CN110546278A - 通过细菌宏基因组分析来诊断慢性阻塞性呼吸道疾病的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过细菌宏基因组学分析诊断诸如哮喘、COPD等慢性阻塞性气道疾病的方法，更具体地，涉及一种经由通过使用来源于受试者的样品进行的细菌宏基因组分析来分析来源于特定细菌中的细胞外囊泡的含量的增加或减少，从而诊断慢性阻塞性肺疾病和哮喘的方法。从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内，因此可能直接影响炎症反应，并且在症状出现之前很难早期诊断出慢性阻塞性气道疾病(如哮喘、COPD等)，因此对其有效治疗是困难的。因而，根据本发明，通过使用来源于人体的样品，通过对存在于来源于细菌的细胞外囊泡中的基因的宏基因组分析，可以预测发生慢性阻塞性气道疾病(如哮喘、COPD等)的风险，因此通过对慢性阻塞性气道疾病的风险组的早期诊断和预测经由适当管理，可以延迟或者防止慢性阻塞性气道疾病的发作，并且甚至在慢性阻塞性气道疾病(如哮喘、COPD等)发生后，可以实现对慢性阻塞性气道疾病的早期诊断，从而降低慢性阻塞性气道疾病的发病率以及提高治疗效果。
Description
技术领域
本公开涉及用于通过细菌的宏基因组分析来诊断慢性阻塞性气道疾病，例如慢性阻塞性肺疾病、哮喘等的方法，更具体地，涉及经由使用来源于受试者的样品的细菌的宏基因组分析，通过分析来源于特异性细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断慢性阻塞性气道疾病的方法。
背景技术
慢性阻塞性气道疾病是特征在于由于慢性气道阻塞而导致呼吸困难的肺部疾病，可大致分为特征在于可逆性气道阻塞的哮喘和特征在于不可逆性气道阻塞的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。根据2012年国家统计局(National Statistics Office)的数据，自2006年以来，每年因呼吸系统疾病而死亡的人数一直在稳步增长，尤其是，众所周知，COPD导致的死亡是在十大主要死因中唯一的数字正在上升的死亡原因，并且《2013年世界卫生组织报告》显示，COPD致死是全球第四大主要死因。
COPD是一种疾病，其中肺部的慢性炎症引起慢性支气管炎、慢性细支气管炎和肺气肿的发生，从而导致不可逆的气道阻塞。关于COPD的致病因子，已知吸烟或化学物质(如空气污染物)和源自病毒、细菌等的生物因素很重要。COPD是一种在病理学上以嗜中性粒细胞炎症为特征的疾病，并且这在免疫学上以Th17细胞诱导的超敏反应为特征。同时，哮喘是一种特征在于气道对非特异性刺激超敏和慢性炎症反应的疾病，并且特征在于变应原(例如源自屋尘螨等的蛋白质抗原)引起的Th2细胞诱导的超敏性和由其引起的嗜酸性炎症。
众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)或微生物菌群(microbiome)是一个微生物群落，其中包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物，并且已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共生地生活在人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学(韩国专利公开No.2011-0073049)。最近，使用基于16s核糖体RNA(16srRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用下一代测序(NGS)平台分析了16s rDNA碱基序列，其是16s核糖体RNA的基因。
然而，在慢性阻塞性气道疾病的发作中，从未报道过，通过从人类来源的物质(例如血液等)中分离的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析来鉴定诸如哮喘和COPD等慢性阻塞性气道疾病的致病因子，以及诊断发展慢性阻塞性气道疾病风险的方法。
发明内容
[技术问题]
为了基于COPD和哮喘的致病因子来诊断慢性阻塞性气道疾病，本发明的发明人从血液(其是来源于受试者的样品)中的来源于细菌的细胞外囊泡中提取DNA，并且对提取的DNA进行宏基因组分析，结果，鉴定出能够作为诸如COPD、哮喘等慢性阻塞性气道疾病的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而基于这些发现完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来为慢性阻塞性气道疾病诊断提供信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目的，提供了一种为慢性阻塞性气道疾病诊断提供信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断慢性阻塞性气道疾病的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少
本发明还提供了一种预测患慢性阻塞性气道疾病的风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于慢性阻塞性肺疾病(COPD)的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一实施方案中，所述受试者样品是血液。
在本发明的一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的属于柔膜菌门(Tenericutes)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由柔膜细菌纲(Mollicutes)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由不等鞭毛目(Stramenopiles)、红杆菌目(Rubrobacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红环菌目(Rhodocyclales)、RF39目和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由红杆菌科(Rubrobacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和戈登氏菌科(Gordoniaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、变形杆菌属(Proteus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter),红杆菌属(Rubrobacter)、巨单胞菌属(Megamonas)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红球菌属(Rhodococcus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、SMB53属、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、梭菌属(Clostridium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、微球菌属(Micrococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和短波单胞菌属(Brevundimonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由绿弯菌门(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)、梭杆菌门(Fusobacter)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)和TM7门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由红杆菌纲(Rubrobacteria)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和4C0d-2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由红杆菌目(Rubrobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、芽胞杆菌目(Bacillales)、红环菌目(Rhodocyclales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、梭杆菌目(Fusobacteriaceae)、CW040目、腐螺旋菌目(Saprospirales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales),、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和YS2目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由红杆菌科(Rubrobacteraceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、F16科、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、泰式菌科(Tissierellaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、线粒体科(Mitochondria)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、疣微菌纲(Verrucomicrobiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过与来源于正常个体的样品的比较并确定来源于受试者样品的选自由土芽孢杆菌属(Geobacillus)、红杆菌属(Rubrobacter)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、红球菌属(Rhodococcus)、变形杆菌属(Proteus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、皮生球菌属(Dermacoccus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、奈氏球菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、栖热菌属(Thermus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巨单胞菌属(Megamonas)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、颗粒链菌属(Granulicatella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、罗氏菌属(Rothia)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