JP7240031B2

JP7240031B2 - ワイセラ属細菌由来のナノ小胞およびその用途

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Publication number: JP7240031B2
Application number: JP2021532853A
Authority: JP
Inventors: キム、ユン－クン
Original assignee: MD Healthcare Inc
Current assignee: MD Healthcare Inc
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2019-11-20
Publication date: 2023-03-15
Anticipated expiration: 2039-11-20
Also published as: US20220016189A1; WO2020122448A1; JP2022511913A

Description

本発明は、ワイセラ属細菌由来のナノ小胞およびその用途に関し、より具体的に、ワイセラ属細菌に由来するナノ小胞を用いた炎症疾患に対する予防、改善、または治療用組成物に関する。

本出願は、２０１８年１２月１０日に出願された韓国特許出願第１０－２０１８－０１５８６２１号および２０１９年１０月２３日に出願された韓国特許出願第１０－２０１９－０１３２１３６号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。

２１世紀に入って過去伝染病と認識された急性感染性疾患の重要性が減少した一方で、ヒトとマイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）との不調和によって発生する免疫機能の異常を伴った慢性炎症疾患が主な疾患に病気パターンが変わった。特に、食習慣の西欧化による口腔内炎症疾患、慢性胃炎および胃癌、大腸炎および大腸癌等の消化器系炎症疾患が国民保健に大きな問題となっている。

前記炎症疾患の発生には、外部原因因子に対する免疫機能に異常を伴っている。細菌に由来する原因因子に対する免疫反応は、インターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ、以下ＩＬという）－１７サイトカインを分泌するＴｈ１７免疫反応が重要であり、細菌性原因因子に露出時にＴｈ１７免疫反応による好中球性炎症が発生する。炎症が発生する過程で腫瘍壊死因子－α（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ、以下ＴＮＦ－αという）のような炎症性メディエーターが炎症および癌の発生に重要な役割を担当する。また、細菌性原因因子により分泌されるＩＬ－６は、Ｔｈ１７細胞への分化に重要な役割を担当し、Ｔｈ１７免疫反応による慢性炎症は、慢性炎症疾患だけでなく、癌の発生とも密接な関連があると最近報告されている。

人体に共生する微生物の個数は、１００兆個に達し、ヒト細胞より約１０倍が多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えることが知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた生息地に存在する真正細菌、古細菌、真核生物を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と病気に大きい影響を及ぼすと知られている。

人体に共生する真正細菌および古細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質等の情報を交換するために、ナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には、粘膜を通過しないが、細菌由来の小胞は、サイズが１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通じて上皮細胞を通過した後に人体に吸収される。人体に吸収される病原性細菌由来の小胞は、最近、糖尿病、肥満等が代謝疾患の病因に重要な役割を担当することが明らかになった。

ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属細菌は、乳酸を分泌するグラム陽性の球菌であって、口腔を含む消化器系に共生する細菌と知られている。特に、ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）菌は、共生過程で過酸化水素を分泌して、歯周疾患、大腸炎、大腸癌等の発病と関連があるフソバクテリア（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎｕｃｌｅａｔｕｍ）細菌の増殖を抑制することが知られている。しかし、まだワイセラ属細菌が細胞外に小胞を用いた治療技術に対する報告は全くない状態である。

そこで、本発明では、ワイセラ属細菌から小胞を最初に分離し、その特性を確認することによって、前記小胞を炎症疾患の予防、改善または治療用組成物として用いることができることを確認した。

本発明者らは、上記のような従来の問題点を解決するために鋭意研究した結果、ワイセラ属細菌由来の小胞が病原性小胞による炎症反応を効率的に抑制することを確認したところ、これに基づいて本発明を完成した。

そこで、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む炎症疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供することを目的とする。

しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む、炎症疾患の予防、改善、または治療用組成物を提供する。

前記組成物は、薬学的組成物、食品組成物、化粧料組成物、および吸入剤組成物を含むことができる。

また、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、炎症疾患の予防または治療方法を提供する。

また、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞の、炎症疾患の予防または治療用途を提供する。

また、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物の炎症疾患の予防または治療用途を提供する。

また、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞の炎症疾患に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。

