CN104189898A - 铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法。本发明要解决的技术问题是现有的处于研发及临床试验阶段铜绿假单胞菌疫苗保护效力低，对机体的毒性大，难以治愈感染而不能满足临床免疫需求的问题。本发明解决上述问题的技术方案是提供一种新型疫苗的制备方法。该方法包括以下步骤：首先获取铜绿假单胞菌菌体，然后射线辐照细菌得到铜绿假单胞菌疫苗。本发明提供的疫苗不仅用来预防疾病，也可以应用与治疗疾病，具有好的应用前景。

Description

铜绿假单胞菌疫苗及其制备方法

技术领域

本发明是涉及生物技术领域，具体涉及一种细菌疫苗及其制备方法。

技术背景

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，其对外界各种环境及灭活措施抵抗力较强，尤其在潮湿的环境中可长期生存。土壤、水、空气、人和动物的皮肤、粘膜、肠道及上呼吸道等多处都有该菌存在。其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力降低下的病人，如大面积烧伤，长期使用免疫抑制剂、肿瘤、低蛋白血症患者等。铜绿假单胞菌引起的感染可发生在人体任何部位，临床上常见的有皮肤和皮下组织感染，中耳炎、脑膜炎、呼吸道感染、尿道感染、败血症等。据近年的调查报告，院内感染中30％以上都是由铜绿假单胞菌引起的。对于铜绿假单胞菌引起的感染主要靠药物治疗，而近些年抗生素的广泛应用产生了大量的耐药菌株进一步加剧了铜绿假单胞菌对患者的威胁。目前已经研究成熟的铜绿假单胞菌对抗生素的耐药机制包括以下几方面：①细菌外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位；②铜绿假单胞菌细胞通过主动外排过程，可将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外；③改变抗生素的作用靶点青霉素结合蛋白(PBPs)的数量或结构，以降低药物与PBPs的亲和力，从而产生固有耐药；④质粒或染色体介导的beta-内酰胺酶使抗生素失活。所以目前铜绿假单胞菌的感染已经到了无抗生素可用的阶段，通过免疫方式预防及控制铜绿假单胞菌感染已是大势所趋。

疫苗是一种能刺激机体免疫系统，活化T和B淋巴细胞产生特异性针对靶抗原(病毒、细菌等)的抗体或者免疫细胞的物质。经典的疫苗起源于抗感染免疫，即采用处理过的病原微生物，特别是细菌及其衍生物作为抗原，促使机体产生体液免疫反应以预防感染性疾病。目前全世界研究的铜绿假单胞菌疫苗制备方式已经涉及多个技术层面，如热或者甲醛处理的死菌疫苗，减毒疫苗，亚单位疫苗，单一组分(菌毛、鞭毛、外膜蛋白OprI/OprF等)疫苗等。在基础实验中，单一组分疫苗得了较好的预防效果，但由于抗原成分单一，只能针对单一的疾病(如肺炎等)的感染。灭活(热、甲醛等)或者减毒(基因突变)的全菌体疫苗抗病谱相对扩大，但由于制备过程某些未知抗原成分的灭活，细菌代谢活性降低，造成免疫原性及预防效果较差，且由于灭活不彻底，造成疫苗残留毒性较大。关于全菌体疫苗的研发已经在众多种属细菌(志贺菌，淋球菌，脑膜炎双球菌等)中实施，但这些疫苗均已失败而告终，可想而知制成有效的全菌体疫苗是非常困难的，而目前研制的铜绿假单胞菌疫苗也依旧存在较大的局限性。理想的铜绿假单胞菌疫苗是尽可能的包括所有潜在致病抗原成分，对机体无潜在威胁毒性，能够针对不同血清型品种均有较好预防效果的低毒性全菌体疫苗。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有的全菌体疫苗保护效力低，对机体的毒性大，难以治愈感染而不能满足临床免疫需求的问题，提供的一种新的铜绿假单胞菌全菌体疫苗及其制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案是提供一种铜绿假单胞菌疫苗的制备方法。该方法包括以下步骤；首先获取铜绿假单胞菌菌体；然后射线辐照细菌得到铜绿假单胞菌细菌疫苗。

