CN104371972A

CN104371972A - 一种无动物源性和人源性成分t淋巴细胞培养基及其制备方法

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Publication number: CN104371972A
Application number: CN201310351472.7A
Authority: CN
Inventors: 谢志明; 武宁
Original assignee: IMPROVING LIFE BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) Co Ltd
Current assignee: IMPROVING LIFE BIOTECHNOLOGY (SHANGHAI) Co Ltd
Priority date: 2013-08-12
Filing date: 2013-08-12
Publication date: 2015-02-25
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: CN104371972B

Abstract

本发明属于体外细胞培养技术领域，涉及一种用于培养T淋巴细胞的培养基，该培养基包括基础培养基以及用于替代人或牛血清的添加剂，所述添加剂包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、胆固醇、油酸、亚油酸等。本发明的培养基优于现有培养基表现在以下几个方面：一是本发明的培养基解决了人源性成分和动物源性成分安全性的问题；二是本发明的培养基比对比培养基培养的T淋巴细胞有更高的增值倍数。

Description

一种无动物源性和人源性成分T淋巴细胞培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种用于培养人类T淋巴细胞的培养基配方及其制备方法。

背景技术

T细胞是淋巴细胞的主要组分之一，它具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助其它淋巴细胞发挥功能，对特异性抗原或促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等，是身体抵御疾病感染、防止肿瘤形成的主要免疫细胞之一。在体外富集、活化、扩增这类免疫细胞，可用于回输治疗多种疾病，包括恶性肿瘤、感染、自身免疫病等，在这个过程中，需要用到一种可以在体外支持T细胞存活和扩增的培养基。

T细胞在体外存活和扩增需要的营养物质包括：氨基酸、维生素、糖、脂质、无机盐、生长因子等。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清等。使用牛血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用牛血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生，而且牛血清并不能很好的支持人T淋巴细胞的生长(Imir，P等，Clin.Immunol.Immunopath.，36：289-296(1985))。使用人AB血清的可以很好的支持人T淋巴细胞的生长，但是人AB血清来源困难，供应量有限，而且也存在传播疾病的风险。因此，以临床应用为目的T淋巴细胞培养基中应尽量避免使用动物来源和人体来源的原料。

戴育成(申请公布号：CN102191215A)发明了一种用于培养CIK细胞的人源性无血清培养基，培养基中含有多种人血来源的成分，包括人白蛋白、人转铁蛋白、人胆固醇、人过氧化氢酶等，证实可以培养和诱导CIK细胞，优于有血清培养基。任秀宝(授权公告号：CN1261562C)发明了一种用于培养淋巴细胞的无血清培养基，培养基中含有动物来源或人体来源的转铁蛋白，证实培养基的培养效果与含2％人血清的培养基相当。Invitrogen公司生产的用于体外淋巴细胞培养的培养基AIM-V也含有人体来源的人血白蛋白和人转铁蛋白。Invitrogen公司的另一款用于体外培养T淋巴细胞的培养基Optmizer也只是不含有动物来源的成分，但还是含有人体来源的人血白蛋白和人转铁蛋白。这些培养基中都或多或少地添加了动物来源或人血来源的成分，虽然有严格的检测和病毒灭活的处理，但是还是存在一定的安全性隐患。

综上所述，作为治疗用的T淋巴细胞的培养基，应该有以下几个特点：安全、稳定、廉价等。本发明着力于解决上述问题，提供了一种更加安全，质量更稳定且成本低廉的T淋巴细胞培养基，而且其培养人T淋巴细胞的效果与含人血清的培养基相当，部分指标优于含人血清培养基。

发明内容

本发明涉及到一种用于培养T淋巴细胞的无血清培养基的组成成分和制备方法。为达到提高安全性的目的，避免任何因为使用含动物来源的成分或人体来源的成分可能带入的传染性疾病，本培养基所使用的所有原料均为非动物源性的原料和非人体来源的原料。本培养基通过上述方法改进，安全性优于以往的T细胞培养基，同时培养效果得到进一步提升。

