JP7132661B2 - スフィンゴモナス属細菌由来のナノ小胞及びその用途 - Google Patents

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Description

本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来のナノ小胞及びその用途に関し、より具体的には、スフィンゴモナス属細菌に由来するナノ小胞を用いた肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎などの診断方法、前記小胞を含む前記疾患に対する予防、改善または治療用組成物、及び前記小胞を含む脳疾患治療薬物伝達用組成物などに関する。
本出願は、２０１８年１２月１０日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０１８－０１５８６２３号及び２０１９年１０月２３日付で出願された大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１３２１３８号に基づく優先権を主張し、該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は、本出願に援用される。
２１世紀に入って、過去の伝染病であると認識されていた急性感染性疾患の重要性が弱まる一方、ヒトとマイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）との不調和によって発生する免疫機能異常を伴う慢性疾患が生活の質とヒトの寿命を決める主な疾患として疾病パターンが変わってきた。２１世紀の難治性慢性疾患として、がん、心血管疾患、アレルギー－慢性肺疾患、代謝性疾患、及び神経－精神疾患がヒトの寿命と生活の質を決める主な疾患として、国民の健康において大きな問題になっている。
人体に共生する微生物の個数は、１００兆個に達し、ヒトの細胞よりも約１０倍と多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えることが知られている。マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた居住地に存在する真正細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）をいう。
人体に共生する細菌及び周辺環境に存在する細菌は、他の細胞への遺伝子、低分子化合物、タンパク質などの情報を交換するため、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成する。粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過できないが、細菌由来の小胞は、サイズが１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過して人体に吸収される。局所的に分泌された細菌由来の小胞は、粘膜の上皮細胞を通じて吸収されて局所炎症反応を誘導するだけでなく、上皮細胞を通過した小胞は、リンパ管を通じて全身的に吸収されて各臓器に分布し、分布した臓器で免疫及び炎症反応を調節する。例えば、大腸菌（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のような病原性グラム陰性細菌に由来する小胞は、局所的に炎症反応及びがんを起こし、血管に吸収された場合には、血管内皮細胞の炎症反応を通じて全身的な炎症反応及び血液凝固を促進させる。また、インスリンが作用する筋肉細胞などに吸収され、インスリン抵抗性と糖尿病を誘発する。一方、有益な細菌に由来する小胞は、病原性小胞による免疫機能及び代謝機能の異常を調節して疾病を調節し得る。
細菌に由来する小胞などの因子に対する免疫反応は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、以下、ＩＬ）－１７サイトカインの分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応が発生するが、これは細菌由来の小胞に露出時に上皮細胞、免疫細胞などからＩＬ－６が分泌され、これはＩＬ－１７分泌を特徴とするＴｈ１７免疫反応を誘導することによる。Ｔｈ１７免疫反応による炎症は、好中球浸潤を特徴とし、炎症が発生する過程において好中球、マクロファージなどのような炎症細胞から分泌される腫瘍壊死因子アルファ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、以下、ＴＮＦ－α）が炎症及びがんの発生に重要な役割を果たす。
スフィンゴモナス属（ｇｅｎｕｓ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）細菌は、水、土壌、及び植物の根などのように、自然界に広く生息する好気性グラム陰性細菌であって、他のグラム陰性細菌が細胞外膜にＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を有しているのに対し、その代わりに細胞外膜にＧＳＬ（ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）を有している。スフィンゴモナス属には、２０個の種が知られており、この中でスフィンゴモナス・パウシモビリス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）は、ヒトに病院内感染を引き起こすと報告されていた。しかし、まだ、前記菌を含んでスフィンゴモナス属細菌に由来する小胞を応用してがん、心血管疾患、アトピー性皮膚炎などのような難治性疾患の診断及び治療に応用した事例は、報告されていない。
そこで、本発明では、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞が健常者に比べて肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、及びアトピー性皮膚炎患者の臨床サンプルにおいて有意に減少していることを確認し、前記疾患を診断できることを確認した。また、スフィンゴモナス属細菌に属するスフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴモナス・コーリエンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）から小胞を分離し、その特性を分析した結果、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎などの疾患に対する予防または治療用組成物として用いられることを確認した。また、前記小胞を経口で投与したとき、脳に薬物を伝達できることを確認した。
本発明者らは、前記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、メタゲノム（Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）分析を通じて健常者に比べて肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎患者由来のサンプルにおいて、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の含量が有意に減少していることを確認した。また、スフィンゴモナス属細菌に属するスフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴモナス・コーリエンシス菌から小胞を分離して、マクロファージを処理したとき、病原性小胞によるＩＬ－６及びＴＮＦ－α分泌を著しく抑制することを確認し、これに基づいて本発明を完成した。
