CN110982736A - 一种食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌及其应用，提供了一种可以产胞外多糖的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)NA‑3。本发明提供的棒状乳杆菌来源于中国东北的传统食品酸菜，通过实验证明：该菌株具有耐酸和耐胆盐的特性，可在人体胃中的酸性环境和小肠中的高胆盐环境的生存，可用于制备调节人和动物胃肠道菌群平衡，维护人和动物的肠道健康的菌种制剂。本发明还提供了棒状乳杆菌NA‑3的胞外多糖，实验证明：棒状乳杆菌NA‑3胞外多糖具有抗氧化和抗菌膜活性，可用于制备保健食品、疫苗佐剂和动物饲料添加剂。

Description

一种食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于食品工业技术、微生物菌种筛选技术领域，具体涉及一种食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌及其应用。
背景技术
东北酸菜作为一种中国传统的发酵食品，备受广大消费者欢迎。与其他常见的发酵食品如奶酪、酸奶、腐乳和纳豆等一样，其亦具有较为复杂的微生物体系，研究表明，发酵成熟的东北酸菜中含有多种乳酸杆菌，如植物乳杆菌、干酪乳杆菌和棒状乳杆菌等等(Zhang et al.2009)。长期以来，人们对乳酸菌的研究逐渐深入，从最初的生物学特性、代谢机制到其益生活性等等。乳酸菌可通过合成细菌素、有机酸、胞外多糖等改善食品的风味和质地，其中胞外多糖作为具有生物活性的天然聚合物在各种工业中的需求越来愈多，引起了国内外研究者的关注(Oleksy and Klewicka 2018)。
乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞外的粘液或者荚膜多糖，属于微生物次级代谢产物，可根据组成单体分为同多糖和杂多糖，同多糖的分子量最高可达107，一般要高于杂多糖的分子量(104～106Da)(Salazar et al.2016,Cerning1990)。同多糖有葡聚糖、果聚糖和半乳聚糖等，产同多糖的乳酸菌主要是魏斯氏菌属，(Monsan etal.,2001,p.；Sanalibaba&Cakmak,2016,p.)。产杂多糖的乳酸菌比较多，如大多数的嗜常温乳酸菌(乳酸乳球菌、鼠李糖乳杆菌、乳脂乳酸球菌、清酒乳杆菌和干酪乳杆菌等)和耐热型乳酸菌(德氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌和链球菌等)(De Vuyst&Degeest,1999,p.)。
研究发现，乳酸菌胞外多糖具有多种生理功能，如免疫调节活性、抗氧化和抗癌性、重金属离子吸附作用、调节肠道菌群和抗菌膜活性等等(Ryan et al.2015,Li etal.2014,Polak-Berecka et al.2014,Bello et al.2001,Li et al.2014)。其中抗氧化和抗菌膜活性是现在研究学者广泛关注的研究热点。乳酸菌胞外多糖的抗氧化活性能够提高细胞的自身防御机制，减少由于活性氧和自由基浓度过高而对机体组织造成的氧化损伤(Aruoma,1996,p.；Liu&Ng,2000,p.；Schinella,Tournier,Prieto,Buschiazzo,&Ríos,2002,p.)。抗菌膜活性则可以预防一些由病原菌菌膜导致的临床疾病，如表皮葡萄球菌、绿脓假单胞菌、霍乱弧菌和鼠疫杆菌等慢性疾病和传染性疾病(CostertonStewart&Greenberg,1999,p.)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种具有抑菌、耐酸、耐胆盐性能的能够产生胞外多糖的棒状乳杆菌。
本发明所提供的棒状乳杆菌为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)，其菌株号为NA-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.18480，下文简称棒状乳杆菌NA-3。
棒状乳杆菌NA-3菌体形状为杆状，在含0.3％碳酸钙的MRS培养基平板上，菌落呈圆形，表面光滑，乳白色，边缘整齐中间突起较白，有拉丝表型。棒状乳杆菌NA-3具有序列表中序列1所示的16S rDNA。棒状乳杆菌NA-3为革兰氏阳性菌，产胞外多糖，具有利用葡萄糖产酸、还原硝酸盐、石蕊牛奶酸凝等生理生化特征。
为了解决以上技术问题，本发明还提供了菌剂。
本发明所提供的菌剂菌剂，含有棒状乳杆菌NA-3或/和所述棒状乳杆菌棒状乳杆菌NA-3的代谢物。
所述菌剂具体可为下述任一种菌剂：
A1、耐酸的菌剂，
A2、耐胆盐的菌剂，
A3、抑制病原菌的菌剂，
A4、产胞外多糖的菌剂，