具体来说，本发明由以下部分组成：

一种用于体外培养T淋巴细胞的培养基，培养方法包括但不限于以下几个方面：

a)T细胞的获取：T细胞可以来源于外周血、淋巴组织、骨髓、肿瘤组织、胸腹腔积液等部位，在此过程中，为防止凝血，可加入肝素或枸橼酸做抗凝剂。

b)T细胞的分离：取自上述部位的细胞种类繁多，如有必要可进一步提纯和分离得到纯度更高的T细胞，常用的分离方法包括Ficoll密度梯度离心法、免疫磁珠吸附法、贴壁吸附法、裂解法等。

c)T细胞的培养：将细胞悬液用培养基配成细胞浓度每毫升10万个到500万个，接种到培养容器中，加入T细胞刺激因子，常用的包括IL-2、抗CD3单抗、IFN-r、抗CD28单抗、植物血凝素、抗原递呈细胞等，于37度、5％二氧化碳细胞培养箱培养扩增，一般培养7-30天。扩增倍数和杀瘤活性受培养基、刺激因子、细胞来源、氧气等因素的影响。

d)T细胞的鉴定：一般采用流式细胞术检测，T细胞包括CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+等细胞群。

本培养基由于在上述培养方法中，可以特异地支持T细胞的扩增和长期存活，表现为培养后，含有T细胞表型的细胞比例增加，细胞总数增加，因此用作T细胞的培养基。

本发明内容中涉及到一种用于扩增活化T淋巴细胞的培养基，这种培养基的优点在于它不含有任何动物来源和人体来源的成分，因此有更高的安全性。

本发明中，基础培养基采用了IMDM培养基、DMEM/F12培养基按照一定的比例混合而成，相比于采用他们任何单一一种基础培养基，培养效果更好，细胞的增值速度更高，细胞密度更高。

本发明的培养基中，特别添加了少量与淋巴细胞相同来源的个体的血清或者热灭活血浆。与不添加血清或血浆相比，可以显著地提高T淋巴细胞的存活率和增值速度。

具体来说本培养基由以下几个方面组成：

基础培养基为细胞的生长提供无机盐、氨基酸、维生素、糖类等营养成分，不同的基础培养基提供的上述成分种类和含量有一定的差异。就T细胞培养来说，常用的基础培养基包括：RPMI1640培养基、IMDM培养基、DMEM/F12培养基等。RPMI1640培养基的特点是营养成分比较全面，但是含量比较低，适合于有血清条件下的细胞培养；IMDM培养基属于高营养成分培养基，另外还含有5.958g/L的HEPES和3.024g/L的碳酸氢钠作为PH缓冲剂，PH缓冲能力较强，比较适合于作为无血清培养基的基础培养基；DMEM/F12培养基是DMEM培养基和F12培养基按照1∶1的比例混合的培养基，营养成分比RPMI1640和IMDM都全面，含量也比1640培养基高，但是PH缓冲能力不足，细胞大密度培养时PH变动大。

本发明中，基础培养基采用IMDM培养基、DMEM/F12培养基按照一定的比例混合而成，优选比例为1∶1，获得了一种高营养成分，PH缓冲能力较高的基础培养基，适合于T细胞的高密度、快速扩增培养。混合后培养基的成分如下表：

表一

传统细胞培养基中，除了基础培养基外，还要添加5％-20％的血清。为了替换或减少血清的用量，需要在培养基中添加其它的添加物。一般来说，添加物可分为以下几类：白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、微量元素、脂质等，还有一些添加物是根据细胞的种类不同，添加生长因子、细胞因子、基质等。

本发明中白蛋白使用重组人血白蛋白，此重组人血白蛋白包括但不限于以下产品：转基因水稻种子生产的重组人血白蛋白，代表产品有Invitria公司的Cellastim；转基因酵母表达生产的重组人血白蛋白，代表产品有Novozyme公司生产的albucult^TM rHSA。本发明中白蛋白的使用量为0.5g/L至10g/L。白蛋白的功能取决于它所携带的脂质、微量元素等，人血白蛋白中常见的脂质包括棕榈酸、油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、微量的激素等，常见的微量元素包括Zn、Cu、Ca、Mg、Mn、Cd、Co、Se和Ni等。重组人血白蛋白与人血白蛋白的差别主要是他们携带的上述脂质和微量元素的差别，本发明中根据T细胞的需求添加了部分脂质和微量元素，使重组人血白蛋白的效果达到或超过了人血白蛋白。

