CN114517181B - 一种人t淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物细胞培养领域，具体公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用，所述无血清培养基包括基础培养基、无血清添加剂、复合脂类和中药单体活性成分；所述无血清添加剂包括：人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素；所述中药单体活性成分包括：黄芪黄酮、黄芪多糖、甘草多糖、丹参多糖、灵芝多糖；该培养基适用于在不额外添加血清或自体血浆的条件下，分离、激活和培养人来源的T淋巴细胞，支持T细胞快速增殖和高密度生长，提高细胞活性，维持相对稳定的细胞表型，优化不同细胞亚型的比例，提高T细胞回输的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物细胞培养领域，具体公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用。
背景技术
免疫细胞治疗也叫过继免疫疗法，是把病人的免疫细胞从血液里面分离出来，在体外用一些细胞因子激活，经过体外培养，使其数量扩增，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体中，以杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。免疫细胞治疗主要包括：树突状细胞诱导的杀伤细胞（DC-CIK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）、树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、T细胞受体基因修饰的T细胞（TCR-T）、嵌合抗原受体修饰的T细胞（CAR-T）等。
目前，CAR-T细胞疗法是国际最前沿的免疫治疗方法之一，它是从人体血液中提取出T淋巴细胞，然后利用基因工程技术在体外嵌入能让T细胞识别特定肿瘤细胞并杀死肿瘤细胞的基因片段，这种CAR-T细胞经过大量扩增培养后成为“加强型”免疫T细胞，最后回输到患者体内进行治疗。经历了30年的研发历程，第四代的CAR-T技术整合了自杀基因编辑、免疫因子改造等各种整合性、精细化调控手段，目前在临床上应用包括治疗血液系统疾病、治疗实体瘤等。
T淋巴细胞（CD3+淋巴细胞）根据表面分子标志物的不同，又可分为诱导/辅助性T淋巴细胞（CD3+CD4+）、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（CD3+CD8+）。CD4+ T细胞可以通过增殖和分泌细胞因子来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞；CD8+ T细胞分泌各种细胞因子参与免疫作用，对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用。早期的CAR-T治疗主要是回输CD8+ T细胞，然而CD8+ T细胞具有很强的细胞毒性的同时却在回输后没有足够的增殖能力，持续作用能力较差。目前普遍同时回输CD4+与CD8+ T细胞，CD4+ T细胞可以提供通过细胞因子和其他信号来维持CD8+ T细胞的增殖和活性。
在CAR-T细胞培养过程中，T细胞无血清培养基提供细胞活化和增殖的直接环境，起到非常重要的作用，在维持T细胞生长的同时还需要支持T细胞的快速扩增，同时CD4+和CD8+ T细胞的比例应维持在相对平衡水平。现有的T细胞无血清培养基，虽然可以提供T细胞的基本生长所需营养，但依旧存在效果不佳的问题，如：1. 无法在完全不添加自体血浆的情况下促进T细胞快速增殖，使得在取用血浆的过程中增加免疫治疗药物受到病原体（细菌、真菌、、支原体、病毒）污染的风险；2. 支持高密度生长能力有限，导致培养基需要量大，增加了成本；3. 不考虑培养后T细胞的CD4+和CD8+亚群比例以及不同亚型的细胞质量，导致回输后效果维持时间短等问题。
因此，研发出一种可以刺激和支持T淋巴细胞快速扩增、高密度生长、细胞表型（CD4+/CD8+亚群比例）相对稳定的无血清培养基是十分必要的。
发明内容
针对上述情况，本发明公开了一种人T淋巴细胞无血清培养基及其制备方法和应用，本发明所述培养基适用于在不额外添加血清或自体血浆的条件下，分离、激活和培养人来源的T淋巴细胞，支持T细胞快速增殖和高密度生长，提高细胞活性，维持相对稳定的细胞表型，优化不同细胞亚型的比例，提高T细胞回输的效果。
