CN113801809B - 一种屎肠球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，公开了一种屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DK‑01及其应用。本发明所述屎肠球菌可提高肠道菌群中乳酸菌的数量，对肠道菌群结构具有正向调节作用，提高机体免疫功能，降低疾病发生率，同时能够提高母畜对饲料中营养物质的消化和吸收效率，提高母畜的受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01及其应用，尤其是一种能够提高母畜受孕率的屎肠球菌及其应用。
背景技术
驴产业是我国的特色畜牧业，也是关键的扶贫民生产业。目前，该产业正在由短期育肥向繁育兼顾的新型可持续发展模式转变，同其他畜禽品种类似，驴产业的转型也是以扩大优良种群和提高品种质量为前提基础，而数量的增加和质量的提高，都离不开良种繁育这一关键环节。然而，后备母驴受孕率的降低以及流产、死胎的发生已严重制约了该产业的发展。
已有大量研究表明，屎肠球菌作为乳酸菌类重要的益生菌种能够维持肠道菌群平衡，抑制病原菌繁殖，降低内毒素水平，提高机体免疫力和抗氧化水平，进而改善母畜受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能。
然而，屎肠球菌在母驴饲料中的应用研究报道较为有限，具体的应用剂量和对母驴繁殖性能的影响也有待于进一步研究。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服上述现有技术中存在的缺陷，提供一种从母驴肠道中分离的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01，该屎肠球菌能够平衡母畜肠道菌群结构，提高机体免疫功能，降低疾病发生率，同时能够提高母畜对饲料中营养物质的消化和吸收效率，提高母畜的受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01，于2021 年 1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2021017，状态为存活。
本发明中的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01的菌株特征为：菌落表面光滑，不透明，呈白色，菌落圆形，革兰氏阳性球菌。
本发明中的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01可在pH值为4.0-9.0的范围内生长良好，能够耐受0.1%和0.3%的猪胆盐，而且可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等病原菌的生长。
本发明中的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01，其过氧化氢酶反应阴性，V-P反应阳性，精氨酸产氨反应阳性，H2S阴性、明胶反应阴性、不产生吲哚，无芽孢形成，兼性厌氧，适于30-37℃生长。
本发明中的屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01，其16S rRNA序列如SEQ IDNo.1所示。
在一个实施方案中，本发明考察了屎肠球菌DK-01对肠道菌群的调节作用，结果显示，屎肠球菌DK-01的摄入可提高肠道菌群中的乳酸菌数量，改善了肠道菌群平衡和肠道健康。
在一个实施方案中，本发明考察了屎肠球菌DK-01对母畜受孕率的影响，结果显示，屎肠球菌DK-01的摄入可明显提升母驴的受孕率。原理在于，屎肠球菌DK-01的饲喂可能是通过改善母驴肠道菌群，从而提升母驴健康状况，进而提高了母驴受孕率及繁殖性能。
因此本发明提供了屎肠球菌DK-01在制备调节肠道菌群产品及提高母畜受孕率产品中的应用。
本发明所述产品包括但不限于饲料添加剂。
进一步地，本发明提供了含有屎肠球菌DK-01的菌粉。
优选的，所述菌粉中屎肠球菌DK-01的活菌数大于1×1010CFU/g。
本发明所书菌粉可以按常规方法制备。
在一些实施方案中，所述菌粉的制备方法为，将屎肠球菌活化后，放入发酵罐扩大培养，经发酵、离心、浓缩、低温喷雾干燥，制成菌粉。
术语解释：
如本文中所使用的，术语“16S rRNA基因序列”是指细菌上编码16S rRNA相对应的DNA序列，其存在于所有细菌基因组中，一般由保守区和可变区组成。保守区在细菌间无显著差异，可用于构建所有生命的统一进化树。可变区在不同细菌中存在一定差异，对16SrRNA可变区进行测序，可对细菌菌群进行精细鉴定至种的级别。
本发明的有益效果在于：
本发明所述屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01，具有较好的pH耐受性、耐胆盐性能和抑菌性能，且安全性高，可改善母畜的肠道菌群平衡，提高机体免疫功能，降低疾病发生率，同时能够提高母畜对饲料中营养物质的消化和吸收效率，进而提升母畜的受孕率、妊娠率和泌乳力，提升母畜的繁殖性能，有利于增加母畜养殖的经济效益。
生物保藏说明：
屎肠球菌（Enterococcus Faecium）DK-01，于2021 年 1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址：湖北省武汉市洪山区八一路，武汉大学-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2021017，状态为存活。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了实施例1所得乳酸菌的菌落图；
图2示出了实施例1所得乳酸菌的结晶紫染色观察图；
图3示出了实施例3中屎肠球菌DK-01的溶血性试验观察图；
图4示出了实施例4中屎肠球菌DK-01的pH耐受曲线；
图5示出了实施例5中屎肠球菌DK-01的胆盐耐受图；
图6示出了实施例7中母驴的直肠粪便活菌计数。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不是对本申请的范围的限定。根据优选实施方案的下列详细描述，本申请的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：屎肠球菌的筛选
本发明所述的屎肠球菌筛选方法，包括以下步骤：
