CN110938563B - 一种乳酸菌bj-reborn001及其在制备抑制幽门螺旋杆菌的发酵液中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乳酸菌BJ‑REBORN001及其在制备抑制幽门螺旋杆菌的发酵液中的应用，本发明所述菌株保藏编号为：CCTCC M 2019917，分类命名为乳酸杆菌BJ‑REBORN001(Lactobacillus plantarum BJ‑REBORN001)，本发明还提供所述乳酸菌BJ‑REBORN001在用于发酵制备抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液中的应用。实验表明，本发明的中药发酵液在体外具有显著的抑制幽门螺旋杆菌的作用，并对小鼠幽门螺旋杆菌感染模型具有防治作用。

Description

一种乳酸菌BJ-REBORN001及其在制备抑制幽门螺旋杆菌的发 酵液中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种乳酸菌BJ-REBORN001及其在抑制幽门螺旋杆菌的发酵液中的应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pyloi，HP)是一种微需氧螺旋杆菌属，带鞭毛的革兰氏阴性菌，其在全世界和我国的人群中的慢性感染率相当高。大量研究表明：HP可引起多种消化道疾病，尤其与胃癌的发生关系密切。近些年，大量研究均证实了慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡等疾病与HP的感染有关，并证实了HP感染是上消化道疾病的重要致病因子。HP感染同样与许多胃肠外疾病密切相关，在这些疾病的发生和发展过程中起着一定的作用。
HP感染的治疗也越来越深入，PPI加上两种抗生素的三联疗法一直是当前根除HP推荐的一线治疗方法，临床常用的抗生素包括甲硝唑、阿莫西林和克拉霉素。然而，随着抗生素的广泛应用，HP对这些抗生素的耐药率正逐年上升，这是PPI三联疗法根除HP失败的主要原因。同时PPI联合抗生素根除幽门螺杆菌的方法还存在副作用大(如腹泻、头昏、头痛、恶心或产生菌群失调)，治疗费用高等诸多缺点。
如何发挥中医药优势，筛选出无毒副作用、服用方便、作用机制明确，能有效的根除HP的中药制剂，替代或协同目前根除HP的治疗方法，对于避免抗生素耐药和毒副作用，提高防治HP相关性疾病的临床疗效，尤其是预防恶性肿瘤，如胃癌，肝癌和胰腺癌发生起到至关重要的作用。
中西医结合治疗，既发挥了副作用小、靶向性强及依从性好的特点，又突出了西医快速简便及起效迅速的优势，既着眼疾病的病理机制，又兼顾了疾病的外在表现，达到了辨证与辨病的有机结合。在辨证论治的基础上采用中西药结合，对延缓西药耐药性的产生、降低毒副作用及不良反应的发生率，防止复发有显著的疗效。
近年来HP的治疗取得了很大的进展，西药治疗HP有多种方案，但是由于耐药菌株的产生，我们应寻求更有效根除HP的方法。中药抗HP治疗有着很好的发展及前景，中药疗效显著，复发率低，副作用少，长期应用耐药率也低，因此加强中医药对此方面的研究应用势在必行。中药治疗中如何明确中药的确切疗效，如何提高中药的有效成分的利用，降低中药中对人体的毒副作用是当前中药在防治幽门螺旋杆菌的热点之一。发酵中药作为一种现代化的微生物转化技术，对提高中药有效成分的含量及吸收，对降解中药中的毒副作用成分有很好的效果。
此外，从现有技术来看，CN201610809409.7公开了一种乳酸菌制剂，所述乳酸菌制剂可广泛应用于胃溃疡的治疗，能显著提高疗效，溃疡治愈率高达90％，幽门螺旋杆菌根除率高达84％。该乳酸菌制剂为发酵乳杆菌冻干粉。更早一些的，JP2001040078同样提供了可以用于预防和治疗幽门螺旋杆菌相关的疾病的发酵乳，它的组成为嗜酸乳杆菌HY2177和干酪乳杆菌HY2743。但是目前尚没有采用乳酸菌通过对中药进行发酵来抑制幽门螺旋杆菌的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供具有特定抑制幽门螺旋杆菌的益生菌，即一株新的乳酸菌BJ-REBORN001。
