CN111417732B - 通过细菌宏基因组分析来诊断阿尔茨海默氏症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过细菌宏基因组分析诊断阿尔茨海默氏症的方法，更具体地，涉及通过使用来源于正常人和受试者的样品进行宏基因组分析来分析特定细菌的细胞外囊泡含量的增加或减少来诊断阿尔茨海默氏症和轻度认知障碍的方法。环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被人体吸收，渗透到脑组织中，从而直接影响诸如阿尔茨海默氏症等认知功能，并且因为阿尔茨海默氏症难以在症状显现之前早期诊断，因此使得有效治疗困难。因此，通过根据本发明，使用来源于人体的样品，对细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析来预先预测轻度认知障碍和阿尔茨海默氏症发作的风险，可早期诊断和预测阿尔茨海默氏症风险群体以利用适当的治愈延迟该疾病发作的时间或防止该疾病发作，并且在该疾病发作之后，可进行早期诊断，从而降低阿尔茨海默氏症的发生率并提高治疗效果。

Description

通过细菌宏基因组分析来诊断阿尔茨海默氏症的方法
技术领域
本发明涉及通过细菌宏基因组学分析诊断阿尔茨海默氏症的方法，更具体地，涉及通过使用来源于正常个体的样品和来源于受试者的样品进行细菌宏基因组分析以分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断阿尔茨海默氏症的方法等。
背景技术
痴呆是导致主要脑功能和记忆力逐渐下降的疾病的总称。阿尔茨海默氏症是最常见的痴呆类型，并且75％的痴呆患者患有阿尔茨海默氏症。阿尔茨海默氏症在65岁或以上的人群中占10％，在85岁或以上的人群中占30％至50％。
尚不清楚阿尔茨海默氏症的病因，但根据其病理机制，阿尔茨海默氏症被定义为一种退行性神经系统疾病，其具有神经病理学症状，例如神经元外部β-淀粉样蛋白斑块的过多沉积和神经元中的磷酸化tau蛋白的过度产生，导致由于神经元功能受损(例如神经可塑性丧失和神经元死亡)而引起的渐进的认知功能障碍。阿尔茨海默氏症症的原因分为遗传原因和环境原因。作为遗传原因，已知淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因的变体，并且尽管它们通常会诱发早发性痴呆，但早发性痴呆的发生率为所有类型的阿尔茨海默氏症中的约1％。载脂蛋白E4基因型(等位基因)是一种遗传危险因素，其可使65岁以上的老年人痴呆症发病率增加约10％至35％。尽管许多研究人员已经认识到阿尔茨海默氏症是由多种非遗传性环境因素(例如衰老、压力等)引起的复杂疾病，而不是由遗传因素引起的复杂疾病，但由非遗传性和环境性原因引起的阿尔茨海默氏症的机制尚不明确。由遗传原因引起的早发性阿尔茨海默氏症可能发生在20多岁至40多岁的人群中，这是例外，大多数痴呆症病例都在65岁或以上被诊断。
尽管阿尔茨海默氏症是一种伴随神经病理学发现的退化性神经系统疾病，但今天，它已通过神经心理学和心理测试在临床上得到诊断，并且诊断准确性为80％至90％。另外，存在一个缺点，即潜在的痴呆症患者或痴呆症患者对于通过上述方法进行的重复诊断具有严重的心理排斥。尽管可以通过借助fMRI(功能磁共振成像)视觉检测沉积在大脑中的β-淀粉样蛋白来诊断阿尔茨海默氏症，但该方法目前仅在研究水平上使用。另外，根据对使用fMRI视觉检测阿尔茨海默氏症患者和正常人的大脑中沉积的β-淀粉样蛋白进行的研究，据报道，在所有对大脑中β-淀粉样蛋白沉积具有影像学发现的病例中，确定阿尔茨海默氏症的实际百分比约为80％至85％，并且10％或更多的正常人也显示出β-淀粉样蛋白沉积的影像学发现。综上所述，使用fMRI视觉检测β-淀粉样蛋白的方法似乎并不是诊断阿尔茨海默氏症的最佳方法。在全球范围内，由于老年人口的增加，阿尔茨海默氏症患者的数量正在迅速增加，但是诊断阿尔茨海默氏症的最常见方法仍取决于神经精神病学心理测试。因此，迫切需要开发在成本和技术方面健康且对医学友好的新型诊断方法(韩国专利No.10-0595494)。
同时，众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)是一种微生物群落，其包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物。已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共存于人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或更小的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学。最近，使用基于16s核糖体RNA(16s rRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用下一代测序(NGS)平台分析了16s rDNA碱基序列，其是16s核糖体RNA的基因。然而，在阿尔茨海默氏症的发作中，从未报道过，通过从人类来源的物质(例如血液或尿等)中分离的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析来鉴定阿尔茨海默氏症的致病因子，以及预测或诊断阿尔茨海默氏症的方法。
发明内容
[技术问题]
本发明人从作为来源于正常个体的样品和来源于受试者的样品的血液中存在的来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，并在这方面进行了宏基因组分析，以便提前诊断出阿尔茨海默氏症的病因和风险，并且结果，鉴定出可用作阿尔茨海默氏症的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而基于此完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组学分析提供用于诊断阿尔茨海默氏症的信息的方法，诊断阿尔茨海默氏症的方法，预测阿尔茨海默氏症发作的风险的方法等等。
另外，本发明的目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组学分析提供用于诊断轻度认知障碍的信息的方法，诊断轻度认知障碍的方法，预测轻度认知障碍发生的风险的方法等等。
然而，本发明的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目的，提供了一种提供用于阿尔茨海默氏症诊断的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断阿尔茨海默氏症的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测阿尔茨海默氏症的风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述来源于受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、SR1门、互养菌门(Synergistetes)和栖热菌门(Thermi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和恐球菌纲(Deinococci)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于立克次体目(Rickettsiales)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、威廉土氏菌科(Williamsiaceae)和异常球菌科(Deinococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、rc4-4属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红球菌属(Rhodococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、副球菌属(Paracoccus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、威廉土氏菌属(Williamsia)和异常球菌属(Deinococcus)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，所述正常个体样品和受试者样品是血液，并且
