CN112402459B - 普拉梭菌缓解过敏性哮喘和鼻炎Th2反应中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及普拉梭菌缓解过敏性哮喘和鼻炎Th2反应中的应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明将普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2‑165应用于缓解过敏性哮喘和鼻炎，具体体现在：(1)显著改善过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部病理症状记忆炎症细胞的浸润作用；(2)显著降低过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺泡灌洗液中IL‑4、IL‑5和IL‑13的含量；(3)显著抑制过敏性哮喘和鼻炎小鼠血清中尘螨特异性免疫球蛋白IgG1的产生；(4)显著提高脾脏中Tregs的比例，因此，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2‑165在制备预防和/或治疗的产品中，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及普拉梭菌缓解过敏性哮喘和鼻炎Th2反应中的应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
过敏性哮喘和鼻炎(Allergic Asthma and Rhinitis)是临床常见病、难治病，病程迁延难愈，其主要特征为各种炎症细胞(肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞)浸润，此类细胞所分泌的炎性介质可放大炎症级联反应，增加气道高反应性(AHR)以及刺激粘液分泌，导致气道阻塞和气道重塑。在易感人群中，此种炎症可引发反复发作的喘息、气促、胸闷和/或咳嗽等症状，进而引发呼吸骤停和呼吸衰竭等并发症，危及患者生命。
目前，过敏性哮喘和鼻炎已经对很患者的生活造成了巨大的困扰。该疾病的引发受多方面因素的影响，如暴露途径，遗传易感性、以及过敏原剂量等。研究表明，屋尘螨(House dust mite,HDM)为主要的过敏原，85％的哮喘和鼻炎患者通常对HDM过敏。过敏原通过上皮进入机体后，刺激Th0细胞趋于分化为Th2细胞，导致IL-4、IL-5和IL-13等Th2型细胞因子分泌增加，致使机体处于致敏状态。当机体再次接触此类过敏原时，B细胞诱导分泌的IgE 与肥大细胞表面结合，而Th2细胞分泌的IL-5细胞因子可刺激嗜酸粒细胞的增殖，引起组胺、白三烯等一系列物质释放，进而产生过敏症状。
随着肠道菌群的深入研究，许多研究证实过敏性哮喘和鼻炎与肠道菌群的紊乱相关。较之健康人群肠道菌群，过敏性哮喘和鼻炎患者的肠道中有益菌减少而有害菌增多，且肠道中代谢产物也发生了改变如短链脂肪酸的减少。有研究检测了过敏性哮喘和鼻炎患者粪便中短链脂肪酸的浓度，发现过敏性哮喘和鼻炎患者肠道内丙酸，丁酸和异丁酸的浓度较健康人群明显下降，同时Th2型变态反应水平的细胞因子IL-4、IL-5和IL-13与肠道中丙酸的含量呈负相关，提示由肠道菌群代谢产生的丙酸有利于降低过敏性哮喘和鼻炎的Th2反应。
目前，治疗过敏性哮喘和鼻炎的手段通常是通过药物控制，这些药物包括支气管舒张药物和抗炎药物。其中，支气管舒张药物和抗炎药物由于多数需要以静脉注射或吸入的方式给药，因此，患者对这些药物的依从性较差，这就导致了患者的疾病会反复发作，久而久之还会引发患者肺气肿、肺心病等严重并发症。
针对上述药物的缺点，研究人员开始尝试使用益生菌制剂治疗过敏性哮喘和鼻炎。益生菌制剂对人体安全健康，且给药方式简便，但目前发现的具有缓解过敏性哮喘和鼻炎症状的加式乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌等益生菌或效果较差或作用效果不明确，而市面上多数的益生菌制剂也或具有见效慢的缺陷，或具有作用关系不明确的缺陷。
因此，急需找到一种对过敏性哮喘和鼻炎针对性强且缓解过敏性哮喘和鼻炎能力强的益生菌以解决现有针对过敏性哮喘和鼻炎的益生菌制剂均见效慢、作用关系不明确的问题。
发明内容
为解决上述问题，本发明将益生菌普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)应用于改善过敏引起的哮喘和鼻炎中，来降低过敏炎症反应。
本发明提供了普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)或含有普拉梭菌的益生菌制剂在制备预防、缓解和/或改善过敏性哮喘和鼻炎的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述普拉梭菌为普拉梭菌A2-165，公开于文献《Gutmicrobial-derived butyrate is inversely associated with IgEresponses toallergens in childhood asthma》(公开于2019年6月)。
在本发明的一种实施方式中，所述产品用于降低机体敏感性、改善过敏反应和/或提高机体免疫力。
在本发明的一种实施方式中，所述益生菌制剂中除普拉梭菌A2-165外，还含有辅料，所述辅料包括但不限于赋形剂或食品添加剂；所述普拉梭菌A2-165在益生菌制剂中的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述产品可用于包括药物、药物组合物或药物辅料，所述药物、药物组合物或药物辅料用于(a)～(d)至少一方面：
(a)改善肺部病理症状，减少肺部灌洗液嗜酸细胞的数量，降低肺部炎症水平；
(b)降低血清中特异性免疫反应水平，包括降低血清中HDM特异性IgG1的含量；
(c)提高脾脏免疫力，包括提高脾脏中Tregs的比例；
(d)提高机体肠道免疫力；上调了短链脂肪酸中的丙酸的含量，促进肠道产生丙酸。
