KR102171028B1 - 비 병원성 f18 대장균 균주 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주가 제공된다. 또한 동물의 F18 병원성 대장균 감염에 의해 유발된 부종 질환 또는 설사를 예방하는데 이 균주를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

비 병원성 F18 대장균 균주 및 이의 용도{Non-Pathogenic F18 E. Coli Strain and Use Thereof}
본 발명은 비 병원성 F18 대장균 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
부종 질환 및 설사는 통상적으로 축산가에 의해 사육되는 동물들 사이에서 일반적인 질환이다. 예를 들어, 젖을 뗀 새끼돼지의 부종 질환은 통상적으로 시가 독소 형태 2e(Stx2e)(MacLeod et al., 1991 , Vet Pathol 28:66-73)를 암호화하는 시가 독소-암호화 대장균(STEC) 균주에 의해 발생하는 반면, 신생 및 젖은 뗀 새끼 돼지의 분비성 설사는 통상적으로 열 안정성(STa, STb, EAST1) 및/또는 열 불안정성(LT) 장독소를 암호화하는 장독성 대장균 균주(ETEC)에 의해 발생한다(Gyles and Fairbrother, 2010, Escherichia coli. In: Pathogenesis of bacterial infections in animals, ed. Gyles CL, Prescott JF, Songer G, Thoen CO, 4th ed., pp 267-308. Blackwell Publishing, Ames, IA; Nagy et al., 1997, Microb Pathog 22:1-1 1). 일부 병원성 균주는 Stx2e 유전자 및 장독소 유전자 모두를 발현하며 따라서 동일한 동물의 부종 질환 및 설사의 증상을 일으킬 수 있다(STEC/ETEC)(Barth et al., 2007, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 120:307-316).
부종 질환 및/또는 설사 질환의 증상과 관련된 장 박테리아 감염에 대한 여러 통상적인 치료 또는 예방 조성물 및 방법과 관련된 결함은 낮은 신뢰성 또는 효율이다. 따라서 부종 질환 및/또는 설사 질환에 대한 개선된 치료 또는 예방 조성물 및 방법에 대한 요구가 존재한다.
한 비 제한적인 넓은 양태에서 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주가 제공된다.
다른 비 제한적인 넓은 양태에서 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주의 유효량을 동물에게 장 전달하는 것을 포함하여, 동물의 병원성 F18 대장균(E. coli) 장 감염을 예방하는 방법이 제공된다.
다른 비 제한적인 넓은 양태에서 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주의 유효량을 동물에게 장 전달하는 것을 포함하여, 동물의 병원성 F18 대장균(E. coli) 장 감염에 의해 발생한 부종 질환 또는 설사를 예방하는 방법이 제공된다.
한 비 제한적인 실시태양에서, 살아있는 대장균 균주는 동결건조 형태이다. 다른 비 제한적인 실시태양에서, 살아있는 대장균은 공급 가능한 담체와 관련이 있는데, 예를 들어 살아있는 대장균 균주는 공급 가능한 담체에 희석되고, 속에 포함되거나 현탁될 수 있다. 다른 비 제한적인 실시태양에서, 살아있는 대장균 균주는 동결 형태이다.
본 발명의 이런 및 다른 양태 및 특징은 첨부된 도면과 함께 본 발명의 특정 실시태양의 다음 설명을 검토하면 당업자에게 명백하게 될 것이다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명의 실시태양의 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조하여 아래에 제공된다.
도 1은 로그 콜로니 형성 단위(CFU)의 평균의 역 로그로서 나타낸, 가변 투여량에 따른 살아있는 비 병원성 F18 균주의 투여 이후 비 병원성 F18 균주의 찌꺼기 배출을 설명하는 비 제한적인 그래프이다.
도 2는 F18-STEC 병원성 면역검사 균주의 찌꺼기 배출을 설명하는 비 제한적인 그래프이다: 혼합 조성물로 치료한 동물들 및 대조군 동물들 사이의 비교.
도 3은 다른 장 단편에서 F18-STEC 병원성 면역검사 균주에 의한 정착을 설명하는 비 제한적인 그래프이다: 혼합 조성물로 치료한 동물들 및 대조군 동물들 사이의 비교.
도 4는 혈청 샘플에서 F18 섬모에 대한 IgM의 면역학적 탐지를 설명하는 비 제한적인 그래프이다: 혼합 조성물로 치료한 동물들 및 대조군 동물들 사이의 비교.
일반적으로, 돼지 STEC 및 여러 돼지 ETEC 균주는 F18 결정자를 발현한다. F18 결정자는 장의 점막 표면의 박테리아 정착을 촉진하는 섬모이다(Fairbrother et al. 2006, Postweaning Escherichia coli diarrhea and edema disease. In: Diseases of swine, ed. Straw B, Zimmermann JJ, D'Allaire S, Taylor DJ, 9th ed., pp. 649-662. Blackwell Publishing, Ames, IA). F18 섬모는 윗 원형질막 상의 소장의 장상피세포에 의해 노출된 장상피세포 수용체, ECF18R 수용체에 대한 F18 발현 박테리아 세포의 부착을 매개한다고 생각된다(Vogeli et al. 1996, Anim Genet 27:321-328; Waddell et al. 1996, Infect Immun 64:1714-1719).
일부 돼지 STEC 및 STEC/ETEC 균주는 F18 섬모 이외에, 다른 세포점착성 섬모 또는 비섬모 어드히신, 특히 F4 또는 F5 섬모 또는 "확산 점착에 관여하는 어드히신"(AIDA)을 발현할 수 있다(Barth et al., 2007, Berl Munch Tierarztl Wochenschr 120:307-316; DebRoy et al. 2009, J Vet Diagn Invest 21 :359-364; Fairbrother et al., supra; Niewerth et al.: 2001 , Clin Diagn Lab Immunol 8:143-149). AIDA 어드히신은 두 병원균에서 자주 발생하는 반면, F4 또는 F5 섬모는 이런 균주에서 드물다.
농장에서, 멧돼지의 이유식 후 설사(PWD) 및 부종 질환(ED)은 일반적으로 이유식 2주 후 처음 발생하며 PWD의 경우 병원성 F4 또는 F18 장독성 대장균(ETEC) 균주 및 ED의 경우 병원성 F18 시가 독소 생산 대장균(STEC) 균주에 의한 감염과 관련이 있고, 섬모(즉, F4 또는 F18)는 소장 융모에 위치한 특정 수용체에 대한 박테리아의 점착을 허용하며, 박테리아의 분할 및 장의 정착이 이어진다.