本发明目的之二是提供乳酸菌BJ-REBORN001发酵产生的针对幽门螺旋杆菌的中药发酵液，可有效用于防治幽门螺旋杆菌感染。
本发明目的之三是提供所述中药发酵液的制备方法。
本发明目的之四是提供一种用于抑制幽门螺旋杆菌的乳酸菌发酵原料。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
关于乳酸菌BJ-REBORN001及应用：
本发明提供的新的乳酸菌菌株，其名称为BJ-REBORN001，已于2019年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为：CCTCC M2019917，分类命名为乳酸杆菌BJ-REBORN001(Lactobacillus plantarum BJ-REBORN001)，该菌具有较好的耐酸性和在中药中的繁殖能力，培养温度为32-35℃，革兰氏染色阳性，在MRS培养基中生长良好，兼性厌氧。
经过实验验证，本发明使用的乳酸菌在体外具有确切的抑制幽门螺旋杆菌的作用，且该菌具有较好的耐人工胃酸和胆汁酸的能力。
本发明还提供所述乳酸菌BJ-REBORN001在用于发酵制备抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液中的应用。
在一种具体的实施方式中，乳酸菌BJ-REBORN001在用于发酵制备抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液的应用中，用于发酵的中药原料按重量计算，为大黄1-5份、蒲公英1-5份、黄连1-4份、三七1-3份、芍药1-3份、炒陈皮1-3份、薏苡仁1-3份、苦参1-2份、生黄芪1-3份；在一种优选的实施例中，中药原料按重量计算，为大黄1-2份、蒲公英1-2份、黄连2-3份、三七1-2份、芍药1-2份、炒陈皮1-2份、薏苡仁1-2份、苦参1-2份、生黄芪2-3份；在一种更优选的实施例中，中药原料按重量计算，为大黄2份、蒲公英1份、黄连2份、三七2份、芍药1份、炒陈皮1份、薏苡仁1份、苦参1份、生黄芪1份。
关于中药发酵液和发酵中药制剂：
本发明还提供一种抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液，用本发明所述的乳酸菌BJ-REBORN001发酵中药原料，过滤除菌之后获得中药发酵液。
在一种实施例中，本发明所述的中药原料按重量计算，为大黄1-5份、蒲公英1-5份、黄连1-4份、三七1-3份、芍药1-3份、陈皮1-3份、薏苡仁1-3份、苦参1-2份、生黄芪1-3份。
在一种优选的实施例中，本发明所述的中药原料按重量计算，为大黄1-2份、蒲公英1-2份、黄连2-3份、三七1-2份、芍药1-2份、陈皮1-2份、薏苡仁1-2份、苦参1-2份、生黄芪2-3份。
在一种优选的实施例中，本发明所述的中药原料按重量计算，为大黄2份、蒲公英1份、黄连2份、三七2份、芍药1份、陈皮1份、薏苡仁1份、苦参1份、生黄芪1份。
在一种实施例中，本发明所述的中药发酵液，具体为：将乳酸菌BJ-REBORN001扩增培养后离心制备成菌泥，接种于中药原料液中，微生物转化3-5天，发酵终点为pH3.5以下，过滤除菌之后获得中药发酵液。
在一种实施例中，本发明所述的乳酸菌BJ-REBORN001扩增培养包括菌种复苏、扩大菌种培养、一级种子培养、种子罐培养以及发酵培养获得菌种培养液，菌种培养液经离心、收集菌泥；本发明乳酸菌BJ-REBORN001的菌种复苏、扩大菌种培养、一级种子培养、种子罐培养以及发酵培养可以按照本领域常规的方法。