そこで、本発明は、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の診断方法または診断のための情報提供方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供することを他の目的とする。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む脳疾患治療薬物伝達用組成物を提供することを他の目的とする。
しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、以下の記載から当業者に明確に理解されるであろう。
前記のような本発明の目的を達成するため、本発明は、下記段階を含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）健常者及び被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を得る段階と、
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて健常者に比べてスフィンゴモナス属細菌由来の小胞の含量が低い場合、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患であると判定する段階。
また、本発明は、下記段階を含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の診断方法を提供する。
（ａ）健常者及び被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡに存在する遺伝子の配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を得る段階と、
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて健常者に比べてスフィンゴモナス属細菌由来の小胞の含量が低い場合、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患であると判定する段階。
本発明の一具現例として、前記（ａ）段階におけるサンプルは、血液または尿であってもよい。
本発明の他の具現例として、前記(ｂ)段階におけるプライマーペアは、配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーペアであってもよい。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。
前記組成物は、薬学的組成物、食品組成物及び化粧料組成物を含んでもよい。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防または治療方法を提供する。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物の肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防または治療用途を提供する。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む、脳に薬物を伝達する薬物伝達体組成物（または脳疾患治療薬物伝達用組成物）を提供する。
また、本発明は、目的とする脳疾患治療薬物を担持したスフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、脳疾患治療薬物伝達方法を提供する。
また、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の脳疾患治療薬物伝達用途を提供する。
本発明の一具現例として、前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍであるものであってもよい。
本発明の他の具現例として、前記小胞は、スフィンゴモナス属細菌から自然的または人工的に分泌されるものであってもよい。
本発明の他の具現例として、前記小胞は、細菌に熱処理、加圧処理などの方法で分泌されるものであってもよい。
本発明の他の具現例として、前記スフィンゴモナス属細菌由来の小胞は、スフィンゴモナス・パウシモビリスから分泌されるものであってもよい。
本発明の他の具現例として、前記スフィンゴモナス属細菌由来の小胞は、スフィンゴモナス・コーリエンシスから分泌されるものであってもよい。
本発明者らは、細菌である場合には体内に吸収されないが、細菌由来の小胞である場合には、上皮細胞を通じて体内に吸収され、全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺を通じて体外に排泄されることを確認し、患者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析により肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎患者の血液または尿に存在するスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が健常者に比べて有意に減少していることを確認した。また、スフィンゴモナス属細菌であるスフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴモナス・コーリエンシスを体外で培養して小胞を分離し、体外で炎症細胞に投与したとき、病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を有意に抑制することを観察した。また、スフィンゴモナス・パウシモビリス小胞を口腔に投与したとき、脳に小胞が伝達されることを観察した。そこで、本発明によるスフィンゴモナス属細菌由来の小胞は、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎に対する診断方法、及び化粧品、食品、または薬物などの前記疾患に対する予防、改善、または治療用組成物として使用されてもよく、さらに脳に薬物を伝達するための薬物伝達体として有用に用いられるものと期待される。
図１ａは、マウスに細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）と細菌由来の小胞（ＥＶ）を口腔に投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔に投与した後、１２時間目に血液、腎臓、肝臓、及びいくつかの臓器を摘出し、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。 図２は、マウスの腸内に細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を投与した後、腸粘膜上皮細胞に細菌と細菌由来の小胞の浸潤の有無を評価した図である（Ｌｕ：腸管内腔、ＬＰ：腸固有層（ｇｕｔ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ））。 