其中，上述方法中所获取的细菌菌体是处于对数生长期的细菌菌体。

进一步的，上述方法包括以下步骤：

(1).获取用于制备疫苗的铜绿假单胞菌细菌株；

(2).增殖细菌：将步骤(1)获取的细菌株接种在适宜培养基中培养，使细菌处于对数增长期；

(3).收集菌体：收集步骤(2)得到的含有菌体及基质成分的培养基，离心并收集离心沉淀物；

(4).射线处理：将上述净化处理的离心沉淀物重悬成细菌悬液，移至非金属容器中，用射线辐照细菌悬液；

(5).调节菌体浓度：将步骤(4)得到的射线辐照后的细菌悬液再次重悬，调节为最终使用目标细菌浓度，即得到铜绿假单胞菌疫苗

优选的，上述方法在第(4)步射线处理前或者后，还进行纯化菌体的步骤。纯化菌体是为了去除有培养基及相应细菌胞外分泌物。纯化步骤可以使用各种不引起机体过敏反应的溶剂进行洗涤。优选方案为无菌生理盐水或者PBS洗涤。集菌纯化步骤也以使用如浓缩、过柱收集法等本领域常用方法。

其中，上述方法中所述的射线辐照为使细菌失去增殖活性且代谢活性保留。

其中，上述方法中所述的所述细菌失去增殖活性是指在适宜培养基上培养24-48小时，无菌落产生；所述代谢活性保留是指用细胞活性检测试剂检测其代谢活性与未接受过辐照的对照组细菌相比不低于正常活性的50％。一般使用辐照后代谢活性为与未接受过辐照的对照组细菌相比的50％-70％的铜绿假单胞菌。

其中，上述方法中所述的射线辐照所使用的射线为X射线、gamma射线或同位素放射源Co⁶⁰产生的射线。

其中，上述方法中所述的射线辐照的总剂量为：3300-3500Gy。优选的剂量为3400Gy。

其中，上述方法中射线辐照的方式为低剂量，长时间，间断照射。

其中，上述方法中射线辐照的方式为每照射20-25分钟，停止4-5分钟，进行循环照射：剂量为8-9Gy/min，照射6.2-7.3小时。

本发明还提供了一种由上述方法制备的细菌疫苗。

进一步的，上述细菌疫苗，还含有免疫佐剂。

其中，上述细菌疫苗的剂型为皮下注射制剂、肌注注射制剂、口服或鼻腔吸入制剂等常用的剂型。

同时，本发明还提供了上述的细菌疫苗在制备治疗铜绿假单胞菌引起的感染性疾病的药物中的用途。

其中，上述铜绿假单胞菌引起的感染性疾病包括肺炎、败血症、角膜炎、皮肤软组织感染等中的至少一种。

本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗由经射线辐照处理的铜绿假单胞菌全菌体组成。且射线辐照处理使细菌丧失增殖能力，但仍保留代谢活性，因此保留了绝大部分免疫原性，机体可针对免疫原刺激产生强有效的免疫反应，即足够的体液及细胞免疫预防及治疗由铜绿假单胞菌引起的感染，同时也有足够的安全性。

本发明提供的疫苗制备方法不仅用来预防疾病，也可以应用与治疗疾病。具体而言，针对正常的动物或者人体，使用本专利制备的疫苗可以增强机体的预防和抗病能力，达到预防疾病的目的；对于患有相应疾病或者感染的动物和人体，本疫苗可以诱导机体产生特定的针对致病因素的反应，快速有效的消灭病原体，达到治疗疾病和病患的目的。

本发明的有益效果在于：该疫苗是一种全菌体灭毒疫苗，但是保留了分泌细胞外基质及毒性分子的能力，最大程度的保留并发挥了铜绿假单胞菌的抗原特性，可以激发机体的固有免疫及适应性免疫应答机制，增强机体的免疫反应，产生足够的抗体及细胞免疫分子对抗潜在的感染病菌。同时也具有足够的安全性。

附图说明

图1、疫苗制备流程示意图。

图2、射线处理后细菌增殖能力变化图(1拉德＝0.01戈瑞Gy)。

图3、射线处理后细菌代谢活性变化图。

图4、小鼠免疫后生存保护效果图(5×10⁷激发)。

图5、小鼠免疫后生存保护效果图(10⁸激发)。

图6、小鼠免疫后中性粒细胞募集比例图。

具体实施方式

本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗由经射线辐照处理的铜绿假单胞菌全菌体组成。且射线辐照处理使细菌丧失增殖能力，但仍保留代谢活性，因此保留了绝大部分免疫原性，机体可针对免疫原刺激产生强有效的免疫反应，即足够的体液及细胞免疫预防及治疗由铜绿假单胞菌引起的感染。同时也具有足够的安全性。

具体而言，要首先培养获取的铜绿假单胞菌样品，反复离心纯化后重悬调节菌体浓度至10¹⁰/ml，此疫苗悬液接受低剂量长时间射线辐射后进一步验证细菌在保留代谢活性的情况下丧失增殖能力，从而得到疫苗制品。

