，也是一种很好的饲用微生物，在水产、畜禽上的应用广泛。此外，粪肠球菌既是人和动物肠道中的正常菌群，也是一种重要的乳酸菌，具有较好的肠道粘附能力，能产生乳酸及一些抗菌物质，抑制肠道腐败菌、致病菌的繁殖及肠道感染，降低腹泻率，促进营养物质的消化吸收，增强免疫力，提高采食量及饲料转化率，促进动物健康，是畜牧生产及食品工业首选使用的益生菌菌种之一。有学者研究发现，在玉米秸秆青贮饲料中添加粪肠球菌和纤维素酶，能使青贮饲料的色泽、气味和质地等发生明显的改善，干物质消失率提高8％，氨态氮与总氮质量比降低33％，丁酸质量分数降低82％，同时使中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别降低10％和7％，明显提高了饲料品质。同时，有研究证实，粪肠球菌能够产生多种抗菌物质，这些抗菌物质对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌具有良好的抑制作用。也有研究表明，粪肠球菌能够产生伏尔加霉素，可以有效抑制李斯特菌和金黄色葡萄球菌和腐败微生物的生长繁殖。粪肠球菌也能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平。粪肠球菌在动物肠道内可形成生物薄膜而附着于动物肠道粘膜上，并且在此发育、生长和繁殖，可形成乳酸菌屏障，抵御外来病菌病毒及霉菌毒素等的负影响。
现有的大量研究表明，粪肠球菌的不同菌株具有不同的益生功能。比如：(1)粪肠球菌菌株T-110与枯草芽孢杆菌TO-A和丁酸梭菌TO-A结合使用作为益生菌(BIO-THREE)。这三种菌株一起可以减少手术患者的术后感染并缩短急性腹泻患儿的住院时间。(2)一项交叉研究发现，对健康人类受试者单次施用粪肠球菌YM0831菌株，可显著改善血糖对蔗糖耐量试验的反应。
由于粪肠球菌来源具有多样性，导致其基因具有多样性和功能多样性。然而，目前针对粪肠球菌的分离鉴定、益生特性和代谢机制的研究依然较少，这在一定程度上也影响了对粪肠球菌的开发利用。因此，有必要挖掘更多具有益生功能的粪肠球菌，并应根据粪肠球菌的不同来源进一步挖掘其不同功能，使其更好地发挥作用，如根据菌株的功能或者益生代谢产物确定其功效，明确其应用前景。综上所述，粪肠球菌的研究及应用有很广阔的发展空间。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明从中国广东地区一名健康成年人的粪便样品中分离纯化得到一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株，该菌株可产生和分泌透明质酸，可抑制α-葡萄糖苷酶活性，可产生和分泌谷胱甘肽，可抑制乙酰胆碱酯酶活性，可抑制黄嘌呤氧化酶活性，在降糖和抗衰老等领域具有重要的潜在应用前景。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明第一方面提供了一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株，所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
本发明第二方面提供了第一方面所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在产透明质酸中的应用。
经研究发现，益生菌粪肠球菌XY3菌株可产透明质酸(HA)，提示粪肠球菌XY3菌株有望用于生产HA，并通过产HA的这一特性应用于抗炎和抗血管生成作用，抗衰老、水润、抚平皱纹，促进伤口消炎及愈合等领域。
本发明第三方面提供了第一方面所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在产还原型谷胱甘肽中的应用。
经研究发现，益生菌粪肠球菌XY3菌株可产还原型谷胱甘肽(GSH)，提示粪肠球菌XY3菌株可用于生产GSH，并通过产GSH这一特性用于抗氧化美白、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤和抗过敏等领域。
本发明第四方面提供了第一方面所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。
经研究发现，益生菌粪肠球菌XY3菌株可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，而α-葡萄糖苷酶与2型糖尿病有关，抑制α-葡萄糖苷酶是控制餐后高血糖的方法之一，提示粪肠球菌XY3菌株有望用于降血糖和抑制肥胖等领域。
本发明第五方面提供了第一方面所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。
经研究发现，益生菌粪肠球菌XY3菌株可有效抑制乙酰胆碱酯酶活性，提示粪肠球菌XY3菌株可通过抑制乙酰胆碱酯酶活性用于增强认知能力和记忆力，扩张血管，兴奋骨骼肌和平滑肌等领域。
本发明第六方面提供了第一方面所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。