本发明中脂质是指胆固醇、油酸、亚油酸。本发明中使用化学合成方法生产的胆固醇，代表产品有SIGMA公司的C1231，使用浓度为0.5mg/L至50mg/L。

本发明中油酸来源于植物，代表产品有SIGMA公司的O1383，使用浓度为0.1mg/L至20mg/L。

本发明中亚油酸来源于植物，代表产品有SIGMA公司的L1012，使用浓度为0.1mg/L至20mg/L。

本发明中锌以硫酸锌或者其水合物的形式添加到培养基中，使用浓度为0.01mg/L至10mg/L。

本发明中铜以硫酸铜的形式添加到培养基中，使用浓度为0.0001mg/L至1mg/L。

本发明中锰以氯化锰或者其水合物的形式添加到培养基中，使用浓度为0.0001mg/L至1mg/L。

本发明中重组人转铁蛋白是使用酵母、植物等为载体生产出来的转基因产品，生产过程中无任何动物来源成分的使用，代表产品有Invitria公司生产的Optiferrin^TM，本发明中其使用浓度为2mg/L至100mg/L。

本发明中重组人胰岛素是使用酵母为载体生产出来的药用级的胰岛素，生产过程中无任何动物来源成分的使用，本发明中其使用浓度为1mg/L至100mg/L。

本发明中乙醇胺的使用浓度为0.1mg/L至20mg/L。

本发明中为预防微生物的污染，添加一定量的庆大霉素，使用浓度为5000IU/L至500000IU/L。

本发明中自体血清或热灭活血浆的使用浓度为5ml/L至50ml/L。

具体实施方式

实施例1：培养基的配置

培养基配置方法

步骤一，配置溶液一：称取2mg胆固醇、油酸2mg、亚油酸2mg溶于1ml无水乙醇中。

步骤二，配置基础培养基：将IMDM培养基和DMEM/F12培养基按照1∶1的比例混合。

步骤三，在上述每一升基础培养基中加入重组人血白蛋白3g，重组人转铁蛋白50mg，重组人胰岛素10mg，溶液一1ml，乙醇胺2mg，硫酸铜0.001mg，硫酸锌0.5mg，氯化锰0.0005mg，庆大霉素10000IU，搅拌使充分溶解，用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节PH值为6.8-7.2之间，0.1um滤膜过滤除菌，分装，4-8度保存。

步骤四，热灭活自体血浆的制备。将无菌保存的血浆置于56摄氏度的水浴中，放置30分钟至45分钟，取出，3000转/分钟离心10分钟，取上清得到热灭活自体血浆。

步骤五，往步骤二中配置的培养基中加入0.5％-5％的自体血浆，得到完全培养基。

实施例2：自体血浆对淋巴细胞增值活性的影响

肝素抗凝采集外周血50ml，3000转离心10分钟，分离血浆和细胞。血浆收集到15ml离心管中，56度水浴灭活处理30分钟，离心去除沉淀，收集上清备用。细胞用使用含1％人血白蛋白生理盐水稀释到原有体积，加入到淋巴细胞分离液上面，密度梯度离心分离外周血单个核细胞。收集界面的细胞，加入含1％人血白蛋白生理盐水1000转离心10分钟，去除上清。设为2组，第一组所用的培养基为实施例1步骤二配置的培养基，第二组所用的培养基为实施例1步骤四配置的培养基，热灭活自体血浆含量为1％。计数细胞，用培养基配成5*10⁵/ml细胞悬液，接种到96孔板内，每组3孔。培养基中加入1000IU/ml IFN-r， 50ng/ml CD3单抗(OKT3)，300IU/ml IL-2。培养7天后，用MTT法测吸光度值。

图1，A：实施例1步骤三配置的培养基；B：实施例1步骤五配置的培养基。

实施例3：人血白蛋白与重组人血白蛋白的对比实验

肝素抗凝采集外周血50ml，3000转离心10分钟，分离血浆和细胞。血浆收集到15ml离心管中，56度水浴灭活处理30分钟，离心去除沉淀，收集上清得到热灭活自体血浆，4度保存备用。细胞用使用含1％人血白蛋白生理盐水稀释到原有体积，加入到淋巴细胞分离液上面，密度梯度离心分离外周血单个核细胞。收集界面的细胞，加入含1％人血白蛋白生理盐水1000转离心10分钟，去除上清。在培养基中加入1％的热灭活自体血浆，制成完全培养基。计数细胞，用完全培养基配成5x10⁵/ml细胞悬液。第1天加入1000IU/ml IFN-r，培养24小时后加入50ng/ml CD3单抗(OKT3)，300IU/ml IL-2。以后每5天计数，补加含300IU/ml IL-2培养液至1*10⁶/ml。培养20天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数。