上述菌剂的活性成分可为棒状乳杆菌NA-3或/和棒状乳杆菌NA-3的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为玉米粉、豆粉或淀粉；所述液体载体可为水；所述菌剂中，棒状乳杆菌NA-3或/和棒状乳杆菌NA-3的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上文中，棒状乳杆菌NA-3的代谢物可为棒状乳杆菌NA-3的发酵液。棒状乳杆菌NA-3的发酵液可按照如下方法制备：在液体发酵培养基中培养棒状乳杆菌NA-3，收集发酵液(含有棒状乳杆菌NA-3和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为棒状乳杆菌NA-3的代谢物。
棒状乳杆菌NA-3的培养物也属于本发明的保护范围。棒状乳杆菌NA-3的培养物是将棒状乳杆菌NA-3在微生物培养基中培养得到的物质(如含有棒状乳杆菌NA-3和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有棒状乳杆菌NA-3和分泌到固体培养基内的物质)。
上述棒状乳杆菌NA-3的培养物具有下述B1-B4中的至少一种功能：
B1、耐酸，
B2、耐胆盐，
B3、抑制病原菌，
B4、产胞外多糖，
棒状乳杆菌NA-3或/和棒状乳杆菌NA-3的代谢物或/和上述棒状乳杆菌NA-3的培养物在制备具有上述B1-B4中的至少一种功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述产品可为菌剂或微生态制剂。
上文中，耐酸可为耐受pH为2以上的酸性条件，所述耐胆盐可为耐受胆盐质量百分含量为0.30％以下的胆盐环境，所述动物病原菌可为蜡样芽孢杆菌和/或鼠伤寒沙门菌，所述胞外多糖含有鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。
上文中，所述胞外多糖中鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为2.6:1.0:5.0:3.3。
上文中，所述胞外多糖具有抗氧化活性和/或抗菌膜活性。
所述抗菌膜活性可为抑制蜡样芽孢杆菌的菌膜形成和/或鼠伤寒沙门氏菌的菌膜形成，但不局限于上述两株病原菌。
本发明的另一个目的是提供上述棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)NA-3及其产生的胞外多糖的用途。
本发明还提供了上述棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis NA-3菌剂在抑菌中的应用。
本发明还提供了上述棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis NA-3菌剂在调节人或动物胃肠道菌群平衡中的潜在应用。
本发明提供了上述棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis NA-3及其胞外多糖成分和结构。
本发明提供了上述棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis NA-3胞外多糖在抗氧化方面的应用。
本发明还提供了上述棒状乳杆菌Lactobacillus coryniformis NA-3胞外多糖在抗菌膜方面的应用。
上述抑菌应用中的病原菌为肠道内常见的有害菌，为蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌。
本发明提供了一株可以产胞外多糖的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)NA-3。本发明提供的棒状乳杆菌来源于中国东北的传统食品酸菜，通过实验证明：该菌株具有耐酸和耐胆盐的特性，可在人体胃中的酸性环境和小肠中的高胆盐环境的生存，可用于制备调节人和动物胃肠道菌群平衡，维护人和动物的肠道健康的菌种制剂。本发明还提供了棒状乳杆菌NA-3的胞外多糖，实验证明：棒状乳杆菌NA-3胞外多糖具有抗氧化和抗菌膜活性，可用于制备保健食品、疫苗佐剂和动物饲料添加剂。
附图说明
图1为棒状乳杆菌NA-3菌落及其拉丝表型。
图2为棒状乳杆菌NA-3与GenBank中的已知细菌的核酸序列建立的系统发育树。
图3为棒状乳杆菌NA-3酸耐受能力测定结果。
图4为棒状乳杆菌NA-3胆盐耐受能力测定结果。
图5为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖粗糖液苯酚硫酸法检测结果。
图6为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖。
图7为棒状乳杆菌NA-3红外光谱检测谱图。
图8为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖分子量检测谱图。
