KR20160140565A - Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ 또는 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents
Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ 또는 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 함유된 세포밖 소포체로 인하여 염증성 질환을 억제할 수 있으며, 이에 따라 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물, 식품 조성물, 및 화장료 조성물 등으로 이용될 수 있다. 또한 본 발명은 포유동물의 체내 또는 분비물에서 분리된 세포밖 소포체 중에서 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 정량함으로써 염증성 질환의 발생 또는 그 경과를 진단하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물 등에 관한 것이다.
염증(Inflammation)은 세포 및 조직의 손상이나 감염에 대한 국부적인 또는 전신적인 방어기작이다. 염증은 주로 면역계를 이루는 체액성 매개체(humoral mediator)가 직접 반응하거나, 국부적 또는 전신적 작동 시스템(effector system)을 자극함으로써 일어나는 연쇄적인 생체반응에 의해 유발된다. 주요 염증성 질환으로는 위염, 염증성 장염 등의 소화기질환, 치주염 등의 구강 질환, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염 등의 호흡기질환, 아토피 피부염 등의 피부질환이 포함되며, 기타 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염; 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨병, 동맥경화증 등이 있다. 또한 지속적인 염증성 질환은 암을 유발할 수 있다는 연구 결과도 있다. 이러한 염증성 질환을 치료 또는 예방하기 위하여 사용되고 있는 일반적인 조성물로는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 조성물로 구분되어지며, 이중 대부분이 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많다. 따라서 효과가 탁월하며 부작용이 적은 염증성 질환의 예방 또는 치료용제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 원핵세포 또는 진핵세포는 세포밖 소포체를 분비하고, 분비된 세포밖 소포체는 여러 기능들을 가지고 있음이 최근 보고되었다. 그람 음성균에서 분비된 세포밖 소포체는 내독소(lipopolysaccharide, LPS)와 세균 유래 단백질 등을 함유하고 있으며, 숙주에서 염증성 질환을 유도하는 것으로 알려져 있다. 또한, 여러 종의 암세포에서 유래된 세포밖 소포체는 암세포의 성장 및 전이에 필요한 단백질들을 함유하고 있음이 보고된 바 있다. 이와 같이, 조직 유래 세포밖 소포체는 소포체를 분비한 조직의 상태를 반영하기 때문에, 질병의 진단에 이용될 수 있음이 보고된 바 있다.
Akkermansia muciniphila는 어린 아이 때부터 시작하여 노인에 이르기까지 지속적으로 사람의 장에 서식하는 공생 세균으로 잘 알려져 있고, 정상 대조군에 비하여 염증성 장염 환자의 경우에는 점막 조직에 적은 세균 수를 가지고 있음이 보고된 바 있다. 그러나 상기 세균의 세포밖 소포체가 염증성 질환에 미치는 영향에 대해서는 연구가 되어 있지 않다. 또한, Bacteroides acidifaciens는 생쥐의 맹장에서 분리, 배양되어 알려졌으나, 세포밖 소포체의 분비 여부나, 그 역할에 대해서는 전혀 연구가 되어 있지 않다.
본 발명은 염증성 질환의 치료, 또는 예방을 위한 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 조성물 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 조성물은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비된 세포밖 소포체를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 염증성 질환은 천식 및 만성폐쇄성폐질환을 포함하는 호흡기 질환; 치주염을 포함하는 구강 내 염증 질환; 위염 및 염증성 대장염을 포함하는 소화기 질환; 아토피 피부염을 포함하는 피부질환; 동맥경화증 및 이의 합병증; 염증에 의해 발생하는 폐암, 위암, 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20 내지 800nm인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 식품 조성물은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens을 이용하여 발효시킨 발효식품에서 유래한 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 염증성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물 등으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
또한 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens를 이용하여 발효시킨 발효 식품에서 분리한 세포밖 소포체로 인하여 염증성 질환을 억제할 수 있으며, 이에 따라 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있고, 최종적으로 암 발생을 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
또한 포유동물의 체내 또는 분비물에서 분리된 세포밖 소포체 중에서 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 정량함으로써 염증성 질환의 발생 또는 그 경과를 진단하는데 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 dextran sodium sulfate(DSS)를 이용하여, C57BL/6 생쥐에 염증성 장염을 유발시켜 대변을 수집하는 실험 계획을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2는 정상 생쥐의 대변에서 분리된 세포밖 소포체, 및 염증성 장염이 유발된 생쥐의 5일째 대변에서 분리된 세포밖 소포체의 투과전자현미경(TEM) 사진이다.