在一种实施例中，本发明所述的中药原料液，其制备方法为：将重量份的中药原料混合，加入8-10倍质量的蒸馏水浸泡1-2小时，温火煎熬50-70分钟，作为头煎药剂，6-8层纱布过滤，将残余固相物用5-6倍质量的蒸馏水再煎熬30-40分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液。
在一种优选的实施例中，本发明所述的中药原料液，其制备方法为：将重量份的中药原料混合，加入8倍质量的蒸馏水浸泡2小时，温火煎熬60分钟，作为头煎药剂，8层纱布过滤，将残余固相物用6倍质量的蒸馏水再煎熬30分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液。
本发明还提供一种发酵中药制剂，为采用本发明所述的中药发酵液，辅以药学上可接受的辅料，形成药学上允许的剂型。
在一种实施例中，本发明所述的药学上允许的剂型为口服剂型，包括但不限于口服液、冻干片、冻干胶囊等。
本发明还提供所述的抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液的制备方法，包括中药原料液的制备、发酵液的制备。
在一种具体的实施例中，本发明所述的中药发酵液的制备方法，具体步骤如下：
(1)中药原料液的制备：将本发明前述的重量份的中药原料混合，加入8-10倍质量的蒸馏水浸泡1-2小时，温火煎熬50-70分钟，作为头煎药剂，6-8层纱布过滤，将残余固相物用5-6倍质量的蒸馏水再煎熬30-40分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液；
(2)中药发酵液的制备：将乳酸菌BJ-REBORN001平板复苏后接种于菌种培养基中，进行梯度扩培；扩增培养后的菌液离心制备成菌泥；将步骤(1)制备的中药原料液接种菌泥进行发酵，过滤除菌即得中药发酵液。
在一种优选的实施例中，本发明所述的中药原料液，其制备方法为：将重量份的中药原料混合，加入8倍质量的蒸馏水浸泡2小时，温火煎熬60分钟，作为头煎药剂，8层纱布过滤，将残余固相物用6倍质量的蒸馏水再煎熬30分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液。
本发明所述的菌种培养基可以为本领域能够用于乳酸菌BJ-REBORN001培养的常规培养基；为了获得更好的培养效果，本发明提供一种菌种培养基，蛋白胨9～11g、牛肉膏9～11g、酵母膏4～6g、柠檬酸氢二铵1.5～2.5g、葡萄糖18～22g、吐温80为0.8～1.2mL、乙酸钠4～6g、磷酸氢二钾1.5～2.5g、硫酸镁0.55～0.60g、硫酸锰0.20～0.30g、琼脂16～20g、蒸馏水1000mL、pH6.2-6.6；更优选的，所述菌种培养基为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.6。
在一种实施例中，本发明所述的梯度扩培，培养条件为：接种量3％-5％，37℃静置培养2-4天，菌体含量为1.0×108-1.0×109CFU/mL。在一种实施例中，为10倍梯度扩培。
在一种实施例中，本发明离心条件为8000r/min。
在一种实施例中，中药原料液接种菌泥进行发酵的过程中，接种量按1.11×104-1.11×105CFU/L的中药原料液。
在一种实施例中，中药原料液接种菌泥进行发酵的过程中，发酵的起始pH值为5.0-5.4，37℃，密闭厌氧发酵3-5天，发酵终点以pH值3-3.5为准。
本发明的发酵过程可以根据制备的量选择合适的发酵容器，例如三角锥瓶、蓝盖玻璃瓶或发酵罐等。
关于中药原料：
本发明还提供一种用于制备发酵中药制剂的中药原料，所述的中药原料按重量计算，为大黄1-5份、蒲公英1-5份、黄连1-4份、三七1-3份、芍药1-3份、陈皮1-3份、薏苡仁1-3份、苦参1-2份、生黄芪1-3份。
在一种优选的实施例中，本发明所述的中药原料按重量计算，为大黄1-2份、蒲公英1-2份、黄连2-3份、三七1-2份、芍药1-2份、陈皮1-2份、薏苡仁1-2份、苦参1-2份、生黄芪2-3份。