PWD에서, F4 수용체는 약 30 내지 40%의 돼지에서 발현되며 F18 수용체는 약 70 내지 80%의 돼지에서 탐지된다. 병원균 균주는 LT, STa 및 STb와 같은 여러 독소의 조합을 생산한다. ETEC-F4에 의해 감염된 돼지는 일반적으로 매우 높은 사망률, 성장 지연, 감염된 동물의 사망을 종종 유도하는 약한 설사 및 심한 설사를 나타낸다.
ED의 경우, F18 수용체는 약 70 내지 80%의 돼지에서 탐지된다. STEC와 관련된 독소는 Stx2e, 혈관 내피 세포에 작용하여 부종 및 운동 실조, 누움 및 결국에는, PWD의 경우 주로 감염 동물의 사망을 유도하는 후속 신경학적 징후를 초래하는 혈관 독소이다.
본 발명에 사용된 표현 "F18 대장균" 또는 "F18 균주"는 F18 결정자(섬모)를 발현하는 대장균 균주에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 표현 "F4 대장균" 또는 "F4 균주"는 F4 결정자(섬모)를 발현하는 대장균 균주에 관한 것이다.
당업자는 본 발명에 개시된 비 병원성 F18 균주는 과도한 노력 없이 돌연변이 또는 본 발명에 기술된 균주의 모든 식별가능한 특성을 가진 이의 변형 균주를 얻도록 조작될 수 있다는 것을 알 것이다. 돌연변이 또는 변형체를 생산하는 방법은 일반적이며 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 No. 7,351,558(전문이 참조로 본 발명에 포함)은 "돌연변이 또는 이의 변형체"를 생산하는 일부 방법의 요약을 개시한다. 복사에너지 또는 화학 물질을 사용하여 돌연변이를 생산하는 특정한 방법은 당업계에 잘 문서화되어 있다. 예를 들어, Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass., or Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992) 참조. 돌연변이 또는 이의 변형 균주는 또한 본 발명에 기술한 균주의 게놈에 대한 높은 엄격성의 조건하에서 혼성화되는 게놈 또는 이의 현저한 부분을 가지는 것으로 확인될 수 있다. 당업자는 소정의 균주가 "돌연변이 또는 이의 변형체"인지를 고려하기 위해서 얼마나 부분의 게놈이 현저해야 하는 지를 인식할 수 있을 것이다. 이와 같이, 당업자는 본 발명은 과도한 노력 없이 이런 변형체 또는 돌연변이를 사용하여 실시될 수 있다는 것을 합리적으로 예측할 것이다.
본 발명에 사용된 표현 "유효량"은 조직, 시스템 또는 동물의 원하는 생물학적 반응을 유도할 양을 의미한다. 본 발명에 기술된 살아있는 F18 대장균 균주의 이런 유효량은, 예를 들어, 장 박테리아 감염을 예방하고, 박테리아 배출을 최소화하고, 장 박테리아 감염에 의해 유발된 질환을 예방하는 등에 충분한 양일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 사용될 유효량은 여러 인자에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 인자의 수는 동물 형태, 동물의 최초 중량, 동물의 성장 단계, 환경, 살아있는 균주와 관련된 공급 가능한 담체, 즉, 동물 시설, 생산 형태 및 관리, 시설의 위생 상태, 이유식 후 동물의 스트레스 또는 부화, 사용된 원료 및 보충제, 동물의 건강 및 공존하는 질환 또는 치료 등으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 유효량은 약 5x106 내지 약 3x1010 CFU의 범위 내에서 선택된 임의의 양일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 당업자는 과도한 노력 없이 적절한 유효량을 측정할 수 있을 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "동물"은 본 발명에 따라 사용되기에 적합한 임의의 어린 또는 성장한 동물을 의미한다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 용어 "동물"은 멧돼지를 의미한다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 용어 "동물"은 돼지를 의미한다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 돼지는 젖 떼기 전 돼지이다. 다른 비 제한적인 실시태양에서, 돼지는 젖 뗀 후 돼지이다. 당업자는 과도한 노력 없이 적절한 동물을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "장 전달"은 균주가 궁극적으로 위장관, 더욱 바람직하게는 장에 도달하게 할 수 있는 투여 방식을 의미한다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 장 전달은 균주의 경구 투여에 의해 실행된다. 다른 비 제한적인 실시태양에서, 장 전달은 직장 투여, 예를 들어, 좌약을 통해 실행된다. 당업자는 과도한 노력 없이 적절한 투여 방식을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명에 사용된 표현 "공급 가능한 담체"는 본 발명에 기술된 균주와 혼용가능한 임의의 담체, 희석제 또는 부형제를 의미하며 부작용없이 동물에 제공될 수 있다. 당업계에 공지된 적절한 공급 가능한 담체는 물, 식염수, 글루코오스, 덱스트로스, 버퍼 용액 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이런 담체는 유리하게는 균주에 대해 비 독성이며 동물에게 해롭지 않다. 이는 또한 생분해성이다. 담체는 고체 또는 액체 공급 가능한 담체일 수 있다. 적절한 고체 공급 가능한 담체는 비 독성 섭취가능한 담체일 수 있다. 예를 들어, 이런 고체 공급 가능한 담체는 보리 사료, 옥수수 사료 또는 밀 사료와 같은 시리얼 제품, 박피된 분쇄 견과류 덩어리 또는 목화씨 덩어리 또는 추출된 목화씨 덩어리와 같은 견과류 및 씨 제품과 예를 들어 소량의 가벼운 사료, 해조류 사료, 뼈 식사, 뼛가루, 분필, 염, 우레아 및 비타민과 함께 이루어진 전형적인 동물 사료의 구성요소와 같은 일반적인 단단한 식품일 수 있으며; 또는 예를 들어, 고령토, 활석, 탄산 칼슘, 백토, 점토, 분쇄된 굴 껍질 또는 분쇄된 석회석과 같은 불활성 고체 희석제 또는 담체일 수 있거나 전분 또는 락토오스일 수 있다. 다른 구체적인 실시예에서, 고체 공급 가능한 담체는 분쇄된 옥수수, 대두 사료, 유장, 동물 지방 등일 수 있다. 적절한 액체 공급 가능한 담체는, 예를 들어, 물 및 바람직하게는 음료수; 전유 또는 탈지유와 같은 우유; 또는 트립손 콩 브로스(TSB)와 같은 배지이다. 당업자는 과도한 노력 없이 적절한 공급 가능한 담체를 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 범위는 다음 실시예에서 설명한 바람직한 실시태양에 의해 제한되지 않으며, 전체로서 상세한 설명과 일치된 가장 넓은 설명을 제공되어야 한다.
