WO2020122450A1 - 스핀고모나스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도 - Google Patents

스핀고모나스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도 Download PDF

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WO2020122450A1
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김윤근
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to nano vesicles derived from bacteria of the genus Spingomonas and uses thereof, more specifically, cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes mellitus, brain tumor, mild cognitive impairment using nanovesicles derived from bacteria from the genus Spingomonas, Dementia, depression, autism, and atopic dermatitis diagnostic methods, and prevention, improvement or treatment for the disease containing the vesicles, and brain disease treatment composition containing the vesicles.
  • Microbiota refers to a microbial community (microbial community), including bacteria, archae, and eukarya.
  • the mucous membrane forms a physical barrier that cannot pass particles over 200 nanometers (nm) in size, and in the case of bacteria that symbiotic with the mucous membrane, it does not pass through the mucous membrane, but the bacterial-derived vesicles are less than 100 nanometers in size. It passes through epithelial cells through the mucous membrane and is absorbed by our body. Locally secreted bacterial-derived vesicles are absorbed through epithelial cells of the mucous membrane to induce a local inflammatory reaction.
  • vesicles that have passed through the epithelial cells are absorbed systemically through the lymphatic vessels and distributed to each organ. It regulates immune and inflammatory responses.
  • vesicles derived from pathogenic Gram-negative bacteria such as E. coli ( Eshcherichia coli ) locally cause inflammatory reactions and cancer, and when absorbed into blood vessels, systemic inflammation and blood clotting through vascular endothelial inflammatory reactions Promotes.
  • insulin is absorbed by acting muscle cells and the like, causing insulin resistance and diabetes.
  • vesicles derived from beneficial bacteria can control disease by controlling immune and metabolic abnormalities caused by pathogenic vesicles.
  • the immune response to factors such as bacterial-derived vesicles is caused by a Th17 immune response characterized by the secretion of interleukin-17 cytokines, which is IL in epithelial cells, immune cells, etc. when exposed to bacterial-derived vesicles -6 is secreted, which induces a Th17 immune response characterized by IL-17 secretion.
  • Th17 immune response characterized by neutrophil infiltration, and tumor necrosis factor-alpha (TNF- ⁇ ) secreted from inflammatory cells such as neutrophils and macrophages during inflammation And plays an important role in cancer development.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor-alpha
  • Genus Sphingomonas bacteria are aerobic Gram-negative bacteria that are widely inhabited in nature, such as water, soil, and plant roots, while other Gram-negative bacteria have lipopolysaccharides (LPS) on the outer membrane. It has a GSL (glycosphingolipid) on the extracellular membrane. Twenty species are known in the genus Spingomonas , of which Sphingomonas paucimobilis has been reported to cause infections in hospitals in humans. However, there have been no reports on the application of vesicles derived from bacteria of the genus Spingomonas, including the above-mentioned bacteria, to the diagnosis and treatment of incurable diseases such as cancer, cardiovascular disease and atopic dermatitis.
  • LPS lipopolysaccharides
  • the diseases are diagnosed by confirming that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas are significantly reduced in clinical samples of patients with cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumors, and atopic dermatitis compared to normal humans.
  • the diseases are diagnosed by confirming that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas are significantly reduced in clinical samples of patients with cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumors, and atopic dermatitis compared to normal humans. was confirmed.
  • the present inventors as a result of earnest research to solve the above-mentioned conventional problems, metagenome (Metagenome) analysis compared to normal cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, In samples derived from patients with autism and atopic dermatitis, it was confirmed that the content of bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas was significantly reduced.
  • metagenome Metalnome
  • the present invention provides a method for diagnosing or diagnosing one or more diseases selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis. It is aimed at providing.
  • the present invention is one selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis, which contains bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas as an active ingredient.
  • Another object is to provide a composition for preventing, improving or treating the above diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for drug delivery for the treatment of brain diseases comprising bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas.
  • the present invention comprises the following steps, liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis Provides informational methods for the diagnosis of one or more diseases selected from the group:
  • the present invention comprises the following steps, liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis diagnosis method of one or more diseases selected from the group to provide:
  • the sample in step (a) may be blood or urine.
  • the primer pair in the step (b) may be a primer pair comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the present invention is selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis, which contain bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas as an active ingredient.
  • a composition for preventing, improving or treating one or more diseases is provided.
  • the composition may include a pharmaceutical composition, food composition and cosmetic composition.
  • the present invention comprises the step of administering to a subject a composition comprising a bacterial-derived vesicle of the genus Spingomonas as an active ingredient, cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, It provides a method of preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of autism and atopic dermatitis.
  • the present invention prevents one or more diseases selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis of bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas. Provides therapeutic use.
  • the present invention is from the group consisting of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis of the composition containing bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas as an active ingredient. It provides for the prophylactic or therapeutic use of one or more selected diseases.
  • the present invention is used for one or more diseases selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis of bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas. It provides a use for producing a drug.
  • the present invention provides a drug delivery composition (or a composition for drug delivery to treat brain diseases), which contains a bacterial-derived vesicle from the genus Spingomonas as an active ingredient.
  • the present invention provides a method of delivering a drug for treating brain diseases, comprising administering to a subject a composition comprising a bacterial-derived vesicle of the genus Spingomonas carrying the drug for treating brain diseases of interest.
  • the present invention provides a drug for the treatment of brain disease treatment of bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas.
  • the vesicle may have an average diameter of 10 to 200 nm.
  • the vesicle may be naturally or artificially secreted from bacteria of the genus Spingomonas.
  • the vesicle may be secreted by a method such as heat treatment or pressure treatment to bacteria.
  • the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas may be secreted from Spingomonas posimobilis.
  • the bacterial vesicles from the genus Spingomonas may be secreted from Spingomonas corinsis.
  • the present inventors have confirmed that, in the case of bacteria, they are not absorbed into the body, but in the case of bacterial-derived vesicles, they are absorbed into the body through epithelial cells, distributed systemically, and excreted outside the body through the kidneys, liver, and lungs.
  • Bacterial-derived bacterial-derived metagenome analysis results in spingomonas-derived bacteria present in the blood or urine of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis It was confirmed that the vesicles were significantly reduced compared to normal people.
  • the bacterial cells of the genus Spingomonas, Spingomonas posimobilis and Spingomonas corinsis were cultured in vitro to separate vesicles, and when administered to inflammatory cells in vitro, the secretion of inflammatory mediators by pathogenic vesicles was significantly suppressed. Was observed. In addition, it was observed that the vesicles are delivered to the brain when the spingomonas posimobilis vesicles are administered orally.
  • the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas include cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and diagnostic methods for atopic dermatitis, and cosmetics, food, Or it can be used as a composition for preventing, improving, or treating the disease, such as drugs, and is expected to be useful as a drug delivery system for delivering drugs to the brain.
  • Figure 1a is a photograph of the distribution pattern of bacteria and vesicles by time after oral administration of bacteria and bacterial-derived vesicles (EV) to mice, and Figure 1b is 12 hours after oral administration. This is a figure that evaluates the distribution of bacteria and vesicles in the body by extracting blood, kidneys, liver, and various organs.
  • Figure 2 is a diagram evaluating whether or not bacteria and bacteria-derived vesicles infiltrate into intestinal mucosal epithelial cells after administration of bacteria and bacteria-derived vesicles (EV) into the intestine (Lu, gut lumen; LP, gut lamina intestinal) .
