CN115518079A - 一种益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用 - Google Patents
一种益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于益生菌转化应用技术领域，具体涉及一种益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用。本发明从嗜黏蛋白阿克曼菌(Akk菌)的培养上清液中经密度梯度离心、过滤、浓缩和外泌体提取试剂层析提取嗜黏蛋白阿克曼菌外膜囊泡(Akk‑OMV)，并通过构建哮喘小鼠模型，并利用Akk菌/Akk‑OMV进行干预，通过对干预处理后小鼠相关生理特征的检测，证实了Akk菌及其Akk‑OMV对抑制气道和肺组织炎症、减少气道粘液的分泌以及具备免疫调节功能的作用，可作为现有药物的替代物或协助治疗药物，用于改善急性和慢性哮喘的药物、食品和保健品。
Description
技术领域
本发明属于益生菌转化应用技术领域，具体涉及一种益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用。
背景技术
支气管哮喘(简称哮喘)是一种以咳嗽、胸闷、喘息和气促等呼吸道症状为主要临床表现的异质性疾病，该病反复发作且缠绵难愈。目前，吸入性糖皮质激素、β肾上腺受体激动剂、白三烯受体拮抗剂和茶碱等常用哮喘治疗药物只能控制症状，并不能预防或根治哮喘。上述药物的长期使用具有一定的副作用，导致依从性不佳，并且存在部分患者对这一些药物不敏感。因此，急需探寻防治哮喘的新制剂。
当前，生活方式、饮食、体重、环境和微生物组的改变都与过敏和哮喘等慢性炎症疾病的患病风险和严重程度有关，然而，这些因素与宿主免疫调节过程之间复杂的相互作用仍然知之甚少。人体和动物肠道内存在数量庞大的微生物群，能够调节宿主的健康和稳态。微生物群的组成和代谢产物能够激活机体黏膜组织的生物屏障功能和免疫效应功能，亦是过敏和哮喘领域的研究热点和重点。
嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila，Akk)是2004年首次分离提出的一种人类肠道的正常粘蛋白分解细菌，是一种革兰氏阴性、严格厌氧且定植在肠道的益生菌，约占正常人体肠道微生物群落总数的3％-5％，且因其在维持宿主健康方面的综合作用备受关注，被认为是预防或治疗代谢性疾病的“下一代有益微生物”。在乳制品、保健品和药品中添加益生菌用以改善胃肠道功能、治疗消化系统疾病的做法已被人们所熟悉和广泛应用。肠道微生物细胞外膜囊泡(outermembranevesicles，OMV)是介导其与机体靶器官之间相互作用和生物信号的关键成分，可以穿过粘液层并通过循环转移到外周组织发挥作用。但关于益生菌及其外膜囊泡对哮喘疾病的预防和治疗效果尚未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过构建急性和慢性哮喘模型，并利用嗜黏蛋白阿克曼菌或/和嗜黏蛋白阿克曼菌外膜囊泡进行干预，通过对干预处理后小鼠相关生理特征的检测，对抑制气道和肺组织炎症、减少气道粘液分泌的以及具备免疫调节功能的作用；本发明提供的Akk菌及Akk-OMV可作为现有药物的替代物或协助治疗药物，用于改善急性和慢性哮喘的药物、食品和保健品，拓宽了益生菌治疗哮喘的应用领域。
为了达到上述目的，本发明实施例提供了一种益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用，所述益生菌为嗜黏蛋白阿克曼菌。
进一步的，所述嗜黏蛋白阿克曼菌为ATCCBAA-835菌株。
进一步的，所述哮喘的类型包括：过敏性哮喘、运动性哮喘、变异性哮喘、月经性哮喘、药物性哮喘、肺源性哮喘、儿童哮喘、职业性哮喘、混合型哮喘。
进一步的，所述益生菌外膜囊泡的制备方法具体包括：
将嗜黏蛋白阿克曼菌进行传代培养活化后加入培养基中，在37℃厌氧状态下以60rpm速率摇晃4天培养后离心取上清液过滤，滤液经浓缩获得浓缩液用外泌体提取试剂提取，获取沉淀即为外膜囊泡；
所述培养基为将BHI培养基加水高温消毒、冷却后加入L-半胱氨酸、刃天青；