在本发明的一种实施方式中，所述普拉梭菌A2-165在药物、药物组合物或药物辅料中的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
在本发明的一种实施方式中，所述降低肺部炎症水平包括降低肺泡灌洗液中的IL-4、IL-5、 IL-13水平。
在本发明的一种实施方式中，所述药物或药物组合物还包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含赋形剂以及附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含抗黏合剂、渗透促进剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、吸收剂、保湿剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、pH值调节剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、整合剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、发泡剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含微晶纤维素、羟丙基甲基纤维素以及精制卵磷脂。
本发明的一种实施方式中，所述药品的剂型包含颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于食品、保健品饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述食品包含使用普拉梭菌A2-165发酵生产得到的乳制品、豆制品或果蔬制品；或所述食品包含含有所述普拉梭菌A2-165的固体饮料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、保健品饮品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂中还含有常规辅料。
有益效果：
本发明通过动物实验证实普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165具有缓解过敏性哮喘和鼻炎的作用，具体体现在：
(1)过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部出血现象和炎症反应得到显著改善；
(2)过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部嗜酸细胞数目由1.9×104个/mL降低到了0.8×104个/mL。
(3)过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺灌洗液中IL-4的含量由154.62pg/mL降低到了96.09pg/mL。
(4)过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺灌洗液中IL-5的含量由6.28pg/mL降低到了4.27pg/mL。
(5)过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺灌洗液中IL-13的含量由32.25pg/mL降低到了22.73pg/mL。
(6)过敏性哮喘和鼻炎小鼠血清中IgG1的含量由124.67ng/mL降低到了15.40ng/mL。
(7)过敏性哮喘和鼻炎小鼠脾脏Tregs的比例由4.36％升高到了5.07％。
(8)过敏性哮喘和鼻炎小鼠结肠丙酸的含量由3.63μmol/g升高到了6.41μmol/g。
因此，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165在制备预防和/或治疗过敏性哮喘和鼻炎的产品(如食品、药品或保健品等)中，具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为不同组别实验小鼠肺组织HE染色结果。
图2为不同组别实验小鼠肺组织灌洗液中嗜酸细胞的数目。
图3为不同组别实验小鼠肺泡灌洗液中IL-4含量。
图4为不同组别实验小鼠肺泡灌洗液中IL-5含量。
图5为不同组别实验小鼠肺泡灌洗液中IL-13含量。
图6为不同组别实验小鼠血清中HDM特异性免疫球蛋白IgG1含量。
图7为不同组别实验小鼠脾脏中Tregs比例的效果对比。
图8为不同组别实验小鼠结肠丙酸的含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的脱脂乳购自光明乳业股份有限公司，葡萄糖与酵母浸膏购自国药集团化学试剂有限公司，胰蛋白胨购自英国OXOID公司，酶联免疫吸附测定试剂盒(IL-4、IL-5、和IL13)，伊红美蓝染色液均购自南京森贝伽生物技术有限公司，IgG1酶联免疫吸附测定试剂盒购自美国Chondrex公司，CD4,CD25,Foxp3利用eBioscienceTM MouseRegulatory T Cell Staining Kit#1(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA,USA)胞内染色，HDM购自德国汉堡公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
YCFA固体培养基(g/L)：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、纤维二糖2g/L、乳糖5g/L、乙酸钠4g/L、氯化钠0.9g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、硫酸镁0.09g/L、氯化钙0.09g/L、血红素10mg/L、琼脂15g/L、半胱氨酸0.5g/L、刃天青1.0mg/L。
