CN117679445A - 含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物及其应用 - Google Patents
含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于细胞产品制备技术领域，提供了含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物及其应用。该组合物中肠道益生菌外囊泡和干细胞外囊泡颗粒数比例为1:1000‑1000:1；肠道益生菌在分类上属于乳杆菌科（Lactobacillaceae）、酵母科(Saccharomycetaceae)和芽孢杆菌属（Bacillus）。上述组合物可用于制备缓解或治疗炎症性肠病的药物。
Description
技术领域
本发明属于细胞制品制备技术领域，涉及一种含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物。
背景技术
公开该背景技术的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种以肠道炎症复发为特征的慢性疾病。该疾病根据严重程度主要有两个特征的表型表现：溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis, UC)和克罗恩病(crohn’s disease, CD)。UC的发病率约为每10万人中有0.5-24.5例/年，CD的发病率约为每10万人中有0.1-16例/年。根据调查发现，在美国有超过180万的患者，全世界大约有350万的患者患有IBD。不幸的是，IBD的发病率在世界范围内急剧增加，给患者的家庭和公共医疗保健带来了沉重的经济负担。
该病的发病机制不明确，可能与遗传、环境因素（如细菌病原体）和免疫反应失调之间存在相互作用。IBD的治疗旨在减少症状的范围和严重程度，并阻止疾病进展。主要药物是5-氨基水杨酸盐（5-ASA）、皮质类固醇和免疫抑制剂等。但这些常规的药物主要针对单一靶点治疗，具有局限性并存在严重的副作用。例如氨基水杨酸类药物长期使用会出现头晕、头痛与胃肠道不良反应；免疫抑制剂、皮质类固醇和生物制剂等会导致白细胞减少、骨质疏松、血管坏死、肾上腺功能不全以及各种感染等不良反应。因此，急需开发安全有效的产品用于IBD的治疗。
益生菌是一种有益的细菌，能够促进肠道菌群平衡，增强机体的免疫能力，促进营养物质的吸收，减少肠道炎症的发生，降低肠道疾病的风险。有研究显示，肠道益生菌可通过改变肠道环境来降低与IBD相关的肠道炎症，它们能够创造更有利的肠道微生物生态位，从而维持消化道的正常生理机能。但是益生菌并非百利而无一害的，部分益生菌在体内活动的时候，可能会发生感染的情况，甚至诱发某些炎症。另外有研究显示，长期摄取益生菌活菌制剂能够增加菌血症的发病率。因此，如何更加安全有效的使用益生菌，降低益生菌的不良作用备受研究人员的关注。
乳杆菌是一种食品级微生物，且是最常见的益生菌物种之一。鼠李糖乳杆菌ATCC53103（LGG）是此类研究的理想益生菌，因为它是文献中研究最深入的细菌，具有记录的体外抗炎作用和可靠的安全性数据。初步临床研究支持可能利用LGG制剂维持IBD患者的缓解。LGG在生长过程中，会释放纳米级的囊泡物质，这种囊泡可能具有LGG功能的同时，还能减少活菌制剂的副作用。此外，细菌外膜囊泡的给药方式多数是注射给药，而对于IBD疾病口服给药更具有空间和安全优势，因此口服细胞外膜囊泡，并将其稳定的递送到特定肠道部位的是在细菌外膜囊泡应用中的需要解决的问题。
MSCs是存在于骨髓、脐带和脂肪等组织中的一种多功能干细胞，由于MSCs具有良好的促再生作用和强大的免疫调节功能且免疫原性较低，基于MSCs的细胞治疗研究越来越多，涉及治疗的疾病谱非常丰富，如骨关节疾病、移植物抗宿主病、肝衰竭、感染性疾病等。有研究表明MSCs通过分泌相关免疫调节因子，抑制促炎性Th1/Th17细胞的增殖和功能，修复损伤的细胞和组织，导致抗炎因子分泌增加，促炎因子分泌减少，从而缓解IBD。然而不同来源的MSCs、移植的数量等导致治疗效果不佳。且MSCs的保存条件比较严格，有使用不便的弊端。MSCs源的外囊泡具有与MSCs相似的生物学功能，能够修复组织损伤，调节多种免疫系统细胞、肠道微生物群等，基本无毒副作用，具有自主靶向的能力，能够归巢到特定病变组织，从而更好地发挥疗效。细胞外囊泡多采用注射的方式给药，而对于IBD疾病口服给药的途径更具有优势。
发明内容