在一种优选的实施例中，本发明所述的中药原料按重量计算，为大黄2份、蒲公英1份、黄连2份、三七2份、芍药1份、陈皮1份、薏苡仁1份、苦参1份、生黄芪1份。
本发明的中药原料是按重量份作为配比的，在实际操作时可按照相应的比例增加或减少，单位可变，原料重量配比比例不变。
关于应用：
本发明还提供本发明所述的乳酸菌BJ-REBORN001、中药原料、中药发酵液或者发酵中药制剂在制备治疗/辅助治疗幽门螺旋杆菌引起的疾病药物中的应用。
本发明还提供本发明所述的乳酸菌BJ-REBORN001、中药原料、中药发酵液或者发酵中药制剂在制备幽门螺旋杆菌抑制剂中的应用。
本发明相对于现有技术的优势：
(1)本发明所述的乳酸菌BJ-REBORN001在体外具有确切的抑制幽门螺旋杆菌的作用，且该菌具有较好的耐人工胃酸和胆汁酸的能力，对本发明使用的中药原料液也具有很好的耐受性，并对中药原料液具有高效的转化能力。
(2)通过乳酸菌BJ-REBORN001发酵制备的中药制剂在体外具有显著的抑制幽门螺旋杆菌的作用，并对小鼠幽门螺旋杆菌感染模型具有防治作用。
附图说明
图1为BJ-REBORN001染色特性；
图2为BJ-REBORN培养特性；
图3为幽门螺旋杆菌抑菌试验，其中：1.哥伦比亚液体培养基；2.菌种培养基；3.中药原料液；4.发酵中药制剂；5.发酵液(除菌)；6.BJ-REBOEN001菌液；7.培养液(过滤除菌)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
本实施例所用药品使用化学纯标准。
以下实施例若无特别说明，则培养乳酸菌BJ-REBORN001所用的菌种培养基(MRS培养基)为：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.6。
本发明所述的乳酸菌BJ-REBORN001的获得
采样：土壤采自咸菜发酵酵坑的土壤，将表层土壤去除，无菌操作采集0.5cm2土块，至于10ml无菌0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，震荡混匀，800rpm离心5分钟，取上清备用。
分离纯化：取上清10％接种于MRS培养基，32℃，厌氧培养3天左右，梯度稀释，涂布于MRS固体培养基平板，32℃，厌氧培养2天，将疑似菌落划线培养于MRS平板，获得菌落纯，染色、镜检。
鉴定：将菌种培养于MRS液体培养基，离心，洗涤，获得菌体提取DNA，用16SrDNA通用引物扩增特异条带，测序，比对，确定菌种分类。获得新的乳酸菌菌株，命名为：BJ-REBORN001，已于2019年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学，其保藏编号为：CCTCC M 2019917，分类命名为乳酸杆菌BJ-REBORN001(Lactobacillus plantarum BJ-REBORN001)，该菌具有较好的耐酸性和在中药中的繁殖能力，培养温度为32-35℃，革兰氏染色阳性(如图1)，在MRS培养基中生长良好(如图2)，兼性厌氧。
实施例1口服液的制备
1)将大黄20g、蒲公英10g、黄连20g、三七20g、芍药10g、陈皮10g、薏苡仁10g、苦参10g、生黄芪10g混合，加入8倍质量的蒸馏水浸泡2小时，温火煎熬60分钟，作为头煎药剂，8层纱布过滤，将残余固相物用6倍质量的蒸馏水再煎熬30分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液；
2)取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.6，制备菌种培养基(MRS培养基)；
3)将所述的乳酸菌BJ-REBORN001平板复苏后接种于所述的菌种培养基中，进行10倍梯度扩培，培养条件为：接种量3％-5％，37℃静置培养3天，菌体含量为1.0×108-1.0×109CFU/mL；获得菌液；