本発明の一具現例において、前記小胞は、ワイセラ・シバリアから分泌されるものでありうる。

本発明の他の具現例において、前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍのものでありうる。

本発明のさらに他の具現例において、前記小胞は、ワイセラ属細菌から自然的または人工的に分泌されるものでありうる。

本発明のさらに他の具現例において、前記人工小胞は、細菌に熱処理、加圧処理等の方法で分泌されるものでありうる。

本発明のさらに他の具現例において、前記炎症疾患は、歯肉炎、歯周炎および口腔癌を含む口腔炎症疾患；胃炎および胃癌を含む胃炎症疾患；大腸炎、大腸ポリープおよび大腸癌を含む大腸炎症疾患；アトピー皮膚炎および乾癬を含む皮膚炎症疾患；鼻炎、鼻ポリープ、喘息、慢性閉塞性肺疾患および肺癌を含む呼吸器系炎症疾患よりなる群から選ばれた1つ以上の疾患でありうる。

本発明者らは、腸内細菌である場合には、体内に吸収されないが、細菌由来の小胞である場合には、粘膜の防御膜を通過して粘膜上皮細胞に吸収されて、全身的に分布し、腎臓、肝、肺を通じて体外に排泄されることを確認した。また、ワイセラ属細菌の一種であるワイセラ・シバリアを体外で培養して小胞を分離して炎症細胞に投与したとき、病原性小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－α等の炎症性メディエーターの分泌を有意に抑制したことを確認したところ、本発明によるワイセラ属細菌由来の小胞は、炎症疾患の予防、改善または治療用組成物に有用に用いられるものと期待される。

図１ａは、マウスに細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を口腔に投与した後、時間別に細菌と小胞の分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、口腔に投与した後１２時間目に、血液、腎臓、肝、および様々な臓器を摘出して、細菌と小胞の体内分布様相を評価した図である。図２は、マウスに腸内に細菌と細菌由来の小胞（ＥＶ）を投与した後、腸粘膜上皮細胞へ細菌と細菌由来の小胞の浸潤の有無を評価した図である（Ｌｕ，ｇｕｔｌｕｍｅｎ；ＬＰ，ｇｕｔｌａｍｉｎａｐｒｏｐｒｉａ）。図３は、ワイセラ・シバリア由来の小胞の細胞死滅効果を評価するために、ワイセラ・シバリア由来の小胞をマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ）に処理して細胞死滅を評価した結果である（ＥＶ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）。図４ａおよび図４ｂは、ワイセラ・シバリア由来の小胞の炎症誘発効果を評価するために、ワイセラ菌由来の小胞をマクロファージ（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ）に処理して炎症性メディエーターの分泌程度を病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉＥＶ）と比較した結果であって、図４ａは、ＩＬ－６の分泌程度を比較したものであり、図４ｂは、ＴＮＦ－αの分泌程度を比較したものである（ＥＶ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）。図５ａおよび図５ｂは、ワイセラ・シバリア由来の小胞の抗炎症効果を評価するために、病原性小胞である大腸菌小胞（Ｅ．ｃｏｌｉＥＶ）の処理前にワイセラ菌由来の小胞を前処理して、大腸菌小胞による炎症性メディエーターの分泌に及ぼす影響を評価した結果であって、図５ａは、ＩＬ－６の分泌程度を比較したものであり、図５ｂは、ＴＮＦ－αの分泌程度を比較したものである（ＥＶ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）。

本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞およびその用途に関する。

本発明者らは、病原性原因因子を投与する前にワイセラ・シバリア菌由来の小胞で炎症細胞を処理すると、病原性原因因子による炎症反応を効率的に抑制することを確認し、これに基づいて本発明を完成した。

そこで、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む、炎症疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。

前記組成物は、薬学的組成物、食品組成物、化粧料組成物および吸入剤組成物を含む。

本発明の他の様態として、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物を個体に投与する段階を含む、炎症疾患の予防または治療方法を提供する。

本発明のさらに他の様態として、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞の、炎症疾患の予防または治療用途を提供する。

本発明のさらに他の様態として、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞を有効成分として含む組成物の炎症疾患の予防または治療用途を提供する。

本発明のさらに他の様態として、本発明は、ワイセラ属細菌由来の小胞の炎症疾患に用いられる薬剤を生産するための用途を提供する。

本発明において使用される用語「ナノ小胞（Ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）」あるいは「小胞（Ｖｅｓｉｃｌｅ）」とは、多様な細菌から分泌されるナノサイズの膜からなる構造物を意味する。ワイセラのようなグラム陽性菌由来の小胞は、タンパク質と核酸の他にも、細菌の細胞壁構成成分であるペプチドグリカンとリポタイコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃａｃｉｄ）、そして小胞内に様々な低分子化合物を有している。本発明において、ナノ小胞あるいは小胞は、ワイセラ属細菌から自然的に分泌されたり、または細菌に熱処理、加圧処理等を通して人工的に生産するものであり、１０～２００ｎｍの平均直径を有している。