  • EV bacteria and bacteria-derived vesicles
  • 3 is a result of comparing the distribution of bacterial-derived vesicles in the genus Spingomonas after performing metagenome analysis of bacterial-derived vesicles present in the blood of cirrhosis patients, liver cancer patients, and normal persons.
  • 5 is a result of comparing the distribution of bacterial-derived vesicles in the genus Spingomonas after performing metagenome analysis of the bacterial-derived vesicles present in the blood of renal failure patients and normal persons.
  • 6 is a result of comparing the distribution of bacterial-derived vesicles in the genus Spingomonas after performing metagenome analysis of bacterial-derived vesicles present in the blood of diabetic patients and normal persons.
  • Figure 8 is a result of comparing the distribution of bacteria-derived vesicles in the genus Spingomonas after performing a metagenome analysis of bacteria derived from the blood of mild cognitive impairment, Alzheimer's dementia patients and normal people.
  • 11 is a result of comparing the distribution of bacterial-derived vesicles in the genus Spingomonas after performing metagenome analysis of bacterial-derived vesicles present in the blood and urine of atopic dermatitis patients and normal persons.
  • FIG. 13A and 13B are treated with spingomonas posimobilis-derived vesicles to macrophages (Raw264.7 cell) to evaluate the inflammatory effect of spingomonas posimobilis-derived vesicles, and the degree of inflammatory mediator secretion is pathogenic.
  • E. coli vesicle E. coli EV
  • FIG. 13A compares IL-6 secretion
  • FIG. 13B compares TNF- ⁇ secretion (EV: extracellular vesicle).
  • E. coli vesicles E. coli EV
  • FIG. 14A compares IL-6 secretion level
  • FIG. 14B compares TNF- ⁇ secretion level (SPC101, Sphingomonas paucimobilis EV; EV, extracellular vesicle) ).
  • FIG. 15A and 15B are pre-processed of Spingomonas corinsis-derived vesicles before treatment with E. coli EV, which is a pathogenic vesicle, in order to evaluate the anti-inflammatory effect of vesicles derived from Spingomonas corinsis, by E. coli vesicles.
  • FIG. 15A is a comparison of IL-6 secretion level
  • FIG. 15B is a comparison of TNF- ⁇ secretion level (SPC102, Sphingomonas koreensis EV; EV, extracellular vesicle).
  • Figure 16 is a photograph of the distribution of vesicles over time after administration of oral vesicles derived from Spingomonas posimobilis to mice.
  • FIG. 17 is a graph in which the distribution pattern of vesicles in brain tissues was evaluated hourly after administration of oral vesicles derived from Spingomonas posimobilis to mice.
  • the present invention relates to bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas and uses thereof.
  • metagenome analysis shows that the content of bacterial-derived vesicles in the genus Spingomonas in samples derived from liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis It was confirmed that this is significantly reduced, and based on this, the present invention was completed.
  • the present invention comprises the following steps of liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumors, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis diagnosis method or diagnosis of one or more diseases Provides informational methods for:
  • diagnosis used in the present invention means, in a broad sense, judging the actual condition of a patient's illness across all aspects.
  • the content of the judgment is disease name, etiology, type, severity, detailed aspects of the bed, presence of complications, and prognosis.
  • Diagnosis in the present invention is to determine whether the onset and disease level, such as cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, or atopic dermatitis.
  • Nenovesicle or "Vesicle” as used in the present invention means a structure made of nano-sized membranes secreted by various bacteria.
  • Gram-negative bacteria-derived vesicles, or outer membrane vesicles (OMVs) also contain lipopolysaccharides or glycosphingolipids, toxic proteins, and bacterial DNA and RNA.
  • vesicles derived from gram-positive bacteria also contain bacterial cell wall components, peptidoglycan and lipoteichoic acid.
  • the nanovesicles or vesicles are naturally secreted from bacteria of the genus Spingomonas or artificially produced by heat treatment, pressure treatment, etc. on bacteria, and have an average diameter of 10 to 200 nm.
  • the term “metagenome”, also called “military genome”, refers to the sum of genomes including all viruses, bacteria, fungi, etc. in isolated areas such as soil and animal intestines. It is used as a concept of genome to identify many microorganisms at once by using a sequencer to analyze microorganisms that are not.
  • metagenome does not refer to a genome or genome of one species, but a genome of all species of one environmental unit. This is a term that comes from the viewpoint that when defining a species in the course of biological development, it is functionally not only one existing species, but also various species interacting with each other to make a complete species.
  • using rapid sequencing it analyzes all DNA and RNA regardless of species, and is a target for techniques to identify all species in one environment and to identify interactions and metabolism.
  • the vesicle is centrifuged, ultra-high-speed centrifugation, high-pressure treatment, extrusion, sonication, cell lysis, homogenization, freeze-thaw, electroporation, mechanical degradation, chemical treatment, filter It can be separated using one or more methods selected from the group consisting of filtration, gel filtration chromatography, free-flow electrophoresis, and capillary electrophoresis. In addition, it may further include a process for removing impurities, concentration of the obtained vesicles, and the like.
  • the sample in step (a) may be blood or urine, but is not limited thereto.
  • the primer pair in the step (b) may be a primer pair comprising a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the present invention includes spinomonas bacterial-derived vesicles as an active ingredient, cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis It provides a composition for the prevention, improvement or treatment of one or more diseases selected from the group consisting of.
  • the composition includes a pharmaceutical composition, a food composition, and a cosmetic composition.
  • the present invention comprises the step of administering to a subject a composition comprising a bacterial-derived vesicle from the genus Spingomonas as an active ingredient, cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mildness It provides a method of preventing or treating one or more diseases selected from the group consisting of disorder, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis.
  • the present invention is selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis of the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas. It provides for the prevention or treatment of one or more diseases.
  • the present invention is cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and It provides a prophylactic or therapeutic use for one or more diseases selected from the group consisting of atopic dermatitis.
  • the present invention is selected from the group consisting of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, renal failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis of the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas.
  • the present invention comprises the step of administering to a subject a composition comprising a bacterial-derived vesicle from the genus Spingomonas carrying a drug for treating brain disease as an active ingredient, a method for delivering a drug for treating brain disease gives
  • the present invention provides a drug for the treatment of brain disease treatment of vesicles derived from bacteria of the genus Spingomonas.
  • prevention refers to suppressing liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, atopic dermatitis, etc. by administration of the composition according to the present invention, or Any action that delays the onset.
  • treatment used in the present invention improves symptoms of cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, atopic dermatitis, etc. by administration of the composition according to the present invention. It means any act that is changed or beneficially changed.
  • the term “improvement” refers to any action that at least reduces the severity of the parameters associated with the condition being treated, such as symptoms.
  • drug delivery system used in the present invention means any means or action of loading and delivering a drug to a composition according to the present invention in order to deliver the drug to a specific organ, tissue, cell, or organelle.
  • bacteria and bacterial-derived vesicles are administered orally to the mouse to evaluate bacterial and vesicle absorption, distribution, and excretion patterns, and in the case of bacteria, vesicles are not absorbed through the intestinal mucosa, whereas vesicles are administered. It was confirmed that it was absorbed within 5 minutes, distributed systemically, and excreted through the kidney, liver, and the like (see Example 1).
  • liver cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis patients and normal blood matching age and gender with the patient or Bacterial metagenome analysis was performed using vesicles separated from urine.