、萨特氏菌属(Sutterella)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)和肠杆菌属(Enterobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的选自由拟杆菌门(Bacteroidetes)、柔膜菌门(Tenericutes)、栖热菌门(Thermi)、TM7门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的选自由拟杆菌纲(Bacteroidia)、4C0d-2纲、柔膜细菌纲(Mollicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、恐球菌纲(Deinococci)、TM7-3纲、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的选自由YS2目、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、RF39目、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、孪生菌目(Gemellales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、放线菌目(Actinomycetales)、CW040目、木霉菌目(Streptophyta)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadaceae)、JG30-KF-CM45目、芽胞杆菌目(Bacillales)和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的选自由螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)泰氏菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、线粒体科(Mitochondria)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、F16科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
在本发明的另一实施方案中，在上述过程(c)中，可以通过比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的选自由肠杆菌属(Enterobacter)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、萨特氏菌属(Sutterella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、片球菌属(Pediococcus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、气味杆菌属(Odoribacter)、小杆菌属(Dialister)、埃希氏菌属(Escherichia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、罗氏菌属(Rothia)、副球菌属(Paracoccus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、颗粒链菌属(Granulicatella)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、小双孢菌属(Microbispora)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、库克菌属(Kocuria)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus、奈氏球菌目(Neisseriales)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、地杆菌属(Pedobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、莫拉菌属(Moraxella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、栖热菌属(Thermus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
在本发明的另一实施方案中，所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
[有利益处]
从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内，因此可能直接影响炎症反应，并且在症状出现之前很难早期诊断出慢性阻塞性气道疾病(如哮喘、COPD等)，因此对其有效治疗是困难的。因而，根据本发明，通过使用来源于人体的样品，通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，可以预测发生慢性阻塞性气道疾病的风险，因此通过对慢性阻塞性气道疾病的风险组的早期诊断和预测经由适当管理，可以延迟或者防止慢性阻塞性气道疾病的发作，并且甚至在慢性阻塞性气道疾病发生后，可以实现对慢性阻塞性气道疾病的早期诊断，从而降低慢性阻塞性气道疾病的发病率以及提高治疗效果。另外，被诊断患有哮喘或COPD的患者能够避免暴露于通过宏基因组学分析预测的致病因子，由此可以改善疾病的进展，或者可以防止其复发。
附图说明
图1A和1B是用于体内评估来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布模式的视图。图1A示出了在小鼠口服给药后肠细菌和每时间(0小时、5分钟、3小时、6小时和12小时)从细菌产生的EV的分布模式的图像。图1B示出了在小鼠口服给药之后肠细菌和来源于细菌的EV的分布模式的图像，并且在12小时后，提取小鼠的血液和各种器官(心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉)。
图2示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图3示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图4示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图5示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图6示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图7示出了在对从来源于哮喘患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图8示出了在对从来源于哮喘患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图9示出了在对从来源于哮喘患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图10示出了在对从来源于哮喘患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图11示出了在对从来源于哮喘患者的血液和来源于正常个体的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图12示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图13示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图14示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图15示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图16示出了在对从来源于COPD患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌宏基因组分析来诊断慢性阻塞性气道疾病，例如COPD、哮喘等等的方法。本发明的发明人从存在于来源于受试者的样品中的来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当COPD和哮喘的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种为慢性阻塞性气道疾病诊断提供信息的方法，所述方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
如本文所使用的术语“慢性阻塞性气道疾病”是包括哮喘和COPD的概念，但是本发明不受限于此。
如本文所使用的术语“COPD”是包括慢性支气管炎、慢性毛细支气管炎和肺气肿的概念，但是本发明不受限于此。
本文所用的术语“慢性阻塞性气道疾病诊断”是指确定患者是否有患慢性阻塞性气道疾病的风险，患慢性阻塞性气道疾病的风险是否相对较高，或者是否已经出现慢性阻塞性气道疾病。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟慢性阻塞性气道疾病发作(所述特定患者是具有高的患慢性阻塞性气道疾病的风险的患者)或预防慢性阻塞性气道疾病发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断慢性阻塞性气道疾病经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从血清分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
在本发明中，受试者样品可以是血液，并且血液可以优选是全血、血清、血浆或血液单核细胞，但是本发明不受限于此。