图2，A：实施例1中用人血白蛋白代替重组人血白蛋白，不添加油酸和亚油酸B：实施例1中白蛋白为重组人血白蛋白

实施例4：与其它淋巴细胞培养基的对比实验

肝素抗凝采集外周血50ml，3000转离心10分钟，分离血浆和细胞。血浆收集到15ml离心管中，56度水浴灭活处理30分钟，离心去除沉淀，收集上清得到热灭活自体血浆，4度保存备用。细胞用使用含1％人血白蛋白生理盐水稀释到原有体积，加入到淋巴细胞分离液上面，密度梯度离心分离外周血单个核细胞。收集界面的细胞，加入含1％人血白蛋白生理盐水1000转离心10分钟，去除上清。在培养基中加入1％的热灭活自体血浆，制成完全培养基。计数细胞，用完全培养基配成5xl0⁵/ml细胞悬液。第1天加入1000IU/ml IFN-r，培养24 小时后加入50ng/ml CD3单抗(OKT3)，300IU/ml IL-2。以后每5天计数，补加含300IU/ml IL-2培养液至1*10⁶/ml。培养20天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数。与市场上现有无血清培养基及含有5％热灭活自体血浆的RPMI1640的培养基做对照。本发明的培养基细胞增殖倍数优于对照培养基。

图3，A：1640+5％热灭活自体血浆B：对照培养基1+1％热灭活自体血浆C：对照培养基2+1％热灭活自体血浆D：本发明无血清培养基+1％热灭活自体血浆

实施例4：淋巴细胞毒性实验

取培养15天的CIK细胞为效应细胞，以Daudi细胞为靶细胞。首先配制效应细胞溶液，取CIK细胞，用IMDM洗2次，用培养基配成1x10⁶/ml细胞悬液。靶细胞daudi细胞用IMDM洗一次，配成1x10⁵/ml细胞悬液。按效靶比10∶1接种到96孔板内，同时设置效应细胞孔和靶细胞孔，每组3个复孔，37度5％C0₂培养24小时。用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。

杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/靶细胞孔

结果，用本发明的培养基培养的CIK杀伤活性与对照无血清培养基培养的CIK细胞相当。

图4，A：1640+5％热灭活自体血浆B：对照培养基1+1％热灭活自体血浆C：对照培养基2+1％热灭活自体血浆D：本发明无血清培养基+1％热灭活自体血浆。

Claims

1.一种T淋巴细胞培养基，主要成分包括基础培养基以及用于替代人或牛血清的添加剂，其特征在于所述替代人或牛血清的添加剂包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白以及重组人胰岛素、胆固醇、油酸、亚油酸、乙醇胺、硫酸铜、硫酸锌、氯化锰、庆大霉素等。

2.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞培养基，其特征在于所述T淋巴细胞培养基中重组人血白蛋白的浓度为0.5g/L-5g/L，重组人转铁蛋白的浓度为5mg/L-100mg/L，重组人胰岛素的浓度为1mg/L-100mg/L，胆固醇的浓度为0.5mg/L-50mg/L，油酸的浓度为0.1mg/L-20mg/L，亚油酸的浓度为0.1mg/L-20mg/L，硫酸铜的浓度为0.0001mg/L-1mg/L，硫酸锌的浓度为0.01mg/L-10mg/L，氯化锰的浓度为0.0001mg/L-1mg/L，乙醇胺浓度为0.1mg/L-20mg/L，庆大霉素浓度为1IU/ml-100IU/ml。

3.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞培养基，其特征在于所述基础培养基为IMDM培养基、DMEM/F12培养基按照1∶1的比例混合而成。

4.根据权利要求1所述的一种T淋巴细胞培养基，其特征在于所述T淋巴细胞培养基还包括0.5-5％的与淋巴细胞来自同一个个体的血清或热灭活血浆。