4)培养后的菌液8000r/min离心，制备成菌泥；将所述的中药原料液接种菌泥，接种量按1.11×104-1.11×105CFU/L的中药原料液接种，汤剂的起始pH值为5.0-5.4，接种后视制备的量选择发酵容器，35℃，密闭厌氧发酵3-5天，发酵终点以pH值3-3.5为准，获得发酵液；
5)将发酵好的制剂8000r/min离心10min后，用0.45nm的过滤膜过滤，获得中药发酵液；
6)将步骤3制备的发酵液加入质量比6％的矫味剂麦芽糖醇，充分混匀，在无菌状态下过滤、封装即得，于4℃冰箱储藏。
实施例2冻干片的制备
1)将大黄20g、蒲公英10g、黄连20g、三七20g、芍药10g、陈皮10g、薏苡仁10g、苦参10g、生黄芪10g混合，加入8倍质量的蒸馏水浸泡2小时，温火煎熬60分钟，作为头煎药剂，8层纱布过滤，将残余固相物用6倍质量的蒸馏水再煎熬30分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液；
2)取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.6，制备菌种培养基；
3)将所述的乳酸菌BJ-REBORN001平板复苏后接种于所述的菌种培养基中，进行10倍梯度扩培，培养条件为：接种量3％-5％，37℃静置培养3天，菌体含量为1.0×108-1.0×109CFU/mL；培养后的菌液8000r/min离心，制备成菌泥；将所述的中药原料液接种菌泥，接种量按1.11×104-1.11×105CFU/L的中药原料液接种，汤剂的起始pH值为5.0-5.4，接种后视制备的量选择发酵容器，37℃，密闭厌氧发酵3-5天，发酵终点以pH值3-3.5为准，获得发酵液；
4)将发酵液加入添加质量比3％的β-环糊精、质量比3％的麦芽糖醇，离心，转移至冷冻干燥机中，冻干操作曲线如下：于-30℃预冻2h，将操作压力设置为60Pa，并保持不变，升温至-20℃保持3h，升温至-10℃并保持4h，升温至0℃并保持2h，升温至5℃并保持3h，升温至20℃并保持4h，将冻干粉压片，即得。
实施例3冻干胶囊的制备
1)将大黄20g、蒲公英10g、黄连20g、三七20g、芍药10g、陈皮10g、薏苡仁10g、苦参10g、生黄芪10g混合，加入8倍质量的蒸馏水浸泡2小时，温火煎熬60分钟，作为头煎药剂，8层纱布过滤，将残余固相物用6倍质量的蒸馏水再煎熬30分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液；
2)取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1000mL、pH 6.2-6.6，制备菌种培养基；
3)将所述的乳酸菌BJ-REBORN001平板复苏后接种于所述的菌种培养基中，进行10倍梯度扩培，培养条件为：接种量3％-5％，37℃静置培养3天，菌体含量为1.0×108-1.0×109CFU/mL；培养后的菌液8000r/min离心，制备成菌泥；将所述的中药原料液接种菌泥，接种量按1.11×104-1.11×105CFU/L的中药原料液接种，汤剂的起始pH值为5.0-5.4，接种后视制备的量选择发酵容器，37℃，密闭厌氧发酵3-5天，发酵终点以pH值3-3.5为准，获得发酵液；
4)将发酵液加入添加质量比3％的麦芽糊精、质量比3％的低聚果糖，离心，转移至冷冻干燥机中，冻干操作曲线如下：于-30℃预冻2h，将操作压力设置为60Pa，并保持不变，升温至-20℃保持3h，升温至-10℃并保持4h，升温至0℃并保持2h，升温至5℃并保持3h，升温至20℃并保持4h，将冻干粉装入空胶囊壳中，即得。
实施例4体外抑菌实验
实验目的：测试菌种培养基(MRS)(实施例1步骤2)制备)、中药原料液(实施例1步骤1)制备的)、发酵中药制剂(实施例1制备的口服液)、中药发酵液(0.45nm过滤除菌)、BJ-REBORN001菌液、培养液抑制幽门螺旋杆菌的作用。