前記小胞は、ワイセラ属細菌を含む培養液を遠心分離、超高速遠心分離、押出、超音波分解、細胞溶解、均質化、冷凍－解凍、電気穿孔、機械的分解、化学物質処理、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動、およびキャピラリー電気泳動よりなる群から選ばれる１つ以上の方法を使用して分離することができる。また、不純物の除去のための洗浄、収得された小胞の濃縮等の過程を追加で含むことができる。

本発明で使用される用語「炎症疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅ）」とは、炎症を誘発する原因因子に露出して皮膚あるいは腸上皮細胞に損傷とその結果として炎症が発生して生じる疾患を意味し、炎症の結果として発生する癌を含む。皮膚に発生するアトピー皮膚炎、乾癬等の皮膚炎症疾患、鼻炎、鼻ポリープ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺癌等の呼吸器系炎症疾患、歯肉炎、歯周炎、口腔癌等の口腔炎症疾患、胃炎、胃潰瘍、胃癌等の胃炎症疾患、大腸炎、大腸ポリープ、大腸癌等の大腸炎症疾患等を含むが、これに制限されない。

本発明で使用される用語「予防」とは、本発明による組成物の投与によって炎症疾患を抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味する。

本発明で使用される用語「治療」とは、本発明による組成物の投与によって炎症疾患に対する症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。

本発明で使用される用語「改善」とは、治療される状態と関連したパラメーター、例えば症状の程度を少なくとも減少させるすべての行為を意味する。

本発明の一実施例では、細菌および細菌由来の小胞をマウスの経口に投与して細菌および小胞の体内吸収、分布、および排泄様相を評価したところ、細菌である場合には、腸粘膜を通じて吸収されないのに対し、小胞は、投与５分以内に吸収されて全身的に分布し、腎臓、肝等を通して排泄されることを確認した（実施例１参照）。

本発明の他の実施例では、細菌と細菌由来の小胞を腸に直接投与して腸粘膜の防御膜を通過するかを評価したところ、細菌である場合には、腸粘膜の防御膜を通過しなかったが、細菌由来の小胞である場合には、粘膜の防御膜を通過することを確認した（実施例２参照）。

本発明のさらに他の実施例では、ワイセラ属細菌に属するワイセラ・シバリア菌株を培養して、これから分泌された小胞の炎症誘発効果を評価したが、多様な濃度のワイセラ・シバリア由来の小胞をマクロファージに処理した後、代表的病原性小胞である大腸菌由来の小胞を処理して炎症性メディエーターの分泌程度を比較した結果、大腸菌由来の小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌と比較してワイセラ・シバリア由来の小胞による分泌能が顕著に減少していた（実施例４参照）。

本発明のさらに他の実施例では、ワイセラ・シバリア菌株由来の小胞の抗炎症効果を評価したが、病原性小胞である大腸菌由来の小胞を処理する前に多様な濃度のワイセラ・シバリア由来の小胞をマクロファージに処理した後、炎症性メディエーターの分泌を評価した結果、炎症誘発大腸菌由来の小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－αの分泌をワイセラ・シバリア由来の小胞が効率的に抑制することを確認した（実施例５参照）。

本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬学的に許容可能な担体は、製剤時に通常用いられるものであって、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム等を含むが、これに限定されず、必要に応じて抗酸化剤、緩衝液等他の通常の添加剤をさらに含むことができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤等を付加的に添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒、または錠剤に製剤化することができる。適合した薬学的に許容される担体および製剤化に関しては、レミントンの文献に開示されている方法を用いて各成分によって好適に製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤、または経口摂取剤等に製剤化することができる。

本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与したり、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、皮膚、鼻腔、気道に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、病気の程度、薬物形態、投与経路および時間によって異なるが、当業者により適宜選択され得る。

本発明による薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、薬学的に有効な量は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量のレベルは、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定され得る。本発明による組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得、単一または多重投与され得る。上記した要素を全部考慮して副作用なしに最小の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。

具体的に、本発明による薬学的組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重によって変わり得、投与経路、肥満の重症度、性別、体重、年齢等によって増減することができる。

本発明の吸入剤組成物において、有効成分を吸入剤にそのまま添加したり、他の成分と共に使用され得、通常の方法によって適宜使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または治療用）に応じて好適に決定され得る。