YCFA液体培养基(g/L)：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、葡萄糖20g/L、纤维二糖2g/L、乳糖5g/L、乙酸钠4g/L、氯化钠0.9g/L、磷酸二氢钾0.45g/L、磷酸氢二钾0.45g/L、硫酸镁0.09g/L、氯化钙0.09g/L、血红素10mg/L、半胱氨酸0.5g/L、刃天青1.0mg/L。
实施例1：普拉梭菌的培养
具体步骤如下：
将普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165接入YCFA固体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃培养48h后，观察其菌落，发现其菌落凸面，半透明，边缘完整，湿润。
将普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165接入YCFA液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中于37℃厌氧培养18h后，转入新鲜的YCFA液体培养基(含0.05％半胱氨酸)中，同样条件培养18h，在厌氧工作站内抽滤获得菌泥，继而用0.1M PBS(pH 7.2，含0.05％半胱氨酸)洗涤重悬后得到菌悬液，使用密封性良好的冻干瓶加塞保存菌悬液，当天使用。
实施例2：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部病理的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉处死小鼠，剖胸腔，使用琼脂糖溶液填充小鼠左肺，取下左肺置于4％的多聚甲醛溶液中固定36h，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片HE染色后，对组织进行病理程度评估，染色结果见图1。
如图1所示，相较于空白组，模型组小鼠肺部组织具有明显出血和炎症细胞浸润的现象，而喂食普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌后，出血和炎症细胞浸润的现象显著得到改善。喂食死菌及上清后，肺部出血现象明显得到控制，炎症细胞浸润虽依然可见，但相较于模型组情况已经得到较大的改善。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌可显著改善过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部的病理症状，其死菌和上清也具有不同程度的改善作用。
实施例3：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部嗜酸细胞数目的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉处理小鼠，置于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1ml注射器吸取0.3ml预冷的PBS，灌洗小鼠左肺，重复进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。灌洗液在4℃下1000rpm离心5min，收集上清液，分装于Eppendorf管中，冻存-20℃。使用Diff-Quick 试剂盒对灌洗液中的嗜酸细胞进行染色，并使用显微镜根据嗜酸细胞的形态进行计数，计数结果见图2。
如图2所示，相较于空白组，模型组小鼠嗜酸细胞数目显著上升。小鼠在喂食普拉梭菌 (Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌和死菌后，嗜酸细胞数目分别减少了51.1％和 56.8％，显著低于模型组(P<0.05)，而上清组则与模型组无显著差异(P>0.05),说明普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165死菌和活菌降低了过敏性小鼠肺部炎症反应。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165死菌和活菌均可显著降低过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺部灌洗液嗜酸细胞的数量以及由此产生的炎症反应。
实施例4：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺泡灌洗液中IL-4的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉处理小鼠，置于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1ml注射器吸取0.3ml预冷的PBS，灌洗小鼠左肺，重复进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。灌洗液在4℃下1000rpm离心5min，收集上清液，分装于Eppendorf管中，冻存-20℃，通过ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的IL-4含量，肺泡灌洗液中的I L-4的含量检测结果分别见图3。
如图3所示，小鼠在喂食本发明中的菌株普拉梭菌A2-165活菌后，肺泡灌洗液中IL-4 含量较模型组显著下降了37.8％(P<0.05)，且与空白组无显著差异；而死菌组和上清组肺泡灌洗液中IL-4的含量与模型组并无显著差异，分别降低了30.1％和31.3％。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌能显著下调哮喘和鼻炎小鼠肺部灌洗液中典型上调Th2相关的细胞因子至正常水平，尤其是降低能刺激气道上皮细胞产生大量粘液的IL-4水平，且优于其死菌和上清。