图9为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖单糖组分检测谱图。
图10为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖清除羟基自由基测定结果。
图11为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖清除超氧自由基测定结果。
图12为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖抑制B.cereus和S.typhimurium菌膜形成的结果。
图13为棒状乳杆菌NA-3胞外多糖分散B.cereus和S.typhimurium菌膜的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌的分离和鉴定
一、食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)NA-3的分离
1、食品原料采集
本专利涉及的食品原料为中国传统酸菜，内蒙古自治区呼伦贝尔市海拉尔区居民家。
2、乳酸菌的分离筛选
(1)初筛
为了从中国传统酸菜中分离出产胞外多糖的乳酸菌，利用发酵糖产酸使菌落周围碳酸钙溶解和单菌落拉丝现象来鉴别产胞外多糖的乳酸菌。具体操作为：取新采集的酸菜汤1mL加入9mL PBS缓冲液(137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，10mmol/L Na2HPO4，pH 6.8)中，在EP管中依次进行十倍梯度稀释制备稀释样本悬液，从最大稀释度开始依次取0.1mL加入含有0.3％碳酸钙的MRS(北京索莱宝生物科技有限公司，产品目录号：M8540-250)固体培养皿中，37℃倒置，厌氧培养24-48h至长出单个菌落。挑选有明显透明圈的菌落进行拉丝实验，将产酸可拉丝的菌株保存于含有30％的甘油管中。
(2)复筛
将既可以产酸又具有拉丝表型的单菌落于MRS固体培养基划线分离，厌氧培养48h，将长出的单菌落进行过氧化氢酶接触试验，选择过氧化氢阴性的菌落进行结晶紫染色，显微镜观察菌株形态，挑取过氧化氢酶阴性和杆状的菌落，在含0.3％碳酸钙的MRS培养基平板上再次分离纯化后，用无菌牙签挑取杆状的菌株于MRS液体培养基中，37℃厌氧连续培养24-48h，保存于30％甘油管中，-80℃冷冻保存备用。并将分离得到的一株菌株命名为菌株NA-3。
过氧化氢酶接触试验具体操作为：将30％过氧化氢滴加在载玻片上，用无菌牙签挑取划线分离长出的单菌落，点于30％过氧化氢液滴中，若有气泡产生则为过氧化氢阳性菌，若不出现泡则为过氧化氢阴性菌。
结晶紫染色具体操作为：将对数生长期的待测菌液滴加于载玻片上，在酒精灯上固定三次，将草酸铵结晶紫滴在固定好的菌液表面染色1min，用蒸馏水充分淋洗和风干，在电子显微镜下观察菌株形态，从低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。
二、食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌NA-3的鉴定
1、个体形态及菌落特征
菌株NA-3在含0.3％碳酸钙的MRS培养基平板上，菌落呈圆形，表面光滑，乳白色，边缘整齐中间突起较白，有拉丝表型。菌株NA-3为杆状，大小0.3-0.6×0.6-3.2μm，形态杆状，单个或成链，一端或两端膨大呈棒状，常呈栅栏状或V字状等。菌株NA-3在MRS-Ca培养基的菌落状态和拉丝表型见图1。
2、生理生化特征:对菌株NA-3参考文献《土壤微生物研究原理与方法》(林先贵，2010)中方法进行革兰氏染色、产胞外多糖、葡萄糖产酸、淀粉酶水解、硫化氢产生、H2O2酶反应、黑色素产生、硝酸盐还原、V-P反应、产生物胺、石蕊牛奶酸凝等部分生理生化特性测定。结果表明菌株NA-3为革兰氏染色(+)、产胞外多糖(+)、葡萄糖产酸(+)、淀粉酶水解(-)、硫化氢产生(-)、H2O2酶反应(-)、黑色素产生(-)、硝酸盐还原(+)、V-P反应(-)、产生物胺(-)、石蕊牛奶酸凝(+)。
3、分子鉴定
16S rDNA序列扩增及系统发育树的构建
以菌株NA-3总DNA为模板，采用通用的16S rDNA引物(27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’；引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增，得到PCR产物。PCR反应体系(25μL)：上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，基因组DNA0.5μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5μL，dNTP each 2.5mM 1μL，加双蒸水至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4min；循环30次(94℃，45s变性；55℃，45s退火；72℃，1min延伸)；72℃延伸10min，PCR产物于4℃终止反应保存。