図３は、肝硬変患者、肝がん患者、及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図４は、心筋梗塞患者及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図５は、腎不全患者及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図６は、糖尿病患者及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図７は、脳腫瘍患者及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図８は、軽度認知障害、アルツハイマー認知症患者及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図９は、うつ病患者及び健常者の血液に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図１０は自閉症患者及び健常者の尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図１１は、アトピー性皮膚炎患者及び健常者の血液及び尿に存在する細菌由来の小胞メタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を比較した結果である。 図１２は、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の細胞死滅効果を評価するため、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞をマクロファージ（Ｒａｗ２６４.７ ｃｅｌｌ）に処理して細胞死滅を評価した結果である（ＥＶ：細胞外小胞）。 図１３ａ及び図１３ｂは、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の炎症誘発効果を評価するため、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞をマクロファージ（Ｒａｗ２６４.７細胞）に処理し、炎症メディエーターの分泌程度を病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ. ｃｏｌｉ ＥＶ）と比較した結果で、図１３ａは、ＩＬ－６の分泌程度を比較したものであり、図１３ｂは、ＴＮＦ－α分泌の程度を比較したものである（ＥＶ：細胞外小胞）。 図１４ａ及び図１４ｂは、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の抗炎症効果を評価するため、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ. ｃｏｌｉ ＥＶ）処理の前に、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を前処理し、大腸菌小胞による炎症メディエーターの分泌に及ぼす影響を評価した結果で、図１４ａは、ＩＬ－６の分泌程度を比較したものであり、図１４ｂは、ＴＮＦ－α分泌の程度を比較したものである（ＳＰＣ１０１：スフィンゴモナス・パウシモビリス ＥＶ、ＥＶ：細胞外小胞）。 図１５ａ及び図１５ｂは、スフィンゴモナス・コーリエンシス由来の小胞の抗炎症効果を評価するため、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ. ｃｏｌｉ ＥＶ）処理の前にスフィンゴモナス・コーリエンシス由来の小胞を前処理し、大腸菌小胞による炎症メディエーターの分泌に及ぼす影響を評価した結果で、図１５ａは、ＩＬ－６の分泌程度を比較したものであり、図１５ｂは、ＴＮＦ－α分泌の程度を比較したものである（ＳＰＣ１０２：スフィンゴモナス・コーリエンシス ＥＶ、ＥＶ：細胞外小胞）。 図１６は、マウスにスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を口腔に投与した後、時間別に小胞の分布様相を撮影した写真である。 図１７は、マウスにスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を口腔に投与した後、脳組織で小胞の分布様相を時間別に評価した図である。
本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞及びその用途に関する。
本発明者らは、メタゲノム解析を通じて健常者に比べて肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎患者由来のサンプルにおいて、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の含量が著しく減少していることを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。
そこで、本発明は、下記段階を含む肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の診断方法または診断のための情報提供方法を提供する。
（ａ）健常者及び被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階と、
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づいて作製したプライマーペアを用いてＰＣＲを行った後、それぞれのＰＣＲ産物を得る段階と、
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じてスフィンゴモナス属細菌由来の小胞の含量が低い場合、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患であると判定する段階。
本発明において使用される用語の「診断」とは、広義には患者の病気の実態をあらゆる面にわたって判断することを意味する。判断の内容は、病名、病因、病型、軽重、病状の詳細な態様、合併症の有無、及び予後等である。本発明において、診断は、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、またはアトピー性皮膚炎などの発症の有無及び疾患のレベルなどを判断するものである。
本発明において使用される用語の「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）」または「小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、様々な細菌から分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。グラム陰性菌由来小胞、または外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＯＭＶｓ）は、内毒素（リポポリサッカライド）またはグリコスフィンゴ脂質）、毒性タンパク質、及び細菌ＤＮＡとＲＮＡも有し、グラム陽性菌由来小胞は、タンパク質と核酸の他にも細菌の細胞壁構成成分であるペプチドグリカンとリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ ａｃｉｄ）も有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、スフィンゴモナス属細菌から自然に分泌されるか、または細菌の熱処理、加圧処理などによって人工的に生産するもので、１０～２００ｎｍの平均直径を有している。