도 3은 날짜 별로 수집한 생쥐 대변에서 분리된 세포밖 소포체를 동적 빛 산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 날짜 별로 수집한 생쥐 대변에서 세포밖 소포체를 분리한 후, 단백질 정량을 수행하고, 날짜별에 따른 대변의 중량(그람) 당 세포밖 소포체의 양을 환산한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 날짜 별로 수집한 생쥐 대변에서 세포밖 소포체를 분리한 후, 쿠마시 블루를 이용하여 염색한 SDS-PAGE 사진이다.
도 6은 대변에서 분리한 세균과 세포밖 소포체를 가지고 메타지노믹스(metagenomics)를 수행 후, 문(phylum) 수준에서 세균의 구성을 분석한 결과를 보여주는 도표이다.
도 7은 대변에서 분리한 세균과 세포밖 소포체를 가지고 메타지노믹스(metagenomics)를 수행 후, 종(species) 수준에서 세균의 구성을 분석한 결과를 보여주는 도표이다.
도 2는 정상 생쥐의 대변에서 분리된 세포밖 소포체, 및 염증성 장염이 유발된 생쥐의 5일째 대변에서 분리된 세포밖 소포체의 투과전자현미경(TEM) 사진이다.
도 3은 날짜 별로 수집한 생쥐 대변에서 분리된 세포밖 소포체를 동적 빛 산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 크기를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 날짜 별로 수집한 생쥐 대변에서 세포밖 소포체를 분리한 후, 단백질 정량을 수행하고, 날짜별에 따른 대변의 중량(그람) 당 세포밖 소포체의 양을 환산한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 날짜 별로 수집한 생쥐 대변에서 세포밖 소포체를 분리한 후, 쿠마시 블루를 이용하여 염색한 SDS-PAGE 사진이다.
도 6은 대변에서 분리한 세균과 세포밖 소포체를 가지고 메타지노믹스(metagenomics)를 수행 후, 문(phylum) 수준에서 세균의 구성을 분석한 결과를 보여주는 도표이다.
도 7은 대변에서 분리한 세균과 세포밖 소포체를 가지고 메타지노믹스(metagenomics)를 수행 후, 종(species) 수준에서 세균의 구성을 분석한 결과를 보여주는 도표이다.
본 발명자들은 염증성 장염에 걸린 포유동물의 대변에서 분리한 세포밖 소포체를 분석한 결과, Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체가 3% 이하로 급격히 감소함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다. 상기 염증성 질환의 치료 또는 예방이란, 염증성 질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 염증성 질환이 걸릴 가능성을 경감하는 것을 포함하는 의미이다.
본 발명에서 염증성 질환이란, 포유동물 체내의 염증 반응에 의하여 유발되는 질환을 의미하며, 대표적인 예로는, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염 등의 호흡기질환; 아토피피부염 등의 피부질환; 위염, 염증성 장염 등의 소화기질환; 동맥경화증, 패혈증, 염증성 관절질환, 염증성 뇌질환 등을 포함한다. 또한, 상기 염증성 질환은 일반적인 염증성 질환 이외에도, 염증 반응과 관련된 암을 포함하는 의미로 사용되며, 폐암, 위암, 및 대장암 등을 포함한다.