将PCR产物送上海生物工程技术服务有限公司测序，PCR产物测序结果表明，菌株NA-3的测序片段长为1469bp，序列如序列1所示。该序列具有典型的16S rDNA的特征。将获得的序列在GenBank数据库中进行Blast分析，结果表明：菌株NA-3的16S rDNA序列与GenBank中同源性最为接近的菌株为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)；下载同源性较高的细菌序列，用MEGA 5.1软件进行多序列比对分析并构建系统发育树，菌株与Lactobacillus coryniformis登录号KLDS 1.0723亲缘关系最近，同源性达100％，故确定分离得到的菌株为棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)，这与形态学、生理生化特性结果一致。序列比对的同源性分析与进化树构建如图2所示。
棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)NA-3已于2019年9月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18480。下文简称棒状乳杆菌NA-3或菌株NA-3。
实施例2、棒状乳杆菌NA-3作为益生菌的体外活性评价
1、棒状乳杆菌NA-3酸耐受能力的测定
分别用pH为2、3、4、5和6.8(阴性对照)的MRS培养基在37℃厌氧的条件下恒温培养棒状乳杆菌NA-3，每组三个平行。在2h、4h、6h、8h、10h和12h时分别取样检测菌悬液在600纳米下的吸光值，通过与阴性对照组比较，计算存活率，最后以存活率表示不同pH值对棒状乳杆菌NA-3生长的影响，如图3所示。试验表明，培养2h后棒状乳杆菌NA-3在pH为2的条件下存活率为67.52％±0，24％，培养4h后棒状乳杆菌NA-3在pH为2的条件下存活率为60.34％±0.27％，说明棒状乳杆菌NA-3具有较好的耐酸特性。胃液pH最低可达1.5，进食后可上升至6或更高，但一般维持在2.5～3.5之间，通常食物在胃内停留时间为2～4h。
2、棒状乳杆菌NA-3胆盐耐受能力的测定
将棒状乳杆菌NA-3分别接种于含有不同质量分数猪胆盐(北京奥博星生物技术有限责任公司)(0％、0.03％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、0.30％)的MRS液体培养基中，在37℃厌氧的条件下恒温培养12h，每组三个平行。分别在2、4、6、8、10和12h时，取样检测菌悬液在600纳米下的吸光值，通过与不含胆盐的组比较，计算存活率，最后以存活率表示不同胆盐浓度对棒状乳杆菌NA-3生长的影响。人体小肠胆盐质量浓度在0.03％～0.3％之间波动，食物在小肠中停留时间为1-4h。试验结果表明，棒状乳杆菌NA-3在胆盐浓度为0.03％条件下培养2h，菌株存活不受胆盐影响，能继续生长，培养4h后，菌株存活率高达98.27％±0.26％；；棒状乳杆菌NA-3在胆盐浓度为0.3％条件下培养2h，菌株存活也不受胆盐影响，能继续生长，培养4h后，菌株存活率为90.17％±0.36％。故棒状乳杆菌NA-3具有很好的耐胆盐特性。
3、抑制致病菌试验
将棒状乳杆菌NA-3和两种常见条件的致病的病原菌分别调至600纳米吸光值为0.2的菌悬液，棒状乳杆菌NA-3和病原菌分别共培养，各自按照1％接种量接种于含有20mL无菌LAPT培养基中，37℃共培养，同时以单独培养的棒状乳杆菌NA-3和病原菌作为对照组，每组做三个平行。24h、48h时分别取样，平板计数(乳杆菌用MRS平板计数，病原菌用LB平板计数)。棒状乳杆菌NA-3分别和蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 21261)、鼠伤寒沙门菌Salmonella typhimurium(中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC 22956共培养的结果如表1所示，表明棒状乳杆菌NA-3和蜡样芽孢杆菌共培养24小时，棒状乳杆菌NA-3对蜡样芽孢杆菌的抑制率为98.66％(1-2.60×104/1.94×106＝0.9866)，继续培养至48小时，棒状乳杆菌NA-3对蜡样芽孢杆菌的抑制率为99.68％(1-2.15×104/6.85×106＝0.9968)；棒状乳杆菌NA-3和鼠伤寒沙门菌共培养24小时，棒状乳杆菌NA-3对鼠伤寒沙门菌的抑制率为99.65％(1-1.30×105/3.75×107＝0.9965)，继续培养至48小时，棒状乳杆菌NA-3对鼠伤寒沙门菌的抑制率为100％。从表1可以看出，在相同的培养条件下，与棒状乳杆菌NA-3共同培养，能够有效的抑制蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门菌的生长。