经研究发现，益生菌粪肠球菌XY3菌株可抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性，提示粪肠球菌XY3菌株可通过XOD活性用于抑制黄嘌呤氧化酶的活性，降低体内嘌呤，减少尿酸生成，从而控制尿酸水平，预防痛风发作。
本发明第七方面提供了一种制备还原型谷胱甘肽的方法，具体为：将第一方面所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株接种于MRS液体培养基中，培养至稳定期后收取菌悬液，最后分离纯化菌悬液中的还原型谷胱甘肽即得；所述粪肠球菌XY3菌株于2023年7月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20231166；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
当然，也可以用相同的方法，经过不同的分离纯化步骤后，用于制备透明质酸等。
优选地，培养的条件为：37℃恒温厌氧。
优选地，先用MRS液体培养基将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株培养至稳定期，再以1:20-1000的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明从中国广东地区一名健康成年人的粪便样品中分离纯化得到一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株，该菌株具有的多种益生功效，包括产生和分泌透明质酸，抑制α-葡萄糖苷酶活性，产生和分泌谷胱甘肽，抑制乙酰胆碱酯酶活性，抑制黄嘌呤氧化酶活性。因此，粪肠球菌XY3菌株具有美白和抗衰老；降糖；抗氧化、抗炎和抗过敏；促进肠道吸收和蠕动；预防和缓解高尿酸血症和痛风等多种功能。可见，本发明新分离得到的粪肠球菌XY3菌株具有多种益生功效，可用于降糖和抗衰老等领域，比如，制作成降糖和抗衰老药品，具有重要的应用价值和经济价值。
附图说明
图1为粪肠球菌XY3菌株的系统进化树(建树菌株来源于NCBI的Genome数据库)；
图2为粪肠球菌XY3菌株可以产生和分泌透明质酸；
图3为粪肠球菌XY3发酵液可分泌物质显著抑制α-葡萄糖苷酶活性；
图4为粪肠球菌XY3菌株可以产生和分泌GSH；
图5为粪肠球菌XY3发酵液可分泌物质显著抑制乙酰胆碱酯酶活性；
图6为粪肠球菌XY3菌株可抑制XOD活性。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
下列实施例涉及的实验材料如下：
(1)粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株，由肠道微生物组研究润泽实验室分离自中国广东广州地区一名健康成年人(BMI＝22.1)的肠道粪便样品中，于甘油管内置于-80℃低温冷冻保藏。一般情况下，将该菌株接种于MRS固体培养基平板表面，并在37℃恒温厌氧培养箱中倒置培养24h，即可获得菌落，或在37℃恒温厌氧培养箱内于MRS液体培养基中振荡培养24-48h，即可获得发酵液。
(2)试剂盒：透明质酸(又名玻尿酸，HA)检测试剂盒(Cloud-Clone Corp.,Cat:CEA182Ge)，α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选试剂盒(abcam,Cat:ab284520)，微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成,Cat:A006-2-1)，乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选试剂盒(abnova,Cat:KA6219)，黄嘌呤氧化酶活性测定试剂盒(盒子生工,Cat:AKAO006M)。
(3)MRS平板：牛肉膏10g,蛋白胨10g,酵母膏5g,柠檬酸三铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,磷酸氢二钾2g,吐温80 1mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,琼脂15g,ddH2O补齐至1L，调pH至6.2-6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MRS平板。
(4)MRS液体培养基：牛肉膏10g,蛋白胨10g,酵母膏5g,柠檬酸三铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,磷酸氢二钾2g,吐温80 1mL,硫酸镁0.58g,硫酸锰0.25g,ddH2O补齐至1L，调pH至6.2-6.6，121℃高压灭菌20min，配置成MRS液体培养基。
实施例1粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株的分离鉴定
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株从中国广东省一名健康成年人的粪便中分离得到，具体如下：