  • bacterial-derived vesicles from the genus Spingomonas were significantly reduced in clinical samples of patients with cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis, compared to the normal sample. It was confirmed (see Examples 4 to 12).
  • the anti-inflammatory effect of vesicles derived from Spingomonas posimobilis and Spingomonas corinsis strains was evaluated, and Spingomonas posimobil of various concentrations before treatment of E. coli-derived vesicles, which are pathogenic vesicles.
  • the secretion of inflammatory mediators was evaluated, confirming that the vesicles effectively inhibited IL-6 and TNF- ⁇ secretion by inflammatory-induced E. coli-derived vesicles. (See Examples 15 and 16).
  • the vesicles derived from Spingomonas posimobilis when the vesicles derived from Spingomonas posimobilis are orally administered, the vesicles are distributed from the time point after 1 hour has elapsed, and from the time point after 3 hours, it is also distributed to the small and large intestine. It was confirmed that the distribution in this organ is maintained until 72 hours. Furthermore, it was confirmed that the fluorescence-labeled spingomonas posimobilis-derived vesicle specifically moved from 3 hours to the brain, increased to 32 hours, and gradually decreased until 72 hours later (see Example 17).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in preparation, and includes, but is not limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, etc. If necessary, it may further contain other conventional additives such as antioxidants, buffers, if necessary.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, and the like can be additionally added to prepare formulations for injection, pills, capsules, granules, or tablets, such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations the formulations described in Remington's literature can be used to formulate according to each component.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in the formulation, but can be formulated as an injection, an inhalant, an external preparation for skin, or an oral intake.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, intravenously, subcutaneously, or applied to the skin) according to a desired method, and the dosage is the patient's condition and weight, the degree of disease, and the drug It depends on the form, route of administration and time, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • a pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a ratio of rational benefit/risk applicable to medical treatment, and an effective dose level corresponds to the type, severity, drug activity, and drug of the patient. Sensitivity to administration, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including co-drugs and other factors well known in the medical field.
  • the composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, and weight, and may increase or decrease depending on the route of administration, severity of obesity, sex, weight, and age.
  • the food composition of the present invention includes a health functional food composition.
  • the food composition according to the present invention may be added as an active ingredient to the food or used with other food or food ingredients, it may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined according to its purpose of use (for prevention or improvement).
  • the composition of the present invention is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less with respect to the raw materials, in the preparation of a food or beverage.
  • the amount may be below the above range.
  • the food composition of the present invention is an essential ingredient in the indicated proportions, and other ingredients than the above-mentioned active ingredient are not particularly limited, and may contain various flavoring agents or natural carbohydrates, etc., as additional ingredients, as in conventional beverages.
  • natural carbohydrates described above include monosaccharides, such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, etc.; And polysaccharides, for example, conventional sugars such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents taumatine, stevia extract, for example rebaudioside A, glycyrrhizine, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the proportion of the natural carbohydrate can be appropriately determined by the choice of those skilled in the art.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and It may contain salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, and the like. These ingredients can be used independently or in combination. The proportions of these additives can also be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the cosmetic composition of the present invention may include bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas, as well as ingredients commonly used in cosmetic compositions, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances Phosphorus adjuvants, and carriers.
  • composition of the present invention may be used in addition to vesicles derived from bacteria of the genus Spingomonas, organic sunscreens that have been conventionally used to the extent that they do not impair the skin protection effect by reacting with the bacteria derived from the genus Spingomonas.
  • organic sunscreen examples include glyceryl baba, drometrizolitrisiloxane, drometrizole, digaloyl trioleate, disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate, diethylhexylbutamidotriazone, diethylamino Hydroxybenzoylhexylbenzoate, die-methoxycinnamate, mixture of Lawson and dihydroxyacetone, methylenebis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol, 4-methylbenzylidene camphor, menthyl anthranylate, benzophenone -3 (oxybenzone), benzophenone-4, benzophenone-8 (dioxyphenbenzone), butylmethoxydibenzoylmethane, bisethylhexyloxyphenolmethoxyphenyltriazine, cynoxate, ethyldihydroxypropylparva, Octoc
  • cosmetics and cleansing agents such as convergent makeup, softening makeup, nutrient makeup, various creams, essences, packs, foundations, cleansing agents, soaps, treatments, and cosmetics And so on.
  • Specific formulations of the cosmetic composition of the present invention include skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisture cream, hand cream, essence, nutrition essence, pack, Contains formulations such as soap, shampoo, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cleanser, emulsion, lipstick, makeup base, foundation, press powder, rust powder, and eye shadow.
  • Example 1 Analysis of bacterial and bacterial-derived vesicle absorption, distribution, and excretion patterns
  • Example 2 Evaluation of the presence or absence of intestinal mucosa barrier of bacteria and bacterial-derived vesicle
  • the bacteria and bacterial-derived vesicles are administered directly to the intestine, and then pass through the mucosal barrier to the intestinal tissue by immunohistochemistry. Infiltration was evaluated.
  • antibodies against bacteria and vesicles were produced and used with GFP (Green fluorescent protein) attached. After staining with DAPI (4, 6-diamidino 2-phenylindole), observed under a microscope Did.
  • Example 3 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenome in clinical samples
  • Blood or urine was first placed in a 10 ml tube and the suspension was settled with a centrifuge (3,500 x g, 10 min, 4 °C), and then only the supernatant was transferred to a new 10 ml tube. After removing the bacteria and foreign matter using a 0.22 ⁇ m filter, transferred to a centripreigugal filters (50 kD), centrifuged at 1500 x g, 4 °C for 15 minutes, discarding substances smaller than 50 kD and concentrating to 10 ml.
  • a centrifuge 3,500 x g, 10 min, 4 °C
  • 50 kD centripreigugal filters
  • the bacteria and foreign matter were removed using a 0.22 ⁇ m filter, and ultra-high-speed centrifugation was performed at 150,000 xg, 4°C for 3 hours using a Type 90ti rotor, and the supernatant was removed to remove lumped pellets. It was dissolved in physiological saline (Phosphate buffered saline, PBS).
  • physiological saline Phosphate buffered saline, PBS
  • the DNA extracted by the above method is amplified using the above 16S rDNA primer, and then sequencing is performed (Illumina MiSeq sequencer), the result is output as a SFF (Standard Flowgram Format) file, and GS FLX software (v2.9) is used.
  • SFF Standard Flowgram Format
  • GS FLX software v2.9
  • OTU Orthogonal Taxonomy Unit
  • clustering is performed according to sequence similarity using UCLUST and USEARCH, genus is 94%, family is 90%, order is 85%, and river ( The class is 80%, the phylum is 75%, and clustering is based on sequence similarity.
  • the level of each OTU is phylum, class, order, family, and genus.
  • BLASTN and GreenGenes 16S RNA sequence databases 108,453 sequences were used to profile bacteria having sequence similarity of 97% or higher at the genus level (QIIME).
  • Example 4 Metagenome analysis of bacterial-derived vesicles in the blood of patients with liver disease
  • Example 5 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenome in the blood of a myocardial infarction patient
  • Example 3 targets blood of 159 normal myocardial infarction patients and age and gender matched blood, extracts genes from vesicles in the blood, performs metagenome analysis, and then derives bacteria from the genus Spingomonas. Distribution of vesicles was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood of patients with myocardial infarction compared to normal blood (see FIG. 4).