采自聊城市禹城、茌平等地驴场健康驴肠道内容物、新鲜粪便及驴场周边土壤。在超净工作台内用无菌注射器抽取驴肠内容物，注入高压灭菌的MRS液体培养基中增菌培养24 h，将菌液倍比稀释至10-7，取10-5和10-7稀释菌液各100 μL注射接种至预还原厌氧琼脂平板，置培养箱中37 ℃培养48 h。从平板中挑取单个菌落，革兰氏染色，选取其中无芽孢革兰氏阳性细菌，将单株细菌纯化培养，直到镜下观察无杂菌。纯化后的菌株用体积分数30％甘油保存于-80℃超低温冰箱中。
通过上述方法，从驴肠道内容物中分离出一株乳白色、革兰氏阳性细菌，其过氧化氢酶反应阴性，V-P反应阳性，精氨酸产氨反应阳性，H2S阴性、明胶反应阴性、不产生吲哚，无芽孢形成，兼性厌氧，适于30-37℃生长，初步鉴定为乳酸菌（参见图1，图2）。
实施例2：屎肠球菌的测序鉴定
采用正向引物P1：5′ - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′，反向引物P2：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT - 3′，引物由上海立菲生物技术有限公司(北京)合成，进行16SrDNA扩增。PCR反应体系：2x PCR mix 30μL，引物各2.5 μL，菌液2 μL，ddH2O 23 μL。PCR程序为：95°C 5 min；95°C 30 s，55°C 30 s，72°C 90 s，共30个循环；最后72°C延伸10 min，PCR扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶(含有万分之一浓度的SYBR® Green I)上电泳30 min，紫外灯下观察，确定产物PCR成功并达到要求后，将PCR产物送交上海立菲生物技术有限公司(北京)进行序列测定。测序结果在NCBI中进行同源性分析。通过Genbank序列比对，结果显示与Enterococcus Faecium的16S rRNA序列的同源性为99.71%-99.78%。通过细菌形态、生理生化特性和适宜的生长条件及测序鉴定结果，确定菌株DK-01为屎肠球菌。
实施例3：屎肠球菌的安全性分析
将屎肠球菌DK-01单菌落点种在血琼脂平板中，置于37℃培养箱培养24-48 h，观察是否有溶血圈以及溶血圈类别。
菌落溶血有下列3种情况：
（1）α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围形成的狭小（1-2 mm）、草绿色溶血环，为高铁血红蛋白所致；
（2）β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；
（3）γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。
经48 h后，分离乳酸菌菌株在溶血板上出现γ型溶血，即不溶血，具有较好的安全性（参见图3）。
实施例4：屎肠球菌的pH耐受性分析
应用盐酸及氢氧化钠调节MRS培养基pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将过夜培养的屎肠球菌DK-01菌液按1%接种量接至初始pH值不同的液体培养基中，37℃静置培养24 h，利用分光光度计在600 nm下测定菌液OD值。
由菌株的pH耐受曲线可知，在pH值4.0-9.0范围内，屎肠球菌菌株的生长状况良好（参见图4），说明屎肠球菌DK-01的能够耐受较为广泛的pH，利于适应动物不同肠段的酸碱度。
实施例5：屎肠球菌耐胆盐分析
将过夜培养的屎肠球菌DK-01菌液按1%接种量接入分别含有0%、0.1%、0.3%和0.6%猪胆盐的MRS培养基，37℃静置培养24 h，测定OD 600，利用分光光度计在600 nm下测定菌液OD值。通过菌株的胆盐耐受图可知，屎肠球菌菌株在0.1%和0.3%的猪胆盐条件下，生长情况良好（参见图5），能够耐受动物肠道中的胆盐浓度。
实施例6：屎肠球菌抑菌性能分析
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接入普通肉汤培养基，37℃培养24h，该菌液作为病原菌指示菌。取病原菌液100μL于营养琼脂平板上，均匀涂布，水平放置牛津杯，在牛津杯中分别加入100 μL过夜培养的屎肠球菌DK-01菌液，3个重复，37℃培养24 h，测量抑菌圈直径。通过分析数据可知，屎肠球菌DK-01能够显著抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长（表1），具有较好的抑菌性能。
表1 屎肠球菌DK-01抑菌活性
注：“＋＋＋”表示抑菌作用显著，抑菌圈≥12 mm
实施例7：屎肠球菌对母驴繁殖性能的影响
鉴于屎肠球菌DK-01 具有较好的pH耐受性、耐胆盐性能和抑菌性能，本发明将屎肠球菌DK-01应用于后备母驴饲料中。
1、菌粉的制备
将屎肠球菌DK-01活化后，放入发酵罐扩大培养，经发酵、离心、浓缩、低温喷雾干燥，制成活菌含量约为1×1010CFU/g的菌粉。
2、试验方案
试验地点：山东省禹城市某规模化驴场。
试验分组：选择200头4岁龄左右、健康无病、体况中等、体重接近的后备德州母驴，分为对照组和益生菌组。对照组为饲喂常规饲料，益生菌组为按1‰的比例添加屎肠球菌DK-01菌粉，试验期为配种前30天至配种后30天。
配种方法：母驴通过人工授精进行受孕，全部由一名配种员操作，经直肠触诊适于输精时，用输精管进行子宫体输精，隔日继续输精至发情结束。
养殖试验结束后，利用B超直肠孕检，对配种后的母驴进行早期妊娠鉴定，结果发现益生菌组母驴受孕率为57%，对照组母驴受孕率为45%，饲喂屎肠球菌DK-01明显提升了母驴的受孕率（表2）。再取母驴直肠粪便，稀释涂布MRS、LB平板分析对照组和益生菌组直肠粪便中活菌数，分析数据后发现，饲喂益生菌后母驴肠道中乳酸菌数明显增加，提升了约4倍（参见图6），改善了肠道菌群平衡和肠道健康。由此可见，屎肠球菌DK-01的饲喂可能是通过改善母驴肠道菌群，从而提升母驴健康状况，进而提高了母驴受孕率及繁殖性能。
表2 屎肠球菌DK-01对母驴受孕率的影响
综上，本发明筛选的驴源屎肠球菌DK-01，具有较好的pH耐受性、耐胆盐性能和抑菌性能，且安全性高，可作为饲料添加剂改善母驴的肠道菌群平衡，提升母驴的受孕率，进而改善母驴的繁殖性能，有利于增加母驴养殖的经济效益。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 聊城大学
<120>一种屎肠球菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 屎肠球菌（Enterococcus Faecium）