在本发明的一实施方式中，对来源于正常个体的血液、来源于哮喘患者的血液、来源于COPD患者的血液中存在的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当COPD和哮喘发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于柔膜菌门(Tenericutes)的细菌的细胞外囊泡的含量在COPD患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于柔膜细菌纲(Mollicutes)和索利氏菌纲(Solibacteres)的细菌的细胞外囊泡的含量在COPD患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于不等鞭毛目(Stramenopiles)、红杆菌目(Rubrobacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红环菌目(Rhodocyclales)、RF39目和索利氏菌目(Solibacterales)的细菌的细胞外囊泡的含量在COPD患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于红杆菌科(Rubrobacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和戈登氏菌科(Gordoniaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在COPD患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、变形杆菌属(Proteus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter),红杆菌属(Rubrobacter)、巨单胞菌属(Megamonas)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红球菌属(Rhodococcus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、SMB53属、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、梭菌属(Clostridium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、微球菌属(Micrococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和短波单胞菌属(Brevundimonas)的细菌的细胞外囊泡的含量在COPD患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于绿弯菌门(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)、梭杆菌门(Fusobacter)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)和TM7门的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于红杆菌纲(Rubrobacteria)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和4C0d-2纲的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于红杆菌目(Rubrobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、芽胞杆菌目(Bacillales)、红环菌目(Rhodocyclales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、梭杆菌目(Fusobacteriaceae)、CW040目、腐螺旋菌目(Saprospirales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales),、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和YS2目的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于红杆菌科(Rubrobacteraceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、F16科、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、泰式菌科(Tissierellaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、线粒体科(Mitochondria)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)、红杆菌属(Rubrobacter)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、红球菌属(Rhodococcus)、变形杆菌属(Proteus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、皮生球菌属(Dermacoccus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、奈氏球菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、栖热菌属(Thermus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巨单胞菌属(Megamonas)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、颗粒链菌属(Granulicatella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、罗氏菌属(Rothia)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、萨特氏菌属(Sutterella)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)和肠杆菌属(Enterobacter)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于拟杆菌门(Bacteroidetes)、柔膜菌门(Tenericutes)、栖热菌门(Thermi)、TM7门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于拟杆菌纲(Bacteroidia)、4C0d-2纲、柔膜细菌纲(Mollicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、恐球菌纲(Deinococci)、TM7-3纲、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于YS2目、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、RF39目、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、孪生菌目(Gemellales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、放线菌目(Actinomycetales)、CW040目、木霉菌目(Streptophyta)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadaceae)、JG30-KF-CM45目、芽胞杆菌目(Bacillales)和索利氏菌目(Solibacterales)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)泰氏菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、线粒体科(Mitochondria)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、F16科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于肠杆菌属(Enterobacter)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、萨特氏菌属(Sutterella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、片球菌属(Pediococcus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、气味杆菌属(Odoribacter)、小杆菌属(Dialister)、埃希氏菌属(Escherichia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、罗氏菌属(Rothia)、副球菌属(Paracoccus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、颗粒链菌属(Granulicatella)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、小双孢菌属(Microbispora)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、库克菌属(Kocuria)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、奈氏球菌目(Neisseriales)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、地杆菌属(Pedobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、莫拉菌属(Moraxella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、栖热菌属(Thermus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)的细菌的细胞外囊泡的含量在哮喘患者和COPD患者之间显著不同(参见实施例6)。
根据上述实施例的结果，证实通过对从血液中分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，鉴定出来源于细菌的细胞外囊泡的在来源于正常个体的血液、来源于哮喘患者的血液和来源于COPD患者的血液中的含量表现出显著的变化，并且通过宏基因组分析，经由分析每个级上的来源于细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少，不仅可以诊断而且还可以鉴别诊断COPD和哮喘。
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本发明的范围。
[本发明的方式]
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的肠细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在施用时不被系统吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV经由泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统吸收后在侵入人体内的各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从血液中进行囊泡分离和DNA提取
为了从血液中分离细胞外囊泡并且提取DNA，首先将粪便和尿加入到10ml管中，以3500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于中心离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从粪便和尿分离的100μl细胞外泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR。
[表1]
实施例3.使用从血液中的囊泡提取的DNA进行宏基因组分析