  • Example 6 Metagenome analysis of bacterial-derived vesicles in the blood of renal failure patients
  • Example 3 the blood of 36 normal patients with renal failure and age and gender matched with the target gene was extracted from the vesicles present in the blood, and metagenome analysis was performed, followed by bacterial-derived vesicles from the genus Spingomonas. The distribution of was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood of patients with renal failure compared to normal blood (see FIG. 5).
  • Example 7 Metagenome analysis of bacterial-derived vesicles in the blood of diabetic patients
  • Example 3 After performing a metagenome analysis by extracting a gene from vesicles existing in the blood of 81 normal diabetic patients and 126 normal blood of age and gender, bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas The distribution of was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood of diabetic patients compared to normal blood (see FIG. 6 ).
  • Example 8 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenome in blood of brain tumor patients
  • Example 3 In the method of Example 3, a sample of 80 brain tumor patients and 121 normal blood whose age and gender matched the blood, and after extracting a gene from the vesicles present in the blood, a metagenome analysis was performed, followed by bacterial-derived vesicles from the genus Spingomonas. The distribution of was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood of brain tumor patients compared to normal blood (see FIG. 7 ).
  • Example 9 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenome in the blood of patients with mild cognitive impairment and dementia
  • Example 3 In the method of Example 3, 76 patients with mild cognitive impairment, 70 patients with Alzheimer's dementia, and 146 normal subjects who matched age and gender were extracted from the vesicles present in the blood to perform metagenome analysis. Then, the distribution of bacterial-derived vesicles was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood of patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's dementia compared to normal blood (see FIG. 8).
  • Example 10 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenome in the blood of depressed patients
  • Example 3 70 genes of depressed patients and 140 normal people who matched age and gender were subjected to metagenome analysis by extracting genes from vesicles present in the blood, followed by bacterial-derived vesicles from the genus Spingomonas. The distribution of was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood of a depressed patient compared to normal blood (see FIG. 9).
  • Example 11 Metagenome analysis of bacterial-derived vesicles in urine of autistic patients
  • Example 3 targets 30 autistic patients and 40 normal urine whose age and gender match, and extracts genes from the vesicles present in the urine, performs metagenome analysis, and then derives bacteria from the genus Spingomonas. The distribution of was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the urine of autistic patients compared to normal urine (see FIG. 10).
  • Example 12 Analysis of bacterial-derived vesicle metagenome in blood and urine of patients with atopic dermatitis
  • Example 3 the subject was analyzed for metagenome by extracting genes from vesicles existing in the blood and urine, targeting the blood and urine of 61 normal patients with atopic dermatitis and age and gender matching. The distribution of bacterial-derived vesicles was evaluated. As a result, it was confirmed that the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas were significantly reduced in the blood and urine of patients with atopic dermatitis compared to normal blood and urine (see FIG. 11 ).
  • Example 13 Separation of vesicles from Spingomonas posimobilis and Spingomonas corinsis culture
  • the filtered supernatant was concentrated to a volume of 50 ml or less through microfiltration using a MasterFlex pump system (Cole-Parmer, US) with a 100 kDa Pellicon 2 Cassette filter membrane (Merck Millipore, US).
  • the concentrated supernatant was filtered once again with a 0.22 ⁇ m filter, and then the protein was quantified using a BCA (Bicinchoninic acid) assay, and the following experiments were performed on the obtained vesicles.
  • Example 14 Inflammatory effect of vesicles derived from Spingomonas posimobilis
  • SPC101 Sphingomonas paucimobilis EV
  • IL-6 inflammatory cells
  • TNF- ⁇ inflammatory cells secretion from inflammatory cells
  • spingomonas on mouse macrophage cell line Raw 264.7 cells After treatment with various concentrations (0.1, 1, 10 ⁇ g/ml) of posimobilis-derived vesicles, apoptosis and ELISA were performed.
  • raw 264.7 cells divided into 5 x 10 4 cells in a 48-well cell culture plate were treated with various concentrations of Spingomonas posimobilis-derived vesicles diluted with DMEM (Dulbecos Modified Eagles Medium) serum-free medium 12 Incubated for hours. Cell death was then measured using EZ-CYTOX (Dogen, Korea), and the cell culture was collected in a 1.5 ml tube, centrifuged at 3000 xg for 5 minutes, and the supernatant was collected and stored at -80°C for ELISA.
  • DMEM Dynamic Eagles Medium
  • capture antibodies were diluted in PBS, dispensed 50 ⁇ l according to the working concentration in 96-well polystyrene plates, and reacted overnight at 4°C.
  • 100 ⁇ l of PBST (PBS with 0.05% tween-20) solution 100 ⁇ l of RD (PBS with 1% BSA) solution was dispensed and blocked at room temperature for 1 hour.
  • 50 ⁇ l of the sample and the standard are dispensed according to the concentration, reacted for 2 hours at room temperature, washed three times with 100 ⁇ l of PBST, and the detection antibody is diluted in RD to match the working concentration.
  • Streptavidin-HRP R&D system, USA
  • TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine
  • apoptosis was not observed by treatment with Spingomonas posimobilis-derived vesicles (SPC 101) (see FIG. 12).
  • IL was treated with Spingomonas posimobilis-derived vesicles (SPC101) compared to treatment with E. coli- derived vesicles ( E. coli EV 1 ⁇ g/ml), which is a positive control. It was confirmed that the secretion of inflammatory mediators such as -6 (FIG. 13A) and TNF- ⁇ (FIG. 13B) was much reduced (see FIGS. 13A and 13B).
  • Example 15 Anti-inflammatory effect of vesicles derived from Spingomonas posimobilis
  • Example 14 Based on the results of Example 14, in order to evaluate the anti-inflammatory effect of vesicles derived from Spingomonas posimobilis, various concentrations (0.1, 1, 10 ⁇ g/ml) of Spingomonas posimobilis derived vesicles (SPC101) ) was pre-treated for 12 hours in a mouse macrophage cell line, treated with 1 ⁇ g/ml of E. coli-derived vesicle, a pathogenic causative agent, and the secretion of inflammatory cytokines was measured by ELISA after 12 hours.
  • SPC101 Spingomonas posimobilis derived vesicles
  • Example 16 Anti-inflammatory effect of vesicles derived from Spingomonas corinsis
  • mice from spingomonas corinsis-derived vesicles (SPC102) at various concentrations (0.1, 1, 10 ⁇ g/ml) After pre-treatment for 12 hours in a macrophage cell line, 1 ⁇ g/ml of E. coli-derived vesicles, which are pathogenic factors, were treated, and secretion of inflammatory cytokines was measured by ELISA after 12 hours.
  • SPC102 spingomonas corinsis-derived vesicles
  • FIGS. 15A and 15B inflammatory mediator secretion such as IL-6 (FIG. 15A) and TNF- ⁇ (FIG. 15B) induced in inflammatory cells by stimulation of E. coli-derived vesicles was predominantly suppressed when pre-treatment of vesicles derived from Spingomonas corinsis. (See FIGS. 15A and 15B).
  • Example 17 Distribution pattern of vesicles derived from Spingomonas posimobilis
  • the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas according to the present invention are absorbed into the body through epithelial cells and distributed systemically, and have been confirmed to be excreted outside the body through the kidney, liver, and lungs, cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes , Brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and atopic dermatitis patients were found to be significantly reduced in blood or urine, and can significantly inhibit the inflammatory mediator secretion by pathogenic vesicles.