为了扩展和强化干细胞外囊泡在炎症性肠病治疗方面的功能，本发明提供一种含益生菌外囊泡和干细胞胞外囊泡的组合物，该组合物结合LGG和UCMSC的作用，两者联合应用具有明显的协同增效作用，可以更好地促进IBD的恢复，促进肠道粘膜屏障的修复，减少炎症反应。
本发明的另一目的在于提供一种上述组合的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物，肠道益生菌外囊泡和干细胞外囊泡颗粒数比例为1:1000-1000:1；如，1:1000、1:800、1:500、1:100、1:50、1:20、1:10、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、25:1、50:1、80:1、100:1、200:1、500:1、1000:1或者上述比值之间的任意比例。为了达到更好的治疗效果，干细胞和益生菌外囊泡颗粒数比例为1:100-100:1；结合成本和疗效，上述比例优选为1:10-10:1。
所述干细胞的来源并无限定，胎盘组织、脐带血、骨髓、脂肪、牙髓、尿液、经血、皮肤、神经、内皮祖细胞等任何组织中可以提取到的干细胞都可以作为干细胞来源。为了采集方便、保证数量，干细胞来源于胎盘组织、脐带血、脂肪或骨髓。用于产生外囊泡的干细胞可以是直接分离获得的或者由直接分离的干细胞传代后获得的。一般的，现有技术中，干细胞可传代10-15次左右，仍能够保持比较好的生物学活性，因此，传代1-15次的干细胞都是可以用于生产外囊泡的。为了保证外囊泡的质量和数量可用于治疗，用于产生外囊泡的干细胞为直接分离获得的干细胞传代3-7次获得的第4-8代的干细胞。
所述肠道益生菌为用于调节人体肠道菌群平衡的有益菌，在分类上属于乳杆菌科（Lactobacillaceae）、酵母科(Saccharomycetaceae)和芽孢杆菌属（Bacillus）。具体地，可以为乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、酵母属、芽孢杆菌属的菌株，如，鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、动物乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌。在一些实施例中，肠道益生菌为鼠李糖乳杆菌或罗伊氏乳杆菌；具体菌株可以选择鼠李糖乳杆菌LGG、鼠李糖乳杆菌HN001、鼠李糖乳杆菌MP108、罗伊氏乳杆菌DSM17938。
外囊泡的制备可采用本领域常用方法，如差速离心法、超滤法、TFF切向流过滤法、密度梯度离心、空间排阻色谱法、微流控分离法、声学流体分离、介电泳分离法、聚合物沉淀、免疫亲和等方法。外囊泡的粒径根据制备方法的不同会有一定的差别。在一些实施例中，粒径范围为50nm-500nm。
上述组合物还包括制剂化所需的载体和/或药用辅料。其剂型可以选择适于口服的液态或固态剂型，如口服液、冻干粉、胶囊、片剂等。具体的制备方法可以采用医学或药学上通用的方法，将含干细胞和益生菌外囊泡的溶液直接或者根据需要与药学上允许的载体、添加剂，如，海藻糖、甘露醇、人白蛋白等，一起进行制剂化获得液体制剂，或者进一步通过冷冻干燥制成粉末物，或与药学上允许的添加剂一起作为胶囊的内容物、或压片制备成固体制剂。在一些实施例中，将外囊泡溶液与冻干保护剂混合后冻干，获得了复合外囊泡冻干粉。所述组合物为了适应释药部位的微环境，可以具有不同的pH，pH的范围可以在医药上、药理学上或生理学上允许的范围内，并无特别限定。如，pH 3.0-10.0、5.0-8.0、6.5-8.0。
为了提高组合物的疗效或者针对同一病症的其他症状，上述组合物还可以包括其他有效成分，如，氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、抗体药、低聚半乳糖、美沙拉嗪、维生素D、钙。
本发明还提供了一种上述组合物在制备缓解或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
上述组合物制备的药物中，外囊泡的总颗粒数并无固定限制。一般地，为了适应不同医疗用途或作用靶标，外囊泡的输注颗粒数量一般为105-1011/kg体重；为了使上述组合物的使用数量能够达到该数量级范围；在一些实施例中，外囊泡的总颗粒数大于105/mL或105/g，如每毫升或每克制剂中含有外囊泡的颗粒数为107-1011数量级范围或108-109数量级范围。
本发明具有以下优点：