本発明において使用される用語の「メタゲノム」とは、「群遺伝体」ともいい、土、動物の舎など孤立した地域内のあらゆるウイルス、細菌、カビなどを含む遺伝体の総合を意味するもので、主に培養されていない微生物を分析するため、配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念として用いられる。特に、メタゲノムは、一種のゲノム、遺伝体をいうのではなく、一環境単位のすべての種の遺伝体として一種の混合遺伝体をいう。これはオミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、様々な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から生まれた用語である。技術的には、速い配列分析法を用いて、種にかかわらず、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析し、一環境内におけるすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を究明する技法の対象である。
前記小胞は、スフィンゴモナス属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、高圧処理、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、凍結－融解、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによるろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、及びキャピラリー電気泳動からなる群から選ばれた一つ以上の方法を用いて分離してもよい。また、不純物の除去のための洗浄、得られた小胞の濃縮などのプロセスをさらに含んでもよい。
本発明において、前記（ａ）段階におけるサンプルは、血液または尿であってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明において、前記（ｂ）段階におけるプライマーペアは、配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列を含むプライマーペアであってもよいが、これに制限されるものではない。
本発明の他の態様において、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。
前記組成物は、薬学的組成物、食品組成物、及び化粧料組成物を含む。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防または治療用途を提供する。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物の肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患の予防または治療用途を提供する。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた一つ以上の疾患に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、目的とする脳疾患治療薬物を担持したスフィンゴモナス属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、脳疾患治療薬物伝達方法を提供する。
本発明のさらに他の態様において、本発明は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の脳疾患治療薬物伝達用途を提供する。
本発明において使用される用語の「予防」とは、本発明による組成物の投与により肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、アトピー性皮膚炎などを抑制させるか、発症を遅らせるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語の「治療」とは、本発明による組成物の投与により肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、アトピー性皮膚炎などに対する症状が好転されるか、有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語の「改善」とは、治療される状態に関連するパラメータ、例えば、症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。
本発明において使用される用語の「薬物伝達体」とは、特定の臓器、組織、細胞、または細胞小器官に薬物を伝達するため、本発明による組成物に薬物をロードして伝達するすべての手段または行為を意味する。
本発明の一実施例では、細菌及び細菌由来の小胞をマウス経口で投与して細菌及び小胞の体内吸収、分布、及び排泄様相を評価し、細菌である場合には、腸粘膜を通じて吸収されないのに対して、小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓などによって排泄されることを確認した（実施例１参照）。
本発明の他の実施例では、細菌と細菌由来の小胞を腸に直接投与して粘膜の防御膜を通過するかを評価したところ、細菌である場合には、粘膜の防御膜を通過できなかったが、細菌由来の小胞である場合には、粘膜の防御膜を通過することを確認した（実施例２参照）。
本発明のさらに他の実施例では、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎患者及び前記患者と年齢及び性別をマッチングした健常者の血液または尿から分離した小胞を用いて、細菌のメタゲノム解析を行った。その結果、健常者のサンプルに比べて、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎患者の臨床サンプルにおいてスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（実施例４～１２参照）。
本発明のさらに他の実施例では、スフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴマナスコリンシス菌株を培養し、これから分泌された小胞の炎症誘発効果を評価したが、様々な濃度の前記細菌由来の小胞をマクロファージに処理した後、代表的な病原性小胞である大腸菌由来の小胞を処理して炎症メディエーターの分泌程度を比較した結果、大腸菌由来の小胞によるＩＬ－６及びＴＮＦ－α分泌に比べて、前記スフィンゴモナス属細菌由来の小胞による炎症メディエーターの分泌能が著しく減少していた（実施例１４参照）。
本発明のさらに他の実施例では、スフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴモナス・コーリエンシス菌株由来の小胞の抗炎症効果を評価したが、病原性小胞である大腸菌由来の小胞を処理する前に、様々な濃度のスフィンゴモナス・ポッシュモービルリース及びスフィンゴモナス・コーリエンシス由来の小胞をマクロファージに処理した後、炎症メディエーターの分泌を評価した結果、炎症誘発大腸菌由来の小胞によるＩＬ－６及びＴＮＦ－α分泌を前記小胞が効率的に抑制することを確認した（実施例１５及び１６参照）。
本発明のさらに他の実施例では、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を経口で投与したとき、１時間が経過した時点から胃に前記小胞が分布し、３時間が経過した時点から小腸及び大腸にも分布されることを確認し、このような臓器内の分布は、７２時間まで維持されることを確認した。さらに、蛍光標識したスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞は、特異的に３時間から脳に移動して３２時間まで増加したが、以後、７２時間が経過した時点まで次第に減少することを確認した（実施例１７参照）。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、これに限定されず、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液などの他の通常の添加剤をさらに含んでもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化してもよい。適切な薬学的に許容される担体及び製剤化については、レミントンの文献に開示されている方法を用いて、各成分に基づいて好ましく製剤化してもよい。本発明の薬学的組成物は、剤形に特段の制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤などに製剤化してもよい。