  • the bacterial-derived vesicles of the genus Spingomonas include cirrhosis, liver cancer, myocardial infarction, kidney failure, diabetes, brain tumor, mild cognitive impairment, dementia, depression, autism, and diagnostic methods for atopic dermatitis, and cosmetics, food, Or it can be used as a composition for the prevention, improvement, or treatment of the disease, such as drugs, and furthermore, it is expected that the industrial value will be great in that it can be usefully used as a drug delivery system for delivering drugs to the brain.

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Abstract

본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포 및 이의 용도 등에 관한 것으로, 본 발명자들은 정상인에 비하여 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자의 임상 샘플에서 상기 소포가 유의하게 감소되어 있고, 상기 균주에서 분리한 소포를 투여하였을 때 대장균 유래 소포와 같은 병원성 소포에 의한 염증매개체 분비를 현저히 억제함을 실험적으로 확인하였으며, 상기 소포를 구강으로 투여하였을 때 소포가 뇌조직으로 분포함을 확인하였는바, 본 발명에 따른 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염의 진단방법, 상기 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 및 뇌로 약물을 전달하는 약물전달체를 개발하기 위한 목적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

스핀고모나스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도
본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 나노소포 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 스핀고모나스 속 세균에서 유래하는 나노소포를 이용한 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 등의 진단방법, 상기 소포를 포함하는 상기 질환에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물, 및 상기 소포를 포함하는 뇌질환 치료 약물전달용 조성물 등에 관한 것이다.
본 출원은 2018년 12월 10일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0158623호 및 2019년 10월 23일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2019-0132138호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
21세기에 들어서면서 과거 전염병으로 인식되던 급성 감염성질환의 중요성이 덜해지는 반면, 인간과 마이크로바이옴(microbiome)과의 부조화에 의해 발생하는 면역기능 이상을 동반한 만성질환이 삶의 질과 인간 수명을 결정하는 주요 질환으로 질병패턴이 바뀌었다. 21세기 난치성 만성질환으로서, 암, 심혈관질환, 알레르기-만성폐질환, 대사질환, 및 신경-정신질환이 인간 수명과 삶의 질을 결정하는 주요 질환으로서 국민보건에 큰 문제가 되고 있다.
인체에 공생하는 미생물의 개수는 100조 개에 이르러 인간 세포보다 약 10배가 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려져 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 진정세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말한다.
우리 몸에 공생하는 세균 및 주변 환경에 존재하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 저분자화합물, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통하여 상피세포를 통과하여 우리 몸에 흡수된다. 국소적으로 분비된 세균 유래 소포는 점막의 상피세포를 통해 흡수되어 국소 염증반응을 유도할 뿐만 아니라, 상피세포를 통과한 소포는 림프관을 통해 전신적으로 흡수되어 각 장기로 분포하고, 분포된 장기에서 면역 및 염증반응을 조절한다. 예를 들어, 대장균( Eshcherichia coli)과 같은 병원성 그람음성세균에서 유래하는 소포는 국소적으로 염증반응 및 암을 일으키고, 혈관으로 흡수된 경우에는 혈관 내피세포 염증반응을 통해 전신적인 염증반응 및 혈액응고를 촉진시킨다. 또한 인슐린이 작용하는 근육세포 등에 흡수되어서 인슐린저항성과 당뇨병을 유발한다. 반면, 유익한 세균에서 유래하는 소포는 병원성 소포에 의한 면역기능 및 대사기능 이상을 조절하여 질병을 조절할 수 있다.
세균에서 유래하는 소포 등의 인자에 대한 면역반응은 인터루킨(Interleukin, 이하 IL)-17 사이토카인 분비를 특징으로 하는 Th17 면역반응이 발생하는데, 이는 세균 유래 소포에 노출 시 상피세포, 면역세포 등에서 IL-6가 분비되고, 이는 IL-17 분비를 특징으로 하는 Th17 면역반응을 유도한다. Th17 면역반응에 의한 염증은 호중구 침윤을 특징으로 하고, 염증이 발생하는 과정에서 호중구, 대식세포 등과 같은 염증세포에서 분비되는 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, 이하 TNF-α)가 염증 및 암 발생에 중요한 역할을 담당한다.
스핀고모나스 속(genus Sphingomonas) 세균은 물, 토양, 및 식물의 뿌리 등과 같이 자연계에 널리 서식하는 호기성 그람음성세균으로서, 다른 그람음성세균이 세포외막에 LPS(lipopolysaccharide)를 갖고 있는데 반해, 대신에 세포외막에 GSL(glycosphingolipid)를 갖고 있다. 스핀고모나스 속에는 20개의 종이 알려져 있고, 이 중에서 스핀고모나스 포시모빌리스( Sphingomonas paucimobilis)는 인간에 병원내 감염을 일으킨다고 보고되었다. 그러나 아직까지 상기 균을 포함하여 스핀고모나스 속 세균에서 유래하는 소포를 응용하여 암, 심혈관질환, 아토피피부염 등과 같은 난치성 질환의 진단 및 치료에 응용한 사례는 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명에서는 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 정상인에 비하여 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 및 아토피피부염 환자의 임상 샘플에 유의하게 감소되어 있음을 확인하여 상기 질환들을 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 스핀고모나스 속 세균에 속하는 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스( Sphingomonas koreensis) 로부터 소포를 분리하고 그 특성을 분석한 결과, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 등의 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물로 이용할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 소포를 경구로 투여하였을 때 뇌로 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 메타게놈(Metagenome) 분석을 통해 정상인에 비하여 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자 유래 샘플에서 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 함량이 유의하게 감소되어 있음 확인하였다. 또한, 스핀고모나스 속 세균에 속하는 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스 균에서 소포를 분리하여 대식세포에 처리하였을 때, 병원성 소포에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비를 현저히 억제함을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 진단 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 치료 약물전달용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후, 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환으로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 진단 방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후, 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (a) 단계에서의 샘플은 혈액 또는 소변일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (b) 단계에서의 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍일 수 있다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물 및 화장료 조성물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 뇌로 약물을 전달하는 약물전달체 조성물(또는 뇌질환 치료 약물전달용 조성물)을 제공한다.
또한, 본 발명은 목적하는 뇌질환 치료 약물을 담지한 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌질환 치료 약물 전달 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 뇌질환 치료 약물 전달 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 소포는 스핀고모나스 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 소포는 세균에 열처리, 가압처리 등의 방법으로 분비되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 포시모빌리스에서 분비되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 코린시스에서 분비되는 것일 수 있다.
본 발명자들은 세균인 경우에는 체내에 흡수되지 않지만, 세균 유래 소포인 경우에는 상피세포를 통해 체내에 흡수되어, 전신적으로 분포하고, 신장, 간, 폐를 통해 체외로 배설됨을 확인하였고, 환자 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 통해 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자의 혈액 또는 소변에 존재하는 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 정상인에 비하여 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다. 또한, 스핀고모나스 속 세균인 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스를 체외에서 배양하여 소포를 분리하고, 체외에서 염증세포에 투여하였을 때, 병원성 소포에 의한 염증매개체 분비를 유의하게 억제함을 관찰하였다. 또한, 스핀고모나스 포시모빌리스 소포를 구강으로 투여하였을 때, 뇌로 소포가 전달되는 것을 관찰하였다. 이에, 본 발명에 따른 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염에 대한 진단방법, 및 화장품, 식품, 또는 약물 등 상기 질환에 대한 예방, 개선, 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있으며, 나아가 뇌로 약물을 전달하기 위한 약물전달체로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 마우스에 세균(bacteria)과 세균 유래 소포(EV)를 구강으로 투여한 후, 시간별로 세균과 소포의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 구강으로 투여한 후 12시간째에, 혈액, 신장, 간, 및 여러 장기를 적출하여, 세균과 소포의 체내 분포양상을 평가한 그림이다.