实验证明，该方法制备的疫苗0.1ml皮下接种免疫小鼠，分别在7、14天追加等量接种。在第28天，小鼠腹腔感染活菌(10倍半数致死量LD50)，结果显示接种了本疫苗的小鼠与对照组相比，生存率明显提高，生存保护试验及结果见下述具体实施例。

更具体而言，参见图1所示，本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗的一个典型的具体的制备方法为：

(1).获取细菌样品。此细菌样品包括但不限于临床样品菌株、商品化菌株、实验室改造的菌株。

(2).增殖细菌：将步骤(1)获取的细菌接种在适宜培养基中培养，使细菌处于对数增长期。

(3).收集菌体：收集步骤(2)得到的含有菌体及基质成分的培养基，离心并收集离心沉淀物。

(4).纯化菌体：将离心沉淀物重悬，混匀后再次离心收集离心沉淀物。重复此步骤至少3次，保证离心沉淀物中全为菌体，而不含有培养基及相应细菌分泌物等，减少疫苗受体的过敏反应。

(5).射线处理：将上述净化处理的离心沉淀物重悬后移置非金属容器中，射线辐照细菌悬液。

(6).调节菌体浓度：将步骤(5)得到的细菌悬液再次重悬，调节为最终使用目标细菌浓度，即得到目标铜绿假单胞菌细菌疫苗。

(7).疫苗储存：将上述步骤(6)得到的细菌疫苗保存备用，优选方案为-20℃或者-80℃。

下面具体对本发明疫苗的制作工序及免疫方法进行更加进一步的具体说明。

关于菌体扩增培养条件，具体培养条件(培养基、时间、温度、转速)可根据具体情况适当调整，而不仅限于实施例的条件。

培养基只要是适合菌体增殖的种类即可，而不限于本发明实施例中所涉及的培养基种类。优选培养基可使用实施例中的培养基。

培养的温度为细菌适宜生长的温度，一般是在35-37℃。优选为37℃。

对PH范围没有特殊限定，只要在菌体不会死亡的酸性或者碱性条件下均能够培养。培养细菌的摇床优选转速为220r/min，优选培养时间为16-18h。

本发明对菌体进行增菌时，根据需要测定细菌数量，以确认培养进度。菌体数量可以吸光度OD或者浊度进行反应，也可以使用PCR的DNA复制数确定，也可以使用其他的本领域常用方法。

本发明细菌培养后，要对收集得到的菌体进行纯化。纯化步骤可以使用各种不引起机体过敏反应的溶剂进行洗涤。优选方案为无菌生理盐水或者PBS洗涤。集菌纯化步骤也以使用如浓缩、过柱收集法等本领域常用方法。而纯化步骤的实施，可以在辐照前，也可以在辐照后。或者在辐照前后均实施。

本发明射线辐照所用的射线，可以使用如X射线，gamma射线，同位素放射源射线Co⁶⁰的射线等种类进行，当然也可以使用本领域常用的其它辐照源进行。

本发明射线辐照的优选操作方案为低剂量长时间照射，如8Gy/min，每照射20分钟停止5分钟，间断照射7.08小时，总射线剂量为3400Gy。

细菌接受的辐射总剂量以满足以下要求为准：

使辐照处理后的细菌具有2个特点：①无增殖能力；②代谢活性保留。

而检测处理后的菌体是否有上述特点的检测方法可以使用本领域的以后方法。同时，本发明提供优选的检测方法：

①无增殖能力的检测

取出辐照处理后的细菌用无菌生理盐水或者PBS稀释，然后用细菌推棒均匀涂布在LB或者TSA琼脂平板上，37℃孵箱培养24h，观察没有菌落产生，即确定细菌无增殖能力。

②代谢活性保留的检测

取出辐照处理后的细菌制成悬液培养于于96孔细胞培养板中，加入细胞活性检测剂(如阿尔马兰，MTT，CCK-8等)，放入37℃孵箱，在检测剂的说明书推荐时间点和测OD₅₇₀值，该值反应细菌的代谢活性，如与未接受过辐照的对照组细菌相比无明显降低，即细菌代谢活性不低于原来的50％。一般使用辐照后代谢活性为与未接受过辐照的对照组细菌相比的50％-70％的铜绿假单胞菌。

本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗制剂，可含有常用的免疫佐剂以增强疫苗的免疫效果。本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗制剂可以有多种免疫方式，如皮下、肌注、口服、鼻腔吸入等，或者是上述方式的组合。