所述外泌体提取试剂为ExoQuick-TC外泌体提取试剂，用量为浓缩液的1/5；提取的条件为：4℃环境下反应12小时后，1500×g，4℃离心30分钟。
进一步的，所述离心过程的工艺条件为：12,000×g，4℃离心15分钟；所述过滤过程的工艺条件为：将上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤；所述浓缩过程的工艺条件为：用孔径为100KD的超滤管将滤液浓缩300-500倍。
基于同一发明构思的，本发明实施例还提供了一种防治支气管哮喘制剂，所述制剂包括嗜黏蛋白阿克曼菌、嗜黏蛋白阿克曼菌外膜囊泡中的任意一种或组合。
进一步的，所述制剂至少包含一种药学、食品学或保健品学上可接受辅料；
所述辅料为载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的一种或多种。
进一步的，所述制剂的剂型为注射液、口服液、胶囊剂、片剂、喷雾剂或软膏剂中的任意一种。
本发明提供了Akk菌及Akk-OMV在防治急性和慢性哮喘药物中的新用途，本发明通过实验，验证了Akk菌及Akk-OMV对抑制气道和肺组织炎症、减少气道粘液分泌的以及具备免疫调节功能的作用。其中抑制急性和慢性哮喘中肺泡灌洗液中气道炎症包括：Akk菌及Akk-OMV均能减少屋尘螨和鸡卵清蛋白诱导哮喘小鼠的肺泡灌洗液中总的细胞数和嗜酸性粒细胞数目；其中减轻急性和慢性哮喘中肺组织炎症以及气道周围炎症细胞浸润包括：肺脏组织气道周围炎症细胞浸润减少，肺组织损伤减少；其中减少急性和慢性哮喘中气道粘液分泌包括杯状细胞化生导致的黏液蛋白分泌减少；其中慢性哮喘气道重构包括支气管壁增厚、基底膜假性增厚、细胞外基质地改变、粘液性肥厚、平滑肌增生肥大等。
有益效果：
本发明首次提出了将嗜黏蛋白阿克曼菌及其外膜囊泡应用至防治哮喘的制剂中，通过相关小鼠模型的构建、干预治疗和结果检测，可以知道嗜黏蛋白阿克曼菌及其外膜囊泡哮喘肺组织炎症中有显著效果：抑制急性和慢性哮喘中肺泡灌洗液中气道炎症；减轻急性和慢性哮喘中肺组织炎症以及气道周围炎症细胞浸润；减少急性和慢性哮喘中气道粘液分泌以及减少慢性哮喘气道重构；还可以用于其他过敏性疾病的预防和治疗，具有良好的产业化前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的屋尘螨诱导哮急性喘小鼠灌胃Akk菌及Akk-OMV后，肺脏组织染色结果对照图；
图2为本发明实施例1提供的鸡卵清蛋白诱导急性哮喘小鼠灌胃Akk菌及Akk-OMV后，肺脏组织染色结果对比图；
图3为本发明实施例1提供的屋尘螨、鸡卵清蛋白诱导哮急性喘小鼠灌胃Akk菌及Akk-OMV后，肺泡灌洗液数目和细胞类型数目变化情况；
图4为本发明实施例提供的鸡卵清蛋白诱导慢性哮喘小鼠模型灌胃Akk菌及Akk-OMV后，肺脏组织染色结果对照图。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例和附图予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
下面更详细地描述特定术语的定义。本公开无意以任何方式受到本文描述的取代者的示例性列表的限制。
在本发明实施例中，所采用的化学试剂可以通过购买或现有的制备方法制备获得，所采用的仪器设备为现有技术中的常规设备。所述嗜黏蛋白阿克曼菌为ATCCBAA-835菌株。培养基的配置：称取BHI培养基，按配置标准加水后高温消毒，冷却后加入L-半胱氨酸、刃天青。
在本发明实施例中，将Akk菌进行传代培养活化后加入到上述培养基中，在37℃厌氧状态下以60rpm速率摇晃4天培养，在12,000×g，4℃离心15分钟后取上清液，将上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤取滤液，并采用孔径为100KD的超滤管将滤液浓缩300-500倍，加入浓缩液1/5的ExoQuick-TC外泌体提取试剂，在4℃环境下反应12小时后，1500×g，4℃离心30分钟取沉淀即为外膜囊泡(Akk-OMV)。