실시예
실시예 1
a) 비 병원성 F18 대장균 균주
2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 대장균을 OIE reference laboratory for Escherichia coli (EcL) at the Faculte de medicine veterinaire (FMV), Universite de Montreal (UdeM), Saint-Hyacinthe, Quebec, Canada에서 1996년에 Dr.제이.엠. 페어브라더에 의해 돼지의 대소변으로부터 분리하였다.
균주의 동정은 API 시스템을 사용하여 실행하였다. 마스터 속도에 대한 API 20E 코드는 5004552이다. 균주의 혈청형구분은 O141:K94:H-의 혈청형을 나타내었다.
균주의 비로타이핑(virotyping)은 콜로니 혼성화 및/또는 연쇄중합반응(PCR)에 의해 실행하였다. 비로타이핑 결과는 균주가 F18 및 AIDA에 대해 양성인 반면 다음 독소: STa, STb, LT, EAST1 , Stx1 , Stx2, CNF, F4, F5, F6, F17, F41 , P, AFA, Eae, Paa, Tsh, 에로박틴 유전자에 대해서는 음성이라는 것을 나타내었다. 따라서 이 균주는 비 병원성 대장균 균주이다.
균주는 다음 항균제: 아목시실린, 앰피실린, 클린다마이신, 독시사이클린, 에리쓰로마이신, 네오마이신, 페니실린, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 설파클로르피리다진, 설파다이메톡신, 설파티아졸, 티아물린, 틸미코신, 테트라사이클린(클로르 및 옥시) 및 틸로신에 대해 저항성이 있는 반면 다음 항균제: 아프라마이신, 세프티오퓨르, 콜리스틴, 다노플록사신, 엔로플록사신 및 젠타미신에 대해 민감하다.
b) 비 병원성 F4 대장균 균주
비 병원성 F4 대장균 균주는 또한 본 발명에 기술된 비 병원성 F18 균주와 조합으로 사용될 수 있다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 비 병원성 F4 대장균은 F4 결정자를 발현하는 임의의 비 병원성 균주이다. 한 비 제한적인 실시태양에서, 비 병원성 F4 대장균 균주는 재조합 균주, 예를 들어, pMK005 균주(Kehoe et a;., J Bacteriol. 1983 Sep;155(3):1071-7)이다. 다른 비 제한적인 실시태양에서, 비 병원성 F4 대장균 균주는 천연 균주, 예를 들어, US 7,981,411(이의 전문이 참조로 본 발명에 포함된다)에서 개시된 대로, 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주이다.
실시예 2
넓은 태양에서, 본 연구의 목적은 본 발명에 기술된 비 병원성 균주 F18 균주의 다른 경구 투여량(dose)의 대소변 분비 및 항-F18 전신 체액 반응에 대한 영향을 평가하는 것이었다.
다음 표 1은 연구 스케줄을 일반적으로 요약한다:
[표 1]
Figure 112015016213485-pct00001
I - 연구 설계
a) 동물
50마리의 기르는 새끼돼지의 혈액 샘플을 F18 수용체 상태 탐지 분석을 위해 채취하였고 새끼돼지 귀에 태그를 붙였다. 17 내지 20일령의 선택된 젖을 뗀 돼지(수컷 및 암컷)를 캐나다, 퀘벡, 몬테레지에 위치한 지역 농장에서 구입하였다. 동물들을 분리 시설로 수송하였다. 선택된 농장은 최근(6개월 미만) 돼지 재생성 호흡기 증후군(PRRS) 및 이유식 후 질환 사건이 없었다. 돼지는 건강하였고 4 내지 6kg의 체중이었다. F18-수용체 상태에 대해 양성인 전체 스물한마리(21) 돼지를 사용하였고, 귀 태그 숫자를 사용하여 7마리의 세(3) 그룹으로 무작위로 분리하였다(3개의 다른 F18 조성물 투여량). 이유식 후 2일에, 대소변 샘플을 채취하여 F4 양성 및 F18 양성 균주에 의한 현존하는 정착을 PCR을 사용하여 측정하였다. 이유식 후 2일에 F4 양성 또는 F18 양성 박테리아에 대해 양성인 동물은 발견되지 않았다.
b) 숙소 및 사육
치료 그룹을 개개의 방에 수용하였다. 동물은 연구 동안 마음대로 물에 접근하였고 하루 2회 사료가 제공되었다. 동물 사료는 미국특허 US 6,355,859(전문이 참조로 본 발명에 포함된다)에 기술된 콩이 주된 사료로 구성되었다. 연구 동안 공동의 의약 또는 백신이 투여되지 않았다.
c) 균주 준비 및 투여
2개의 성장 곡선을 준비하여 동일한 방식으로 최적 수율을 얻기 위해 비 병원성 F18 균주에 의해 필요로 한 시간을 계산하였다. 제조용 씨드(WS)를 사용하여 F18 조성물을 제조하는데 사용된 성장 곡선 및 배지를 제조하였다. 1밀리리터의 WS를 사용하여 동물 기원의 재료 없이 500mL의 트립틱쏘이 브로스를 접종하였다. 배지를 교반하면서(180rpm) 37℃에서 대략 6.5시간 배양하였다. 생균수를 계산하여 F18 균주 배지의 수율을 평가하였고 PCR 반응을 사용하여 분석 동안 적절한 균주가 사용되었다는 것을 입증하였다. 결과를 기초로, 배지를 조절하여 동물 기원의 재료 없이 살균 TSB를 사용하여 테스트될 투여량을 충족시켰다: 그룹 1, 5x108 CFU/투여량; 그룹 2, 1x109 CFU/투여량; 및 그룹 3, 5x109 CFU/투여량.
9회 투여량의 비 병원성 F18 균주 조성물을 각 제제에 대해 임의의 조성물 손실을 보상하기 위해 테스트될 새끼돼지 수의 2배 이상으로 제조하였다. 6mL의 F18 조성물을 각 새끼돼지에 경구로 투여하였다. F18-조성물을 식도 튜브를 사용하여 이유식 후 5일에 투여하였다.