대장에는 숙주세포 수의 약 10배 정도 되는 수의 세균이 서식하고 있다. 세균은 세포밖 소포체를 분비하는데, 병원성 세균에서 유래된 소포체는 국소적 혹은 전신적으로 흡수되었을 때 염증반응을 유도하는 것이 알려져 있다. 그러나 병원성 세균 유래 세포밖 소포체에 의한 염증반응의 발생을 억제하는 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않은 상태이다. 본 발명자들은 DSS를 이용하여 생쥐에 염증성 장염을 유발하고 질병 발생 전과 후에 대변을 수집한 후, 대변으로부터 세포밖 소포체를 분리하여 메타지노믹스(metagenomics)를 시행하였다. 메타지노믹스 결과, 대조군인 정상 상태 생쥐 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 경우에는 Akkermansia muciniphila의 세포밖 소포체가 25%를 차지하며, Bacteroides acidifaciens의 세포밖 소포체가 27%를 차지하고 있음을 보여주었다. 그러나 염증성 장염이 유발된 생쥐의 경우에는 Akkermansia muciniphila의 세포밖 소포체가 0.4%를 차지하며, Bacteroides acidifaciens의 세포밖 소포체가 2.3%를 차지하고 있음을 보여주었다(실시예 5 참조).
상기 결과로부터, 본 발명의 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 조성물 등은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 발명은 상기 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는 약학적 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 등을 제공한다.
상기 조성물은 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens의 배양액, 또는 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens를 이용하여 발효시킨 발효식품에서 분리된 세포밖 소포체를 포함한다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 세포밖 소포체는 배양액이나 발효식품에서, 원심분리, 초원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동 등의 방법 또는 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있다. 또한, 상기의 분리 과정에는 불순물의 제거를 위한 세척, 분리된 세포밖 소포체의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법에 의하여 분리된 세포밖 소포체는 자연적으로 분비된 것이나, 혹은 인공적으로 생산된 것 일 수 있으며, 평균 직경이 20~800nm일 수 있으나, 바람직하게는 50~200nm일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하며, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 멸균수, 링거액, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 및 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 및 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 및 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 약제학적 유효량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 세포밖 소포체는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 상기 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하며, 식품 제조 시 통상적으로 첨가하는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제 등을 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다. 또한 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 세포밖 소포체 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 및 과즙 등을 추가로 포함시킬 수 있다. 또한 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens를 이용하여 발효시킨 발효식품 자체를 이용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 함유하며, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 및 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 포유동물의 체내 또는 분비물로부터 분리된 세포밖 소포체 중, Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 세포밖 소포체를 정량하여 염증성 질환의 발생 또는 경과를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 진단 방법은 포유동물의 체내 물질 또는 분비물을 수집하는 단계, 상기 수집된 물질을 원심분리하여 불순물, 동물세포, 및 세균을 제거하는 단계, 초원심분리를 수행하여 세포밖 소포체를 분리하는 단계, 및 분리된 세포밖 소포체를 정량하는 단계를 포함한다. 상기 세포밖 소포체는 포유 동물의 구강, 소장, 대변으로부터 분리될 수 있다.
상기 세포밖 소포체의 분리 방법은 전술한 정상 상태의 포유동물의 체내 또는 분비물에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법과 동일한 방법으로 분리가 가능하며, 세포밖 소포체를 순수하게 분리할 수 있다면 분리 방법은 특별히 제한되지 않는다.