如下表2所示，使用与实施例2相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16SrDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在删除低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或97％以上序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从来源于正常个体和COPD患者的血液中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的COPD诊断模型
从205例COPD患者和231例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别方面匹配，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于柔膜菌门(Tenericutes)的细菌开发的诊断模型对于COPD表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自柔膜细菌纲(Mollicutes)和索利氏菌纲(Solibacteres)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于COPD表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
通过在目级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自不等鞭毛目(Stramenopiles)、红杆菌目(Rubrobacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红环菌目(Rhodocyclales)、RF39目和索利氏菌目(Solibacterales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于COPD表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
通过在科级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自红杆菌科(Rubrobacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和戈登氏菌科(Gordoniaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于COPD表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
通过在属级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、变形杆菌属(Proteus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter),红杆菌属(Rubrobacter)、巨单胞菌属(Megamonas)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红球菌属(Rhodococcus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、SMB53属、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、梭菌属(Clostridium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、微球菌属(Micrococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和短波单胞菌属(Brevundimonas)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于COPD表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
实施例5.基于对从正常个体和哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的哮喘诊断模型
从219例哮喘患者和236例正常个体(两组在年龄和性别方面)的血液样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差选择为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自于绿弯菌门(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)、梭杆菌门(Fusobacter)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)和TM7门的一或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对哮喘表现出显著的诊断性能(见表7和图7)。
[表7]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于红杆菌纲(Rubrobacteria)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和4C0d-2纲的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘表现出显著的诊断性能(参见表8和图8)。
[表8]
通过在目级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于红杆菌目(Rubrobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、芽胞杆菌目(Bacillales)、红环菌目(Rhodocyclales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、梭杆菌目(Fusobacteriaceae)、CW040目、腐螺旋菌目(Saprospirales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales),、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和YS2目的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘表现出显著的诊断性能(参见表9和图9)。
[表9]
通过在科级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于红杆菌科(Rubrobacteraceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、F16科、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、泰式菌科(Tissierellaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、线粒体科(Mitochondria)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘表现出显著的诊断性能(参见表10和图10)。
[表10]
通过在属级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于土芽孢杆菌属(Geobacillus)、红杆菌属(Rubrobacter)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、红球菌属(Rhodococcus)、变形杆菌属(Proteus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、皮生球菌属(Dermacoccus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、奈氏球菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、栖热菌属(Thermus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巨单胞菌属(Megamonas)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、颗粒链菌属(Granulicatella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、罗氏菌属(Rothia)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、萨特氏菌属(Sutterella)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)和肠杆菌属(Enterobacter)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘表现出显著的诊断性能(参见表11和图11)。
[表11]
实施例6.基于对从来源于COPD患者的血液和来源于哮喘患者的血液中分离的来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析的COPD和哮喘鉴别诊断模型
从205例COPD患者和219例哮喘患者的血液样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自拟杆菌门(Bacteroidetes)、柔膜菌门(Tenericutes)、栖热菌门(Thermi)、TM7门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘和COPD表现出显著的鉴别诊断性能(参见表12和图12)。
[表12]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自拟杆菌纲(Bacteroidia)、4C0d-2纲、柔膜细菌纲(Mollicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、恐球菌纲(Deinococci)、TM7-3纲、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘和COPD表现出显著的鉴别诊断性能(参见表13和图13)。
[表13]
通过在目级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自YS2目、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、RF39目、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、孪生菌目(Gemellales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、放线菌目(Actinomycetales)、CW040目、木霉菌目(Streptophyta)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadaceae)、JG30-KF-CM45目、芽胞杆菌目(Bacillales)和索利氏菌目(Solibacterales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘和COPD表现出显著的鉴别诊断性能(参见表14和图14)。