II - 관찰 및 평가
a) 일반적 건강
새끼돼지를 일반적 건강에 대해 하루 2회 관찰하였다: 행동, 탈수, 식욕 및 일반적 신체 상태. 이동성과 모발 외관도 또한 평가하였다.
b) 설사
대소변 견고성은 다음과 같이 매일 점수를 매긴다: 0, 정상; 1, 반죽 같음; 2, 액체가 존재하나 액체보다 고체 입자가 많음; 3, 고체 입자보다 더 많은 액체가 존재; 및 4, 완전히 액체.
c) 투여된 비 병원성 F18 균주의 배출
이유식 후 2일 및 5일 내지 19일에, 각 그룹에서 투여된 비 병원성 F18 균주의 존재를 평가하기 위해서 루리아-베르토니(LB) 브로스에서 농축 후 PCR(멀티플렉스: LT, STa, STb 및 F4; F18, Stx2e 및 AIDA)에 의해 대소변을 테스트하였다. F18에 대해 양성인 샘플은 투여된 비 병원성 F18 균주에 대해 양성인 것으로 생각하였다. 이유식 5 내지 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 19일에, 생균수를 투여 이후 배출된 투여된 비 병원성 F18 균주의 수준을 평가하기 위해, 트립틱 쏘이 아가 II(TSA II) - 5% 양 혈액을 사용하여 대소변 샘플에 대해 계산하였다. 전형적인 대장균 형태를 가진 용혈성 콜로니만을 계수하였다.
d) 면역화 평가
혈액 샘플을 이유식 후 5, 10, 12, 15 및 19일에 수집하여 투여된 비 병원성 F18 균주의 투여량에 따라 최적 면역 반응을 ELISA에 의해 평가하였다.
III - 검시
a) 검시
첫 번째 검시를 무작위로 선택한 2마리 동물에 대해 백신접종 후 3일에, 이유식 후 8일에 실행하였고 전반적인 이상을 평가하였다. 두 번째 검시를 연구 종료시에, 따라서 모든 잔존 동물에 대한 백신접종 후 14일인 이유식 후 19일에 실시하였다.
b) 장 내용물 견고성
장 내용물 견고성을 공장, 회장, 맹장, 결장 및 직장에서 다음과 같이 점수를 매긴다: 0, 정상; 1, 반죽 같음; 2, 액체가 존재하나 액체보다 고체 입자가 많음; 3, 고체 입자보다 더 많은 액체가 존재 또는 완전히 액체.
c) 백신 균주에 의한 회장의 정착
회장의 2센티미터 부분을 회맹판에 가까운 10cm에서 샘플을 채취하였다. 살아있는 박테리아 계수를 TSA II - 5% 양 혈액을 사용하여 실시하였고, 전형적인 대장균 형태를 가진 용혈성 콜로니만을 계수하였다.
IV - 결과
연구 내내 치료된 동물 및 대조군 동물 모두에서 사망이 관찰되지 않았다. 선택된 모든 돼지는 PCR-RFLP 방법에 따라 F18 수용체에 대해 양성이었다. 일반적으로, 새끼돼지는 연구 내내 건강 상태가 좋았다. 소수의 동물이 비 병원성 F18 균주의 투여 이전에 나타난 또는 비 병원성 F18의 투여와 관련이 없는 손상에 의한 감소된 사망을 나타내었다.
이 연구 동안, 2 이상의 점수는 설사로 생각하였다. 21마리 동물에 대해, 5마리가 F18 투여 후 일시적인 약한 설사를 나타내었다. 한 동물(그룹 3의 돼지 5)은 2일 연속 (3점의) 설사를 했다(표 2a, 2b 및 2c).
대소변 샘플을 PCR에 의해 매일 테스트하여 F18 투여 균주의 존재를 탐지하였다; 그룹 2의 3마리 동물(1x109 CFU/투여량)은 늦어도 백신접종 후 11일에 F18 투여 균주에 대해 양성이었고, 그룹 3(5x109 CFU/투여량)은 백신접종 후 10일에 양성인 1마리 새끼돼지, 8일에 양성인 1마리 새끼돼지, 7일에 3마리 새끼돼지를 가졌다. 그룹 1(5x108 CFU/투여량)의 경우 1마리 새끼돼지가 백신접종 후 8일에 비 병원성 F18 투여 균주에 대해 양성이었고, 백신접종 후 7일에 1마리 및 6일에 2마리가 양성이었다(표 2a, 2b 및 2c).
[표 2a]
5x108 CFU/투여량으로 투여된 그룹에 대한 설사의 점수, 지속기간 및 심각성
Figure 112015016213485-pct00002
[표 2b]
1x109 CFU/투여량으로 투여된 그룹에 대한 설사의 점수, 지속기간 및 심각성
Figure 112015016213485-pct00003
[표 2c]
5x109 CFU/투여량으로 투여된 그룹에 대한 설사의 점수, 지속기간 및 심각성
Figure 112015016213485-pct00004
*1 대소변 견고성은 다음과 같이 점수를 매긴다: 0, 정상; 1, 반죽 같음; 2, 액체가 존재하나 액체보다 고체 입자가 많음; 3, 고체 입자보다 더 많은 액체가 존재; 및 4, 완전히 액체;
*2 5일: F18 투여 균주 투여;
*3 설사의 지속기간(백신접종 후 기간: 6일 내지 19일 동안 2 이상의 점수를 가진 날수);
*4 설사의 심각성(백신접종 후 기간: 6일 내지 19일 동안 누적 설사 점수);
*5 설사 점수의 중앙값.
수직의 굵은 선은 F18(백신 균주)이 PCR에 의해 탐지된 마지막 날을 나타낸다.
ND: 실행되지 않음
E: 비었음
D: 사망(검시를 거침)
비 병원성 F18 투여 균주의 대소변 배출을 5 내지 8, 10, 12, 14, 16, 18 및 19일에 대소변 샘플로부터 박테리아 계수에 의해 평가하였다. 도 1은 투여 후 균주의 배출을 나타낸다. 더 낮은 투여량(5x108 CFU)에 의해 배출된 박테리아의 수준은 다른 2개보다 낮으며, 최고 배출은 1x109 CFU의 투여량으로 투여된 그룹 2의 동물에 의해 관찰되었다.
전반적인 이상은 내부 장기에 대해 관찰되지 않았다. 장 내용물 견고성을 유체의 축적에 대해 평가하였다.
이 연구에서, 2 이상의 점수는 검시일에 장 부분에서 유체 축적으로 생각하였다. 표 3a, 3b 및 3c는 그룹 1의 한 동물은 2개의 연속 부분에 유체 축적을 제공하였다는 것을 나타낸다(점수 2). 다른 동물은 유체 축적을 나타내지 않았다.
비 병원성 F18 균주의 투여와 관련한 바람직하지 않은 사건이 연구 동안 관찰되지 않았고, 테스트된 투여량이 일반적으로 안정하다는 것을 나타내었다.
균주 배출 평가를 기초로, PCR 및 박테리아 계수는 1x109 CFU/투여량은 이 균주의 연장된 대소변 배출을 얻는데 적절한 투여량이라는 것을 나타내었다. 두 테스트는 1x109 CFU/투여량의 비 병원성 F18 균주의 투여가 다른 테스트 투여량보다 더 긴 기간 동안 배출되었다는 것을 증명하였다.