实施例5：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺泡灌洗液中IL-5的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉处理小鼠，置于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1ml注射器吸取0.3ml预冷的PBS，灌洗小鼠左肺，重复进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。灌洗液在4℃下1000rpm离心5min，收集上清液，分装于Eppendorf管中，冻存-20℃，通过ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的IL-5含量，肺泡灌洗液中的IL-5的含量检测结果见图4。
如图4所示，小鼠在喂食本发明中的菌株普拉梭菌A2-165活菌和死菌后，肺泡灌洗液中 IL-5含量较模型组分别显著下降了29.1％和32.0％(P<0.05)，且与空白组无显著差异；而上清组肺泡灌洗液中IL-5的含量与模型组并无显著差异，仅降低了15.7％。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌和死菌均可显著下调哮喘和鼻炎小鼠肺部灌洗液中典型上调Th2相关的细胞因子至正常水平，尤其能降低刺激嗜酸细胞增殖的IL-5水平，且优于其上清。
实施例6：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠肺泡灌洗液中IL-13的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉处理小鼠，置于解剖盘上，固定头部和四只，解剖胸腔和颈部，使小鼠气管和双肺暴露，结扎右肺，用留置针进行气管插管，以1ml注射器吸取0.3ml预冷的PBS，灌洗小鼠左肺，重复进行3次，回收量≥80％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。灌洗液在4℃下1000rpm离心5min，收集上清液，分装于Eppendorf管中，冻存-20℃，通过ELISA试剂盒检测肺泡灌洗液中的IL-13含量，肺泡灌洗液中的IL-13的含量检测结果见图5。
如图5所示，小鼠在喂食本发明中的菌株普拉梭菌A2-165活菌和死菌后，肺泡灌洗液中 IL-5含量较模型组分别显著下降了26.7％和29.5％(P<0.05)，且与空白组无显著差异；而上清组肺泡灌洗液中IL13的含量与模型组并无显著差异，仅降低了15.5％。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌和死菌均可显著下调哮喘和鼻炎小鼠肺部灌洗液中典型上调Th2相关的细胞因子至正常水平，尤其是降低能刺激气道上皮细胞产生大量粘液的IL-13水平，且优于其上清。
实施例7：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠血清中HDM-IgG1的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉小鼠，眼球采血，静止2h后，于离心机3000rpm离心10分钟，收集血清于干净的离心管中，冻存于-20℃。通过HDM特异性IgG1 ELISA试剂盒检测血清中HDM特异性IgG1的含量，检测结果见图6。
如图6所示，喂食普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌和死菌后，小鼠血清中HDM特异性IgG1的含量分别降到了15.4和18.1ng/mL，显著低于模型组含量124.7ng/mL(P<0.05)，与空白组含量11.2ng/mL相当，优于上清组含量94.2ng/mL。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌和死菌可显著降低过敏性哮喘和鼻炎小鼠血清中HDM特异性IgG1的含量，有助于缓解小鼠的过敏性哮喘和鼻炎反应。
实施例8：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠脾脏Tregs比例的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉小鼠，解剖胸腔，摘取小鼠脾脏，利用eBioscienceTM MouseRegulatory T Cell染色试剂按照试验说明书处理脾脏细胞，通过流式细胞仪测定小鼠脾脏中CD4+CD25+ Foxp3+Tregs比例，结果见图7。
如图7所示，小鼠喂食普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌后，脾脏中 Tregs的比例较模型组显著升高了16.2％(P<0.05)，优于死菌组的3.7％；而上清组较模型组反而减低了6.3％，且结果并无统计学上的差异。
以上实验表明，普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)A2-165活菌可显著提高哮喘和鼻炎小鼠脾脏中Tregs的比例，有助于恢复小鼠的正常免疫反应。
实施例9：普拉梭菌对过敏性哮喘和鼻炎小鼠肠道丙酸含量的影响
具体步骤如下：
将40只SPF级雌性BALB/c小鼠(14-16g)随机分为5组，分别为空白组、模型组、实验组，其中，实验组包括上清组、死菌组和活菌组，每组8只。小鼠在江南大学实验动物中心，普通饲料喂养，恒定温度21-26℃，湿度40-70％，噪声小于等于60dB，动物照度15-20LX (所有动物实验程序皆由江南大学动物福利与伦理管理委员会进行审查并批准)。
实验共四周：小鼠先适应性喂养5天，从第6天开始，每隔一周对模型组和实验组小鼠 (除空白组外)均麻醉滴鼻100μg/25μL的HDM(屋尘螨提取物)，空白组滴鼻25μL无菌 PBS作为对照。另外，实验组从第6天开始每天灌胃0.25mL普拉梭菌(Faecalibacteriumprausnitzii)A2-165活菌菌液、死菌菌液以及其培养物上清溶液，单次灌胃剂量为1×109CFU/ 只/次，空白组和模型组仅灌胃等量PBS作为对照。