表1棒状乳杆菌NA-3分别与B.cereus、S.typhimurium共培养计数结果
Figure BDA0002293655800000071
实施例3、胞外多糖提取和测定
1、胞外多糖的提取
参考文献中胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)提取方法(
Figure BDA0002293655800000072
A.,PolakBerecka M.,Skrzypek H.,Kreft A.,Production of exopolysaccharides by aprobiotic strain of Lactobacillus rhamnosus:biosynthesis and purificationmethods,Acta Aliment Hung.42(2)(2013)220-228和Yang C.,He N.,Ling X.,Ye M.,Zhang C.,Shao W.,Yao C.,Wang Z.,Li Q.,The isolation and characterization ofpolysaccharides from longan pulp,Sep Purif Technol.63(1)(2008)226-230)，具体提取方法如下所示。将实施例1中的棒状杆菌NA-3在MRS琼脂培养基上37℃厌氧培养24h，得到棒状杆菌NA-3菌落。将棒状杆菌NA-3菌落转移到新鲜的MRS液体培养基中静置培养24h，以1％接种量接入2250mL(750mL×3)MRS培养基中，厌氧条件下于37℃培养48h，得到菌悬液。将菌悬液12000×g离心10分钟，并用0.9％NaCl洗涤两次菌体沉淀。洗过的菌体沉淀用80℃蒸馏水处理约20h。12000×g离心20min(4℃)后，除去沉淀物，上清液为EPS粗提取液，采用苯酚硫酸法初步定性分析其主要组分，结果如图5所示，所提取的粗糖液中含有糖成分。酚硫酸法初步定性分析操作如下：100μL粗糖液(以蒸馏水作为空白对照)加入100μL 5％苯酚溶液，混匀后加入500μL浓硫酸，再混匀观察颜色变化，若显现红色则其中含有糖成分。向EPS粗糖液中加入三倍体积的冷乙醇沉淀EPS，悬浮液于4℃静置4天。12000×g离心20min获得粗EPS。将粗EPS重悬于含有14％三氯乙酸(TCA)的水溶液中，4℃下静置24h。12000×g离心20min(4℃)除去可溶性蛋白质，上清液用透析膜(MWCO 7000Da，DL BioChem，USA)透析3天，浓缩后冻干，得到分离的胞外多糖，该胞外多糖为白色絮状粉末。
2、棒状乳杆菌NA-3胞外多糖红外光谱分析
将本实施例步骤1得到的胞外多糖进行红外光谱测试。具体方法为：EPS样品采用KBr压片法，检测其在4000cm-1到400cm-1范围内的吸收峰，结果如图7所示。从图7上可以看出，在波数3382.8cm-1处有强的羟基伸缩振动峰；2935.1cm-1处为C-H伸缩振动峰；1661.8cm-1处明显的吸收峰有可能是由于酰胺键I>C＝O伸缩振动或者肽胺键C-N弯曲而产生的；此外，在1375.7cm-1处的吸收峰是羧基中的>C＝O伸展产生的。特征羟基的存在初步表明提取的EPS样品为多糖。此外，在谱图的指纹区域，主要吸收峰在1057.2cm-1，此处为醇羟基的C-O的吸收峰，在1219.7cm-1处较弱峰是C-O-C基团的吸收峰。红外光谱表明所提取得棒状乳杆菌NA-3胞外多糖样品含有与多糖相关的大部分特征吸收峰，可鉴定为多糖。
3、棒状乳杆菌NA-3胞外多糖分子量检测
将本实施例步骤1得到的胞外多糖通过高效凝胶渗透色谱法测试其分子量。具体的EPS分子量检测条件如下：
色谱柱：TSK GMPW XL柱(300mm×7.8mm，Tosoh Corp.，Tokyo，Japan)
仪器：Waters 2695 HPLC和折射率检测器
流动相：超纯水
上样量：10μL
流速：1mL/min
运行时间：30min
标准品：右旋糖苷(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)。
分子量大小与出峰时间成线性关系，通过计算可得出EPS分子量为8.6×106Da。EPS检测谱图如图8所示。
4、棒状乳杆菌NA-3胞外多糖单糖组分检测
将本实施例步骤1中制备的胞外多糖经1M硫酸沸水浴3h，酸解碳酸钡中和后，浓缩，过0.22μm的膜，进行HPLC检测，检测条件如下所示：
色谱柱：Shodex HILICpak VG-50 4E(250mm×4.6mm,Shodex,Japan)
仪器：Waters 2695 HPLC和ELSD检测器(6100 Chromachem,ESA lnc)
流动相：乙腈：水＝9：1
上样量：10μL
流速：1mL/min
运行时间：30min