过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、SR1门、互养菌门(Synergistetes)和栖热菌门(Thermi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和恐球菌纲(Deinococci)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于立克次体目(Rickettsiales)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、威廉土氏菌科(Williamsiaceae)和异常球菌科(Deinococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、rc4-4属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红球菌属(Rhodococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、副球菌属(Paracoccus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、威廉土氏菌属(Williamsia)和异常球菌属(Deinococcus)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量增加诊断为阿尔茨海默氏症：
来源于脱铁杆菌门(Deferribacteres)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和脱铁杆菌纲(Deferribacteres)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)和威廉土氏菌科(Williamsiaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、副球菌属(Paracoccus)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、威廉土氏菌科(Williamsia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量减少诊断为阿尔茨海默氏症：
来源于选自由SR1门、互养菌门(Synergistetes)和栖热菌门(Thermi)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由黄小杆菌纲(Flavobacteriia)和恐球菌纲(Deinococci)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于立克次体目(Rickettsiales)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由周蝶菌科(Weeksellaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红球菌属(Rhodococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、异常球菌属(Deinococcus)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
为了实现本发明的上述目的，提供了一种提供用于轻度认知障碍诊断的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述来源于受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断轻度认知障碍的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述来源于受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测轻度认知障碍的风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述来源于受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、SR1门、TM7门、栖热菌门(Thermi)、绿弯菌纲(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)、菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由木霉菌目(Streptophyta)和立克次体目(Rickettsiales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由周蝶菌科(Weeksellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、红球菌属(Rhodococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，所述正常个体样品和受试者样品是血液，并且
过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、SR1门、TM7门、栖热菌门(Thermi)、绿弯菌纲(Chloroflexi)和装甲菌门(Armatimonadetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)和菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由木霉菌目(Streptophyta)和立克次体目(Rickettsiales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由周蝶菌科(Weeksellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)和菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、红球菌属(Rhodococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量增加诊断为轻度认知障碍：
来源于梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌纲(Fusobacteriia)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌目(Fusobacteriaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)和根瘤菌科(Rhizobiaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由梭杆菌属(Fusobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、气味杆菌属(Odoribacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)和类芽孢杆菌属(Paenibacillus)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量减少诊断为轻度认知障碍：
来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)、SR1门、TM7门、栖热菌门(Thermi)、绿弯菌门(Chloroflexi)和装甲菌门(Armatimonadetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由变形菌纲(Betaproteobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)和菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由木霉菌目(Streptophyta)和立克次体目(Rickettsiales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由周蝶菌科(Weeksellaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)和菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红球菌属(Rhodococcus)、异常球菌属(Deinococcus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