本发明提供的肠道益生菌外囊泡和干细胞外囊泡的组合物能够通过口服到达肠道，提供了囊泡给药的新方法。此外，本发明的复合冻干粉能够缓解DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎，能够降低疾病活动指数、减少结肠缩短、缓解结肠炎症、修复结肠屏障，效果优于炎性肠病常用药物美沙拉嗪。
附图说明
图1是鼠李糖乳杆菌囊泡结构（左）和囊泡粒径分布（右）；
图2是UCMSC囊泡结构（左）和囊泡粒径分布（右）；
图3是复合冻干粉对炎性肠病大鼠DAI评分的影响；
图4是复合冻干粉对炎性肠病大鼠结肠长度的影响；
图5是复合冻干粉对炎性肠病大鼠结肠炎性相关因子的影响；
图6是复合冻干粉对炎性肠病大鼠结肠肠通透性的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 鼠李糖乳杆菌囊泡和干细胞囊泡组合物的制备
1. 鼠李糖乳杆菌外囊泡的制备
乳酸菌是一种肠道益生菌，通常被用来改善肠道的消化过程，减轻、延缓各种疾病的症状和进展，对肠道有明显的益生作用。乳酸菌能够通过分泌多种活性酶来促进胃肠道对营养成分的吸收，能够黏附在胃肠道表面抑制有害菌的生长繁殖同时调控肠道菌群，能够增强肠上皮屏障来发展和维持体内平衡，能够参与机体的免疫调控，维持机体的正常免疫功能，降低感染和炎症发生的风险。乳酸菌分泌的外囊泡具有与乳酸菌相似的功能，具有乳酸菌来源的多种成分，其携带的免疫调节因子和生物活性物质能够穿过肠上皮细胞达到基底层，调节肠道的免疫功能，抑制病原菌的生长，保障了机体的健康，提高了机体抗病能力。乳杆菌是一种最常见和使用最广泛的乳酸菌，以鼠李糖乳杆菌ATCC 53103（LGG）为例进行肠道益生菌外囊泡的提取。
将鼠李糖乳杆菌冻干粉接种到MRS液体培养基（胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、一水硫酸锰0.05g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、吐温80 1mL/L），37℃、200rpm恒温培养12h获得种子溶液；取100μL菌液均匀的涂布在MRS固体培养基（胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、无水乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、七水硫酸镁0.1g/L、一水硫酸锰0.05g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、磷酸氢二钾2g/L、吐温80 1mL/L、琼脂15g/L）上，37℃恒温培养24h；从固体培养基上蘸取少量菌落，在新的MRS固体培养基四区划线分离，37℃恒温培养24h；挑取单菌落至新鲜的MRS液体培养基中，37℃、200rpm恒温培养12h；分别取适量的菌液至多个MRS液体培养基中扩大培养，37℃、200rpm恒温培养12h；收集菌液，低速离心（8000g、4℃离心20min）获得上清液。上清液再次低速离心（8000g、4℃离心20min），去除杂质；先用0.45μm再用0.2μm的滤器过滤除菌；用TFF技术浓缩20-30倍；将浓缩液16500g、4℃离心30min，去除杂质；上清液120000g、4℃离心70min获得囊泡沉淀；囊泡沉淀用无菌PBS重悬后再次120000g、4℃离心70min；用无菌PBS进行重悬，获得鼠李糖乳杆菌囊泡。
将提取的鼠李糖乳杆菌囊泡20μL滴加到铜网上，室温下放置1min，吸附掉多余的外泌体，室温下用30 g/L磷钨酸(pH 6.8)染色5分钟，半瓦灯下干燥。然后在透射电子显微镜下成像。取20μL鼠李糖乳杆菌囊泡，用纳米颗粒跟踪分析仪检测其颗粒浓度和粒径分布。
鼠李糖乳杆菌外囊泡的电镜图片如图1左图所示：形态完整、脂质双分子层的膜性小囊泡；群体粒径检测结果如图1右图所示：外囊泡中位粒径212nm，浓度为8×108particles /mL。
2. 干细胞外囊泡的制备
以脐带来源的间充质干细胞（UCMSC）为工作细胞制备干细胞外囊泡：将细胞从液氮罐中取出，细胞计数后按照8000cell/cm2的密度接种，待细胞汇合度达到80-90%后，收集UCMSC细胞上清液；用TFF（切向流）超滤系统浓缩20-30倍；将浓缩液16500g、4℃离心30min，去除杂质；上清液120000g、4℃离心70min获得囊泡沉淀；囊泡沉淀用无菌PBS重悬后再次120000g、4℃离心70min；用无菌PBS进行重悬。
将提取的UCMSC囊泡20μL滴加到铜网上，室温下放置1分钟，吸附掉多余的外泌体，室温下用30 g/L磷钨酸(pH 6.8)染色5分钟，半瓦灯下干燥。然后在透射电子显微镜下成像。再取20μL UCMSC囊泡，用纳米颗粒跟踪分析仪检测其颗粒浓度和粒径分布。