本発明の食品組成物は、健康機能食品組成物を含む。本発明による食品組成物は、有効成分を食品にそのまま添加したり、他の食品または食品成分と共に使用され得、通常の方法によって適宜使用され得る。有効成分の混合量は、その使用目的（予防または改善用）に応じて好適に決定され得る。一般的に、食品または飲料の製造時に、本発明の組成物は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは、１０重量％以下の量で添加される。しかしながら、健康および衛生を目的としたり、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は、前記範囲以下でありうる。

本発明の食品組成物は、指示された割合で必須成分として前記有効成分を含有すること他に、他の成分には、特別な制限がなく、通常の飲料のように、様々な香味剤または天然炭水化物等を追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物の例は、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖等；ジサッカライド、例えばマルトース、スクロース等；およびポリサッカライド、例えばデキストリン、シクロデキストリン等のような通常の糖、およびキシリトール、ソルビトール、エリトリトール等の糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物、例えばレバウディオサイドＡ、グリチルリチン等）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテーム等）を好適に使用することができる。前記天然炭水化物の比率は、当業者の選択によって適宜決定され得る。

前記の他に本発明の食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤等の風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤等を含有することができる。このような成分は、独立して、または組み合わせて使用することができる。このような添加剤の比率も、当業者によって適宜選択され得る。

本発明の前記化粧料組成物は、ワイセラ属細菌由来の小胞だけでなく、化粧料組成物に通常用いられる成分を含むことができ、例えば抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料、および香料のような通常の補助剤、そして担体を含むことができる。

また、本発明の組成物は、ワイセラ属細菌由来の小胞以外に、ワイセラ属細菌由来の小胞と反応して皮膚保護効果を損傷させない限度で従来から使用されてきた有機紫外線遮断剤を混合して使用することもできる。前記有機紫外線遮断剤としては、グリセリルＰＡＢＡ、ドロメトリゾールトリシロキサン、ドロメトリゾール、ジガロイルトリオレエート、ジソジウムフェニルジベンズイミダゾールテトラスルホネート、ジエチルヘキシルブタミドトリアゾン、ジエチルアミノヒドロキシベンゾイルヘキシルベンゾエート、ＤＥＡ－メトキシシンナメート、ローソンとジヒドロキシアセトンの混合物、メチレンビス－ベンゾトリアゾリルテトラメチルブチルフェノール、４－メチルベンジリデンカンファ、メンチルアントラニレート、ベンゾフェノン－３（オキシベンゾン）、ベンゾフェノン－４，ベンゾフェノン－８（ジオキシベンゾン）、ブチルメトキシジベンゾイルメタン、ビスエチルヘキシルオキシフェノールメトキシフェニルトリアジン、シノキサート、エチルジヒドロキシプロピルＰＡＢＡ、オクトクリレン、エチルヘキシルジメチルＰＡＢＡ、エチルヘキシルメトキシシンナメート、エチルヘキシルサリシレート、エチルヘキシルトリアゾン、イソアミル－ｐ－メトキシシンナメート、ポリシリコン－１５（マロン酸ジメチコジエチルベンザル）、テレフタリリデンジカンフルスルホン酸およびその塩類、ＴＥＡ－サリシレートおよびアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）よりなる群から選ばれた１種以上を使用することができる。

本発明の化粧料組成物を添加できる製品としては、例えば、収れん化粧水、柔軟化粧水、栄養化粧水、各種クリーム、エッセンス、パック、ファンデーション等のような化粧品類と、クレンジング、洗顔剤、石鹸、トリートメント、美容液等がある。本発明の化粧料組成物の具体的な剤形としては、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、シャンプー、クレジングフォーム、クレジングローション、クレンジングクリーム、ボディローション、ボディクレンザー、乳液、リップスティック、メイクアップベース、ファンデーション、プレスパウダー、ルースパウダー、アイシャドウ等の剤形を含む。

以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が制限されるものではない。

［実施例１．細菌および細菌由来の小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析］
細菌と細菌由来の小胞が胃腸管を通じて全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した細菌と細菌由来の小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管に投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウスの全体イメージを観察した結果、図１ａに示されたように、細菌である場合には、全身的に吸収されなかったが、細菌由来の小胞である場合には、投与後５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった（図１ａ参照）。

細菌と細菌由来の小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来の小胞を前記の方法のように投与した後、投与１２時間後に、血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉を採取した。採取した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示されたように、細菌由来の小胞が血液、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、脂肪、筋肉、腎臓に分布したが、細菌は吸収されないことが分かった（図１ｂ参照）。