用无菌水将粪便样品反复清洗3次，置于研钵中，每100mg粪便加入500uL无菌水，彻底研磨匀浆，用移液器吸取适量研磨液，涂布于MRS平板上，室温培养3天。然后，用记号笔对分离实验平板中待划线纯化的菌落进行编号，并相应地在平板上标明菌株编号。标记后，挑取菌落接种到MRS平板上，用平板划线法纯化菌株。若此法不能将菌株分离则需要从富集平板上挑取菌落，经MRS液体培养基梯度稀释后，涂布于培养基上。最后参考《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《真菌分类鉴定手册》，首先分辨属于细菌的菌株，然后观察菌落的生长状况：生长形态、是否有菌丝、颜色是否均匀一致，菌落个体表面及边缘。最终初步分离得到一株纯化菌株，菌株编号为XY3，培养24小时后观察到菌株的菌落呈圆形或椭圆形、湿润、凸起、边缘光滑、表面平整。
接着，通过16S rDNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT)对分离得到的XY3菌株进行分子鉴定后，由北京百迈客生物科技有限公司对XY3菌株进行全基因组测序，将得到的序列16S rDNA sequence(SEQ ID No：1)在NCBI的Genome数据库进行BLAST比对。结果显示，XY3菌株与已知的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)16S rDNA序列的同源性>99％，并与同源菌株进行进化分析(图1)，确认菌株XY3是同种不同株的粪肠球菌。
最后，对菌株XY3进行保藏，保藏信息如下：保藏时间：2022年9月27日；保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏号：CCTCC NO:M 20221505；保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；分类命名：Enterococcus faecalis。
粪肠球菌具有广泛的益生功效，如抗炎、抗衰老和降胆固醇等，但不同来源的菌株其功效不同，说明本发明从人体粪便分离得到的一株新的粪肠球菌XY3可以作为益生菌使用，并可能具有新的功效和功能。
Enterococcus faecalis XY3 16S rDNA sequence(1434bp，SEQ ID No：1)：
TGCAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGTTGCGAAGTCGCGAGGCTAAGCTAATCTCTTAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGG。
实施例2粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株的功能及其应用
(1)粪肠球菌XY3菌株可产生和分泌透明质酸(HA)
将用MRS液体培养基培养至稳定期的粪肠球菌XY3以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过透明质酸(又名玻尿酸，HA)特定ELISA试剂盒(CEA182Ge)测定发酵液上清的HA浓度。结果显示，与空白培养基MRS中低浓度HA相比，菌株XY3的发酵上清液中HA的浓度显著性增加，可积累量为103.07ng/mL，说明粪肠球菌XY3可以在稳定期产生并分泌透明质酸(图2)。
透明质酸，又名玻尿酸，是一种可生物降解、生物相容性、无毒、无致敏性的聚合物，具有多种生物学功能。既具有抗炎和抗血管生成作用，又具有较强的抗衰老、水润、抚平皱纹的能力。由于其有助于皮肤抗皱，促进伤口消炎及愈合，可用于抗皱剂，具有开发皮肤化妆品的潜力。此外，由于HA具有很高的润滑、吸水和保水能力，可以影响多种细胞功能，如迁移、粘附和增殖，使得HA也被广泛应用于眼科手术，关节炎治疗，伤口愈合支架，组织工程，以及植入材料等生物医学领域。
因此，益生菌粪肠球菌XY3菌株可通过产生透明质酸的功效发挥以上多个用途。
(2)粪肠球菌XY3菌株发酵液可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性
将用MRS液体培养基培养至稳定期的粪肠球菌XY3以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选试剂盒(ab284520)测定发酵液上清对α-葡萄糖苷酶水解葡萄糖的酶活性能力的影响。结果显示，与空白培养基MRS的无抑制作用相比，菌株XY3的发酵上清液显著抑制了α-葡萄糖苷酶水解葡萄糖的能力，其抑制率约为15.52％，说明粪肠球菌XY3的发酵液可以有效的抑制α-葡萄糖苷酶的活性(图3)。
a-葡萄糖苷酶是一种在碳水化合物分解中起作用的酶，与2型糖尿病有关，抑制α-葡萄糖苷酶是控制餐后高血糖的方法之一，从而有助于糖尿病的治疗。因此，α-葡萄糖苷酶抑制剂有助于维持血糖平，能够改善糖尿病并发症。此外，抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以控制肥胖。