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚に適用）してもよく、投与量は、患者の状態及び体重、疾患の程度、薬物形態、投与経路及び時間によって異なるが、当業者によって適切に選ばれてもよい。
本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出割合、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野においてよく知られている要素によって決定されてもよい。本発明による組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは、順次または同時に投与されてもよく、単一又は多重投与されてもよい。前記要素をすべて考慮し、副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
具体的には、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって異ってもよく、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢などによって増減されてもよい。
本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加するか、または他の食品または食品成分とともに使用されてもよく、通常の方法によって適切に使用されてもよい。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）によって適切に決められてもよい。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは、１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康及び衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下であってもよい。
本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有するもののほか、他の成分には特に制限がなく、通常の飲料のように様々の香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有してもよい。上述の天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖などと、ジサッカライド、例えばマルトース、スクロースなどと、ポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。上述のもの以外の香味剤として、天然香味剤（ソーマチン、ステビアエキス、例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリシンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使用してもよい。前記天然炭水化物の割合は、当業者の選択によって適切に決められてもよい。
前記の他に、本発明の食品組成物は、種々の栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含んでもよい。これらの成分は、独立してまたは組み合わせて使用してもよい。これらの添加剤の割合も当業者によって適切に選ばれてもよい。
本発明の前記化粧料組成物は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞だけでなく、化粧料組成物に通常用いられる成分を含んでもよく、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、及び香料などの通常のサプリメント、また、担体を含んでもよい。
また、本発明の組成物は、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の他に、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞と反応して皮膚の保護効果を損なわない範囲で、従来から使用されてきた有機紫外線遮断剤を混合して使用してもよい。前記有機紫外線遮断剤としては、グリセリルＰＡＢＡ、ドロメトリゾールトリシロキサン、ドロメトリゾール、ジガロイルトリオレエート、フェニルジベンズイミダゾールテトラスルフォネート二ナトリウム、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、ＤＥＡ－メトキシシンメイト、ローソンとジヒドロキシアセトンとの混合物、メチレンビス－ベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、４－メチルベンジリデンキャンパー、メンチルアントラニレート、ベンゾフェノン－３（オキシベンゾン）、ベンゾフェノン－４、ベンゾフェノン－８（デオキシフェベンゾン）、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、シノキサート、エチルジヒドロキシプロピルＰＡＢＡ、オクトクリレン、エチルヘキシルジメチルＰＡＢＡ、エチルヘキシルメトキシシンナメート、エチルヘキシルサリシレート、エチルヘキシルトリアゾン、イソアミル－ｐ－メトキシシンナメート、ポリシリコン－１５（ジメチコジエチルベンザルマロネート）、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸及びその塩類、ＴＥＡ－サリシレート及びアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）からなる群から選ばれた１種以上を使用してもよい。
本発明の化粧料組成物を添加できる製品としては、例えば、収れん化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーションなどのような化粧品類とクレンジング、洗顔剤、石鹸、トリートメント、美容液などがある。本発明の化粧料組成物の具体的な剤形としては、スキンローション、スキンソフトナー、スキントナー、アストリンジェント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、乳液、口紅、メイクアップベース、ファンデーション、プレストパウダー、ルースパウダー、アイシャドウなどの剤形を含む。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例１．細菌及び細菌由来の小胞の体内吸収、分布、及び排泄の様相分析］