实验结束后，麻醉小鼠，解剖腹腔，取盲肠内容物于干净的离心管中，冻存于-20℃。通过GC-MS检测结肠内容物中丙酸的含量，检测结果见图8，丙酸各组平均含量(μM/g)：空白7.9，模型3.6，上清5.1，死菌6.4，活菌5.7。
如图8所示，小鼠在喂食本发明中的普拉梭菌A2-165活菌和死菌后，结肠内容物中丙酸的含量较模型组分别显著提高了57.0％和76.7％(P<0.05),优于上清组的41.5％。说明本发明的普拉梭菌A2-165菌株活菌和死菌均能促进过敏性小鼠肠道中丙酸的产生。
综合上述实验结果，普拉梭菌A2-165显著上调了短链脂肪酸中的丙酸的含量。在促进肠道产生丙酸的方面，普拉梭菌A2-165死菌优于活菌，但差异并不显著。
实施例10：含有普拉梭菌A2-165的固体饮料的制备
具体步骤如下：
将普拉梭菌A2-165按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养 18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到普拉梭菌A2-165菌粉。
将含有109CFU的普拉梭菌A2-165菌粉同麦芽糊精进行混合，A2-165菌粉和麦芽糊精总质量为1克，得到富含普拉梭菌A2-165的固体饮料。
取10克(相当于共灌1010CFU)上述含有普拉梭菌A2-165的固体饮料，用生理盐水复溶，定容到20毫升，每只小鼠每天灌胃200微升，连续3周，可有效降低变应性哮喘和鼻炎小鼠血清中IgG1的含量、肺组织中炎症细胞浸润、炎性细胞因子的产生，提高脾脏中Tregs的比例和肠道中丙酸的含量，在缓解变应性哮喘和鼻炎有极好的效果。
实施例11：含有普拉梭菌A2-165的牛乳的制备
具体步骤如下：
将普拉梭菌A2-165按照占培养基总质量3％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养 18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用pH为7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次后用海藻糖浓度为100g/L的海藻糖冻干保护剂重悬至菌浓度达到1×1010CFU/mL，得到菌悬液；将悬浮液于37℃下放置60min进行预培养后采用冻干法冻干，得到普拉梭菌A2-165发酵剂；其中，所述培养基包含占培养基总质量87.7％的水、10％的酶水解脱脂乳、0.5％的葡萄糖、1.5％的胰蛋白胨以及0.3％的酵母浸膏溶解；所述培养基的pH为6.8；
将脱脂乳在95℃热杀菌20min，然后冷却至4℃，加入普拉梭菌A2-165发酵剂，使乳脱脂奶中普拉梭菌A2-165活菌浓度达到1×109CFU/mL，在4℃下冷藏保存，得到含有普拉梭菌 A2-165活菌的牛乳。
取200微升含有普拉梭菌A2-165活菌的牛乳，对小鼠进行灌胃连续3周，可有效降低变应性哮喘和鼻炎小鼠血清中IgG1的含量、肺组织中炎症细胞浸润、炎性细胞因子的产生，提高脾脏中Tregs的比例和肠道中丙酸的含量，在缓解变应性哮喘和鼻炎有极好的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (9)
1.普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)或含有普拉梭菌的益生菌制剂在制备预防、缓解和/或改善过敏性哮喘和鼻炎的产品中的应用；所述普拉梭菌为普拉梭菌A2-165。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品用于降低机体敏感性、改善过敏反应和/或提高机体免疫力。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述益生菌制剂中除普拉梭菌外，还含有辅料，所述辅料为赋形剂或食品添加剂；所述普拉梭菌在益生菌制剂中的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物或药物组合物，所述药物或药物组合物中含有药物辅料；所述药物或药物组合物用于(a)～(d)至少一方面：
(a)改善肺部病理症状，减少肺部灌洗液嗜酸细胞的数量，降低肺部炎症水平；
(b)降低血清中特异性免疫反应水平，降低血清中HDM特异性IgG1的含量；
(c)提高脾脏免疫力，提高脾脏中Tregs的比例；
(d)提高机体肠道免疫力；上调了短链脂肪酸中的丙酸的含量，促进肠道产生丙酸；
所述普拉梭菌在药物或药物组合物中的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降低肺部炎症水平包括降低肺泡灌洗液中的IL-4、IL-5、IL-13水平。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物或药物组合物还包含微囊、微球、纳米粒以及脂质体，所述药用辅料包含赋形剂以及附加剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药用辅料为抗黏合剂、渗透促进剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、吸收剂、保湿剂、溶剂、抛射剂、增溶剂、乳化剂、着色剂、pH值调节剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、整合剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、发泡剂、助悬剂、包衣材料、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂中还含有常规辅料。
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-
2020
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Non-Patent Citations (2)
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