<400> 1
ATGACACACTGAGGCCGGAGCACACTCTACGGCTACCTTGTTACGACTTACCGAGGCAGG 60
GTGTCACTCTACAGCTAACTTGTTACTACTTACGGGCTGATCCGCGATTACTACCGATTC 120
CGGCTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGATTA 180
GCTTAGCCTCGCGACTTCGCAACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAG 240
GTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAG 300
TCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGATGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG 360
GACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTG 420
CCCCCGAAGGGGAAGCTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTT 480
CTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC 480
CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCA 540
GCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCA 600
GGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAGCCTCAGCGTCGTTACAGACCAGAG 660
AGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAA 720
TTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGC 780
CGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCC 840
GGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTT 900
CTGGTTAGATACCGTCAAGGGATGAACAGTTACTCTCATCCTTGTTCTTCTCTAACAACA 960
GAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCGGTCAGACTTTCGTC 1020
CATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCA 1080
ATGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTC 1140
ACCAACTAGCTAATGCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCAAA 1200
TCAAAACCATGCGGTTTCGATTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCC 1260
CTTCTGATGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTCCTCTTTTTCCGGT 1320
GGAGCAAGCTCCGGTGGAAAAAGAAGCGTACGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGC 1380
GTTCGTCCTGAGCCAGGATTCAAACTCTACGG 1412
Claims (6)
1.一种屎肠球菌，其特征在于：拉丁文学名为Enterococcus Faecium，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M2021017，其16S核糖体RNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
2.权利要求1所述屎肠球菌在制备调节母驴肠道菌群产品中的应用；
所述调节母驴肠道菌群为提高母驴肠道菌群中乳酸菌的数量。
3.权利要求1所述屎肠球菌在制备提高母驴受孕率产品中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述产品为饲料添加剂。
5.含有权利要求1所述屎肠球菌的菌粉；所述屎肠球菌的活菌数大于1×1010CFU/g。
6.权利要求5所述菌粉的制备方法，其特征在于，将屎肠球菌活化后，放入发酵罐扩大培养，经发酵、离心、浓缩、低温喷雾干燥，制成菌粉。
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|---|---|---|---|---|
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| CN103820363A (zh) * | 2014-01-27 | 2014-05-28 | 福建省农业科学院生物技术研究所 | 一种屎肠球菌菌粉的制备与应用 |
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| CN110628669A (zh) * | 2019-09-04 | 2019-12-31 | 中国农业科学院特产研究所 | 枯草芽孢杆菌ly-5、菌剂及其应用和应用其的产品 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 屎肠球菌饲用效果及作用机理;夏锴等;粮食与饲料工业(第5期);第44页左栏第1段，第46页左栏第3、4段，第47页左栏倒数第1段 * |
| 粪肠球菌的生物学特性及其在养殖业中的应用;安玉亭等;安徽农业科学;第43卷(第27期);第116页右栏第2段 * |
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