［実施例２．細菌および細菌由来の小胞の腸粘膜防御膜浸透有無の評価］
細菌と細菌由来の小胞が腸粘膜の防御膜を通過して腸組織に浸潤されるかを評価するために、細菌と細菌由来の小胞を腸に直接投与した後、免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）方法で腸粘膜の防御膜を通過して腸組織への浸潤を評価した。腸粘膜で細菌と小胞の存在を評価するために、細菌と小胞に対する抗体を製作して、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）を付けて使用し、ＤＡＰＩ（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色を行った後、顕微鏡で観察した。

その結果、細菌である場合には、腸粘膜の防御膜を通過しなかった反面、細菌由来の小胞は、腸粘膜を通過して腸組織に浸潤されることを確認した（図２参照）。

［実施例３．ワイセラ・シバリア培養液から小胞分離］
ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）菌株を培養した後、これの小胞を分離して特性を分析した。まず、ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）菌株を３７℃の培養器で吸光度（ＯＤ６００）が１．０～１．５になるまでＭＲＳ（ｄｅＭａｎ－ＲｏｇｏｓａａｎｄＳｈａｒｐｅ）培地で培養した後、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地にサブ－カルチャー（ｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅ）した。以後、菌株が含まれている培養液を回収して、１０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して菌体を除去し、０．２２μｍのフィルターに濾過した。濾過した上澄み液を１００ｋＤａＰｅｌｌｉｃｏｎ２Ｃａｓｓｅｔｔｅフィルターメンブレイン（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳ）でＭａｓｔｅｒＦｌｅｘポンプシステム（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ，ＵＳ）を用いて微細濾過（ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を通じて５０ｍｌ以下の体積で濃縮した。濃縮させた上澄み液をもう一度０．２２μｍフィルターで濾過した。以後、ＢＣＡ（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ）ａｓｓａｙを用いてタンパク質を定量し、得られた小胞に対して下記実験を実施した。

［実施例４．ワイセラ・シバリア由来の小胞の炎症誘発効果］
炎症細胞でワイセラ・シバリア由来の小胞（ＷｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａＥＶ）の炎症性メディエーター（ＩＬ－６、ＴＮＦ－α）の分泌に対する影響を調べてみるために、マウスマクロファージ細胞株であるＲａｗ２６４．７細胞にワイセラ・シバリア由来の小胞を多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞死滅とＥＬＩＳＡを進めた。

より具体的に、４８－ｗｅｌｌ細胞培養プレート内に５×１０^４個ずつ分注したＲａｗ２６４．７細胞にＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）無血清培地で希釈した多様な濃度のワイセラ・シバリア由来の小胞を処理して１２時間の間培養した。以後、細胞死滅は、ＥＺ－ＣＹＴＯＸ（Ｄｏｇｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を利用して測定し、細胞培養液は、１．５ｍｌのチューブに集めて、３０００×ｇで５分間遠心分離し、上澄み液を集めて、－８０℃に保管しておいた後、ＥＬＩＳＡを進めた。

ＥＬＩＳＡを行うために、捕捉抗体をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ）に希釈させて、９６－ｗｅｌｌのポリスチレンプレートに作用濃度に合うように５０μｌずつ分注した後、４℃で一晩反応させた。以後、ＰＢＳＴ（０．０５％ｔｗｅｅｎ－２０が入っているＰＢＳ）溶液１００μｌで３回ずつ洗浄した後、ＲＤ（１％ＢＳＡが入っているＰＢＳ）溶液１００μｌを分注して常温で１時間の間ブロッキングした。サンプルおよびスタンダードを濃度に合うように５０μｌずつ分注し、常温で２時間の間反応させた。

次に、ＰＢＳＴ１００μｌで３回洗浄した後、検出抗体をＲＤに希釈させて、作用濃度に合うように５０μｌずつ分注して、常温で２時間の間反応させた。そして、ＰＢＳＴ１００μｌで３回洗浄した後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍ，ＵＳＡ）をＲＤに１／４０で希釈させて、５０μｌずつ分注して、常温で２０分間反応させた。

最後に、ＰＢＳＴ１００μｌで３回洗浄した後、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質（ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ，ＵＳＡ）５０μｌを分注し、５分から２０分後に発色が進んだとき、１Ｍの硫酸溶液を５０μｌずつ分注して、反応を中止し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＭ３ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｒｅａｄｅｒ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。