实验方法：
1)幽门螺旋杆菌的培养：哥伦比亚血平板复苏HP43504，在微需氧条件下培养72小时，连续传代2次后，涂布于哥伦比亚血平板上，梯度稀释，计数、换算菌体浓度。
2)乳酸菌BJ-REBORN001平板复苏后接种于菌种培养基中，进行10倍梯度扩培，培养条件为：接种量3％-5％，37℃静置培养3天，形成菌体含量为1.0×108-1.0×109CFU/mL的乳酸菌BJ-REBORN001菌液；乳酸菌BJ-REBORN001菌液分为三份，一份作为BJ-REBORN001菌液的待测液体备用(即实验结果中的BJ-REBORN001菌液)；一份用0.45nm的膜进行过滤除去制剂中的乳酸菌形成培养液，作为培养液的待测液体备用(即实验结果中的培养液)；第三份8000r/min离心，制备成菌泥。
3)各种测试液的准备：将实施例1步骤(1)的中药原料液制备后，分成两份，一份作为中药原料液的待测液体备用(即实验结果中的中药原料液)，另一份接种乳酸菌(BJ-REBORN001)菌泥，接种量按1.11×104-1.11×105CFU/L的中药原料液接种，静置发酵72h，用0.44nm的膜进行过滤除去制剂中的乳酸菌，取滤液作为中药发酵液的待测液体(即实验结果中的中药发酵液)。
3)测试液对幽门螺旋杆菌的抑制试验：将幽门螺旋杆菌菌液100μL涂布于平板上(浓度为2ⅹ108CFU/平板)，每个平板涂布后放入4个牛津杯中，每个牛津杯中分别加入100μL待测液体(中药原料液、制剂、中药发酵液(制剂采用0.45nm过滤除去制剂中的乳酸菌)、BJ-REBORN001菌液、培养液(菌液过滤除菌))，以哥伦比亚液体培养基、菌种培养基(pH6.2)作为对照，在微需氧条件下培养48-72小时，测量抑菌环大小，实验重复3次。
表1幽门螺旋杆菌抑菌试验(抑菌圈直径：mm)
Figure GDA0002374463100000101
注：ZOI：抑菌圈直径大小；SEM：标准偏差
实验结果如表1和图3所示，表1的试验结果表明，中药原料液和乳酸菌BJ-REBORN001菌液本身具有一定的抑制幽门螺旋杆菌的能力。但是，本发明中的制剂和发酵液均对幽门螺旋杆菌具有更加良好的抑制作用，其抑菌效果明显优于中药原料液和BJ-REBORN001菌液。
实施例5乳酸菌(BJ-REBORN001)耐受性试验
实验方法：
1)人工胃液、胰液的配制：配制pH值分别为1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0的PBS，121℃15min灭菌，用过滤除菌法加入胃蛋白酶至终浓度3.0g/L，制备成人工胃液；同样制备pH值8.0的灭菌PBS，用过滤除菌法加入胰蛋白酶至终浓度1.0g/L，制备人工胰液。
2)胆盐培养液的制备：取胆酸钠和脱氧胆酸钠按质量比1：1配制成DBS母液，按要求将母液进行稀释配制成6.0g/L,5g/L，4g/L,3g/L，2g/L,1g/L的溶液，0.22μm过滤除菌；按两倍浓度配制MRS液体培养基，121℃，15min灭菌；按MRS培养基与各浓度DBS体积比1：1配制胆盐培养液。
3)乳酸菌(BJ-REBORN001)对人工胃液耐受性的测定：分别吸取1.0ml菌液，加入不同pH值的9.0ml人工胃液及9.0mlpH值为6.0的PBS中，37℃厌氧条件下混合3h，取样，用平板计数法测定活菌数，计算不同pH值人工胃液与对照PBS缓冲液中CFU的比值。
4)乳酸菌(BJ-REBORN001)对人工胰液耐受性的测定：吸取1.0ml菌液，加入到9.0ml人工胰液中，同时以pH值6.5的PBS做对照，37℃厌氧培养。分别于0、2、4、8、12h取样，用平板计数法测定活菌数。每个样品3个平行，计算不同时间人工胰液处理液中CFU与对照液中CFU的比值。