本发明的技术方案如下：
一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述无血清培养基包括基础培养基、无血清添加剂、复合脂类和中药单体活性成分；
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述无血清添加剂包括：人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素；
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述中药单体活性成分包括：黄芪黄酮、黄芪多糖、甘草多糖、丹参多糖、灵芝多糖。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，黄芪黄酮的含量为0.5-2mg/L；黄芪多糖的含量为5-15mg/L；甘草多糖的含量为0.5-2mg/L；丹参多糖的含量为3-10mg/L；灵芝多糖的含量为3-10mg/L。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述基础培养基由α-MEM、IMDM、RPMI 1640、DMEM/F-12、F-12K中的两种或三种按一定比例混合而成；优选的，将α-MEM、IMDM和F-12K按照1:1:1的体积比例混合均匀； 或者将RPMI 1640和DMEM/F-12按照1:1的体积比例混合均匀。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述复合脂类包括花生四烯酸、胆固醇、亚油酸、亚麻酸、棕榈油酸、硬脂酸、乙醇胺。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述的复合脂类包括0.01-0.1mg/L花生四烯酸、0.05-0.5mg/L胆固醇、0.1-0.5mg/L亚油酸、0.1-10mg/L亚麻酸、0.05-0.2mg/L棕榈油酸、0.02-0.2mg/L硬脂酸、0.5-4mg/L乙醇胺。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述无血清添加剂包括人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素、地塞米松、钼酸钠二水、氯化镍、二氯化锰四水、亚硒酸钠、精胺盐酸盐、R848、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、三碘甲状腺原氨酸、Pluronic™ F-68。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基，所述的人血白蛋白的含量为2-5mg/L；人转铁蛋白的含量为0.3-20mg/L；重组人胰岛素的含量为0.6-30mg/L；地塞米松的含量为0.0001-0.001mg/L；钼酸钠二水的含量为0.2-0.8mg/L；氯化镍的含量为0.05-0.2mg/L；二氯化锰四水的含量为0.06-0.2mg/L；亚硒酸钠的含量为5-10mg/L；精胺盐酸盐的含量为0.04-1mg/L；R848的含量为0.1-1mg/L；L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的含量为0.02-10mg/L；三碘甲状腺原氨酸的含量为0.002-0.02mg/L；Pluronic™ F-68的含量为0.1-10mg/L。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基的制备方法，包括以下步骤，先将人血白蛋白、人转铁蛋白、重组人胰岛素加入到基础培养基中溶解，再加入提前用乙醇溶解的复合脂类，再加入剩下的成分，充分溶解混匀后过滤除菌后即可得到所述人T淋巴细胞无血清培养基。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基的应用，所述应用为在不添加血清的情况下培养人外周血来源的T淋巴细胞，促进T淋巴细胞的体外激活和高效扩增。
进一步的，上述一种人T淋巴细胞无血清培养基在制备用于CAR-T细胞疗法中的培养基中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
第一，本发明人T淋巴细胞无血清培养基含有T细胞生长所需的全部营养成分，包括蛋白、脂类、微量元素、抗氧化剂、多胺、激素、细胞保护剂等，可以在不添加自体血浆的情况下满足T细胞生长的营养需求，提高T细胞活性，促进T细胞快速增殖，简化操作步骤，减少血浆处理和添加操作中引入微生物的风险，避免因血浆带来的细胞毒性和批次间差异。