その結果、図３に示されたように、ワイセラ・シバリア由来の小胞（ＷｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａＥＶ）の処理による細胞死滅は観察されなかった（図３参照）。また、炎症細胞での炎症性メディエーターの分泌様相を評価した結果、陽性対照群である大腸菌由来の小胞（Ｅ．ｃｏｌｉＥＶ１μｇ／ｍｌ）の処理時に比べてワイセラ・シバリア由来の小胞の処理時に、炎症性メディエーターの分泌が格別に減少していることを確認した（図４ａおよび４ｂ参照）。

［実施例５．ワイセラ・シバリア由来の小胞の抗炎症効果］
前記実施例４の結果を基に、ワイセラ・シバリア由来の小胞の抗炎症効果を評価するために、多様な濃度（０．１、１、１０μｇ／ｍｌ）のワイセラ・シバリア由来の小胞をマウスマクロファージ細胞株に１２時間前処理した後、病原性原因因子である大腸菌由来の小胞１μｇ／ｍｌを処理し、１２時間後に、炎症性サイトカインの分泌をＥＬＩＳＡで測定した。

その結果、ワイセラ・シバリア由来の小胞を前処理時に、大腸菌由来の小胞刺激による炎症細胞に分泌されるＩＬ－６、ＴＮＦ－αの量が顕著に抑制されることを確認した（図５ａおよび５ｂ参照）。ＩＬ－６の場合には、有用微生物対照群であるラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の小胞を前処理したときと同様に、抗炎症効果を示すことを確認し（図５ａ参照）、ＴＮＦ－αの場合には、有用微生物対照群であるラクトバチルス・プランタルム由来の小胞を前処理したときより抗炎症効果が顕著に高いと同時に、抑制効果がワイセラ・シバリア由来の小胞処理濃度に依存的であることを確認した（図５ｂ参照）。これは、大腸菌由来の小胞のような病原性炎症誘発因子によって誘導される炎症反応をワイセラ・シバリア由来の小胞が効率的に抑制することができることを意味する。

上述した本発明の説明は、例示のためのものであって、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。

本発明によるワイセラ属細菌由来の小胞は、粘膜の防御膜を通過して粘膜上皮細胞に吸収されて全身的に分布することができ、病原性小胞によるＩＬ－６およびＴＮＦ－α等の炎症性メディエーターの分泌を抑制できるところ、炎症疾患の予防、改善または治療用組成物に有用に用いられるという点から、産業的利用価値が大きいと予想される。

Claims

ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）由来の小胞を有効成分として含み、ワイセラ・シバリア菌体は除かれている、炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍである、請求項１に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
前記小胞は、ワイセラ・シバリアから自然的または人工的に分泌されたものである、請求項１に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
前記炎症疾患は、歯肉炎および歯周炎を含む口腔炎症疾患；胃炎を含む胃炎症疾患；大腸炎を含む大腸炎症疾患；アトピー皮膚炎および乾癬を含む皮膚炎症疾患；鼻炎、喘息および慢性閉塞性肺疾患を含む呼吸器系炎症疾患よりなる群から選ばれる１つ以上の疾患である、請求項１に記載の炎症疾患の予防または治療用薬学的組成物。
ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）由来の小胞を有効成分として含み、ワイセラ・シバリア菌体は除かれている、炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
前記小胞は、平均直径が１０～２００ｎｍである、請求項５に記載の炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
前記小胞は、ワイセラ・シバリアから自然的または人工的に分泌されたものである、請求項５に記載の炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
前記炎症疾患は、歯肉炎および歯周炎を含む口腔炎症疾患；胃炎を含む胃炎症疾患；大腸炎を含む大腸炎症疾患；アトピー皮膚炎および乾癬を含む皮膚炎症疾患；鼻炎、喘息および慢性閉塞性肺疾患を含む呼吸器系炎症疾患よりなる群から選ばれた1つ以上の疾患である、請求項５に記載の炎症疾患の予防または改善用食品組成物。
ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）由来の小胞を有効成分として含み、ワイセラ・シバリア菌体は除かれている、炎症疾患の予防または改善用化粧料組成物。
前記小胞は、ワイセラ・シバリアから自然的または人工的に分泌されたものである、請求項９に記載の炎症疾患の予防または改善用化粧料組成物。
ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）由来の小胞を有効成分として含み、ワイセラ・シバリア菌体は除かれている、炎症疾患の予防または治療用吸入剤組成物。
ワイセラ・シバリア（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａｃｉｂａｒｉａ）由来の小胞の炎症疾患に用いられる薬剤の生産のための使用。