상기 분리된 소포체를 정량하는 단계는 분리된 세포밖 소포체 내의 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 특이 유전형을 측정하는 단계; 또는 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 특이 단백질을 측정하는 단계; 또는 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens 유래 소포체 자체 혹은 소포체내 단백질에 대한 면역반응을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예의 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에서 세포밖 소포체 분리
6주령 생쥐(C57BL/6)에 염증성 장염을 유발시키는 dextran sodium sulfate (DSS)를 처리하기 전 하루부터 처리 후 5일 동안 매일 생쥐의 대변을 수집하였다. 수집한 생쥐 대변의 무게(그람)를 측정한 후, PBS에 분산시켰다. 이물질을 제거하기 위해 500×g에서 5분, 3,000×g에서 5분, 4,350rpm에서 5분씩 연속적으로 원심분리를 수행하였다. 원심분리하여 상층액을 분리한 후, 10,000×g에서 20분간 초고속 원심분리를 수행하여 대변에 포함되어 있는 세균을 제거하였다. 분리된 상층액을 0.45μm 필터를 이용하여 여과한 후, 단백질 정량을 수행하였다. 0.8M과 2.5M sucrose cushion을 만든 후, 28,500rpm으로 4℃에서 2시간 동안 초고속 원심분리를 두 번 반복 수행하였다. 마지막으로 대변유래 세포밖 소포체를 얻기 위하여 4℃ 에서 40,200rpm으로 2시간 동안 초고속 원심분리를 수행하였고, 습득한 세포밖 소포체는 PBS에 분산시켜 보관하였다.
실시예 2. 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 구조 분석
날짜 별로 수집한 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 존재 여부 및 크기를 확인하기 위하여 세포밖 소포체를 50μg/mL의 농도로 분산시킨 후, 투과전자현미경(TEM)으로 관찰하였다. 관찰한 결과는 도 2에 나타내었다.
TEM 관찰 결과, DSS 처리 전과 처리 후 시료 모두 세포밖 소포체가 대변으로부터 분리되었음을 확인할 수 있었고, 또한 구형의 입자를 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다.
날짜별로 수집한 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 정확한 크기를 동적 빛 산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 확인하였다. DLS 방법을 사용하기 위하여 세포밖 소포체를 5μg/ml의 농도로 PBS에 분산시킨 후, 크기 측정기기(Zetasizer nano ZS)에 넣어 그 크기를 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
대변 유래 세포밖 소포체의 크기는 수집된 날짜와 관계없이 100~800nm의 크기를 가지고 있음을 보여주었다.
실시예 3. 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 단백질 패턴 분석
날짜별로 수집한 대변에서 분리한 세포밖 소포체를 대변의 무게(그람)와 비교하여 세포밖 소포체의 분비량을 환산하였다. 환산한 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 염증성 장염 유발 5일 후에 대변에서 분리한 세포밖 소포체의 양이 상대적으로 가장 많음을 확인하였다.
또한 단백질의 패턴을 분석하기 위하여, 동일한 양의 대변 유래 세포밖 소포체(10μg)를 SDS-PAGE(10% resolving gel)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 이렇게 분리된 단백질을 쿠마시 블루 염색 용액으로 8시간 동안 염색한 후, 탈염색 용액에서 4시간 동안 탈염색한 후 단백질 패턴을 분석하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
정상 생쥐의 대변 유래 세포밖 소포체에서는 7 내지 8개의 단백질 밴드가 관찰되었으나, DSS에 의해 염증성 장염이 진행될수록 관찰되는 단백질 밴드의 수가 감소되었고, 5일째에는 3 내지 4개의 단백질 밴드만이 관찰되었다. 이를 통해 염증성 장염이 진행될수록 전체적인 단백질의 밴드 수가 감소됨을 확인 할 수 있었다.
실시예 4. 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에 존재하는 세균에 대한 메타지노믹스(metagenomics)
정상 생쥐와 염증성 장염 생쥐의 대변에 존재하는 세균을 확인하기 위하여 메타지노믹스를 수행하였다. 이를 수행하기 위하여, 대변에 세균이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 16s rRNA 프라이머(27F: 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 1492R: 3'-GGTTACCTTGTTACGACTT-5')를 이용하여 PCR을 수행하여 세균이 존재함을 확인하였다. 이후, barcode sorting, prescreen by quality, trimming primer sequences, removing non-target sequence, taxonomic assignment의 순서로 메타지노믹스를 시행하여 대변에 존재하는 세균을 분석하였다. 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6의 stool bacteria는 문(phylum) 수준에서 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에 존재하는 세균들을 보여준다. Actinobacteria, Bacteroidetes, 및 Firmicutes 가 대변에 존재하는 주 세균임을 알 수 있었고, 정상과 염증성 장염 생쥐의 대변에 존재하는 세균의 비율에는 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.