[표 3a]
5x108 CFU/투여량으로 투여된 그룹에 대한 장 내용물 견고성 점수 및 장에서 유체 축적의 정도 및 심각성
Figure 112015016213485-pct00005
[표 3b]
1x109 CFU/투여량으로 투여된 그룹에 대한 장 내용물 견고성 점수 및 장에서 유체 축적의 정도 및 심각성
Figure 112015016213485-pct00006
[표 3c]
5x109 CFU/투여량으로 투여된 그룹에 대한 장 내용물 견고성 점수 및 장에서 유체 축적의 정도 및 심각성
Figure 112015016213485-pct00007
*1 장 내용물 견고성은 공장, 회장, 맹장, 결장 및 직장에서 다음과 같이 점수를 매긴다: 0, 정상; 1, 반죽 같음; 2, 액체가 존재하나 액체보다 고체 입자가 많음; 3, 고체 입자보다 더 많은 액체가 존재 또는 완전히 액체;
*2 장에서 유체의 축적의 정도(2 이상의 점수를 가진 장 부분의 수)
*3 설사의 심각성(장 부분에 대한 누적 견고성 장 내용물 점수)
*4 장 내용물 견고성 점수의 중앙값
ND: 실행되지 않음
실시예 3
넓은 양태에서, 이 연구의 목적은 본 발명에 기술된 비 병원성 F4 및 F18 대장균 균주를 포함하는 혼합 조성물의 효과를 평가하는 것이었다.
다음 표 4는 일반적으로 연구 스케줄을 요약한다:
[표 4]
Figure 112020031158576-pct00020
I - 연구 설계
a) 동물
50마리의 기르는 새끼돼지의 혈액 샘플을 F18 수용체 상태 탐지 분석을 위해 채취하였고 새끼돼지 귀에 태그를 붙였다. 17 내지 20일령의 선택된 젖을 뗀 돼지(수컷 및 암컷)를 캐나다, 퀘벡, 몬테레지에 위치한 지역 농장에서 구입하였다. 동물들을 분리 시설로 수송하였다. 선택된 농장은 최근(6개월 미만) 돼지 재생성 호흡기 증후군(PRRS) 및 이유식 후 질환 사건이 없었다. 돼지는 건강하였고 4 내지 6kg의 체중이었다.
귀 태그 숫자를 사용하여 무작위로 분리한 전체 스무마리(20) 돼지를 사용하였다. 무작위 추출 장치 소프트웨어를 사용하여 10마리의 두(2) 그룹(대조군 및 투여된 그룹)으로 20마리 동물을 무작위로 분배하였다. 이유식 후 1일에, 대소변 샘플을 채취하여 농장으로부터 기원하는 병원성 F4-ETEC 양성 균주 및 F18-ETEC/STEC 양성 균주에 의한 현존하는 정착을 PCR 분석을 사용하여 측정하였다. 표적화된 유전자는 STa, STb, LT, F4, Stx2 및 F18이다. 이유식 후 1일에 F4-ETEC 또는 F18-ETEC/STEC 박테리아에 대해 양성으로 밝혀진 동물은 발견되지 않았다.
b) 숙소 및 사육
치료 그룹 및 대조군 그룹을 개개의 방에 수용하였다. 동물은 연구 동안 마음대로 물과 음식에 접근하였다. 동물 사료는 미국특허 US 6,355,859에 기술된 콩이 주된 사료로 구성되었다. 연구 동안 공동의 의약 또는 백신이 투여되지 않았다.
c) 균주 준비 및 투여
재수화 혼합 조성물을 희석하여 6mL 투여량 당 5x108CFU/균주의 최소량을 얻었다. 위약은 6mL의 살균수로 구성되었다. 혼합 조성물 및 위약은 고무관을 가진 주사기를 사용하여 경구로 투여하였다.
d) 면역성 검사 균주(F18-STEC EcL14724) 준비 및 투여
이 면역성 검사 균주는 2013년 7월9일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 090713-01을 부여받았다.
배지를 준비하여 새끼돼지 당 1x1011 CFU의 감염성 투여량을 얻었다. 10mL의 탄산 칼슘 1.2%(CaCO3) 투여 이후, 오(5) mL의 면역성 검사 균주를 식도 튜브를 사용하여 각 새끼돼지에 경구로 투여하였다. 면역성 검사 균주를 매일 1x1011 CFU/투여량의 농도로 연속 삼일(3) 동안, 즉 이유식 후 12, 13 및 14일 투여하였다.
e) 관찰 및 평가
매일 2회 일반적인 건강에 대해 새끼돼지를 관찰하였다: 행동, 식욕, 일반적인 신체 상태, 이동성 및 모발 외관 또한 평가하였다. 탈수 및 체온도 하루 1회 관찰하였다. 면역성 균주의 배출은 PCR 및 생균수(CFU)에 의해 평가하였다. 혈액 샘플을 특정 효소 결합 면역흡수 분석법(ELISA)을 사용하여 분석하였다. 결과는 양성의 백분율(PP%) 대 양성 대조군으로 제공되었다.
II - 검시
면역성 검사 균주에 의한 회장 및 맹장의 정착은 다음과 같이 측정하였다. 회장의 2센티미터 부분뿐만 아니라 맹장의 일부를 회맹판에 가까운 10cm에서 샘플을 채취하였다. 살아있는 박테리아 계수를 TSA II - 5% 양 혈액을 사용하여 실시하였고, 전형적인 대장균 형태를 가진 용혈성 콜로니만을 37℃에서 12 내지 18시간 배양 후 계수하였다.
III - 결과
a) 일반적인 정보
테스트된 50마리 새끼돼지로부터, 30마리는 F18 균주 점착에 영향을 받기 쉬었고 20마리는 테스트를 무작위로 선택하였다. 일반적으로, 새끼돼지는 면역성 검사 이전 건강이 좋았다.
다음 표 5는 치료된 동물 및 대조군 동물의 대소변으로부터의 배출된 면역성 검사 균주의 PCR 결과를 나타낸다:
[표 5]
Figure 112015016213485-pct00009
표 5에서 입증한 대로, 혼합 조성물의 투여는 위약을 투여받은 돼지와 비교하여 면역성 검사 균주의 배출을 감소시켰다. 위약 동물(56%)의 절반 이상은 최종 면역성 검사(연구의 종료) 후 5일 면역성 검사 균주를 여전히 배출하는 반면 면역성 검사 균주는 최종 면역성 검사 4일 후와 같이 초기에 혼합된 조성물로 치료한 동물에서 탐지되지 않았다.