細菌と細菌由来の小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するため、下記のような方法で実験を行った。まず、マウスの胃腸に蛍光で標識した前記細菌と、前記細菌由来の小胞をそれぞれ５０μｇの容量で口腔投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体のイメージを観察した結果、図１ａに示すように、細菌の場合には、全身的に吸収されなかったが、細菌由来の小胞の場合には、投与後５分で全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱で蛍光が濃く観察され、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かり、また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった（図１ａ参照）。
前記細菌と細菌由来の小胞が全身的に吸収された後、いくつかの臓器に浸潤された様相を評価するため、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来の小胞を前記方法のように投与した後、投与１２時間後に血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組織において蛍光を観察した結果、図１ｂに示すように、細菌由来の小胞は、血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は、吸収されないことが分かった（図１ｂ参照）。
［実施例２．細菌及び細菌由来の小胞の腸粘膜防御膜浸透の有無の評価］
細菌と細菌由来の小胞が粘膜防御膜を通過して組織に浸潤されるかを評価するため、細菌と細菌由来の小胞を腸に直接投与した後、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方法により粘膜防御膜を通過して腸組織への浸潤を評価した。粘膜組織において細菌と小胞の存在を評価するため、細菌と小胞に対する抗体を作製してＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を付けて使用し、ＤＡＰＩ（４、６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ ２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色を行った後、顕微鏡で観察した。
その結果、細菌の場合には、粘膜防御膜を通過できなかった反面、細菌由来の小胞は、粘膜に通過して腸組織に浸潤されることを確認した（図２参照）。
［実施例３.臨床サンプルにおける細菌由来の小胞メタゲノム解析］
血液または尿を先に１０ｍｌのチューブに入れ、遠心分離機（３,５００ｘｇ、１０ｍｉｎ、４℃）で浮遊物を沈めた後、上澄み液だけを新しい１０ｍｌのチューブに移した。０.２２μｍのフィルターを使用して細菌及び異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移して１５００ｘｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さな物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０.２２μｍのフィルターを使用してバクテリア及び異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０,０００ｘｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離を行い、上澄み液を除去した後、塊状のペレットを生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で溶かした。
前記方法で分離した小胞１００μｌを１００℃でボイルして内部のＤＮＡを脂質外に出るようにし、その後、氷で５分間冷やした。そして、残りの浮遊物を除去するために１０,０００ｘｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた後、ナノドロップ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を用いてＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するため、下記表１に示す１６ｓ ｒＤＮＡプライマーでＰＣＲを行い、前記抽出された遺伝子に細菌由来の遺伝子が存在することを確認した。
Figure 0007132661000001
前記方法で抽出したＤＮＡを前記１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用して増幅を行った後、シーケンシングを行って（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、結果をＳＦＦ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ）ファイルとして出力し、ＧＳ ＦＬＸソフトウェア（ｖ２.９）を用いてＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（.ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認した後、ｗｉｎｄｏｗ（２０ ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。ＯＴＵ（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ）分析のためにＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを用いてシーケンス類似度によってクラスタリングを行い、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％のシーケンス類似度を基準にクラスタリングを行い、各ＯＴＵの門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、 目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｕｓ）レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＲＮＡシーケンスデータベース（１０８,４５３シーケンス）を用いて、属レベルで９７％以上のシーケンス類似度を有する細菌をプロファイリングした（ＱＩＩＭＥ）。
［実施例４．肝疾患患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で肝硬変患者９７人、肝がん患者７６人、さらに年齢と性別をマッチングした健常者１７１人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて肝硬変及び肝がん患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した(図３参照）。
［実施例５.心筋梗塞患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で心筋梗塞患者６９人と、年齢と性別をマッチングした健常者１５９人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて心筋梗塞患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図４参照）。
［実施例６．腎不全患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で腎不全患者３６人と、年齢と性別をマッチングした健常者７２人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて腎不全患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図５参照）。