도 7의 stool 시료는 종(species) 수준에서 대변에 Akkermansia muciniphila와 Bacteroides acidifaciens가 얼마나 존재하는지를 보여주는 결과이다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 정상 생쥐의 대변에서는 Akkermansia muciniphila와 Bacteroides acidifaciens의 비율이 총 세균의 각각 0.33%, 0.21%를 차지한 데 비하여, 염증성 질환 생쥐의 대변에서는 각각 0.87%, 0.43%로 정상 상태에 비하여 이들 세균이 차지하는 비율이 약간 증가된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에서 분리한 세포밖 소포체에 대한 메타지노믹스(metagenomics)
정상 생쥐와 염증성 장염 생쥐의 대변에서 분리한 세포밖 소포체를 분석하기 위하여 메타지노믹스를 수행하였다. 이를 위하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 정상 및 염증성 장염 생쥐의 대변에서 세포밖 소포체를 분리하였고, 실시예 4와 동일한 방법으로 분리한 세포밖 소포체에 대한 메타지노믹스(metagenomics)를 수행하였다. 결과는 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에서 나타난 바와 같이, 문(phylum) 수준에서 비교하였을 때, 정상 생쥐의 대변에서는 Bacteroidetes와 Verrucomicrobia의 세포밖 소포체가 비율이 총 세균의 각각 48%, 26.1%를 차지한 데 비하여, 염증성 질환 생쥐의 대변에서는 각각 22.6%, 0.5%로 크게 감소된 것을 확인하였다.
도 7에서 나타난 바와 같이, 세포밖 소포체에 메타지노믹스를 종(species) 수준에서 분석한 결과는 정상 생쥐의 대변에서는 Akkermansia muciniphila와 Bacteroides acidifaciens의 비율이 총 세균의 각각 25.07%, 27.68%를 차지한 데 비하여, 염증성 질환 생쥐의 대변에서는 각각 0.4%, 2.3%로 크게 감소된 것을 확인하였다.
상기 실시예들은 정상 상태의 생쥐 및 염증성 장염 생쥐의 대변에서 분리한 세포밖 소포체에 대하여 메타지노믹스를 시행하여 정상 및 질병 상태에 존재하는 세포밖 소포체를 분비하는 세균의 변화를 최초로 규명한 것이다. 즉, 정상 상태의 대변에는 Akkermansia muciniphila, Bacteroides acidifaciens의 비율이 총 세균의 각각 0.33%, 0.21%를 차지한 데 비하여, 이들 세균에서 유래한 세포밖 소포체는 각각 25.07%, 27.68%를 차지하였다. 반면, 질병 상태인 경우 대변에 Akkermansia muciniphila, Bacteroides acidifaciens의 비율이 총 세균의 각각 0.87%, 0.43%로 정상 상태에 비하여 이들 세균이 차지하는 비율이 증가한 반면, 세포밖 소포체는 각각 0.4%, 2.31%로 정상 상태에 비하여 이들 세균에서 분비되는 세포밖 소포체의 비율이 현저히 감소하였다. 이는 Akkermansia muciniphila 또는 Bacteroides acidifaciens에서 유래하는 세포밖 소포체가 질병을 억제하여 정상 상태로 유지하는 면역 항상성(immune homeostasis)에 결정적인 역할을 담당함을 의미한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (7)
- 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는, 염증성 대장염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포밖 소포체는 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20 내지 800nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 유래 세포밖 소포체를 유효 성분으로 함유하는, 염증성 대장염 개선용 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 세포밖 소포체는 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 식품은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 균을 첨가하여 발효시킨 발효식품인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20 내지 800nm인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
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