应该理解的是，在本发明所公开内容的基础上，本领域技术人员可以采用本领域其他熟知的试剂盒提取技术等提取上清中的外膜囊泡，这对本来领域技术人员来说是容易实现，无论其采用何种方法得到外膜囊泡并且用于吸烟导致的系统性疾病的治疗，其均是属于本发明的保护性范围。
实施例1
Akk菌及Akk-OMV防治急性哮喘小鼠的疗效评价。
(1)屋尘螨(Housedustmite，HDM)诱导急性哮喘模型小鼠的构建及给药设计。
C57BL/6J小鼠经建议合格后，随机分为正常对照组(Control)、哮喘模型组(HDM+Vehicle)、Akk干预哮喘模型组(HDM+Akk)、Akk菌外膜囊泡干预模型组(HDM+Akk-OMV)。选用HDM构建急性哮喘模型，予以Akk和Akk-OMV进行干预。具体为：6-8周龄小鼠，适应一周后，在第0、2和4天间隔3次通过气管给药方式给予溶于50μl无菌PBS中的20μgHDM进行致敏；在第11至13天连续3天气管内给予20μgHDM进行激发，对照组均予以等量无菌PBS完成相同操作。对于Akk和Akk-EVs干预组别，在刺激前1小时开始Akk菌和Akk-OMV灌胃，具体干预方法如下：
HDM+Vehicle组：每次灌胃0.2ml的PBS，每周2次。
HDM+Akk组：每次灌胃2×108CFU的Akk菌液(溶解于0.2ml的PBS中)。
HDM+Akk-OMV组：每次灌胃或50μg的Akk-OMV(溶解于0.2ml的PBS中)，每周2次。
Control组：气管内给予PBS，时间同模型组。
第14天处理小鼠，完成样本收集。小鼠麻醉后，通过心脏抽取血液，通过气管插管，并用0.8ml的无菌PBS分别进行两次肺泡灌洗，收取肺泡灌洗液中细胞行流式细胞学检测。
(2)鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱导急性哮喘模型小鼠的构建及给药设计。
C57BL/6J小鼠经建议合格后，随机分为正常对照组(Control)、哮喘模型组(OVA+Vehicle)、Akk干预哮喘模型组(OVA+Akk)、Akk菌外膜囊泡干预模型组(OVA+Akk-OMV)。选用OVA构建急性哮喘模型，予以Akk和Akk-OMV进行干预。具体为：6-8周龄小鼠，适应一周后，首先运用2mg明矾联合100μgOVA(溶于0.2ml的PBS)在第0、7和14天经腹腔注射进行致敏；在第21天至27天，予以5％OVA进行雾化吸入，每天30分钟。对照组均予以等量无菌PBS完成相同操作。对于Akk和Akk-EVs干预组别，在刺激前1小时开始Akk菌和Akk-OMV灌胃，具体干预方法如下：
OVA+Vehicle组：每次灌胃0.2ml的PBS。
OVA+Akk组：每次灌胃2×108CFU的Akk菌液(溶解于0.2ml的PBS中)。
OVA+Akk-OMV组：每次灌胃或50μg的Akk-OMV(溶解于0.2ml的PBS中)。
Control组：气管内给予PBS，时间同模型组。
第28天处理小鼠，完成样本收集。小鼠麻醉后，通过心脏抽取血液，通过气管插管，并用0.8ml的无菌PBS分别进行两次肺泡灌洗，收取肺泡灌洗液中细胞行流式细胞学检测。
(3)Akk菌及Akk-OMV防治急性哮喘的效价评估
空白对照组小鼠支气管无明显炎症细胞浸润，结构正常。哮喘模型组可见弥漫性细小支气管和血管周围炎性细胞浸润，其中嗜酸性粒细胞显著增多。气道上皮有不同程度脱落，支气管上皮细胞杯状细胞增生明显，官腔内可见粘液栓及炎性渗出，支气管平滑肌显著增厚，血管周围水肿。符合哮喘病理改变。
如图1所示，经过治疗后取材制作肺脏组织石蜡切片，经H&E和PAS染色发现，HDM诱导的急性哮喘模型组H&E染色可见弥漫性细小支气管和血管周围炎性细胞浸润明显，PAS染色检测可见哮喘组杯状细胞化生明显，可见粘液栓及炎性渗出。而Akk菌及Akk-OMV干预能够明显减轻HDM哮喘小鼠肺组织的肺组织损伤和杯状细胞化生情况。
如图2所示，经过治疗后取材制作肺脏组织石蜡切片，行H&E和PAS染色发现，OVA诱导的急性哮喘模型组H&E染色可见弥漫性细小支气管和血管周围炎性细胞浸润明显，PAS染色检测可见哮喘组杯状细胞化生明显，可见粘液栓及炎性渗出。而Akk菌及Akk-OMV干预能够明显减轻OVA哮喘小鼠肺组织的肺组织损伤和杯状细胞化生情况。