本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗制剂，也可以有不同的免疫计量和免疫时间间隔。可以给药一次，也可以多次，优选方案为第0、7、14、28天共4次的免疫时间间隔，但具体实施过程不局限于此，可以根据实际情况改变或者调整免疫次数和免疫时间点。

本发明提供的铜绿假单胞菌疫苗制剂的剂量可根据受体情况调整，优选剂量为每次10⁷～5×10⁹个细菌体。具体免疫数量也可以根据受体情况调整。

本发明提供的疫苗制备方法不仅用来预防疾病，也可以应用与治疗疾病。针对正常的动物或者人体，使用本专利制备的疫苗可以增强机体的预防和抗病能力，达到预防疾病的目的；对于患有相应疾病或者感染的动物和人体，本疫苗可以诱导机体产生特定的针对致病因素的反应，快速有效的消灭病原体，达到治疗疾病和病患的目的。

以下通过实施例进一步说明本发明所提供的疫苗制备过程及相应疫苗效果的实验结果。本实施例只是一种举例，是本发明的解决方案之一，并非讲本发明局限于实施例，也不局限于实施例之间的组合。

下述实施例中的铜绿假单胞菌株均来源于美国菌种收藏所(ATCC)，LB培养基和阿尔马蓝试剂购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，C57/BL6小鼠购买自北京华阜康生物科技股份有限公司，X射线辐照仪为美国Rad Source公司产品，型号:RS 2000(RS2000‐Biological Irradiator)。其余试剂和设备为常规市售。

实施例一、本发明铜绿假单胞菌疫苗的制备及功效试验

选用铜绿假单胞菌标准株ATCC 27853,用LB培养基在37℃220r/min的细菌摇床上培养增殖16个小时，用0.5麦氏比浊度检测浓度，使细菌达到约10¹¹个菌体数。收集细菌培养基，在3500r/min条件下离心10min中，收集离心沉淀物用无菌生理盐水重悬后再次按照上述条件离心，重复3次。将细菌离心沉淀物用无菌生理盐水重悬后，装在50ml BD管中，置于X射线辐照仪放射源中心位置下辐照，将完成照射处理的细菌，用无菌生理盐水稀释100倍后，用细菌涂棒均匀涂布在LB琼脂平板上，37℃培养24h，观察无菌落生长，表明细菌无增殖能力。

同时吸取0.1ml照射后细菌于96孔板中，加入10ul阿尔玛兰试剂，37℃孵箱放置4h之后检测OD₅₇₀值，与对照组相比，细菌保留了代谢活性。射线处理的增殖能力及代谢活性的改变如图2、3所示：当射线总剂量为3300Gy时，细菌的增殖能力完全丧失，细菌涂板扩增无菌落生长；而此时的细菌仍有57％的代谢活性，当射线总剂量为7000Gy时，细菌的代谢活性完全丧失，表明细菌死亡。将细菌再次重悬至10¹⁰/ml，保存在-20℃备用。

选用C57/BL6小鼠鼻腔免疫模型，分为疫苗免疫组和生理盐水免疫组，每组10只。用10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠放在倾斜45℃的操作台上，保持小鼠处于头高脚底位。实验组小鼠于第0,7,14,28天给小鼠2侧鼻孔各缓慢注入10ul上述制备的铜绿假单胞菌菌体疫苗，对照组小鼠2侧鼻腔注入10ul无菌生理盐水，观察小鼠生存状态。第35天用ATCC27853活菌5X10⁷个菌体数腹腔注射两组小鼠，观察一周生存率。结果图4所示，免疫组小鼠7天总生存率为100％，而对照组小鼠感染铜绿假单胞菌后第2天死亡率即达到90％，免疫组小鼠生存率较对照组小鼠明显提高，说明本发明的铜绿假单菌疫苗有效。

实施例二、本发明铜绿假单胞菌疫苗的制备及功效试验

选用铜绿假单胞菌标准株ATCC27853,用LB培养基在37℃220r/min的细菌摇床上培养增殖16个小时，用0.5麦氏比浊度检测浓度，使细菌达到约10¹¹个菌体数。收集细菌培养基，在3500r/min条件下离心10min中，收集离心沉淀物用无菌生理盐水重悬后再次按照上述条件离心，重复3次。将细菌离心沉淀物用无菌生理盐水重悬后，装在50ml BD管中，置于X射线辐照仪放射源中心位置下辐照，条件8Gy/min，共间断照射470分钟，(照射20分钟，停止5分钟后继续，重复上述循环，总照射时间为470分钟)。