［実施例７．糖尿病患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で糖尿病患者８１人と、年齢と性別をマッチングした健常者１２６人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて糖尿病患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図６を参照）。
［実施例８．脳腫瘍患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で脳患者８０人と、年齢と性別をマッチングした健常者１２１人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて脳腫瘍患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図７参照）。
［実施例９．軽度認知障害及び認知症患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で軽度認知障害患者７６人、アルツハイマー認知症患者７０人、及び年齢と性別をマッチングした健常者１４６人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて軽度認知障害及びアルツハイマー認知症患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図８参照）。
［実施例１０．うつ病患者の血液における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法でうつ病患者７０人と、年齢と性別をマッチングした健常者１４０人の血液を対象に、血液中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液に比べて、うつ病患者の血液でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図９参照）。
［実施例１１．自閉症患者の尿における細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法で自閉症患者３０人と、年齢と性別をマッチングした健常者４０人の尿を対象に、尿中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の尿に比べて自閉症患者の尿中でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図１０を参照）。
［実施例１２．アトピー性皮膚炎患者の血液及び尿において細菌由来の小胞メタゲノム解析］
前記実施例３の方法でアトピー性皮膚炎患者６１人と、年齢と性別をマッチングした健常者５２人の血液及び尿を対象に、血液及び尿中に存在する小胞から遺伝子を抽出してメタゲノム解析を行った後、スフィンゴモナス属細菌由来の小胞の分布を評価した。その結果、健常者の血液及び尿に比べてアトピー性皮膚炎患者の血液及び尿でスフィンゴモナス属細菌由来の小胞が有意に減少していることを確認した（図１１を参照）。
［実施例１３．スフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴモナス・コーリエンシス培養液からの小胞分離］
スフィンゴモナス・パウシモビリス及びスフィンゴモナス・コーリエンシス菌株を培養した後、その小胞を分離して特性を分析した。前記菌株を３７℃培養器で吸光度（ＯＤ ６００）が１.０～１.５になるまで、ＭＲＳ（ｄｅ Ｍａｎ－Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ）培地で培養した後、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にサブカルチャーした。以後、菌株が含まれている培養液を回収して１０,０００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌体を除去し、０.２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過した上澄み液を１００ ｋＤａ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｃａｓｓｅｔｔｅフィルターメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳ）でＭａｓｔｅｒＦｌｅｘポンプシステム（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ、ＵＳ）を用いて微細ろ過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって５０ｍｌ以下の体積で濃縮した。濃縮させた上澄み液を再び０.２２μｍのフィルターでろ過した後、ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）アッセイを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して下記実験を行った。
［実施例１４．スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の炎症誘発効果］
炎症細胞においてスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ ＥＶ、ＳＰＣ１０１）の炎症メディエーター（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）の分泌に対する影響を調べるため、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ ２６４.７細胞にスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を様々な濃度（０.１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞死滅とＥＬＩＳＡを行った。
より具体的には、４８－ｗｅｌｌ細胞培養プレート内に５×１０４個ずつ分注したＲａｗ ２６４.７細胞にＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｏｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ Ｍｅｄｉｕｍ）無血清培地で希釈した様々な濃度のスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を処理して１２時間の間培養した。以後、細胞死滅は、ＥＺ－ＣＹＴＯＸ（Ｄｏｇｅｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて測定し、細胞培養液は、１.５ｍｌのチューブに集めて３０００ｘｇで５分間遠心分離し、上澄み液を集めて－８０℃で保管しておいてＥＬＩＳＡを行った。
ＥＬＩＳＡを行うため、捕捉抗体をＰＢＳに希釈して９６ウェルポリスチレンプレートに作用濃度に合わせて５０μｌずつ分注した後、４℃で一晩反応させた。以後、ＰＢＳＴ（０.０５％ｔｗｅｅｎ－２０が含まれているＰＢＳ）溶液１００μｌで３回ずつ洗浄した後、ＲＤ（１％ＢＳＡが含まれているＰＢＳ）溶液１００μｌを分注して常温で１時間の間ブロッキングした。次に、サンプル及びスタンダードを濃度に合わせて５０μｌずつ分注し、常温で２時間の間反応させてＰＢＳＴ １００μｌで３回洗浄した後、検出抗体をＲＤに希釈させて作用濃度に合わせて５０μｌずつ分注して、室温で２時間の間反応させた。次に、ＰＢＳＴ １００μｌで３回洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）をＲＤに１／４０で希釈させて５０μｌずつ分注して、常温で２０分間反応させた。