干细胞外囊泡的电镜图片如图2左图所示：形态完整、脂质双分子层的膜性小囊泡；群体粒径检测结果如图2右图所示：外囊泡中位粒径105nm，浓度为1.25×109particles/mL。
3. 复合外囊泡组合物的制备
将干细胞外囊泡的浓度稀释至8×108particles/mL后，鼠李糖乳杆菌外囊泡和UCMSC外囊泡以1:1混合均匀，然后加入终浓度为56mM海藻糖和208mM甘露醇的溶液中，放入真空冷冻干燥冻干机中，进行冻干操作。
采用同样的冻干保护剂和程序将鼠李糖乳杆菌外囊泡和UCMSC外囊泡分别冻干，获得单一的外囊泡冻干粉。
实施例2 复合外囊泡冻干粉治疗DSS诱导的大鼠炎性肠病
1. 实验分组
将36只5-6周龄的雄性SD大鼠随机分为6组，每组6只，6组分别为：正常对照组（Control）、模型组（DSS）、美沙拉嗪组（(Mesalazine）、UCMSC囊泡组（UCMSC-EV）、鼠李糖乳杆菌囊泡组（LGG-EV）、UCMSC囊泡和鼠李糖乳杆菌囊泡混合组（EV），具体方案如下：
上述处理组在第8-9天自由饮水，并于第10天安乐死进行组织的取材及各种指标的检测。
2. 疾病活动指数(DAI)
每天称量各组大鼠体重，观察并记录各组大鼠疾病活动指数(DAI)，DAI评分参照Praveschotinunt等人的评分系统，包括体重下降、粪便性状和便血情况三个方面，DAI为三者分数之和，即DAI＝体重下降分数+粪便性状分数+便血情况分数。体重下降分为五个等级：0％、1-5％、6-10％、11-15％和>15％；粪便性状分为四个等级：正常、松散、不成形和稀便；便血情况分为五个等级：隐血阴性、浅蓝、蓝色、深蓝和肉眼血便。
结果如图3所示：造模后大鼠的DAI评分显著升高，药物干预后DAI评分均显著下降，其中LGG-EV和UCMSC-EV复合冻干粉EV的DAI评分显著低于其它3个治疗组，效果更好（*表示，与control组相比，p<0.05；#表示与DSS组相比，p<0.05；$表示与EV组相比，p<0.05）。
3. 结肠长度
麻醉后处死大鼠，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量结肠长度并拍照。结果如图4所示，造模后大鼠的结肠长度显著缩短，药物干预后结肠长度有所恢复，各药物组间无明显差异（*表示，与control组相比，p<0.05；#表示与DSS组相比，p<0.05）。
4. 炎性因子
取部分结肠组织qPCR检测炎性相关因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表达变化。结果如图5所示，造模后结肠组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6表达显著增加，IL-10的表达显著下降。药物干预后，TNF-α、IL-1β、IL-6显著降低，IL-10的表达显著升高，表明药物干预后能够缓解DSS导致的结肠炎症，其中LGG-EV和UCMSC-EV复合冻干粉EV的效果更好（*表示，与control组相比，p<0.05；#表示与DSS组相比，p<0.05；$表示与EV组相比，p<0.05）。
5. 肠通透性
取部分结肠组织ELISA检测肠通透性相关指标ZO-1、Occludin和Claudin-1变化。结果如图6所示，造模后结肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1表达显著降低，药物干预后ZO-1、Occludin和Claudin-1显著升高，表明药物干预修复了结肠屏障，其中LGG-EV和UCMSC-EV复合冻干粉EV的效果更好（*表示，与control组相比，p<0.05；#表示与DSS组相比，p<0.05；$表示与EV组相比，p<0.05）。
综上，干细胞和鼠李糖乳杆菌玩囊泡复合冻干粉能够缓解DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎，效果显著优于常用的药物美沙拉嗪（Mesalazine），也显著优于同浓度下两种单一的外囊泡冻干粉，具有更好的治疗效果；通过试验证明了囊泡口服途径给药的有效性，也为该类药剂提供了一种新的给药途径，扩展了细胞外囊泡的应用方式。