도 2는 치료 동물 및 대조군 동물의 대소변으로부터 배출된 면역성 검사 균주의 생균수(CFU)/g를 나타낸다. 배출된 면역성 검사 균주의 농도의 최대는 치료 동물 및 대조군 동물에 대해 이유식 후 14일(면역성 검사 후 0일)에 나타난다. 치료된 동물에서, 대소변에서 면역성 검사 균주의 농도는 최종 면역성 검사 2일후(이유식 후 16일)에 감소하기 시작하였고 추가 감소는 최종 면역성 검사 4 및 5일에 위약과 비교하여 관찰되었다. 이런 결과는 PCR 결과와 일치한다. 더욱 정확하게는, 혼합 조성물의 투여는 최종 면역성 검사(연구의 종료) 후 5일에 약 2 로그만큼 면역성 검사 균주의 배출 수준을 감소시켰다.
b) 면역성 검사 균주에 의한 회장 및 맹장 정착
치료된 동물 및 위약 동물 사이의 장 정착에 대한 차이는 두 장 조직 부분(회장 및 맹장)에 대해 관찰하였다. 도 3은 혼합된 조성물의 투여는 면역성 검사 균주에 의한 장의 정착을 현저하게 감소시켰다는 것을 입증한다. 더욱 정확하게는, 혼합된 조성물의 투여는 최종 면역성 검사(연구의 종료) 후 5일에 약 2 log만큼 회장 및 맹장의 면역성 검사 균주 정착을 감소시켰다.
c) 면역 반응성 평가
F18 섬모에 대한 전신 IgM의 존재를 특정 ELISA를 사용하여 혈청 샘플에서 평가하였다. 혼합된 조성물 치료 동물은 투여 후 7일이 되자마자 특정 면역 반응을 나타내었다(도 4).
면역성 검사 균주 정착의 최종 감소, 특이적 항-F18 항체의 배출 및 자극의 감소를 기반으로, 이 연구는 본 발명에 기술된 비 병원성 F18 균주를 포함하는 조성물의 장 전달이 F18 대장균 장 박테리아 감염을 예방할 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 4
넓은 양태에서, 본 연구의 목적은 본 발명에 기술된 비 병원성 F18 대장균 균주의 효과를 평가하는 것이었다.
I - 연구 설계
a) 동물
동물들을 시설에 넣기 전에, 전체 100마리 새끼돼지에 대해, 10마리 한 배 새끼의 10마리 돌보는 새끼돼지를 DNA 분리를 위해 한 배의 새끼돼지 집단에서 표본으로 하였고 RFLP-PCR 방법에 의해 F18 수용체(RF18+) 상태에 대해 선별하였다. 서른(30) 마리 RF18+새끼돼지를 한 배의 새끼(1:1 비)로 차단하여 그룹들 사이에 무작위로 분배하였고 n = 6의 블럭 크기를 생성하였다. 새끼돼지를 다음 그룹 중 하나로 할당하였다: 비 병원성 F18 테스트 균주가 투여된 T1(n=15); 및 위약이 투여된 T2(n=15).
치료된 그룹(T1)의 동물을 실험실의 우리 속에 함께 섞었고 위약 그룹(T2)의 동물을 면역성 검사 단계까지 다른 실험실의 우리 속에 함께 섞었다. 면역성 검사일, 즉 비 병원성 F18 균주 또는 위약의 투여 후 11일에, T1(n=15) 및 T2(n=15) 그룹의 동물을 면역성 검사 이전 면역성 검사 방에 위치한 2개의 분리된 우리 속에 옮겼다. 특정 치료 그룹의 모든 15마리 돼지를 개개의 우리에 함께 섞었다. 연구 내내, 동물은 백신접종 이전 물 억제 기간 동안을 제외하고 자유롭게 물에 접근하였다. 동물에 약을 첨가하지 않은 콩이 주된 사료를 일일 2회 제공하였다(U.S. 6,355,859).
이유식 후 1일에, 대소변 샘플을 채취하여 농장으로부터 기원하는 병원성 F4-ETEC 양성 균주 및 F18-ETEC/STEC 양성 균주에 의한 현존하는 정착을 PCR 분석을 사용하여 측정하였다. 표적화된 유전자는 STa, STb, LT, F4, Stx2 및 F18이다. 이유식 후 1일에 F4-ETEC 또는 F18-ETEC/STEC 박테리아에 대해 양성으로 밝혀진 동물은 발견되지 않았다. 동물 보호를 이유로 T1 그룹의 세 마리(3) 동물을 연구로부터 배제하였다. 이런 부작용은 비 병원성 F18 균주의 투여와 관련이 없는 것으로 생각디었다.
다음 표 6은 일반적으로 사용된 동물을 요약한다:
[표 6]
Figure 112015016213485-pct00010
다음 표 7은 일반적으로 연구 설계를 요약한다:
[표 7]
Figure 112015016213485-pct00011
II - 절차 및 평가
T1 그룹 및 T2 그룹 동물은 치료된 동물이 위약 대조군으로부터 분리되어 수용될 것을 필요로 하는 테스트 생성물(즉, 살아있는 백신)의 특성 때문에 함께 섞이지 못할 수 있다. 비 병원성 F18 균주 및 위약 용액은 동물 단계에 관여하지 않은 사람이 제조하였다. 코드 "A" 및 "B"를 비 병원성 F18 균주 및 위약 용액에 무작위로 배정하였다. 방들을 치료에 무작위로 할당하고 방 1 및 2로 표시하였다. 각 방은 단일 우리에 함께 섞인 모든 T1 그룹 또는 T2 그룹 동물을 가졌다 동물 단계에 관여하고 실험실 분석을 실행한 인원이 치료 및 방 할당에 대해 모르게 하였다. 검시 단계를 위해, 검시될 동물의 순서를 무작위로 결정하고 동물을 A 내지 AD로 재표시하였다. 검시를 실행하는 사람이 돼지 동정 및 치료에 대해 모르게 하였다. 무작위화 코드를 담당 임상통계전문가에 의해 밀봉된 봉투에 보관시켰다.
a) 비 병원성 F18 균주의 준비 및 투여
비 병원성 F18 균주를 발효기에서 배양 후, 박테리아를 동결하고 200 명목 투여량을 포함하는 10mL 유리병에 -78℃에 저장하였다. 동결된 박테리아를 사용하기 전에 실온에서 물로 희석하였다.