도 2는 마우스에 장내에 세균과 세균 유래 소포(EV)를 투여한 후, 장 점막 상피세포로 세균과 세균 유래 소포의 침윤 여부를 평가한 그림이다(Lu, gut lumen; LP, gut lamina propria).
도 3은 간경변 환자, 간암 환자, 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 4는 심근경색 환자 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 5는 신부전 환자 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 6은 당뇨병 환자 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 7은 뇌종양 환자 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 8은 경도인지장애, 알츠하이머 치매 환자 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 9는 우울증 환자 및 정상인의 혈액에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 10은 자폐증 환자 및 정상인의 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 11은 아토피피부염 환자 및 정상인의 혈액 및 소변에 존재하는 세균 유래 소포 메타게놈 분석을 실시한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 비교한 결과이다.
도 12는 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 세포사멸 효과를 평가하기 위하여, 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 대식세포(Raw264.7 cell)에 처리하여 세포사멸을 평가한 결과이다(EV, extracellular vesicle).
도 13a 및 도 13b는 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 염증유발 효과를 평가하기 위하여, 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 대식세포(Raw264.7 cell)에 처리하여, 염증매개체 분비 정도를 병원성 소포인 대장균 소포 (E. coli EV)와 비교한 결과로, 도 13a는 IL-6 분비 정도를 비교한 것이고, 도 13b는 TNF-α 분비 정도를 비교한 것이다(EV: extracellular vesicle).
도 14a 및 도 14b는 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 병원성 소포인 대장균 소포( E. coli EV) 처리 전에 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 전처리하여, 대장균 소포에 의한 염증매개체 분비에 미치는 영향을 평가한 결과로, 도 14a는 IL-6 분비 정도를 비교한 것이고, 도 14b는 TNF-α 분비 정도를 비교한 것이다(SPC101, Sphingomonas paucimobilis EV; EV, extracellular vesicle).
도 15a 및 도 15b는 스핀고모나스 코린시스 유래 소포의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 병원성 소포인 대장균 소포( E. coli EV) 처리 전에 스핀고모나스 코린시스 유래 소포를 전처리하여, 대장균 소포에 의한 염증매개체 분비에 미치는 영향을 평가한 결과로, 도 15a는 IL-6 분비 정도를 비교한 것이고, 도 15b는 TNF-α 분비 정도를 비교한 것이다(SPC102, Sphingomonas koreensis EV; EV, extracellular vesicle).
도 16은 마우스에 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 구강으로 투여한 후, 시간별로 소포의 분포양상을 촬영한 사진이다.
도 17은 마우스에 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 구강으로 투여한 후, 뇌조직에서 소포의 분포양상을 시간별로 평가한 그림이다.
본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명자들은 메타게놈 분석을 통해 정상인에 비하여 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자 유래 샘플에서 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 함량이 현저히 감소되어 있음을 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 진단 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA 염기서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행한 후, 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환으로 판정하는 단계.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 또는 아토피피부염 등의 발병 여부 및 질환의 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "나노소포(Nanovesicle)" 혹은 "소포(Vesicle)"란, 다양한 세균에서 분비되는 나노 크기의 막으로 된 구조물을 의미한다. 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 소포, 또는 외막 소포(outer membrane vesicles, OMVs)는 내독소(lipopolysaccharide) 또는 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid), 독성 단백질, 및 세균 DNA와 RNA도 가지고 있고, 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 소포는 단백질과 핵산 외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan)과 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 가지고 있다. 본 발명에 있어서, 나노소포 혹은 소포는 스핀고모나스 속 세균에서 자연적으로 분비되거나 또는 세균에 열처리, 가압처리 등을 통해 인공적으로 생산하는 것으로, 10 내지 200 nm의 평균 직경을 가지고 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈"이란, "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈, 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다.
상기 소포는 스핀고모나스 속 세균을 포함하는 배양액을 원심분리, 초고속 원심분리, 고압처리, 압출, 초음파분해, 세포 용해, 균질화, 냉동-해동, 전기천공, 기계적 분해, 화학물질 처리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 및 모세관 전기영동으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 샘플은 혈액 또는 소변일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서의 프라이머 쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하는 프라이머 쌍일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 및 화장료 조성물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 목적하는 뇌질환 치료 약물을 담지한 스핀고모나스 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 뇌질환 치료 약물 전달 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 뇌질환 치료 약물 전달 용도를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란, 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 아토피피부염 등을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란, 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 아토피피부염 등에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개선"이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약물전달체"란, 특정 장기, 조직, 세포, 또는 세포소기관으로 약물을 전달하기 위하여 본 발명에 따른 조성물에 약물을 로딩하여 전달하는 모든 수단 또는 행위를 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는, 세균 및 세균 유래 소포를 마우스 경구로 투여하여 세균 및 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상을 평가하여, 세균인 경우에는 장 점막을 통해 흡수되지 않는데 비해 소포는 투여 5분 이내에 흡수되어 전신적으로 분포하고, 신장, 간 등을 통해 배설됨을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 세균과 세균 유래 소포를 장으로 직접 투여하여 점막의 방어막을 통과하는지를 평가하였는 바, 세균인 경우에는 점막의 방어막을 통과하지 못하였지만, 세균 유래 소포인 경우에는 점막의 방어막을 통과함을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자 및 상기 환자와 연령 및 성별을 매칭한 정상인의 혈액 또는 소변에서 분리한 소포를 이용하여 세균 메타게놈 분석을 실시하였다. 그 결과, 정상인 샘플에 비하여, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자의 임상 샘플에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(실시예 4 내지 12 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고마나스 코린시스 균주를 배양하여 이로부터 분비된 소포의 염증유발 효과를 평가하였는데, 다양한 농도의 상기 세균 유래 소포를 대식세포에 처리한 후, 대표적 병원성 소포인 대장균 유래 소포를 처리하여 염증매개체 분비 정도를 비교한 결과, 대장균 유래 소포에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비와 비교해서 상기 스핀고모나스속 세균 유래 소포에 의한 염증 매개체 분비능이 현저히 감소되어 있었다(실시예 14 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스 균주 유래 소포의 항염증 효과를 평가하였는데, 병원성 소포인 대장균 유래 소포를 처리하기 전에 다양한 농도의 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스 유래 소포를 대식세포에 처리한 후, 염증매개체 분비를 평가한 결과, 염증유발 대장균 유래 소포에 의한 IL-6 및 TNF-α 분비를 상기 소포가 효율적으로 억제함을 확인하였다(실시예 15 및 16 참고).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 경구로 투여하였을 때, 1시간이 경과한 시점부터 위에 상기 소포가 분포하였고, 3시간이 경과한 시점부터는 소장 및 대장에도 분포됨을 확인하였으며, 이러한 장기 내 분포는 72시간까지 유지됨을 확인하였다. 나아가 형광 표지한 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포 특이적으로 3시간부터 뇌로 이동하여, 32시간까지 증가하다가 이후 72시간이 경과한 시점까지 점차적으로 감소함을 확인하였다(실시예 17 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른식품 조성물은 유효성분을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 스핀고모나스 속 세균 유래 소포 이외에, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포와 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 유기 자외선 차단제를 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 유기 자외선 차단제로는 글리세릴파바, 드로메트리졸트리실록산, 드로메트리졸, 디갈로일트리올리에이트, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에틸헥실부타미도트리아존, 디에틸아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디이에이-메톡시신나메이트, 로우손과 디하이드록시아세톤의 혼합물, 메틸렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 4-메틸벤질리덴캠퍼, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존), 벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시페벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 비스에틸헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 시녹세이트, 에틸디하이드록시프로필파바, 옥토크릴렌, 에틸헥실디메틸파바, 에틸헥실메톡시신나메이트, 에틸헥실살리실레이트, 에틸헥실트리아존, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 폴리실리콘-15(디메치코디에틸벤잘말로네이트), 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드 및 그 염류, 티이에이-살리실레이트 및 아미노벤조산(파바)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 우선 마우스의 위장에 형광으로 표지한 상기 세균과 상기 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 구강 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타난 바와 같이, 세균의 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포의 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에서 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었으며 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다(도 1a 참조).