5)乳酸菌(BJ-REBORN001)对胆盐耐受能力的测定：以1％接种量将菌液接种于含胆盐MRS培养基和不含胆盐的的1×MRS培养基中，37℃培养24h，培养后用平板计数法测定活菌数，每个样品3个平行，计算含胆盐与不含胆盐培养基中CFU的比值。
实验结果如表2～4所示：
表2乳酸菌(BJ-REBORN001)对人工胃液耐受性
Figure GDA0002374463100000111
表3乳酸菌(BJ-REBORN001)对人工胰液的耐受性
Figure GDA0002374463100000121
表4乳酸菌(BJ-REBORN001)对不同浓度胆盐的耐受性
Figure GDA0002374463100000122
表2～表4的乳酸菌(BJ-REBORN001)耐受性试验显示，该菌对人工胃液、人工胰液和胆盐均有较好的耐受性，能够在胃、肠道中具有较好的活力，从而分泌生物活性物质，与幽门螺旋杆菌相互作用发挥抑制效应。不同pH值的人工胃液对菌体生长有一定的影响，当pH值小于3.0时，其抑制性较大，pH值在3.0-6.0时，影响较小。人工胰液对菌体的影响较小，主要影响体现在胰液的pH值对菌体的影响，而胰液成分的影响相对较小。乳酸菌(BJ-REBORN001)对胆盐的耐受性良好，高浓度对乳酸菌(BJ-REBORN001)的影响较大，当胆盐浓度大于2时，其抑制率达70％左右，当胆盐浓度≤1.5时.其抑制率约为30-40％。
实施例6体内抑菌实验
实验方法：
1)小鼠幽门螺旋杆菌感染模型的建立：将60只BALB/c小鼠胃部灌服混合抗生素溶液(氨苄青霉素10mg/ml、庆大霉素1.2mg/m L、阿奇霉素10mg/mL)0.3mL/只，1次/d，共3d。灌胃混合抗生素一周后，除空白组10只小鼠灌胃0.3ml生理盐水外，其余小鼠灌胃0.3ml/次/天新鲜培养的幽门螺旋杆菌(Hp43504，1ⅹ109CFU/mL)，连续灌胃5次，接种后3、6周随机处死模型感染组小鼠及空白组各2只，取胃黏膜评估其感染模型的建立情况。
2)Hp43504感染模型的鉴定
尿素酶活性的检测：造模后3、6周，取空白组和模型组各2只小鼠胃组织，加入500μLHp尿素酶试剂(胃幽门螺旋杆菌诊断试剂盒)，混匀，室温孵育4h，观察Hp尿素酶试剂颜色由黄色变为玫瑰色，判为阳性，证明造模成功。
幽门螺旋杆菌的定量培养：称取一定重量的小鼠胃组织，用生理盐水冲洗内容物，再用0.5mL生理盐水匀浆，1000rpm离心1min，吸取20μL组织匀浆上清液，按照1：10、1：100和1：1000比例稀释。每个稀释度各取100μL均匀涂布在哥伦比亚血平板上，37℃，微需氧培养72小时。用Hp诊断试剂盒等方法鉴定HP菌落。
3)小鼠分组及处理(治疗组所用中药原料药、制剂、发酵液(除菌)、乳酸菌BJ-REBORN001菌液和培养液同实施例4所用的待测液体)：空白组小鼠正常饲养，直至实验结束时处置；其余造模小鼠待抽样检查确定造模成功后(造模后40天左右)分成7组，每组6只。第1组(PPI+抗生素处理组)：自第3～10天，每天先禁食12h，给予PPI液0.25mL及氨苄青霉素0.25mL加克拉霉素0.1mL灌胃，灌完胃后再禁食3～4h，每天1次，连续7d。第2组(中药原料液治疗组)：自第1～10天，每日先禁食12h，给予中药原料液0.5mL/只灌胃，灌完胃后再禁食3～4h,，每天1次，连续10d。第3组(制剂治疗组)：自第1～10天，每天先禁食12h，给予制剂灌胃，0.5mL每只，灌完胃后再禁食3～4h，每天1次，连续10d。第4组(发酵液(除菌)组)：自第1～10天，每天予中药发酵液0.5mL/只灌胃，每天1次，连续10d。第5组(乳酸菌BJ-REBORN001菌液组)：自第1～10天，每天给予益生菌液0.5mL/只灌胃，每天1次，连续10d。第6组(培养液(菌液过滤除菌)组)，自第1～10天，每天予培养液0.5mL/只灌胃，每天1次，连续10d。第七组(生理盐水组)自第1～10天，每天予生理盐水0.5mL/只灌胃，每天1次，连续10d。第八组(正常组)不做任何处理。