第二，本发明人T淋巴细胞无血清培养基成分配比科学，支持T细胞高密度生长（大于7×106cells/ml），维持细胞90%以上的活率，可以减少培养基的使用量，从而降低细胞生产的成本。
第三，本发明人T淋巴细胞无血清培养基中添加的中药单体活性成分可以对T细胞进行免疫学干预。体外实验及肿瘤动物模型的研究显示，黄芪黄酮能够增加荷瘤小鼠脾脏CD4/CD8比值；黄芪多糖可以通过重建细胞因子平衡和减少Foxp3表达来抑制调节性T细胞（Treg细胞）细胞的增殖；甘草多糖能够减少Foxp3的表达，下调Treg细胞比例，同时上调Th1与Th2细胞的比例；丹参多糖能够显著刺激CD3+ T细胞增殖，促进抗炎因子IL-2、IL-4和IL-10的分泌，抑制促炎因子IL-6和TNF-α的分泌，同时增强细胞毒性T细胞功能；灵芝多糖可以提高Treg细胞与效应T细胞的比例，减少Treg细胞对效应T细胞的抑制作用，同时也可增加IL-2的分泌。在培养基中添加上述中药单体活性成分后，最终获得的T细胞群体中CD4+和CD8+亚群比例相对平衡，且提高细胞毒性T细胞的活性，抑制Treg细胞的增殖，优化细胞亚型的比例，提高细胞质量，促进T细胞回输之后的免疫应答，使效果维持时间更长。
本发明符合临床应用需求，有助于提高国内细胞治疗产品生产过程的安全性和高效性。
附图说明
图1为本发明实施例1与对照培养基培养人外周血来源T细胞14天生长曲线结果图；
图2为本发明实施例1与对照培养基培养人外周血来源T细胞14天后扩增倍数与存活率结果图；
图3为本发明实施例1与对照培养基高密度培养人T细胞72小时后细胞数与存活率结果图；
图4为本发明实施例1与对照培养基培养人外周血来源T细胞14天后细胞表面标志物流式结果图；
图5为本发明实施例1与对照培养基培养人外周血来源T细胞14天后CTL细胞因子检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购获得的常规试剂产品。
实施例1
制备例
人T淋巴细胞无血清培养基1L使用量的配制方法：
1、配制培养基基础A溶液：将α-MEM、IMDM和F-12K按照1:1:1的体积比例混合均匀，制成培养基基础A溶液。
2、配制1ml复合脂类B溶液：在0.8ml无水乙醇溶液中依次加入0.025mg花生四烯酸、0.5mg胆固醇、0.28mg亚油酸、0.4mg亚麻酸、0.14mg棕榈油酸、0.15mg硬脂酸、2.6mg乙醇胺，完全溶解后用无水乙醇定容至1ml。
3、取800ml A溶液，向其中依次加入人血白蛋白3mg、人转铁蛋白15mg、重组人胰岛素30mg，充分溶解后再加入1ml B溶液，混合均匀。
4、再向其中加入地塞米松0.0005mg、钼酸钠二水0.65mg、氯化镍0.1mg、二氯化锰四水0.08mg、亚硒酸钠7mg、精胺盐酸盐0.08mg、R848 0.45mg、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐1.2mg、三碘甲状腺原氨酸0.015mg、Pluronic™ F-68 6mg、黄芪黄酮1.3mg、黄芪多糖8mg、甘草多糖1.5mg、丹参多糖5mg、灵芝多糖3mg。
5、充分溶解后，用盐酸调节pH至7.0，再用A溶液定容至1L，然后采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，装于灭菌的1L试剂瓶中，即得到人T淋巴细胞无血清培养基。
实施例2
制备例
人T淋巴细胞无血清培养基1L使用量的配制方法：
1、配制培养基基础A溶液：将α-MEM、IMDM和DMEM/F-12按照1:1:1的体积比例混合均匀，制成培养基基础A溶液。
2、配制1ml复合脂类B溶液：在0.8ml无水乙醇溶液中依次加入0.05mg花生四烯酸、0.2mg胆固醇、0.15mg亚油酸、4mg亚麻酸、0.08mg棕榈油酸、0.05mg硬脂酸、1mg乙醇胺，完全溶解后用无水乙醇定容至1ml。
3、取800ml A溶液，向其中依次加入人血白蛋白2.5mg、人转铁蛋白20mg、重组人胰岛素20mg，充分溶解后再加入1ml B溶液，混合均匀。
4、再向其中加入地塞米松0.001mg、钼酸钠二水0.4mg、氯化镍0.05mg、二氯化锰四水0.1mg、亚硒酸钠5mg、精胺盐酸盐0.05mg、R848 0.2mg、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐4mg、三碘甲状腺原氨酸0.02mg、Pluronic™ F-68 1mg、黄芪黄酮0.9mg、黄芪多糖15mg、甘草多糖2mg、丹参多糖8mg、灵芝多糖5mg。