为了实现本发明的上述目标，提供了一种提供用于阿尔茨海默氏症诊断的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自轻度认知障碍患者的样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于轻度认知障碍患者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断阿尔茨海默氏症的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自轻度认知障碍患者样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于轻度认知障碍患者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测阿尔茨海默氏症的风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自轻度认知障碍患者样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于轻度认知障碍患者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由梭杆菌门(Fusobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和装甲菌门(Armatimonadetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由梭杆菌纲(Fusobacteriia)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由微杆菌科(Microbacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由梭杆菌属(Fusobacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、副球菌属(Paracoccus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、紫单胞菌属(Porphyromonas)和纤毛菌属(Leptotrichia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，所述轻度认知障碍患者样品和受试者样品是血液，并且
过程(c)可以包括比较并确定：来源于选自由梭杆菌门(Fusobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和装甲菌门(Armatimonadetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由梭杆菌纲(Fusobacteriia)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由微杆菌科(Microbacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由梭杆菌属(Fusobacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、副球菌属(Paracoccus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、紫单胞菌属(Porphyromonas)和纤毛菌属(Leptotrichia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于轻度认知障碍患者的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量增加诊断为阿尔茨海默氏症：
来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)和装甲菌门(Armatimonadetes)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由脱铁杆菌纲(Deferribacteres)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)和纤毛菌科(Leptotrichiaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、副球菌属(Paracoccus)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、紫单胞菌属(Porphyromonas)和纤毛菌属(Leptotrichia)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于轻度认知障碍患者的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量减少诊断为阿尔茨海默氏症：
来源于梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于梭杆菌纲(Fusobacteriia)的细菌的细胞外囊泡；
来源于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由微杆菌科(Microbacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由梭杆菌属(Fusobacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、气味杆菌属(Odoribacter)和韦荣氏球菌属(Veillonella)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，所述血液可以是全血、血清、血浆或血液单核细胞。
[有利效果]
由环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡可吸收到人体中并直接影响阿尔茨海默氏症的发作，并且由于难以在症状显现之前及早诊断出阿尔茨海默氏症，因而难以有效治疗阿尔茨海默氏症。因此，根据本发明，通过经由使用来源于人的样品对细菌的细胞外囊泡的宏基因组学分析来预先诊断阿尔茨海默氏症的病因和发病风险，可以早期诊断和预测阿尔茨海默氏症的风险人群，并且可利用适当的护理延迟发病的时间或预防疾病的发作。另外，由于阿尔茨海默氏症可以在发作后早期诊断，因此可以降低阿尔茨海默氏症的发病率并提高治疗效果，并且可以通过经由对诊断为阿尔茨海默氏症的患者进行宏基因组分析鉴定致病因子以避免接触相关因子来改善疾病的进展或预防疾病的复发。此外，由于还可以通过宏基因组学分析早期诊断轻度认知障碍的危险人群，因此可以通过适当的治疗来延迟发病的时间或预防疾病的发作，并且可以在疾病发作后早期诊断，因此可以降低轻度认知障碍的发生率，并且可以提高治疗效果。
附图说明
图1A例示了示出在小鼠口服给药肠道细菌和来源于细菌的细胞外囊泡(EV)后，细菌和细胞外囊泡(EV)的随时间推移的分布模式的图像，并且图1B例示了示出在小鼠口服给药之后细菌和EV的分布模式的图像，并且在12小时，提取血液和各种器官。
图2是通过从阿尔茨海默氏症患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在门级上的诊断性能方面是显著的。
图3是通过从阿尔茨海默氏症患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在纲级上的诊断性能方面是显著的。
图4是通过从阿尔茨海默氏症患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在目级上的诊断性能方面是显著的。
图5是通过从阿尔茨海默氏症患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在科级上的诊断性能方面是显著的。
图6是通过从阿尔茨海默氏症患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在属级上的诊断性能方面是显著的。
图7是通过从轻度认知障碍患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在门级上的诊断性能方面是显著的。
图8是通过从轻度认知障碍患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在纲级上的诊断性能方面是显著的。
图9是通过从轻度认知障碍患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在目级上的诊断性能方面是显著的。
图10是通过从轻度认知障碍患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在科级上的诊断性能方面是显著的。
图11是通过从轻度认知障碍患者和正常个体的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在属级上的诊断性能方面是显著的。
图12是通过从轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在门级上的诊断性能方面是显著的。