最後に、ＰＢＳＴ １００μｌで３回洗浄した後、ＴＭＢ（３，３'，５，５'－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ、ＵＳＡ）５０μｌを分注し、５分から２０分後に発色が進行したとき、１Ｍ硫酸溶液を５０μｌずつ分注して反応を停止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ３マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。
その結果、図１２に示すように、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞（ＳＰＣ １０１）の処理による細胞死滅は、観察されなかった（図１２参照）。また、炎症細胞における炎症メディエーターの分泌様相を評価した結果、陽性対照群である大腸菌由来の小胞（Ｅ. ｃｏｌｉ ＥＶ １μｇ／ｍｌ）処理時に比べて、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞（ＳＰＣ１０１）の処理時、ＩＬ－６（図１３ａ）及びＴＮＦ－α（図１３ｂ）のような炎症メディエーターの分泌がはるかに減少していることを確認した（図１３ａ及び図１３ｂ参照）。
［実施例１５．スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の抗炎症効果］
前記実施例１４の結果に基づいて、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の抗炎症効果を評価するため、様々な濃度（０.１、１、１０μｇ／ｍｌ）のスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞（ＳＰＣ１０１）をマウスマクロファージ細胞株に１２時間前処理した後、病原性原因因子である大腸菌由来の小胞１μｇ／ｍｌを処理し、１２時間後に炎症性サイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。
その結果、スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を前処理時、大腸菌由来の小胞刺激による炎症細胞に誘導されるＩＬ－６（図１４ａ）及びＴＮＦ－α(図１４ｂ）のような炎症メディエーターの分泌が著しく抑制されることを確認した（図１４ａ及び１４ｂ参照）。
［実施例１６．スフィンゴモナス・コーリエンシス由来の小胞の抗炎症効果］
前記実施例１６の結果に基づいて、他のスフィンゴモナス属細菌の抗炎症効果を評価するため、スフィンゴモナス・コーリエンシス由来の小胞（ＳＰＣ１０２）を様々な濃度（０.１、１、１０μｇ／ｍｌ）でマウスマクロファージ細胞株に１２時間前処理した後、病原性原因因子である大腸菌由来の小胞１μｇ／ｍｌを処理し、１２時間後に炎症性サイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。
その結果、スフィンゴモナス・コーリエンシス由来の小胞を前処理時、大腸菌由来の小胞刺激による炎症細胞に誘導されるＩＬ－６（図１５ａ）及びＴＮＦ－α（図１５ｂ）のような炎症メディエーターの分泌が著しく抑制されることを確認した（図１５ａ及び１５ｂ参照）。
［実施例１７．スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞の分布様相］
スフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞を経口で投与したとき、時間別の臓器内の吸収及び分布を確認するため、以下のような方法で実験を行った。蛍光で標識したスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞１０μｇを経口で投与し、それぞれ１、３、６、３２、４８、７２時間後に蛍光を側定した。マウス全体のイメージの蛍光を観察した結果、経口投与１時間からスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞が胃に分布し、３時間からは小腸及び大腸にも分布することを確認し、これらの臓器内の分布が７２時間まで維持されることを観察した（図１６参照）。
また、蛍光標識したスフィンゴモナス・パウシモビリス由来の小胞は、特異的に３時間から脳へ移動することが確認され、脳へ移動した細胞外小胞の分布度が３２時間まで増加し、３２時間以降から７２時間まで次第に減少することを確認した（図１７参照）。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を持つ者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解できるだろう。したがって、前述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解しなければならない。
本発明によるスフィンゴモナス属細菌由来の小胞は、上皮細胞を通じて体内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝臓、肺によって体外に排泄されることが確認され、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎患者の血液または尿で有意に減少していることが確認され、病原性小胞による炎症メディエーターの分泌を有意に抑制し得る。したがって、本発明によるスフィンゴモナス属細菌由来の小胞は、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病、自閉症、及びアトピー性皮膚炎に対する診断方法、及び化粧品、食品、または薬物などの前記疾患に対する予防、改善、または治療用組成物として使用されてもよく、さらに脳に薬物を伝達するための薬物伝達体として有用に用いられてもよいという点で、産業的利用価値が大きいと予想される。

Claims (2)

  1. 下記段階を含む、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた１以上の疾患の診断のための情報提供方法。
    （ａ）健常者及び被検者のサンプルから分離した小胞からＤＮＡを抽出する段階と、
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１及び配列番号２で表されるプライマーからなるプライマーペアを用いてＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、それぞれのＰＣＲ産物を得る段階と、
    （ｃ）前記ＰＣＲ産物の定量分析を通じて健常者に比べてスフィンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）属細菌由来の小胞の割合が低い場合、肝硬変、肝がん、心筋梗塞、腎不全、糖尿病、脳腫瘍、軽度認知障害、認知症、うつ病及びアトピー性皮膚炎からなる群から選ばれた１以上の疾患であると判定する段階。
  2. 前記（ａ）段階におけるサンプルは、血液または尿であることを特徴とする、請求項１に記載の情報提供方法。
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