标准品：鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖(Tokyo Chemical Industry,Japan)。
EPS的HPLC检测谱图如9所示，通过计算可得其中鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的比例为2.6:1.0:5.0:3.3。
5、棒状乳杆菌NA-3胞外多糖抗氧化活性测定
将本实施例步骤1中提取的胞外多糖进行抗氧化活性测定，胞外多糖的抗氧化活性主要通过两方面测定：清除羟基自由基和超氧自由基的能力。
清除羟基自由基的具体操作步骤为：参考文件(Wu S.,Liu G.,Jin W.,Xiu P.,Sun C.,Antibiofilm and Anti-Infection of a Marine Bacterial ExopolysaccharideAgainst Pseudomonas aeruginosa,Front Microbiol.7(2016))中记载的清除羟基自由基测定方法。将PBS缓冲液(20mM，pH 7.4)，50μL；12.5mM 1,10-菲咯啉溶液，25μL；2.5mMFeSO4溶液，25μL；20mM H2O2，25μL依次加入到96孔板的每个孔中并充分混合。然后将100μL不同浓度的EPS(0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL)加入混合物中，37℃下孵育1h，立即测定混合物在536nm下的吸光度。同时以抗坏血酸作阳性对照。每组做三个平行。羟基自由基清除活性计算公式如下所示：清除活性(％)＝(As-Ac/Ao-Ac)×100，其中“As”为含不同浓度EPS组的吸光度，“Ac”是不含EPS组的吸光度，“Ao”是不含EPS和H2O2组的吸光度。棒状乳杆菌NA-3胞外多糖清除羟基自由基的结果如图10所示。如图10所示，可知，虽然棒状乳杆菌NA-3胞外多糖具有清除羟基自由基的能力不如抗坏血酸(高达80％)的好，但是具有一定的清除作用(约37％)。
清除超氧自由基的具体操作步骤为：参考文献(Zhang S.,Antioxidativeactivity of lactic acid bacteria in yogurt,African Journal of MicrobiologyResearch.5(29)(2011))中记载的实验方法。将50μL Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，150mM)与25μL连苯三酚(1.50mM，溶于10mM HCl)和100μL不同浓度的EPS(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL)充分混合后，在25℃下温育30分钟，325nm下测量混合物的吸光度，同时以抗坏血酸作为阳性对照。每组做三个平行。以清除邻苯三酚自动氧化产生的超氧自由基作为胞外多糖的超氧自由基清除活性(％)，计算公式为：[1-(A11-A10/A01-A00)]×100。其中“A00”是不含EPS和邻苯三酚组的吸光度，“A01”是含有连苯三酚但不含EPS组的吸光度，“A10”是含有EPS但不含邻苯三酚组的吸光度，“A11”是含有EPS和连苯三酚组的吸光度。棒状乳杆菌NA-3胞外多糖清除超氧自由基的结果如图11所示。如图所示，可知棒状乳杆菌NA-3胞外多糖具有清除超氧自由基的能力，清除率高达78％，比抗坏血酸清除超氧自由基(最高约63％)作用更好。
综合图10和图11的结果，本发明的棒状乳杆菌NA-3胞外多糖，具有较高的清除超氧自由基的能力，和一定的清除羟基自由基的能力。
6、棒状乳杆菌NA-3胞外多糖抗菌膜活性测定
棒状乳杆菌NA-3胞外多糖抗菌膜活性主要主要体现在抑制病原菌菌膜形成的性能和分散病原菌已形成的菌膜的能力。
棒状乳杆菌NA-3胞外多糖抑制病原菌菌膜形成的具体操作步骤为：将活化好的B.cereus和S.typhimurium菌液分别稀释至OD600≈0.2，将OD600≈0.2的B.cereus菌液和S.typhimurium菌液稀释10倍，再分别加入到96孔板中，90μL/孔，每个孔中加入10μL的过滤除菌的EPS(PBS配制)，使EPS的终浓度分别为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.50μg/mL和31.25μg/mL，每个浓度做4个平行。同时做阴性对照组(不含EPS的菌液)。96孔板于37℃培养箱中静置培养，培养24h。培养后的96孔板用120μL无菌的PBS清洗4遍，避光加入500μg/mL的MTT溶液(对应培养基配制)，100μL/孔，37℃避光孵育3h，去除MTT溶液后，加入二甲基亚砜(DMSO)，100μL/孔，震荡脱色15min后，酶标仪检测OD490，以实验组少于对照组的百分比作为EPS对菌膜形成的抑制率(％)，结果如图12所示，其中图12中，A表示棒状乳杆菌NA-3胞外多糖对蜡样芽孢杆菌的抑制率；B表示棒状乳杆菌NA-3胞外多糖对鼠伤寒沙门氏菌的抑制率。从图12中可以看出，棒状乳杆菌NA-3胞外多糖可以抑制蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的菌膜形成，且其抑制能力相对于鼠伤寒沙门氏菌，对蜡样芽孢杆菌有更好的作用。对于蜡样芽孢杆菌，在EPS浓度范围为500μg/mL～31.25μg/mL时，其抑制作用没有浓度梯度效应，抑制率约为80％。但是在该浓度范围，对于抑制鼠伤寒沙门氏菌菌膜形成有浓度梯度效应，在500μg/mL抑制率最高为40％，31.25μg/mL时抑制率最低为9％。