2mL 투여량 당 대략 3x108 CFU로 이유식 후 1일(0일)에 한 번 투여량을 투여하였다. 고무 튜브가 장착된 주사기를 사용하여 투여량을 투여하였다. 대조군 동물은 동일한 양의 위약 용액(물)을 투여받았다.
b) 면역성 검사 균주(F18-STEC 균주 EcL 14724)
이 분석법에 사용된 면역성 검사 균주를 EcL 14724 균주(Stx2, F18ab, AIDA 및 Paa에 대해 양성)에 의해 미리 면역성 검사된 돼지(#381)로부터 재분리하였다. 면역성 검사 균주를 돼지 당 대략 1x1010 CFU로 3일 연속, 연구의 11, 12 및 13일에 경구로 투여하였다. 각 면역성 검사 투여량을 식도 삽관에 대한 대체물로서 젤라틴 캡슐를 사용하여 투여하였다. 카르바독스(시가독소의 방출을 자극하는 항생제)를 시가독소의 방출을 일으키도록 면역성 검사 균주의 투여 직후 젤라틴 캡슐에 경구에 투여하였다.
c) 일반적인 건강 및 평가
일반적인 건강을 위해 면역성 검사기간 이전 돼지를 하루 1회 관찰하였다. 제 1 면역성 검사 이후, 동물을 우울, 탈수, 식욕을 포함하는 일반적인 건강 및 부종 질환: 운동 실조, 얼굴 또는 팔다리 부종, 급사와 관련된 임의의 임상적 신호에 대해 하루 2회 관찰하였다.
d) 면역성 검사 균주의 전파의 평가
면역성 균주의 대소변 전파는 F18 섬모의 FedA 주요 단백질에 대해 암호화하는 유전자를 표적화하는 최확수(most-probable number) PCR(MPN-PCR) 방법을 사용하여 정량하였다.
e) 검시
제 1 면역성 검사 7일 후 검시를 실행하였다. 면역성 균주에 의한 맹장의 정착을 조직의 대략 2cm2 부분을 사용하여 F18 섬모의 FedA 주요 단백질에 대해 암호화하는 유전자를 표적화하는 최확수 PCR 방법을 사용하여 정량하였다.
III - 결과
PCR 분석은 면역성 검사 F18 시가독소 병원성 균주의 배출을 막도록 비 병원성 F18 균주의 투여 효과를 입증하였다. 약 2.5 log의 대소변 전파의 감소를 최종 면역성 검사 후 4일에 위약 동물과 비교된 치료된 동물에 대해 관찰하였다(표 8). 최종 면역성 검사 후 4일에, 93%의 위약 동물은 대소변 샘플의 그램 당 1x105 CFU 초과의 면역성 검사 균주를 전파한 반면 단지 42%의 치료된 동물이 전파하였다(표 9).
다음 표 8은 최종 면역성 검사 후 4일에 면역성 검사 균주의 전파를 나타낸다:
[표 8]
Figure 112015016213485-pct00012
다음 표 9는 최종 면역성 검사 후 4일에 다른 박테리아 적재량으로 면역성 검사 균주를 전파하는 돼지의 비율을 나타낸다:
[표 9]
Figure 112015016213485-pct00013
맹장에서 탐지된 약 1 log의 면역성 검사 균주의 감소를 최종 면역성 검사 후 5일에 위약 동물과 비교하여 치료된 동물(비 병원성 F18 균주 투여)에 대해 관찰하였다(표 10). 최종 면역성 검사 후 5일에, 53% 초과의 위약 동물은 맹장 조직의 그램 당 1x105 CFU 초과의 면역성 검사 균주를 전파한 반면 단지 8%의 치료된 동물이 전파하였다(표 11). 80% 초과의 위약 동물은 최종 면역성 검사 후 5일에 50%의 치료된 동물과 비교하여 맹장의 그램 당 1x106 CFU 초과의 면역성 검사 균주만큼 매장에 정착하였다(표 11).
다음 표 10은 최종 면역성 검사 후 5일에 면역성 검사 균주에 의한 맹장의 정착을 나타낸다:
[표 10]
Figure 112015016213485-pct00014
다음 표 11은 최종 면역성 검사 후 5일에 맹장이 다른 박테리아 적재량으로 면역성 검사 균주에 의해 정착된 돼지의 비율을 나타낸다:
[표 11]
Figure 112015016213485-pct00015
면역성 검사 균주 정착의 최종 감소 및 배출의 감소를 기반으로, 이 연구는 본 발명에 기술된 비 병원성 F18 균주를 포함하는 조성물의 장 전달이 장 박테리아 감염을 일으키는 F18 대장균 부종을 예방할 수 있다는 것을 암시한다.
다음 조항은 본 발명에 따른 비 제한적인 실시태양의 실시예의 추가 설명을 제공한다:
조항:
조항 1: 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주.
조항 2: 동결건조 형태인 조항 1의 분리된 대장균 균주.
조항 3: 동결 형태인 조항 1의 분리된 대장균 균주.
조항 4: 균주가 공급 가능한 담체와 결합되는 제 1항의 분리된 대장균 균주.
조항 5: 조항 1 내지 조항 3 중 임의의 하나의 분리된 대장균 균주 및 공급 가능한 담체를 포함하는 조성물.
조항 6: F4 섬모를 발현하는 분리된 살아있는 비 병원성 대장균을 더 포함하는 조항 5의 조성물.
조항 7: F4 섬모를 발현하는 상기 비 병원성 대장균은 2005년 1월21일에 International Depositary Authority of Canada에 기탁하고 등록번호 IDAC 210105-01을 부여받은 균주인 조항 6의 조성물.
조항 8: 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 유효량의 살아있는 대장균 균주의 동물에 대한 장 전달을 포함하여, 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염을 예방하는 방법.
조항 9: 상기 장 전달은 살아있는 대장균 균주의 경구 투여에 의해 얻어지는 조항 8의 방법.
조항 10: 상기 살아있는 대장균 균주는 동결건조 형태인 조항 8 또는 9의 방법.
조항 11: 상기 살아있는 대장균 균주는 동결 형태인 조항 8 또는 9의 방법.
조항 12: 상기 살아있는 대장균 균주는 공급 가능한 담체와 결합되는 조항 8 또는 9의 방법.
조항 13: 상기 유효량은 적어도 5x107 CFU인 조항 8 내지 12 중 임의의 하나에 따른 방법.
조항 14: 상기 동물은 돼지인 조항 8 내지 12 중 임의의 하나에 따른 방법.
조항 15: 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 유효량의 살아있는 대장균 균주의 동물에 대한 장 전달을 포함하여, 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염에 의해 유발된 부종 질환 또는 설사를 예방하는 방법.
조항 16: 상기 장 전달은 살아있는 대장균 균주의 경구 투여에 의해 얻어지는 조항 15의 방법.
조항 17: 상기 살아있는 대장균 균주는 동결 형태인 조항 15 또는 16의 방법.
조항 18: 상기 살아있는 대장균 균주는 동결건조 형태인 조항 15 또는 16의 방법.
조항 19: 상기 살아있는 대장균 균주는 공급 가능한 담체와 결합되는 조항 15 또는 16의 방법.
조항 20: 상기 유효량은 적어도 5x107 CFU인 조항 15 내지 19 중 임의의 하나에 따른 방법.