图13是通过从轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在纲级上的诊断性能方面是显著的。
图14是通过从轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在目级上的诊断性能方面是显著的。
图15是通过从轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在科级上的诊断性能方面是显著的。
图16是通过从轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在属级上的诊断性能方面是显著的。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌的宏基因组分析来诊断阿尔茨海默氏症和轻度认知障碍的方法。本发明的发明人使用正常个体的样品和来源于受试者的样品中从来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当阿尔茨海默氏症和轻度认知障碍的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供用于诊断阿尔茨海默氏症的信息的方法，所述方法包括：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
另外，本发明提供了一种提供用于诊断轻度认知障碍的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
另外，本发明还提供了一种提供用于诊断阿尔茨海默氏症的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自轻度认知障碍和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于轻度认知障碍的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述来源于受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
如本文所用，术语“阿尔茨海默氏症诊断”是指确定患者是否有患阿尔茨海默氏症的风险，患阿尔茨海默氏症的风险是否相对较高，或者是否已经出现阿尔茨海默氏症。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟阿尔茨海默氏症发作(所述特定患者是具有高的患阿尔茨海默氏症的风险的患者)或预防阿尔茨海默氏症发作。此外，该方法可以在临床上用于通过早期诊断阿尔茨海默氏症经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文使用的术语“轻度认知障碍”是指由于正常的衰老现象导致的认知能力下降，并且被定义为与相同年龄人群相比认知能力下降的状态。轻度认知障碍和痴呆之间的区别在于日常生活是可能的，并且由于已知10％的患有轻度认知障碍的老年患者会发展为痴呆，因此轻度认知障碍被称为痴呆的危险因素。
如本文所用，术语“轻度认知障碍诊断”是指确定患者是否有患轻度认知障碍的风险，患轻度认知障碍的风险是否相对较高，或者是否已经出现轻度认知障碍。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟轻度认知障碍发作(所述特定患者是具有高的患轻度认知障碍的风险的患者)或预防轻度认知障碍发作。此外，该方法可以在临床上用于通过早期诊断轻度认知障碍经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
如本文所用，术语“宏基因组”("metagenome")是指包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以鉴定一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从例如血分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
在本发明中，正常个体的样品和受试者的样品可以是血液或尿，血液优选可以为全血、血清、血浆或血液单核细胞，但本发明不受限于此。
在本发明的一个实施方案中，对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当阿尔茨海默氏症发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在门级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于脱铁杆菌门(Deferribacteres)、SR1门、互养菌门(Synergistetes)、栖热菌门(Thermi)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在纲级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和恐球菌纲(Deinococci)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在目级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于立克次体目(Rickettsiales)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在科级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、威廉土氏菌科(Williamsiaceae)和异常球菌科(Deinococcaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在属级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、rc4-4属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红球菌属(Rhodococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、副球菌属(Paracoccus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、威廉土氏菌属(Williamsia)和异常球菌属(Deinococcus)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
在本发明的另一实施方案中，对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当轻度认知障碍发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在门级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、SR1门、TM7门、栖热菌门(Thermi)、绿弯菌纲(Chloroflexi)和装甲菌门(Armatimonadetes)的细菌的细胞外囊泡的含量在轻度认知障碍患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在纲级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)和菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)的细菌的细胞外囊泡的含量在轻度认知障碍患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在目级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于木霉菌目(Streptophyta)和立克次体目(Rickettsiales)的细菌的细胞外囊泡的含量在轻度认知障碍患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在科级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于周蝶菌科(Weeksellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)和菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在轻度认知障碍患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在属级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、红球菌属(Rhodococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)的细菌的细胞外囊泡的含量在轻度认知障碍患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