哮喘是一种气道炎症性疾病，通过分析肺泡灌洗液中总的细胞数和细胞组成分发现(如图3所示)，Akk菌及Akk-OMV干预后，HDM和OVA诱导的急性哮喘小鼠中支气管肺泡灌洗液中总数和嗜酸性粒细胞明显减少，表明炎症反应得到了有效的抑制。
实施例2
Akk菌及Akk-OMV防治慢性哮喘小鼠的疗效评价。
(1)OVA诱导慢性哮喘模型小鼠的构建及给药设计。
C57BL/6J小鼠经建议合格后，随机分为正常对照组(Control)、慢性哮喘模型组(C-OVA+Vehicle)、Akk干预哮喘模型组(C-OVA+Akk)、Akk菌外膜囊泡干预模型组(C-OVA+Akk-OMV)。选用OVA构建慢性哮喘模型，予以Akk和Akk-OMV进行干预。具体为：6-8周龄小鼠，适应一周后，首先运用2mg明矾联合100μgOVA(溶于0.2ml的PBS)在第0和14天经腹腔注射进行致敏；从第三周开始，予以5％OVA进行雾化吸入，每周3次，每天30分钟。对照组均予以等量无菌PBS完成相同操作。对于Akk和Akk-EVs干预组别，在雾化前1小时开始Akk菌和Akk-OMV灌胃，具体干预方法如下：
C-OVA+Vehicle组：每次灌胃0.2ml的PBS，每周2次。
C-OVA+Akk组：每次灌胃2×10^8CFUAkk菌液(溶解于0.2ml的PBS中)。
C-OVA+Akk-OMV组：每次灌胃或50μgAkk-OMV(溶解于0.2ml的PBS中)。
Control组：气管内给予PBS，时间同模型组。
第10周处理小鼠，完成样本收集。小鼠麻醉后，通过心脏抽取血液，通过气管插管，并用无菌PBS0.8ml分别进行两次肺泡灌洗，收取肺泡灌洗液中细胞行流式细胞学检测。
(2)Akk菌及Akk-OMV防治慢性哮喘的效价评估。
如图4所示，经过治疗后取材制作肺脏组织石蜡切片，经H&E和PAS染色发现，OVA介导的慢性哮喘小鼠肺组织可见明显的气道周围炎症浸润、杯状细胞化生明显和基底膜增厚。Akk菌及Akk-OMV干预能够减轻上述改变。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用，其特征在于，所述益生菌为嗜黏蛋白阿克曼菌。
2.根据权利要求1所述的益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用，其特征在于，所述哮喘的类型包括：过敏性哮喘、运动性哮喘、变异性哮喘、月经性哮喘、药物性哮喘、肺源性哮喘、儿童哮喘、职业性哮喘、混合型哮喘。
3.根据权利要求1所述的益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用，其特征在于，所述益生菌外膜囊泡的制备方法具体包括：
将嗜黏蛋白阿克曼菌进行传代培养活化后加入培养基中，在37℃厌氧状态下以60rpm速率摇晃4天培养后离心取上清液过滤，滤液经浓缩获得浓缩液用外泌体提取试剂提取，获取沉淀即为外膜囊泡；
所述培养基为将BHI培养基加水高温消毒、冷却后加入L-半胱氨酸、刃天青；
所述外泌体提取试剂为ExoQuick-TC外泌体提取试剂，用量为浓缩液的1/5；提取的条件为：4℃环境下反应12小时后，1500×g，4℃离心30分钟。
4.根据权利要求3所述的益生菌及其外膜囊泡在制备防治支气管哮喘制剂中的应用，其特征在于，所述离心过程的工艺条件为：12,000×g，4℃离心15分钟；所述过滤过程的工艺条件为：将上清液用0.22μm孔径的过滤器过滤；所述浓缩过程的工艺条件为：用孔径为100KD的超滤管将滤液浓缩300-500倍。
5.一种防治支气管哮喘制剂，其特征在于，所述制剂包括嗜黏蛋白阿克曼菌、嗜黏蛋白阿克曼菌外膜囊泡中的任意一种或组合。
6.根据权利要求5所述的防治支气管哮喘制剂，其特征在于，所述制剂至少包含一种药学、食品学或保健品学上可接受辅料；
所述辅料为载体、赋形剂、稀释剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂以及香料中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的防治支气管哮喘制剂，其特征在于，所述制剂的剂型为注射液、口服液、胶囊剂、片剂、喷雾剂或软膏剂中的任意一种。
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