[表14]
通过在科级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)泰氏菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、线粒体科(Mitochondria)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、F16科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘和COPD表现出显著的鉴别诊断性能(参见表15和图15)。
[表15]
通过在属级分析血液中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自肠杆菌属(Enterobacter)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、萨特氏菌属(Sutterella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、片球菌属(Pediococcus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、气味杆菌属(Odoribacter)、小杆菌属(Dialister)、埃希氏菌属(Escherichia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、罗氏菌属(Rothia)、副球菌属(Paracoccus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、颗粒链菌属(Granulicatella)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、小双孢菌属(Microbispora)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、库克菌属(Kocuria)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、奈氏球菌目(Neisseriales)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、地杆菌属(Pedobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、莫拉菌属(Moraxella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、栖热菌属(Thermus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于哮喘和COPD表现出显著的鉴别诊断性能(参见表16和图16)。
[表16]
提供本发明的上述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方式应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明，通过细菌宏基因组学分析诊断慢性阻塞性气道疾病的方法可以用于经由通过使用来源于受试者的样品进行的细菌宏基因组分析来分析来源于特定细菌中的细胞外囊泡的含量的增加或减少来预测发生诸如哮喘、COPD等慢性阻塞性气道疾病的风险和诊断这些疾病。从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内，因此可能直接影响炎症的发生，并且在症状出现之前很难早期诊断出慢性阻塞性气道疾病(如哮喘、COPD等)，因此对其有效治疗是困难的。因而，根据本发明，通过使用来源于人体的样品，通过对细菌或来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，可以预测发生慢性阻塞性气道疾病(如哮喘、COPD等)的风险，因此通过对慢性阻塞性气道疾病的风险组的早期诊断和预测经由适当管理，可以延迟或者防止慢性阻塞性气道疾病的发作，并且甚至在慢性阻塞性气道疾病发生后，可以实现对慢性阻塞性气道疾病的早期诊断，从而降低慢性阻塞性气道疾病的发病率以及提高治疗效果。另外，被诊断患有哮喘或COPD的患者能够避免暴露于通过宏基因组学分析预测的致病因子，由此可以改善哮喘和COPD的进展，或者可以防止其复发。
<110> MD保健株式会社
<120> 通过细菌宏基因组分析来诊断慢性阻塞性呼吸道疾病的方法
<130> MPO19-088CN
<150> KR 10-2017-0025084
<151> 2017-02-24
<150> KR 10-2017-0059081
<151> 2017-05-12
<150> KR 10-2018-0021708
<151> 2018-02-23
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
Claims (18)
1.一种为慢性阻塞性气道疾病的诊断提供信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品与来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，在过程(c)中，所述比较包括比较：
来源于选自由柔膜菌门(Tenericutes)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由柔膜细菌纲(Mollicutes)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由不等鞭毛目(Stramenopiles)、红杆菌目(Rubrobacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红环菌目(Rhodocyclales)、RF39目和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌科(Rubrobacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和戈登氏菌科(Gordoniaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或
来源于选自由嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、变形杆菌属(Proteus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter),红杆菌属(Rubrobacter)、巨单胞菌属(Megamonas)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红球菌属(Rhodococcus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、SMB53属、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、梭菌属(Clostridium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、微球菌属(Micrococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和短波单胞菌属(Brevundimonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在过程(c)中，所述比较包括比较：
来源于选自由绿弯菌门(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)、梭杆菌门(Fusobacter)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)和TM7门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌纲(Rubrobacteria)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、TM7-3纲、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和4C0d-2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌目(Rubrobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、芽胞杆菌目(Bacillales)、红环菌目(Rhodocyclales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、梭杆菌目(Fusobacteriaceae)、CW040目、腐螺旋菌目(Saprospirales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales),、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和YS2目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌科(Rubrobacteraceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、F16科、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、泰式菌科(Tissierellaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、线粒体科(Mitochondria)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或
来源于选自由土芽孢杆菌属(Geobacillus)、红杆菌属(Rubrobacter)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、红球菌属(Rhodococcus)、变形杆菌属(Proteus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、皮生球菌属(Dermacoccus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、奈氏球菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、栖热菌属(Thermus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巨单胞菌属(Megamonas)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、颗粒链菌属(Granulicatella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、罗氏菌属(Rothia)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、萨特氏菌属(Sutterella)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)和肠杆菌属(Enterobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，在过程(c)中，所述比较包括比较：