因此，益生菌粪肠球菌XY3菌株具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的功能，这使它成为潜在的降血糖和抑制肥胖的益生菌。
(3)粪肠球菌XY3菌株可产生和分泌还原型谷胱甘肽(GSH)
将用MRS液体培养基培养至稳定期的粪肠球菌XY3菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(A006-2-1)测定发酵液上清GSH的浓度。结果显示，与空白培养基MRS中低浓度的GSH相比，菌株XY3的发酵上清液中GSH的浓度为265.27μmol/L，说明经XY3发酵后GSH的浓度显著增加(**P<0.01)，证明粪肠球菌XY3可以在稳定期产生并分泌谷胱甘肽(GSH)(图4)。
谷胱甘肽(glutathione，GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，且含有γ-酰胺键和巯基的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。半胱氨酸上的巯基为谷胱甘肽活性基团(故谷胱甘肽常简写为GSH)。谷胱甘肽有助于维持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，在多种细胞生化过程中发挥重要作用，如自由基中和、解毒、半胱氨酸的运输和储存、细胞氧化还原作用的维持、抗坏血酸和维生素E的再生等。主要包括以下几个方面：
①解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用；
②参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应；
③保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团(-SH)维持还原状态；
④维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。
由此，GSH的多种生物学功能赋予了其多种功效和用途，主要表现在：
1)抗氧化剂：清除人体内的自由基，保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被有害物质氧化，从而保证蛋白质和酶等分子生理功能的正常发挥；人体红细胞中谷胱甘肽的含量很多，这对于保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血具有重要意义；还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力，并使皮肤产生光泽。
2)临床药物：利用其巯基螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素而防止中毒；还可以在肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等方面作为治疗或辅助治疗的药物；还可以纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用。
3)食品添加剂：强化食品营养、稳定维生素C、强化风味。
综上所述，谷胱甘肽不仅可以用于药物，而且可以作为功能性食品的基料，在抗氧化美白、延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤和抗过敏等功能性食品领域具有广泛的应用价值。
因此，益生菌粪肠球菌XY3菌株可以通过产生的GSH的功能，从而发挥以上多个功效。
(4)粪肠球菌XY3菌株发酵液可有效抑制乙酰胆碱酯酶活性
将用MRS液体培养基培养至稳定期的粪肠球菌XY3以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选试剂盒(KA6219)测定发酵液上清对乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的抑制能力。结果显示，与空白培养基MRS的无抑制作用相比，菌株XY3的发酵上清液显著抑制了乙酰胆碱酯酶的活性，其抑制率约为16.33％，说明粪肠球菌XY3的发酵液可以有效的抑制乙酰胆碱酯酶的活性(图5)。
乙酰胆碱酯酶抑制剂通过对乙酰胆碱酯酶的可逆性抑制，让胆碱够在神经纤维末梢释放的乙酰胆碱的作用下不断堆积于突触处，兴奋胆碱受体，延长并且增加了乙酰胆碱的作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂可增强认知能力和记忆力(改善阿尔茨海默症、改善认知障碍)，扩张血管(改善心率过速)，兴奋骨骼肌和平滑肌(改善便秘、术后腹胀、术后尿潴留)。因此，益生菌粪肠球菌XY3菌株可抑制乙酰胆碱酯酶活性，可以兴奋骨骼肌和肠道的平滑肌，这使它成为潜在的促进胃肠道吸收和蠕动的益生菌。
(5)粪肠球菌XY3菌株可抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性