5、充分溶解后，用盐酸调节pH至7.0，再用A溶液定容至1L，然后采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，装于灭菌的1L试剂瓶中，即得到人T淋巴细胞无血清培养基。
实施例3
制备例
人T淋巴细胞无血清培养基1L使用量的配制方法：
1、配制培养基基础A溶液：将RPMI 1640和DMEM/F-12按照1:1的体积比例混合均匀，制成培养基基础A溶液。
2、配制1ml复合脂类B溶液：在0.8ml无水乙醇溶液中依次加入0.01mg花生四烯酸、0.5mg胆固醇、0.3mg亚油酸、2.5mg亚麻酸、0.2mg棕榈油酸、0.05mg硬脂酸、3.5mg乙醇胺，完全溶解后用无水乙醇定容至1ml。
3、取800ml A溶液，向其中依次加入人血白蛋白5mg、人转铁蛋白15mg、重组人胰岛素25mg，充分溶解后再加入1ml B溶液，混合均匀。
4、再向其中加入地塞米松0.001mg、钼酸钠二水0.25mg、氯化镍0.2mg、二氯化锰四水0.18mg、亚硒酸钠6mg、精胺盐酸盐0.05mg、R848 0.7mg、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐8mg、三碘甲状腺原氨酸0.005mg、Pluronic™ F-68 1mg、黄芪黄酮0.7mg、黄芪多糖5.5mg、甘草多糖0.8mg、丹参多糖3mg、灵芝多糖3mg。
5、充分溶解后，用盐酸调节pH至7.0，再用A溶液定容至1L，然后采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，装于灭菌的1L试剂瓶中，即得到人T淋巴细胞无血清培养基。
实施例4
细胞学实验例
为了评估本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基对人外周血T淋巴细胞的培养效果，采用实施例1所述的人T淋巴细胞无血清培养基和两种市售的国外品牌同类培养基（对照1：GibcoCTS™ OpTmizer™ T Cell Expansion SFM；对照2：Lonza X-VIVO™ 15），在相同的实验条件下进行人外周血PBMC分离的T细胞的激活和扩增，具体步骤如下：
使用Ficoll密度离心法从人外周血中分离PBMC，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤3次，用人T淋巴细胞无血清培养基重悬，进行细胞计数；
根据计数结果用人T淋巴细胞无血清培养基将细胞密度调整到1×106cellls/ml，然后将细胞接种到培养皿中，并添加终浓度为10μg/ml的CD3抗体、5μg/ml的CD28抗体、100IU/ml的IL-2；
置于37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养；
从第3天起，每2-4天进行细胞计数，计算细胞数、存活率，然后根据计数结果补充新鲜的含有100IU/ml IL-2的人T淋巴细胞无血清培养基，使活细胞密度调整到1×106cells/ml，并继续置于37℃，5％二氧化碳培养箱中静置培养；
在培养的第14天进行细胞计数，计算细胞数、存活率和扩增倍数，并用流式细胞仪对细胞表面标志物CD3、CD4和CD8的表达情况进行检测；
离心收集细胞，即得到扩增后的T淋巴细胞，后续可进行冻存或回输至患者体内。
按照以下方法评估本发明人T淋巴细胞无血清培养基的效果：
1. 为了检测本发明人T淋巴细胞无血清培养基支持T细胞增殖情况，按照上述步骤，分别使用实施例1制得的人T淋巴细胞无血清培养基和两种对照培养基培养同一外周血细胞样品14天后，按照细胞数绘制生长曲线，结果如附图1所示。计算扩增倍数和细胞存活率，结果如附图2所示。
2. 为了检测本发明人T淋巴细胞无血清培养基支持T细胞高密度培养情况，分别使用实施例1制得的人T淋巴细胞无血清培养基和两种对照培养基培养同一T细胞样品，以2×106cells/ml接种，培养72小时后进行细胞计数，检测细胞数和存活率，结果如附图3所示。
3. 为了检测本发明人T淋巴细胞无血清培养基维持细胞表型和调节细胞亚型比例的情况，按照上述步骤，分别使用实施例1制得的人T淋巴细胞无血清培养基和两种对照培养基培养同一外周血细胞样品14天后，用流式细胞仪对细胞表面标志物CD3、CD4、CD8、CD25、FOXP3的表达情况进行检测，结果如附图4所示。并用ELISA方法分析干扰素7（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）这类细胞因子的释放，以评价细胞毒性T细胞的功能，结果如附图5所示。