来源于选自由拟杆菌门(Bacteroidetes)、柔膜菌门(Tenericutes)、栖热菌门(Thermi)、TM7门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由拟杆菌纲(Bacteroidia)、4C0d-2纲、柔膜细菌纲(Mollicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、恐球菌纲(Deinococci)、TM7-3纲、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由YS2目、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、RF39目、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、孪生菌目(Gemellales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、放线菌目(Actinomycetales)、CW040目、木霉菌目(Streptophyta)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadaceae)、JG30-KF-CM45目、芽胞杆菌目(Bacillales)和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)泰氏菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、线粒体科(Mitochondria)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、F16科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或
来源于选自由肠杆菌属(Enterobacter)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、萨特氏菌属(Sutterella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、片球菌属(Pediococcus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、气味杆菌属(Odoribacter)、小杆菌属(Dialister)、埃希氏菌属(Escherichia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、罗氏菌属(Rothia)、副球菌属(Paracoccus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、颗粒链菌属(Granulicatella)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、小双孢菌属(Microbispora)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、库克菌属(Kocuria)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、奈氏球菌目(Neisseriales)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、地杆菌属(Pedobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、莫拉菌属(Moraxella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、栖热菌属(Thermus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者样品是血液。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
10.一种诊断慢性阻塞性气道疾病的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品与来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断COPD。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，在过程(c)中，所述比较包括比较：
来源于选自由柔膜菌门(Tenericutes)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由柔膜细菌纲(Mollicutes)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由不等鞭毛目(Stramenopiles)、红杆菌目(Rubrobacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红环菌目(Rhodocyclales)、RF39目和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌科(Rubrobacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、S24-7科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)和戈登氏菌科(Gordoniaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或
来源于选自由嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、变形杆菌属(Proteus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter),the genus红杆菌属(Rubrobacter)、巨单胞菌属(Megamonas)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、红球菌属(Rhodococcus)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、SMB53属、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、埃希氏菌属(Escherichia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、梭菌属(Clostridium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、戈登氏菌属(Gordonia)、微球菌属(Micrococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和短波单胞菌属(Brevundimonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于哮喘患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断哮喘。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在过程(c)中，所述比较包括比较：
来源于选自由绿弯菌门(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)、梭杆菌门(Fusobacter)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、栖热菌门(Thermi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、酸杆菌门(Acidobacteria)和TM7门组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌纲(Rubrobacteria)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、恐球菌纲(Deinococci)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、TM7-3纲、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和4C0d-2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌目(Rubrobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、芽胞杆菌目(Bacillales)、红环菌目(Rhodocyclales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、放线菌目(Actinomycetales)、木霉菌目(Streptophyta)、梭杆菌目(Fusobacteriaceae)、CW040目、腐螺旋菌目(Saprospirales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales),、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和YS2目组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由红杆菌科(Rubrobacteraceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、F16科、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、泰式菌科(Tissierellaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、线粒体科(Mitochondria)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)和双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或