采用罗伊氏乳杆菌DSM17938制备外囊泡，与UCMSCs外囊泡制备复合冻干粉（乳杆菌EV颗粒数：干细胞EV颗粒数=9:1，总量1010particles/g），按照上述方法对DSS诱导的大鼠溃疡性结肠炎进行治疗，也发现了类似的效果，与单独使用干细胞外囊泡或单独使用罗伊氏乳杆菌外囊泡相比，复合冻干粉能够显著降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达，显著提高IL-10的表达，显著升高ZO-1、Occludin和Claudin-1表达，对结肠屏障进行修复。
Claims (10)
1.一种含干细胞胞外囊泡和肠道益生菌外囊泡的组合物，其特征在于，肠道益生菌外囊泡和干细胞外囊泡颗粒数比例为1:1000-1000:1；或1:100-100:1；或1:10-10:1。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，干细胞的来源选自胎盘组织、脐带血、骨髓、脂肪、牙髓、尿液、经血、皮肤、神经或内皮祖细胞；
干细胞可以是直接分离获得的或者由直接分离的干细胞传代后获得的；传代的次数为1-15次。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，干细胞的来源选自胎盘组织、脐带血、脂肪或骨髓；传代的次数为3-7次。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，肠道益生菌选自乳杆菌科（Lactobacillaceae）、酵母科(Saccharomycetaceae)和芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌；
肠道益生菌选自乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、双歧杆菌属、酵母属、芽孢杆菌属的细菌；
肠道益生菌选自鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、植物乳杆菌、嗜热乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、加氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、发酵乳杆菌、瑞士乳杆菌、动物乳双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜热链球菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、酪酸梭状芽孢杆菌；
肠道益生菌选自鼠李糖乳杆菌或罗伊氏乳杆菌；如鼠李糖乳杆菌LGG、鼠李糖乳杆菌HN001、鼠李糖乳杆菌MP108、罗伊氏乳杆菌DSM17938。
5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，外囊泡的制备选自差速离心法、超滤法、TFF切向流过滤法、密度梯度离心、空间排阻色谱法、微流控分离法、声学流体分离、介电泳分离法、聚合物沉淀或免疫亲和法；
外囊泡的粒径根范围为50nm-500nm。
6.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括制剂化所需的载体和/或药用辅料；如，海藻糖、甘露醇、人白蛋白。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括其他有效成分；如，氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、抗体药、低聚半乳糖、美沙拉嗪、维生素D、钙。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH为3.0-10.0，或5.0-8.0，或6.5-8.0。
9.一种如权利要求1-8任意所述的组合物在制备缓解或治疗炎症性肠病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其他证在于，药物的剂型选自适于口服的液态或固态剂型，如口服液、冻干粉、胶囊、片剂；
药物中的外囊泡的总颗粒数大于105/mL或105/g，如每毫升或每克制剂中含有外囊泡的颗粒数为107-1011数量级范围，或108-109数量级范围。
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| CN117965402A (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-03 | 中国农业大学 | 乳酸菌外膜囊泡的制备方法及应用 |
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