조항 21: 상기 동물은 돼지인 조항 15 내지 20 중 임의의 하나에 따른 방법.
조항 22: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염을 예방하기 위한, 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 살아있는 대장균 균주의 유효량 살아있는 대장균 균주의 용도로서, 상기 균주는 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 23: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염을 예방하는데 사용하기 위한 조성물의 제조에서, 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 살아있는 대장균 균주의 유효량 살아있는 대장균 균주의 용도로서, 상기 조성물은 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 24: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염에 의해 유발된 부종 질환 또는 설사를 예방하기 위한, 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 살아있는 대장균 균주의 유효량 살아있는 대장균 균주의 용도로서, 상기 균주는 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 25: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염에 의해 유발된 부종 질환 또는 설사를 예방하는데 사용하기 위한 조성물의 제조에서, 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 살아있는 대장균 균주의 유효량 살아있는 대장균 균주의 용도로서, 상기 조성물은 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 26: 상기 살아있는 대장균 균주는 경구 투여에 적합한 조항 22 내지 25 중 어느 하나의 용도.
조항 27: 상기 살아있는 대장균 균주는 동결건조 형태인 조항 22 내지 26 중 어느 하나의 용도.
조항 28: 상기 살아있는 대장균 균주는 동결 형태인 조항 22 내지 26 중 어느 하나의 용도.
조항 29: 상기 살아있는 대장균 균주는 공급 가능한 담체와 결합되는 조항 22 내지 26 중 어느 하나의 용도.
조항 30: 상기 유효량은 적어도 5x107 CFU인 조항 22 내지 29 중 어느 하나에 따른 용도.
조항 31: 상기 동물은 돼지인 조항 22 내지 30 중 어느 하나에 따른 용도.
조항 32: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염을 예방하는데 사용하기 위한 조항 1 내지 4 중 어느 하나의 분리된 대장균 균주로서, 상기 균주는 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 33: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염을 예방하는데 사용하기 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 조항 1 내지 4 중 어느 하나의 분리된 대장균 균주로서, 상기 조성물은 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 34: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염에 의해 유발된 부종 질환 또는 설사를 예방하는데 사용하기 위한 조항 1 내지 4 중 어느 하나의 분리된 대장균 균주로서, 상기 균주는 동물의 장 전달에 적합하다.
조항 35: 동물의 F18 병원성 대장균 장 감염에 의해 유발된 부종 질환 또는 설사를 예방하는데 사용하기 위한 조성물의 제조에 사용하기 위한 조항 1 내지 4 중 어느 하나의 분리된 대장균 균주로서, 상기 조성물은 동물의 장 전달에 적합하다.
제목 또는 소제목은 전부 독자의 편의를 위해 제공되었고 결코 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 또한, 특정 이론이 본 발명에 제안되고 개시되나, 이론이 맞거나 틀리든 결코 임의의 특정 이론 또는 실행 계획에 대한 고려 없이 본 발명에 따라 실시되는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
명세서 전체에서, 용어 앞에 사용된 용어 "한"(a)은 용어가 의미하는 것에 데해 하나 이상을 포함하는 실시태양을 포함한다는 것을 당업자가 이해할 것이다. 또한 본 명세서 전체에서, "포함하는"(including), "포함하는"(containing) 또는 "특징으로 하는"(characterized by)"과 동의어인 용어 "포함하는"(comprising)은 포괄적이며 또는 개방적이며 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다는 것을 당업자가 이해할 것이다.
달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명에 기술된 연구는 젖을 뗀 돼지를 사용하였으나, 당업자는 치료된 돼지는 선택적으로 이유식 전 돼지일 수 있다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명에 사용된 "쯤"(around), "약"(about) 또는 "대략"(approximately)은 일반적으로 소정의 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내 및 더욱 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 본 발명에 제공된 수량은 일반적으로 대략적이며; 용어 "쯤"(around), "약"(about) 또는 "대략"(approximately)은 명확하게 언급하지 않는 한 암시될 수 있다는 것을 의미한다.
명세서 전체에서 언급된 모든 참고문헌은 전문이 참조로 본 발명에 포함된다.
청구항의 범위는 실시예에 설명한 바람직한 실시태양에 의해 제한되지 않으나, 전체로서 설명과 일치하는 가장 넓은 해석이 제공되어야 한다.
기탁기관명 : International Depositary Authority of Canada
수탁번호 : IDAC 210105-01
수탁일자 : 20050121
기탁기관명 : International Depositary Authority of Canada
수탁번호 : IDAC 200613-01
수탁일자 : 2013620

Claims (22)

  1. 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주 및 동물에 공급 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    조성물은 동결건조 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    조성물은 동결 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    조성물은 동물의 장(intestine)으로 전달(delivery)되기 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    장으로 전달은 경구 투여를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    동물은 돼지인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 5 항에 있어서,
    동물은 이유 후(post-weaning) 돼지인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    조성물은 F4 섬모를 발현하는 분리된 살아있는 비 병원성 대장균을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    F4 섬모를 발현하는 상기 비 병원성 대장균은 2005년 1월21일에 International Depositary Authority of Canada에 기탁하고 등록번호 IDAC 210105-01을 부여받은 균주인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 투여량(dose) 당 적어도 5x107 CFU의 양의 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 투여량(dose) 당 5x106 내지 3x1010 CFU 범위 내의 양의 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 유효량의 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 살아있는 대장균 균주를 포함하는 조성물이 돼지의 장(intestine)으로 전달(delivery)되는 것을 포함하여, F18 병원성 대장균이 돼지의 장에 감염되는 것을 예방하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 장으로 전달은 조성물의 경구 투여에 의해 성취되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 조성물은 동결건조 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 조성물은 동결 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서,
    상기 살아있는 대장균 균주는 동물에 공급 가능한 담체와 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 12 항에 있어서,
    F18 병원성 대장균이 돼지의 장에 감염으로 인해 돼지에서 부종 질환 또는 설사를 일으키는 것인 방법.
  18. 제 12 항에 있어서,
    돼지는 이유 후(post-weaning) 돼지인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 12 항에 있어서,
    조성물은 F4 섬모를 발현하는 분리된 살아있는 비 병원성 대장균을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    F4 섬모를 발현하는 비 병원성 대장균은 2005년 1월21일에 International Depositary Authority of Canada에 기탁하고 등록번호 IDAC 210105-01을 부여받은 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 투여량(dose) 당 적어도 5x107 CFU의 양의 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 투여량(dose) 당 5x106 내지 3x1010 CFU 범위 내의 양의 2013년 6월20일에 International Depositary Authority of Canada(IDAC)에 기탁하고 등록번호 200613-01을 부여받은 분리된 대장균 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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