在本发明的一个实施方案中，对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当阿尔茨海默氏症发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在门级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于梭杆菌门(Fusobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和装甲菌门(Armatimonadetes)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和轻度认知障碍患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在纲级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于梭杆菌纲(Fusobacteriia)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和轻度认知障碍患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在目级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和轻度认知障碍患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在科级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于微杆菌科(Microbacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和轻度认知障碍患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在属级对存在于来源于受试者的血液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于梭杆菌属(Fusobacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、副球菌属(Paracoccus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、紫单胞菌属(Porphyromonas)和纤毛菌属(Leptotrichia)的细菌的细胞外囊泡的含量在阿尔茨海默氏症患者和轻度认知障碍患者之间显著不同(参见实施例6)。
通过实施例的结果，证实了所鉴定的来源于细菌的细胞外囊泡的分布变量可用于预测阿尔茨海默氏症或轻度认知障碍的发作。
[本发明的模式]
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不旨在限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的肠细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在给药时不被系统吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，由此确认EV经由泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统吸收后侵入人体内的各种器官中的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，然而来源于细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从血液中进行囊泡分离和DNA提取
为了从血液分离细胞外囊泡并且提取DNA，首先将血液加入到10ml管中，以在3500×g和4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于离心过滤器(50kD)中，并在1500×g和4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从血液分离的100μl细胞外泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却。接下来，将所得的囊泡在10,000×g和4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR。
[表1]
实施例3.使用从血液中提取的DNA进行宏基因组分析
使用与实施例2中所用相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16S rDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在除去低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或更大的序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从正常个体和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来源于细菌 的EV的宏基因组分析的阿尔茨海默氏症诊断模型
从67例阿尔茨海默氏症患者和70例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于脱铁杆菌门(Deferribacteres)、SR1门、互养菌门(Synergistetes)和栖热菌门(Thermi)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、黄小杆菌纲(Flavobacteriia)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和恐球菌纲(Deinococci)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于立克次体目(Rickettsiales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
通过在科级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、消化球菌科(Peptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、组织菌科(Tissierellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、孪生菌科(Gemellaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、威廉土氏菌科(Williamsiaceae)和异常球菌科(Deinococcaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
/>
通过在属级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、rc4-4属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、红球菌属(Rhodococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、副球菌属(Paracoccus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、威廉土氏菌属(Williamsia)和异常球菌属(Deinococcus)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
/>
实施例5.基于对从正常个体和轻度认知障碍患者的血液中分离的来源于细菌的 EV的宏基因组分析的轻度认知障碍诊断模型
从65例轻度认知障碍患者和70例正常个体的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于梭杆菌门(Fusobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、SR1门、TM7门、栖热菌门(Thermi)、绿弯菌纲(Chloroflexi)和装甲菌门(Armatimonadetes)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于轻度认知障碍表现出显著的诊断性能(参见表7和图7)。
[表7]
/>