상기 세균과 세균 유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균 유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 후, 투여 12시간 후에 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방, 근육을 채취하였다. 채취한 조직에서 형광을 관찰한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 세균 유래 소포는 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방, 근육, 신장에 분포하였으나, 세균은 흡수되지 않음을 알 수 있었다(도 1b 참조).
실시예 2. 세균 및 세균 유래 소포의 장 점막 방어막 침투 유무 평가
세균과 세균 유래 소포가 점막 방어막을 통과하여 조직으로 침윤되는지를 평가하기 위하여, 세균과 세균 유래 소포를 장으로 직접 투여한 후, 면역조직화학(Immunohistochemistry) 방법으로 점막 방어막을 통과하여 장 조직으로의 침윤을 평가하였다. 점막조직에서 세균과 소포 존재를 평가하기 위하여 세균과 소포에 대한 항체를 제작하여 GFP(Green fluorescent protein)를 달아 사용하였고, DAPI(4, 6-diamidino 2-phenylindole) 염색을 한 후, 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 세균의 경우에는 점막 방어막을 통과하지 못한 반면, 세균 유래 소포는 점막으로 통과하여 장 조직으로 침윤됨을 확인하였다(도 2 참조).
실시예 3. 임상 샘플에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
혈액 또는 소변을 먼저 10 ml 튜브에 넣고 원심분리기(3,500 x g, 10 min, 4 ℃)로 부유물을 가라앉힌 후, 상등액만을 새로운 10 ml 튜브에 옮겼다. 0.22 μm 필터를 사용하여 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮겨서 1500 x g, 4 ℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리며 10 ml 까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 μm 필터(filter)를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4 ℃에서 3시간 동안 초고속원심분리를 수행하고, 상등액을 제거한 후 덩어리진 펠릿(pellet)을 생리식염수(Phosphate buffered saline, PBS)로 녹였다.
상기 방법으로 분리한 소포 100 μl를 100 ℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 하고, 그 후 얼음에서 5분 동안 식혔다. 그리고 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4 ℃에서 30분간 원심분리하고, 상등액만을 모은 다음 나노드롭(Nanodrop)을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후, 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA 프라이머(primer)로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
프라이머 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
상기 방법으로 추출한 DNA를 상기의 16S rDNA 프라이머를 사용하여 증폭을 한 다음 시퀀싱을 수행하여(Illumina MiSeq sequencer), 결과를 SFF(Standard Flowgram Format) 파일로 출력하고, GS FLX 소프트웨어(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인한 후, window (20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만 (Phred score <20)인 부분을 제거하였다. OTU(Operational Taxonomy Unit) 분석을 위해서 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하고, 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고, 각 OTU의 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 속(genus) 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S RNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 속 수준에서 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 세균을 프로파일링 하였다(QIIME).
실시예 4. 간질환 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 간경변 환자 97명, 간암 환자 76명, 그리고 나이와 성별을 매칭한 정상인 171명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 간경변 및 간암환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 3 참조).
실시예 5. 심근경색 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 심근경색 환자 69명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 159명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 심근경색 환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 4 참조).
실시예 6. 신부전 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 신부전 환자 36명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 72명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 신부전 환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 5 참조).
실시예 7. 당뇨병 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 당뇨병 환자 81명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 126명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 당뇨병 환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 6 참조).
실시예 8. 뇌종양 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 뇌종양 환자 80명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 121명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 뇌종양 환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 7 참조).
실시예 9. 경도인지장애 및 치매 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 경도인지장애 환자 76명, 알츠하이머치매 환자 70명, 및 나이와 성별을 매칭한 정상인 146명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 경도인지장애 및 알츠하이머치매 환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 8 참조).
실시예 10. 우울증 환자의 혈액에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 우울증 환자 70명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 140명의 혈액을 대상으로, 혈액 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액에 비하여 우울증 환자의 혈액에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 9 참조).
실시예 11. 자폐증 환자의 소변에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 자폐증 환자 30명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 40명의 소변을 대상으로, 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 소변에 비하여 자폐증 환자의 소변에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 10 참조).
실시예 12. 아토피피부염 환자의 혈액 및 소변에서 세균 유래 소포 메타게놈 분석
상기 실시예 3의 방법으로 아토피피부염 환자 61명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 52명의 혈액 및 소변을 대상으로, 혈액 및 소변 내에 존재하는 소포에서 유전자를 추출하여 메타게놈 분석을 수행한 후, 스핀고모나스 속 세균 유래 소포의 분포를 평가하였다. 그 결과, 정상인 혈액 및 소변에 비하여 아토피피부염 환자의 혈액 및 소변에 스핀고모나스 속 세균 유래 소포가 유의하게 감소되어 있음을 확인하였다(도 11 참조).
실시예 13. 스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스 배양액에서 소포 분리
스핀고모나스 포시모빌리스 및 스핀고모나스 코린시스 균주를 배양한 후 이의 소포를 분리하여 특성을 분석하였다. 상기 균주를 37 ℃ 배양기에서 흡광도(OD 600)가 1.0~1.5가 될 때까지 MRS(de Man-Rogosa and Sharpe) 배지에서 배양한 후 LB(Luria-Bertani) 배지에 서브-컬쳐(sub-culture) 하였다. 이후 균주가 포함되어 있는 배양액을 회수하여 10,000 x g, 4 ℃에서 20분 동안 원심분리하여 균체를 제거하고, 0.22 μm 필터에 여과하였다. 여과한 상층액을 100 kDa Pellicon 2 Cassette 필터 멤브레인(Merck Millipore, US)으로 MasterFlex 펌프 시스템(Cole-Parmer, US)을 이용하여 미세여과(microfiltration)를 통해 50 ml 이하의 부피로 농축하였다. 농축시킨 상층액을 다시 한 번 0.22 μm 필터로 여과한 다음, BCA(Bicinchoninic acid) assay를 이용해 단백질을 정량하였고, 얻어진 소포에 대하여 하기 실험들을 실시하였다.