来源于选自由土芽孢杆菌属(Geobacillus)、红杆菌属(Rubrobacter)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、芽孢八叠球菌属(Sporosarcina)、嗜氢菌属(Hydrogenophilus)、红球菌属(Rhodococcus)、变形杆菌属(Proteus)、纤毛菌属(Leptotrichia)、短杆菌属(Brevibacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、皮生球菌属(Dermacoccus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、奈氏球菌属(Neisseria)、不动杆菌属(Acinetobacter)、栖热菌属(Thermus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、咸海鲜球菌属(Jeotgalicoccus)、迪茨氏菌属(Dietzia)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巨单胞菌属(Megamonas)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、颗粒链菌属(Granulicatella)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、伯克氏菌属(Burkholderia)、库克菌属(Kocuria)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、异常球菌属(Deinococcus)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、放线菌属(Actinomyces)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、罗氏菌属(Rothia)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、萨特氏菌属(Sutterella)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、毛形杆菌属(Lachnobacterium)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、拟杆菌属(Bacteroides)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、嗜胆菌属(Bilophila)和肠杆菌属(Enterobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
15.根据权利要求10所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于哮喘患者的样品和来源于COPD患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来鉴别诊断哮喘和COPD。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，在过程(c)中，所述比较包括比较：
来源于选自由拟杆菌门(Bacteroidetes)、柔膜菌门(Tenericutes)、栖热菌门(Thermi)、TM7门、蓝细菌门(Cyanobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、梭杆菌门(Fusobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、装甲菌门(Armatimonadetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由拟杆菌纲(Bacteroidia)、4C0d-2纲、柔膜细菌纲(Mollicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、恐球菌纲(Deinococci)、TM7-3纲、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、腐螺旋菌纲(Saprospirae)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、噬纤维菌纲(Cytophagia)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)、热微菌纲(Thermomicrobia)和索利氏菌纲(Solibacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由YS2目、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、RF39目、肠杆菌目(Enterobacteriales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、奈氏球菌目(Neisseriales)、孪生菌目(Gemellales)、异常球菌目(Deinococcales)、黄杆菌目(Flavobacteriales)、黄单胞菌目(Xanthomonadales)、疣微菌目(Verrucomicrobiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、柄杆菌目(Caulobacterales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、腐螺旋菌目(Saprospirales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、放线菌目(Actinomycetales)、CW040目、木霉菌目(Streptophyta)、立克次体目(Rickettsiales)、交替单胞菌目(Alteromonadales)、噬纤维菌目(Cytophagales)、气单胞菌目(Aeromonadales)、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadaceae)、JG30-KF-CM45目、芽胞杆菌目(Bacillales)和索利氏菌目(Solibacterales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺杆菌科(Helicobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、迪茨氏菌科(Dietziaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、放线菌科(Actinomycetaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)泰氏菌科(Tissierellaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、线粒体科(Mitochondria)、鞘氨醇杆菌科(Sphingobacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、弯曲菌科(Campylobacteraceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、芽胞杆菌科(Bacillaceae)、动球菌科(Planococcaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、纤毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、F16科、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或
来源于选自由肠杆菌属(Enterobacter)、特拉布斯氏菌属(Trabulsiella)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、萨特氏菌属(Sutterella)、丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、副拟杆菌属(Parabacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、片球菌属(Pediococcus)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、SMB53属、罗斯氏菌属(Roseburia)、气味杆菌属(Odoribacter)、小杆菌属(Dialister)、埃希氏菌属(Escherichia)、鞘脂菌属(Sphingobium)、罗氏菌属(Rothia)、副球菌属(Paracoccus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、颗粒链菌属(Granulicatella)、凯氏杆菌属(Kaistobacter)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、小双孢菌属(Microbispora)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、金黄色杆菌属(Chryseobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、库克菌属(Kocuria)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、粪球菌属(Coprococcus)、嗜胨菌属(Peptoniphilus、奈氏球菌目(Neisseriales)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、微红微球菌属(Rubellimicrobium)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、地杆菌属(Pedobacter)、芬戈尔德菌属(Finegoldia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、莫拉菌属(Moraxella)、水栖菌属(Enhydrobacter)、皮生球菌属(Dermacoccus)、栖热菌属(Thermus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、纤毛菌属(Leptotrichia)、迪茨氏菌属(Dietzia)、短杆菌属(Brevibacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、戈登氏菌属(Gordonia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、微球菌属(Micrococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、雷尔氏菌属(Ralstonia)、渺小杆菌属(Exiguobacterium)和需烷烃型菌属(Alkanindiges)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
17.根据权利要求10所述的方法，其中，所述受试者样品是血液。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述血液是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
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