棒状乳杆菌NA-3胞外多糖分散病原菌菌膜的具体操作步骤为：将活化好的B.cereus和S.typhimurium菌液稀释至OD600≈0.2，将OD600≈0.2的B.cereus和S.typhimurium稀释10倍，再分别加入到96孔板中，90μL/孔，培养12h，至形成菌膜。96孔板用120μL无菌的PBS清洗4遍，每个孔中加入90μL对应的培养基和10μL的过滤除菌的EPS(PBS配制)，使EPS的终浓度分别为500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.50μg/mL、31.25μg/mL，每个浓度做4个平行。同时做阴性对照组(只加对应培养基)96孔板于37℃培养箱中静置培养24h。96孔板用120μL无菌的PBS清洗4遍，避光加入500μg/mL的MTT溶液(对应培养基配制)，100μL/孔，37℃避光孵育3h，去除MTT溶液后，加入二甲基亚砜(DMSO)，100μL/孔，震荡脱色15min后，酶标仪检测OD490，OD以实验组少于对照组的百分比作为EPS对菌膜的分散率(％)，结果如图13所示，其中图13中，A表示棒状乳杆菌NA-3胞外多糖对蜡样芽孢杆菌菌膜的分散率；B表示棒状乳杆菌NA-3胞外多糖对鼠伤寒沙门氏菌菌膜的分散率。棒状乳杆菌NA-3胞外多糖可以分散蜡样芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的菌膜，且其分散蜡样芽孢杆菌菌膜能力高达90％以上，远远高于分散鼠伤寒沙门氏菌菌膜的能力(大约20％)。且在EPS浓度范围为500μg/mL～31.25μg/mL时，其分散作用没有浓度梯度效应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一种食品来源产胞外多糖的棒状乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1469
<212> DNA
<213> 棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)
<400> 1
cgtgcgggtg ctatacatgc agtcgaacgc actgacgtcg accgaagctg cttgcagtgg 60
acgttgattg acgtgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaaccta cccttaagtg 120
ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcataacc attcagacca catggtctga 180
atgtaaaaga cggcctttgg ctgtcacttt tggacggacc cgcggcgtat tagttagttg 240
gtaaggtaac ggcttaccaa gacaatgata cgtagccgac ctgagagggt aatcggccac 300
attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa 360
tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga aggttttagg atcgtaaaac 420
tctgttgttg gagaagaaca gggactagag taactgttag tcctttgacg gtatccaacc 480
agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540
ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg tgaaagcctt 600
cggcttaacc gaagaagtgc attagaaact gggaaacttg agtgcagaag aggacagtgg 660
aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg 720
ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg ggagcgaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc cgcccttcag 840