取100ul完成照射处理的细菌，用无菌生理盐水稀释100倍后，用细菌涂棒均匀涂布在LB琼脂平板上，37℃培养24h，观察无菌落生长，表明细菌无增值能力。

同时吸取100ul照射后细菌于96孔板中，加入10ul阿尔玛兰试剂，37℃孵箱放置4h之后检测OD₅₇₀值，与未接受射线辐照的对照组细菌相比，细菌代谢活性为对照组未处理过的细菌代谢活性的58.3％，将此处理的细菌涂板在细菌培养箱中放24h，无菌落增长。将细菌再次重悬至10¹⁰/ml，保存在-20℃备用。

选用C57/BL6小鼠鼻腔免疫模型，用10％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，将麻醉好的小鼠放在倾斜45℃的操作台上，保持小鼠处于头高脚底位进行免疫。实验组小鼠于第0,7,14,28天给小鼠2侧鼻孔各缓慢注入10ul上述制备的铜绿假单胞菌菌体疫苗，对照组小鼠给予等量无菌生理盐水鼻腔注入，每次免疫后观察小鼠生存状态。第35天用ATCC 27853活菌10⁸个菌体数腹腔注射感染小鼠，观察一周生存率。

结果显示全菌体疫苗免疫组小鼠生存率提高(图5)，且对照生理盐水组小鼠铜绿假单胞菌激发后8h小鼠肺中中性粒细胞募集数量为7.14％，而疫苗免疫组小鼠铜绿假单胞菌激发后8h小鼠肺中中性粒细胞募集数量增加到34.7％，表明其抵抗铜绿假单胞菌感染能力增强(图6)。

Claims (16)

1.铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征包括以下步骤；首先获取铜绿假单胞菌菌体；然后接受射线辐照得到细菌疫苗。

2.根据权利要求1所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所获取的铜绿假单胞菌菌体是处于对数生长期的细菌菌体。

3.根据权利要求1-2所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1).获取用于制备疫苗的铜绿假单胞菌细菌株；

(2).增殖细菌：将步骤(1)获取的细菌株接种在适宜培养基中培养，使细菌处于对数增长期；

(3).收集菌体：收集步骤(2)得到的含有菌体及基质成分的培养基，离心并收集离心沉淀物；

(4).射线处理：将上述净化处理的离心沉淀物重悬成细菌悬液，移至非金属容器中，用射线辐照细菌悬液；

(5).调节菌体浓度：将步骤(4)得到的射线辐照后的细菌悬液再次重悬，调节为最终使用目标细菌浓度，即得到铜绿假单胞菌疫苗。

4.根据权利要求1-3任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：在射线辐照处理前或者射线辐照后，进行纯化菌体的步骤；或者，在射线辐照处理前后均进行纯化菌体的步骤。

5.根据权利要求1-4任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述射线辐照为使细菌失去增殖活性且代谢活性保留。

6.根据权利要求1-5任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述增殖活性是指在适宜培养基上培养24-48小时，无菌落产生；所述代谢活性保留是指用细胞活性检测试剂检测其代谢活性与未接受过辐照的对照组细菌相比不低于正常活性的50％。

7.根据权利要求6任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述代谢活性保留是指用细胞活性检测试剂检测其代谢活性与未接受过辐照的对照组细菌的正常活性相比的50％-70％。

8.根据权利要求1-7任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述的射线辐照使用的射线为X射线、gamma射线或同位素放射源Co⁶⁰产生的射线。

9.根据权利要求1-8任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述的射线辐照的总剂量为：3300-3500Gy。

10.根据权利要求1-9任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述的射线辐照的方式为低剂量，长时间，间断照射。

11.根据权利要求10所述的铜绿假单胞菌疫苗的制备方法，其特征在于：所述的射线辐照的方式为每照射20-25分钟，停止4-5分钟，进行循环照射；剂量为8-9Gy/min，照射6.2-7.3小时。

12.铜绿假单胞菌疫苗，其特征在于，由权利要求1-11任一项所述的方法制成的铜绿假单胞菌疫苗作为主要活性成分。

13.根据权利要求12所述的铜绿假单胞菌疫苗，其特征在于：还含有免疫佐剂。

14.根据权利要求12或13所述的铜绿假单胞菌疫苗，其特征在于：所述铜绿假单胞菌疫苗的剂型为皮下注射制剂、肌注注射制剂、口服或鼻腔吸入制剂。

15.权利要求12-14任一项所述的铜绿假单胞菌疫苗在制备治疗铜绿假单胞菌引起的感染性疾病的药物中的用途。

16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于所述的铜绿假单胞菌引起的感染性疾病为肺炎、败血症、角膜炎或皮肤软组织感染中的至少一种。