将用MRS液体培养基培养至稳定期的粪肠球菌XY3菌株以1:30的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中，在培养至稳定期24h时收取菌悬液，10,000×g、4℃离心10min后收取发酵液上清，然后通过黄嘌呤氧化酶活性测定试剂盒(盒子生工,Cat:AKAO006M)测定发酵液上清中黄嘌呤氧化酶的活性。结果显示，与空白培养基MRS对黄嘌呤氧化酶活性无抑制作用相比，菌株XY3的发酵上清液对黄嘌呤氧化酶活性具有明显的抑制作用，抑制率为24.59％(*P<0.05)，说明粪肠球菌XY3可以在稳定期产生并分泌代谢物以抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)的活性(图6)。
黄嘌呤氧化酶是嘌呤分解代谢过程中的关键酶，可以催化次黄嘌呤和黄嘌呤直接生成尿酸。因此当体内黄嘌呤氧化酶活性异常活跃时，会导致大量尿酸的生成，从而引发高尿酸血症或痛风。
黄嘌呤氧化酶抑制剂，如别嘌呤醇能抑制黄嘌呤氧化酶活性，阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸生成，改善痛风和高尿酸血症。黄嘌呤氧化酶抑制剂还可以减少自由基造成的应激反应和对组织的伤害，有望在临床上用于治疗痛风及过氧化物自由基导致的疾病。当前，别嘌呤醇是治疗高尿酸血症及痛风的主要药物之一，也是临床上唯一一种抑制尿酸生成的化学药物，但该药物有很多副作用，不但会引起发热，还会引发过敏性皮疹腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少和多器官受损，甚至有引起死亡的报道，安全性受到质疑，由于其对黄嘌呤氧化酶有很好的抑制作用所以一直沿用至今。因此，研究新的低毒高效的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有十分重要的意义。
因此，益生菌粪肠球菌XY3菌株有望通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性，降低体内嘌呤，减少尿酸生成，从而控制尿酸水平，预防痛风发作。
综上可知，本发明新分离的粪肠球菌XY3菌株具有的多种益生功效：(1)可产生和分泌透明质酸；(2)可抑制α-葡萄糖苷酶活性；(3)可产生和分泌谷胱甘肽；(4)可抑制乙酰胆碱酯酶活性；(5)可抑制黄嘌呤氧化酶活性。可见，本发明新分离得到的粪肠球菌XY3菌株在降糖和抗衰老等领域具有重要的应用价值和经济价值。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在产透明质酸中的应用，其特征在于，所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCCNO:M 20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
2.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在产还原型谷胱甘肽中的应用，其特征在于，所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
3.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
4.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
5.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株在制备黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
6.一种制备还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于，将粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)XY3菌株接种于MRS液体培养基中，培养至稳定期后收取菌悬液，最后分离纯化菌悬液中的还原型谷胱甘肽即得；所述粪肠球菌XY3菌株于2022年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO:M 20221505；所述粪肠球菌XY3菌株的16S rDNA全序列如SEQ ID No：1所示。
7.根据权利要求6所述的一种制备还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于，培养的条件为：37℃恒温厌氧。
8.根据权利要求6所述的一种制备还原型谷胱甘肽的方法，其特征在于，先用MRS液体培养基将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)XY3菌株培养至稳定期，再以1:20-1000的稀释倍数扩培至新的MRS液体培养基中。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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