tgctgcagct aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca 900
aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960
aagaacctta ccaggtcttg acatcctttg accactgtag agatacagct ttcccttcgg 1020
ggacaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgcaac gagcgcaacc cttatgacta gttgccagca tttagttggg cactctagta 1140
agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcagca tgccccttat 1200
gacctgggct acacacgtgc tacaatggtc ggtacaacga gttgcgaacc cgcgagggta 1260
agctaatctc ttaaagccga tctcagttcg gattgtaggc tgcaactcgc ctacatgaag 1320
ccggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcac gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380
cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgggg taaccctttt 1440
agggaactag ccgctaaggg gatcagagg 1469

Claims (10)

1.棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)，其菌株号为NA-3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.18480。
2.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1所述的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)或/和所述棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的代谢物。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂为下述任一种菌剂：
A1、耐酸的菌剂，
A2、耐胆盐的菌剂，
A3、抑制病原菌的菌剂，
A4、产胞外多糖的菌剂。
4.一种培养物，其特征在于：所述培养物是将权利要求1所述的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)在微生物培养基中培养得到的物质。
5.权利要求1所述的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)或/和所述棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的代谢物或/和权利要求4所述的培养物在制备具有下述至少一种功能的产品中的应用：
B1、耐酸，
B2、耐胆盐，
B3、抑制病原菌，
B4、产胞外多糖，
B5、调节人或动物胃肠道菌群平衡。
6.权利要求1所述的棒状乳杆菌(Lactobacilluscoryniformis)或/和所述棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)的代谢物或/和权利要求4所述的培养物在制备保健食品、疫苗佐剂和/或动物饲料添加剂中的应用。
7.权利要求1所述的棒状乳杆菌(Lactobacillus coryniformis)产生的胞外多糖。
8.根据权利要求7所述的胞外多糖，其特征在于：所述胞外多糖含有鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。
9.根据权利要求8所述的胞外多糖，其特征在于：所述胞外多糖中鼠李糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的摩尔比为2.6:1.0:5.0:3.3。
10.根据权利要求7-9中任一所述的胞外多糖下述任一种应用：
1)在制备抗氧化剂或自由基清除剂中的应用；
2)在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)在制备病原菌菌膜形成抑制剂中的应用；
4)在制备病原菌菌膜分散剂中的应用。
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