4)小鼠的处理：用断颈法处死小鼠后立即解剖，取出胃腔，去除前胃，沿大弯侧剪开，取完整的胃组织(包括胃窦、胃体等)行快速尿素酶试验(观察时间5min)、涂片及Hp细菌培养。
实验结果：
表5：幽门螺旋杆菌感染模型治疗试验
Figure GDA0002374463100000141
表5动物感染模型治疗试验显示，制剂和发酵液(除菌)对幽门螺旋杆菌感染模型的根治率与阳性对照(PPI+抗生素组)结果相当，效果明显优于中药原料液、乳酸菌BJ-REBORN001菌液、培养液(菌液过滤除菌)对幽门螺旋杆菌。
上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种可抑制幽门螺旋杆菌的乳酸杆菌(Lactobacillus plantarum) BJ-REBORN001在用于发酵制备抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液中的应用，其特征在于，所述乳酸杆菌BJ-REBORN001的保藏编号为：CCTCC M 2019917，用于发酵的中药原料按重量计算，为大黄1-2份、蒲公英1-2份、黄连2-3份、三七1-2份、芍药1-2份、炒陈皮1-2份、薏苡仁1-2份、苦参1-2份、生黄芪2-3份。
2.一种抑制幽门螺旋杆菌的中药发酵液，其特征在于，用权利要求1中所述的乳酸杆菌BJ-REBORN001发酵中药原料，过滤除菌之后获得中药发酵液；所述的中药原料按重量计算，为大黄1-2份、蒲公英1-2份、黄连2-3份、三七1-2份、芍药1-2份、炒陈皮1-2份、薏苡仁1-2份、苦参1-2份、生黄芪2-3份。
3.根据权利要求2所述的中药发酵液，其特征在于，具体为将乳酸杆菌BJ-REBORN001扩增培养后离心制备成菌泥，接种于中药原料液中，微生物转化3-5天，发酵终点以pH值3-3.5为准，过滤除菌之后获得中药发酵液。
4.根据权利要求3所述的中药发酵液，其特征在于，所述的中药原料液的制备方法为：将重量份的中药原料混合，加入8-10倍质量的蒸馏水浸泡1-2小时，温火煎熬50-70分钟，作为头煎药剂，6-8层纱布过滤，将残余固相物用5-6倍质量的蒸馏水再煎熬30-40分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液。
5.一种发酵中药制剂，其特征在于，权利要求2～4任一项所述的中药发酵液辅以药学上可接受的辅料，形成药学上允许的剂型。
6.一种中药发酵液的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)中药原料液的制备：将重量份的中药原料混合，加入8-10倍质量的蒸馏水浸泡1-2小时，温火煎熬50-70分钟，作为头煎药剂，6-8层纱布过滤，将残余固相物用5-6倍质量的蒸馏水再煎熬30-40分钟，将两次汤剂合并，形成中药原料液；所述中药原料按重量计算，为大黄1-2份、蒲公英1-2份、黄连2-3份、三七1-2份、芍药1-2份、炒陈皮1-2份、薏苡仁1-2份、苦参1-2份、生黄芪2-3份；
(2)中药发酵液的制备：将如权利要求1中所述的乳酸杆菌BJ-REBORN001平板复苏后接种于菌种培养基中，进行梯度扩培；扩增培养后的菌液离心制备成菌泥；将步骤(1)制备的中药原料液接种菌泥进行发酵，过滤除菌即得中药发酵液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的梯度扩培，培养条件为：接种量3％-5％，37℃静置培养2-4天，菌体含量为1.0×108-1.0×109 CFU/mL；中药原料液接种菌泥进行发酵的过程中，接种量按1.11×104-1.11×105 CFU/L的中药原料液；发酵的起始pH值为5.0-5.4，37℃，密闭厌氧发酵3-5天，发酵终点以pH值3-3.5为准。
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