图1和图2结果显示，在不添加血清或自体血浆的条件下，与对照培养基相比，使用本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基激活和培养T细胞14天期间，T细胞增长速度更快，14天收获细胞时细胞倍增倍数和存活率更高。说明在不添加血清或自体血浆的情况下本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基可以提高T细胞活率，促进T细胞的快速增殖。
图3结果显示，以较高细胞密度接种T细胞，使用本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基72小时可以使T细胞增长至7×106cells/ml以上，并且可以维持90%以上的存活率。说明本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基可以有效支持T细胞的高密度生长。
图4结果显示，在不添加血清或自体血浆的条件下，使用本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基激活和培养T细胞14天后，CD3+T细胞比例可以达到95%以上，比对照培养基更高；CD3+/CD4+与CD3+/CD8+的百分比例更接近；CD4+/CD25+的比例更低。说明本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基收获的T细胞纯度更高，并且可以使T细胞群体中CD4+（辅助性T细胞）和CD8+（细胞毒性T细胞）亚群比例相对平衡，抑制Treg细胞（CD4+/CD25+/FOXP3+）的增殖，优化细胞亚型的比例，从而促进T细胞回输之后的持续作用。
图5结果显示，在不添加血清或自体血浆的条件下，使用本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基激活和培养T细胞14天后，通过ELISA方法测得的IFN-γ和TNF-α释放量比对照更多。说明本发明所述的人T淋巴细胞无血清培养基可以促进细胞毒性T细胞功能性细胞因子的分泌，提高细胞毒性T细胞的活性，从而增强T细胞回输之后的杀伤作用
综合以上实施例可知，本发明所述的培养基适用于在不额外添加血清或自体血浆的条件下，分离、激活和培养人来源的T淋巴细胞，支持T细胞快速增殖和高密度生长，提高细胞活性，维持相对稳定的细胞表型，优化不同细胞亚型的比例，提高T细胞回输的效果。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (3)
1.一种人T淋巴细胞无血清培养基，其特征在于，由以下步骤制备：
1）配制培养基基础A溶液：将α-MEM、IMDM和F-12K按照1:1:1的体积比例混合均匀，制成培养基基础A溶液；
2）配制1ml复合脂类B溶液：在0.8ml无水乙醇溶液中依次加入0.025mg花生四烯酸、0.5mg胆固醇、0.28mg亚油酸、0.4mg亚麻酸、0.14mg棕榈油酸、0.15mg硬脂酸、2.6mg乙醇胺，完全溶解后用无水乙醇定容至1ml；
3）取800ml A溶液，向其中依次加入人血白蛋白3mg、人转铁蛋白15mg、重组人胰岛素30mg，充分溶解后再加入1ml B溶液，混合均匀；
4）再向其中加入地塞米松0.0005mg、钼酸钠二水0.65mg、氯化镍0.1mg、二氯化锰四水0.08mg、亚硒酸钠7mg、精胺盐酸盐0.08mg、R848 0.45mg、L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐1.2mg、三碘甲状腺原氨酸0.015mg、Pluronic F-68 6mg、黄芪黄酮1.3mg、黄芪多糖8mg、甘草多糖1.5mg、丹参多糖5mg、灵芝多糖3mg；
5）充分溶解后，用盐酸调节pH至7.0，再用A溶液定容至1L，然后采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤除菌，装于灭菌的1L试剂瓶中，得到人T淋巴细胞无血清培养基。
2.如权利要求1所述的人T淋巴细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述应用为在不添加血清的情况下培养人外周血来源的T淋巴细胞。
3.如权利要求1所述的T淋巴细胞无血清培养基在制备用于CAR-T细胞疗法中的培养基中的用途。
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