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于变形菌纲(Betaproteobacteria)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、叶绿体纲(Chloroplast)、TM7-3纲、恐球菌纲(Deinococci)和菌毛单胞菌纲(Fimbriimonadia)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于轻度认知障碍表现出显著的诊断性能(参见表8和图8)。
[表8]
/>
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于木霉菌目(Streptophyta)和立克次体目(Rickettsiales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于轻度认知障碍表现出显著的诊断性能(参见表9和图9)。
[表9]
通过在科级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于周蝶菌科(Weeksellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、黄色单胞菌科(Xanthomonadaceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)和菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于轻度认知障碍表现出显著的诊断性能(参见表10和图10)。
[表10]
通过在属级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、红球菌属(Rhodococcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于轻度认知障碍表现出显著的诊断性能(参见表11和图11)。
[表11]
/>
实施例6.基于对从轻度认知障碍患者和阿尔茨海默氏症患者的血液中分离的来 源于细菌的EV的宏基因组分析的阿尔茨海默氏症诊断模型
从67例阿尔茨海默氏症患者和65例轻度认知障碍患者的血液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于梭杆菌门(Fusobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和装甲菌门(Armatimonadetes)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表12和图12)。
[表12]
通过在纲级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于梭杆菌纲(Fusobacteriia)、脱铁杆菌纲(Deferribacteres)和α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表13和图13)。
[表13]
通过在目级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表14和图14)。
[表14]
通过在科级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于微杆菌科(Microbacteriaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)和微球菌科(Micrococcaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表15和图15)。
[表15]
通过在属级分析血液中来源于细菌的EV得出，使用属于梭杆菌属(Fusobacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、副球菌属(Paracoccus)、黄杆菌属(Flavobacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、气味杆菌属(Odoribacter)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、紫单胞菌属(Porphyromonas)和纤毛菌属(Leptotrichia)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于阿尔茨海默氏症表现出显著的诊断性能(参见表16和图16)。
[表16]
/>
提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特性。因此，本文描述的实施方案应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明的通过细菌宏基因组分析提供用于诊断阿尔茨海默氏症的信息的方法可用于通过使用来源于正常个体的样品和来源于受试者的样品进行细菌宏基因组分析以分析特定的来源于细菌的细胞外囊泡含量的增加或减少来预测阿尔茨海默氏症和轻度认知障碍发作的风险，以及诊断阿尔茨海默氏症和轻度认知障碍。
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16s rDNA的正向引物(Forward primer for 16s rDNA)
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16s rDNA的反向引物(Reverse primer for 16s rDNA)
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (1)

1.包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的一对引物在制备用于诊断阿尔茨海默氏症的组合物中的用途，所述组合物用于通过对从正常个体和受试者血液样品中分离的细胞外囊泡中提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以检测正常个体和受试者血液样品中细胞外囊泡的含量；并且通过对PCR产物进行测序比较与来自正常个体的血液样品的细菌来源的细胞外囊泡含量相比，来自所述受试者的血液样品的细菌来源的细胞外囊泡含量的增加或减少，
其中所述比较包括比较来源于如下的细胞外囊泡含量的增加或减少：
鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、rc4-4属、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、奈瑟菌属(Neisseria)、副球菌属(Paracoccus)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)、威廉土氏菌属(Williamsia)和异常球菌属(Deinococcus)细菌，
与来源于正常个体组的血液样品中的细胞外囊泡含量比较，下述的细胞外囊泡的含量增加：
来源于黏液螺旋菌属(Mucispirillum)、rc4-4属、副球菌属(Paracoccus)、紫单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、台湾温单胞菌属(Tepidimonas)、纤毛菌属(Leptotrichia)、安德克氏菌属(Adlercreutzia)和威廉土氏菌属(Williamsia)细菌的细胞外囊泡；以及
下述的细胞外囊泡的含量减少：
来源于克劳斯氏菌属(Cloacibacterium)、柯林斯氏菌属(Collinsella)、罗氏菌属(Rothia)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、奈瑟菌属(Neisseria)、厌氧球菌属(Anaerococcus)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophaga)和异常球菌属(Deinococcus)细菌的细胞外囊泡,
表明存在患阿尔茨海默氏症的风险。
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High throughput DNA sequencing to detect differences in the subgingival plaque microbiome in elderly subjects with and without dementia;Andrew F Cockburn 等;《Investig Genet》;20120921;第3卷(第1期);摘要 *
阿尔茨海默病与肠道微生物;胡旭等;《中国科学:生命科学》;20161020(第10期);第1174-1191页 *

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