실시예 14. 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 염증유발 효과
염증세포에서 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포( Sphingomonas paucimobilis EV, SPC101)의 염증매개체(IL-6, TNF-α) 분비에 대한 영향을 알아보기 위해, 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 다양한 농도(0.1, 1, 10 μg/ml)로 처리한 후, 세포사멸과 ELISA를 진행하였다.
보다 구체적으로, 48-well 세포 배양 플레이트 안에 5 x 10 4 개씩 분주한 Raw 264.7 세포에 DMEM(Dulbecos Modified Eagles Medium) 무혈청 배지로 희석한 다양한 농도의 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 처리하여 12시간 동안 배양하였다. 이후 세포사멸은 EZ-CYTOX(Dogen, Korea)을 이용하여 측정하였고, 세포 배양액은 1.5 ml 튜브에 모아 3000 x g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 모아 -80 ℃에 보관해두었다가 ELISA를 진행하였다.
ELISA를 수행하기 위해, 캡쳐(Capture) 항체를 PBS에 희석시켜 96-웰 폴리스틸렌(polystyrene) 플레이트에 작용 농도에 맞게 50 μl씩 분주한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안(overnight) 반응시켰다. 이후 PBST(0.05 % tween-20이 들어있는 PBS) 용액 100 μl로 세 번씩 씻어준 후, RD(1 % BSA 가 들어있는 PBS) 용액 100 μl을 분주하여 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 그 다음, 샘플 및 스탠다드(standard)를 농도에 맞게 50 μl씩 분주하고 상온에서 2시간 동안 반응시키고 PBST 100 μl로 세 번 씻어준 후, 디텍션(detection) 항체를 RD에 희석시켜 작용 농도에 맞게 50 μl씩 분주하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 다음, PBST 100 μl로 세 번 씻어준 후, Streptavidin-HRP (R&D system, USA)를 RD에 1/40으로 희석시켜 50 μl씩 분주하여 상온에서 20분간 반응시켰다.
마지막으로, PBST 100 μl로 세 번 씻어준 후, TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 기질 (SurModics, USA) 50 μl를 분주하고 5분에서 20분 후 발색이 진행되었을 때, 1 M 황산용액을 50 μl씩 분주해 반응을 멈추고 SpectraMax M3 microplate reader (Molecular Devices, USA)를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포 (SPC 101) 처리에 의한 세포사멸은 관찰되지 않았다(도 12 참조). 또한, 염증세포에서의 염증매개체 분비 양상을 평가한 결과, 양성대조군인 대장균 유래 소포( E. coli EV 1 μg/ml) 처리 시에 비해 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포 (SPC101)의 처리 시 IL-6(도 13a) 및 TNF-α(도 13b)와 같은 염증매개체의 분비가 훨씬 감소되어 있음을 확인하였다(도 13a 및 도13b 참조).
실시예 15. 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 항염증 효과
상기 실시예 14의 결과를 바탕으로, 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 다양한 농도(0.1, 1, 10 μg/ml)의 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포(SPC101)를 마우스 대식세포주에 12시간 전처리한 후, 병원성 원인 인자인 대장균 유래 소포 1 μg/ml를 처리하고 12시간 후에 염증성 사이토카인의 분비를 ELISA로 측정하였다.
그 결과, 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 전처리 시, 대장균 유래 소포 자극에 의한 염증세포에 유도되는 IL-6(도 14a) 및 TNF-α(도 14b)와 같은 염증매개체 분비가 현저히 억제됨을 확인하였다(도 14a 및 14b 참조).
실시예 16. 스핀고모나스 코린시스 유래 소포의 항염증 효과
상기 실시예 16의 결과를 바탕으로, 다른 스핀고모나스속 세균의 항염증 효과를 평가하기 위하여, 스핀고모나스 코린시스 유래 소포(SPC102)를 다양한 농도(0.1, 1, 10 μg/ml)로 마우스 대식세포주에 12시간 전처리한 후, 병원성 원인 인자인 대장균 유래 소포 1 μg/ml를 처리하고 12시간 후에 염증성 사이토카인의 분비를 ELISA로 측정하였다.
그 결과, 스핀고모나스 코린시스 유래 소포를 전처리 시, 대장균 유래 소포 자극에 의한 염증세포에 유도되는 IL-6(도 15a) 및 TNF-α(도 15b)와 같은 염증매개체 분비가 현저히 억제됨을 확인하였다(도 15a 및 15b 참조).
실시예 17. 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포의 분포 양상
스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포를 경구로 투여하였을 때, 시간별 장기 내 흡수 및 분포를 확인하기 위해 아래와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 형광으로 표지한 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포 10 μg을 경구로 투여하고 각각 1, 3, 6, 32, 48, 72시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지의 형광을 관찰한 결과, 경구 투여 1시간부터 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포가 위에 분포되었고 3시간부터는 소장 및 대장에도 분포됨을 확인하였으며 이러한 장기 내 분포가 72시간까지 유지됨을 관찰하였다(도 16 참조).
또한, 형광 표지한 스핀고모나스 포시모빌리스 유래 소포 특이적으로 3시간부터 뇌로 이동함이 확인되었고, 뇌로 이동한 세포외소포의 분포도가 32시간까지 증가하다가 32시간 이후부터 72시간까지 점차적으로 감소함을 확인하였다(도 17 참조).
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 상피세포를 통해 체내에 흡수되어 전신적으로 분포하고, 신장, 간, 폐를 통해 체외로 배설됨이 확인되었으며, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염 환자의 혈액 또는 소변에서 유의하게 감소되어 있음이 확인되었고, 병원성 소포에 의한 염증매개체 분비를 유의하게 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염에 대한 진단방법, 및 화장품, 식품, 또는 약물 등 상기 질환에 대한 예방, 개선, 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있으며, 나아가 뇌로 약물을 전달하기 위한 약물전달체로 유용하게 이용될 수 있다는 점에서 산업적 이용 가치가 클 것으로 예상된다.

Claims (20)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행한 후, 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환으로 판정하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서의 샘플은 혈액 또는 소변인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 소포는 스핀고모나스 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 포시모빌리스( Sphingomonas paucimobilis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 코린시스( Sphingomonas koreensis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  8. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 소포는 평균 직경이 10 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 소포는 스핀고모나스 속 세균에서 자연적 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 포시모빌리스( Sphingomonas paucimobilis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 코린시스 ( Sphingomonas koreensis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 식품 조성물.
  13. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 아토피피부염의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  14. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는, 뇌질환 치료 약물전달용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 포시모빌리스( Sphingomonas paucimobilis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 뇌질환 치료 약물전달용 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 스핀고모나스 속 세균 유래 소포는 스핀고모나스 코린시스 ( Sphingomonas koreensis)에서 분비되는 것을 특징으로 하는, 뇌질환 치료 약물전달용 조성물.
  17. 하기의 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 진단 방법:
    (a) 정상인 및 피검자 샘플에서 분리한 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 16S rDNA에 존재하는 유전자 서열에 기초하여 제작한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reaction)을 수행한 후, 각각의 PCR 산물을 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 정량분석을 통하여 정상인에 비하여 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포의 함량이 낮을 경우, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환으로 판정하는 단계.
  18. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료방법.
  19. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포의 간경변, 간암, 심근경색, 신부전, 당뇨병, 뇌종양, 경도인지장애, 치매, 우울증, 자폐증, 및 아토피피부염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도.
  20. 스핀고모나스( Sphingomonas) 속 세균 유래 소포의 뇌질환 치료 약물 전달 용도.
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